UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE FARMCIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

BIANCA ALOISE MANEIRA CORRA

MODELAGEM MOLECULAR, DOCKING E ESTUDOS TERICOS DO ESPECTRO ELETRNICO DE ABSORO DE DERIVADOS DA BENZOFENONA

Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos

Rio de Janeiro 2010

BIANCA ALOISE MANEIRA CORRA

MODELAGEM MOLECULAR, DOCKING E ESTUDOS TERICOS DO ESPECTRO ELETRNICO DE ABSORO DE DERIVADOS DA BENZOFENONA
Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos

Rio de Janeiro 2010

Corra, Bianca Aloise Maneira Modelagem molecular, docking e estudos tericos do espectro eletrnico de absoro de derivados da benzofenona / Bianca Aloise Maneira Corra Rio de Janeiro : UFRJ / Faculdade de Farmcia, 2010. 110 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Carlos Rangel Rodrigues e Elisabete Pereira dos Santos. Dissertao (mestrado) UFRJ / Faculdade de Farmcia, Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, 2010. Referncias bibliogrficas: f. 104-110.

1. Disruptores Endcrinos - efeitos adversos. 2. Moduladores de Receptor Estrognico - agonistas. 3. Espectrofotometria Ultravioleta. 4. Filtros Ultravioletas. 5. Benzofenonas - anlise. 6. Modelos Moleculares. 7. Relao Estrutura-Atividade. 8. Farmcia - Tese. I. Rodrigues, Carlos Rangel. II. Santos, Elisabete Pereira dos. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmcia, Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas. IV. Ttulo.

BIANCA ALOISE MANEIRA CORRA

MODELAGEM MOLECULAR, DOCKING E ESTUDOS TERICOS DO ESPECTRO ELETRNICO DE ABSORO DE DERIVADOS DA BENZOFENONA
Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

Aprovada em _____ de ________________ de 2010.

____________________________________________________________ Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues - Orientador Faculdade de Farmcia UFRJ (Presidente) ____________________________________________________________ Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos - Orientadora Faculdade de Farmcia - UFRJ ____________________________________________________________ Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral Faculdade de Farmcia - UFRJ ____________________________________________________________ Prof. Dr. Arlan da Silva Gonalves Instituto Federal do Esprito Santo IFES ____________________________________________________________ Profa. Dra. Adriane Regina Todeschini Instituto de Biofisica Carlos Chagas Filho - UFRJ ____________________________________________________________ Profa. Dra. Rita de Cssia Elias Estrela Marins Faculdade de Farmcia UFRJ (suplente) ____________________________________________________________ Profa. Dra. Magaly Giro Albuquerque Instituto de Qumica UFRJ (suplente)

Rio de Janeiro 2010

Aos meus pais e irmos pelo amor, confiana, apoio e compreenso. Dedico-lhes esta conquista como gratido.

AGRADECIMENTOS

minha famlia amada, Claudia, Wilson, Vitor e Fbio. Agradeo por acreditarem em mim e nos meus sonhos, por todo apoio, incentivo, e tambm pela compreenso. Obrigada por sempre estarem presentes, mesmo com a distncia. Ao Carlos Eduardo, meu companheiro de toda a vida, pelo apoio, pacincia e presena constante nessa jornada. Obrigada por me trazer sempre felicidade. professora Elisabete Pereira dos Santos que me abriu as portas para essa etapa de vida na Universidade Federal do Rio de Janeiro e me apresentou ao professor Carlos Rangel Rodrigues, meu orientador. Ao professor Carlos Rangel Rodrigues, por me aceitar como aluna e pela oportunidade, confiana e apoio. Obrigada por toda a ateno, tempo e esforo dedicados. Aos meus tios, Ktia e Mauro, que me incentivaram e proporcionaram a oportunidade de estar aqui no Rio de Janeiro, e a minha tia amiga Shirley, sempre prxima e presente. Obrigada por todo apoio que me deram, no s nessa fase, mas tambm em todas da minha vida. todos os meus parentes, avs, tios e primos e s minhas amigas, que mesmo com a distncia, continuaram participando da minha vida e estiveram sempre na torcida. Aos alunos do Laboratrio ModMolQSAR-3D da Faculdade de Farmcia da UFRJ pelo apoio. A Alessandra e ao Arlan pela essencial ajuda na elaborao do trabalho. Aos professores e colaboradores do programa de ps-graduao pelos

ensinamentos e orientaes e em especial professora Magaly G. Albuquerque que enriqueceu o trabalho com suas aulas e consideraes. Aos professores da banca por gentilmente aceitarem o convite e pelas contribuies. Ao CNPq, CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro que foi fundamental para a realizao deste trabalho.

Minha doce donzela! Enfrente a tempestade noturna, como os pssaros. Ao amanhecer, mesmo com seus ninhos derrubados, Eles cantam sem palco e platia! Para eles, a vida uma grande festa!

Minha querida princesa! No tenha medo da vida, Tenha medo de no viver; No tenha medo de cair, Tenha medo de no caminhar.

(Augusto Cury)

RESUMO

Corra, Bianca Aloise Maneira. Modelagem molecular, docking e estudos tericos do espectro eletrnico de absoro de derivados da benzofenona. Rio de Janeiro, 2010. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas) - Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.

As benzofenonas possuem a habilidade de absorver e dissipar a radiao ultravioleta (UV) e, por isso, so muito utilizadas como filtros UV na indstria farmacutica, alimentcia e cosmtica. Diversas publicaes apontam a presena sistmica de benzofenonas aps aplicao cutnea ou ingesto de alimentos que mantiveram contato direto com plsticos cuja composio apresenta benzofenonas. A benzofenona-3 o principal alvo desses estudos, devido sua elevada aplicao em formulaes fotoprotetoras. Diversas publicaes evidenciam absoro, bioacumulao, metabolizao e excreo da benzofenona-3. Do ponto de vista toxicolgico, diversos estudos avaliam a atividade das benzofenonas como desreguladores endcrinos. A atividade estrognica das benzofenonas identificada por uma srie de estudos in vitro e in vivo. O objetivo desse trabalho a aplicao de tcnicas de modelagem molecular no estudo de derivados da benzofenona visando gerar informaes estruturais e eletrnicas importantes que possam ser empregadas para o desenho racional de novos compostos com atividade fotoprotetora, mas que no apresentem atividade estrognica evidenciada em muitos desses derivados. Para isso, utilizou-se uma srie de derivados da benzofenona e buscou-se identificar parmetros estruturais e eletrnicos que possam ser correlacionados com a atividade estrognica, bem como o estudo de docking em receptor de estrognio e o clculo do espectro eletrnico de absoro UV visando obter uma metodologia robusta que possa avaliar a faixa de absoro no espectro UV desses derivados. Os resultados do estudo de SAR apontaram que a alta densidade eletrnica na posio para dos anis A e B como uma caracterstica importante para a interao com o receptor de estrognio. No estudo de docking do derivado com maior atividade estrognica foram identificadas trs interaes por ligao hidrognio, duas com os mesmos resduos que o 17-estradiol faz, Glu353 e Arg394, e uma com o resduo Thr347. Observaram-se tambm interaes hidrofbicas. No estudo do espectro eletrnico terico, mtodo TD-DFT, foi possvel

identificar as contribuies em termos de orbitais moleculares das principais transies eletrnicas. Os mximos tericos esto de acordo com as faixas dos mximos de absoro obtidos experimentalmente. O presente trabalho compila informaes estruturais e eletrnicas importantes sobre derivados da benzofenona, que podem ser racionalizadas em estudos posteriores visando o desenvolvimento de novos compostos utilizados como filtros UV, mas que no apresentem atividade estrognica, portanto, eficazes e mais seguros.

ABSTRACT

The benzophenones have the ability to absorb and dissipate ultraviolet (UV) and therefore are widely used in pharmaceutical, food and cosmetics as UV filters. Several publications indicate the presence of systemic benzophenones after dermal application or ingestion of foods that have maintained their surface in contact with plastics whose composition has benzophenones. The benzophenone-3 is the main target of these studies, due to its high application in formulations sunscreens. Several publications show the absorption, bioaccumulation, metabolism and excretion of benzophenone-3. From the toxicological point of view, several studies evaluating the activity of benzophenones as endocrine disrupters. The estrogenic activity of the benzophenones is identified by a series of in vitro and in vivo. The aim of this work is the application of molecular modeling techniques in the study of benzophenone derivatives in order to generate structural and electronic information that may be employed for the rational design of new compounds with sunscreen activity, but that did not show estrogenic activity evident in many of these derivatives. For this, we used a series of derivatives of benzophenone and sought to identify structural and electronic parameters that can be correlated with estrogenic activity, as well as the study of estrogen receptor in docking and calculation of the electronic spectrum of UV absorption to obtain a robust methodology that can evaluate the range of UV absorption spectra of these derivatives. The results of the SAR indicated that the high electron density in para position for the rings A and B as an important feature for interaction with the estrogen receptor. In the study by docking the derivative with greater estrogenic activity by three hydrogen bond interactions, two with the same residues that 17-estradiol does, Glu353 Arg394, and one with the Thr347 residue, were identified. There were also hydrophobic and electrostatic interactions. In the theoretical study of the electronic spectrum, TD-DFT method, it was possible to identify the contributions in terms of molecular orbitals of the main electronic transitions. The theoretical maximum are in agreement with the bands of maximum absorption obtained experimentally. This work compiles structural and electronic information of benzophenones, which can be streamlined in future studies aimed at developing new compounds as UV absorbers, but that did not show estrogenic activity, therefore, more effective and safe.

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NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura qumica do DDT, Bisfenol A, DES e Estradiol. ........................... 23 Figura 2. Estrutura qumica geral dos ftalatos. ......................................................... 24 Figura 3. Estrutura comum dos hormnios esteroidais, representada pelo composto ciclopentaperhidrofenantreno. A numerao IUPAC (SODERO, 2007). ................ 25 Figura 4. Diagrama esquemtico ilustrativo da distribuio de ER- e ER- no tecido de ratos machos e fmeas (FITOESTROGNIOS, 2010)......................................... 28 Figura 5. Comparao entre as seqncias de aminocidos dos receptores de estrognio e (SODERO, 2007). Entre parnteses esto indicados o percentual de identidade entre as seqncias dos domnios A/B, C, D, E e F. .......................... 29 Figura 6. Estruturas qumicas dos estrognios endgenos: 17 -estradiol, estrona e estriol. ........................................................................................................................ 29 Figura 7. Representao da estrutura tridimensional do LBD do ER- complexado ao 17-estradiol obtida por difrao de raios-X (cdigo PDB: 1ERE): (A) principais estruturas secundrias ao redor do ligante; (B) interaes por ligao hidrognio do ligante com o LBD (SODERO, 2007). ....................................................................... 30 Figura 8. Espectro eletromagntico e os tipos de transies (KLN & WIRZ, 2009)31 Figura 9. Representao esquemtica dos tipos de transies eletrnicas. ............ 33 Figura 10. Diagrama de Jablnski: Os processos fotofsicos so representados por (1) absoro de luz, (2) converso interna (IC), (3) fluorescncia, (4) cruzamento entre sistemas (ISC) e (5) fosforescncia (PAULA, 2003). ....................................... 34 Figura 11. Estrutura qumica da benzofenona. ......................................................... 35 Figura 12. Estrutura qumica da benzofenona-3....................................................... 36 Figura 13. Tipos de transies eletrnicas presentes na excitao fotoqumica das benzofenonas (S0 estado fundamental, S1 primeiro estado excitado singleto, S2 segundo estado excitado singleto) ............................................................................ 37 Figura 14. Processo de emisso de energia da benzofenona (Adaptado de BARTON et al., 2010) ............................................................................................................... 38

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Figura 15. Rota de metabolizao em ratos proposta para a benzofenona-3 (1. Formao dos produtos intermedirios: (2) 2,2-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona, (3) 2,4-Dihidroxibenzofenona e (4) 2,3,4-Trihidroxibenzofenona (JEON et al., 2008). ... 39 Figura 16. Erros mdios da entalpia de formao, momento de dipolo, potencial de ionizao e distncia interatmica, os erros mdios. Comparao entre os mtodos RM1, AM1, PM3 e PM5 (ROCHA et al., 2006). ......................................................... 45 Figura 17. Distribuio dos valores de atividade (pEC50) dos 16 derivados da benzofenona selecionados para o estudo de SAR (SUZUKI et al., 2005). ............... 55 Figura 18. Numerao dos tomos na benzofenona. ............................................... 56 Figura 19. Fluxograma da metodologia. ................................................................... 60 Figura 21. (a) Estrutura da benzofenona no otimizada - Impedimento estrico, entre os tomos de hidrognio destacados em amarelo, observado na estrutura da benzofenona que apresenta planaridade entre os anis (Modelo CPK). (b) Estrutura da benzofenona otimizada (Modelo de varetas) (c) Estrutura da benzofenona otimizada em modelo CPK (Corey Pauling Koltum). ................................................. 62 Figura 23. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados monohidroxilados: derivado orto-substitudo (02), meta-substitudo (03) e para-substitudo (04)......................... 66 Figura 24. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados 4-Hidroxibenzofenona (04), 2,2'-Dihidroxibenzofenona (05), 2,4-Dihidroxibenzofenona (06) e 4,4'Dihidroxibenzofenona (07). ....................................................................................... 66 Figura 25. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados mais potentes do estudo de SUZUKI et al., 2005. ................................................................................................. 68 Figura 26. Alinhamento e sobreposio dos compostos 07 e 09. Tracejado amarelo aponta a interao por ligao hidrognio do grupo 2-hidroxil com a carbonila. ....... 68 Figura 27. Estrutura dos compostos 06 (pEC50=-0,10) e 08 (pEC50=-1,07) e dos compostos 09 (pEC50=1,00) e 11 (pEC50=-1,50) em modelo CPK e rea exposta () dos tomos de oxignio e hidrognio dos substituintes para-hidroxila. .............. 70 Figura 28. Correlao linear de Pearson: Energia de LUMO (ELUMO) e atividade estrognica (pEC50) da srie de derivados da benzofenona (01-16)......................... 73

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Figura 29. Distncia entre os tomos de hidrognio dos compostos 10 (esquerda) e 15 (direita) (modelo CPK). ......................................................................................... 74 Figura 30. Mapa de densidade do Orbital Molecular de Menor Energia Desocupado (LUMO) da srie de derivados (01-16) codificado na faixa de vermelho profundo (0,00) a azul profundo (0,02) sobre uma superfcie de densidade eletrnica constante de 0,002 eV/ua3, as reas azuis e vermelhas indicam menores e maiores valores de energia LUMO, respectivamente. ............................................................ 75 Figura 31. Mapa de densidade do Orbital Molecular de Maior Energia Ocupado (HOMO), codificado na faixa de vermelho profundo (0.00) a azul profundo (0.02) sobre uma superfcie de densidade eletrnica constante de 0,002 eV/ua 3, as reas azuis e vermelhas indicam maiores e menores valores de energia de HOMO, respectivamente. ....................................................................................................... 76 Figura 32. Mapa do potencial eletrosttico molecular (MEP) codificado na faixa de 100 a 100 kJ/mol sobre uma superfcie de densidade eletrnica constante de 0,002 eV/ua3. Compostos destacados (07, 09, 10 e 12) apresentam maior atividade estrognica. ............................................................................................................... 78 Figura 33. Alinhamento e sobreposio das benzofenonas mais ativas (07, 09, 10 e 12 em cinza) e do 17-estradiol (em rosa). ............................................................ 80 Figura 34. Agrupamento em clusters (RMSD inferiores a 2.0 ) dos poses do derivado 09. Em vermelho, cluster de menor energia com 10 poses. .................... 81 Figura 35. Ligaes de hidrognio do derivado 09 com os resduos de aminocido Arg394, Glu353 e Thr347 do LBD do receptor de estrognio (ER-) (cdigo do PDB: 1ERE). ....................................................................................................................... 82 Figura 36. Interaes de van der Waals observadas entre o ligante (derivado 09) e o LBD do receptor de estrognio (ER-) (cdigo do PDB: 1ERE). .............................. 83 Figura 37. Modo de ligao da delfinidina no LBD do receptor de estrognio (ER-) (Adaptado de CHALOPIN et al., 2010)...................................................................... 84 Figura 38. Estrutura qumica do DDT e o HPTE....................................................... 85 Figura 39. Ligao do (A) DDT, (B) HPTE (conformao 1) e (C) HPTE

(conformao 2) no stio de ligao do receptor de estrognio (Adaptado de CELIK et al., 2008). .............................................................................................................. 86

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Figura 40. Comparao entre os espectros eletrnicos calculados da benzofenona (01). ........................................................................................................................... 90 Figura 41. Coeficientes dos orbitais envolvidos na transio mais intensa ( *) para a benzofenona (01). .......................................................................................... 92 Figura 42. Coeficientes dos orbitais envolvidos na transio de menor energia para a benzofenona (01). .................................................................................................. 92 Figura 43. Comparao entre os espectros de absoro calculados e experimental da benzofenona-3 (derivado 13). .............................................................................. 94 Figura 44. Coeficientes dos orbitais envolvidos nas transies eletrnicas do derivado 13................................................................................................................ 96 Figura 45. Representao esquemtica da transferncia de prton intramolecular no estado excitado (ESPT) (Adaptado de BAUGHMAN et al., 2009)............................. 96 Figura 46. Comparao entre os espectros eletrnicos calculados para o derivado 14. ............................................................................................................................. 99 Figura 47. Coefientes do orbitais de HOMO-2, HOMO e LUMO do derivado 14.... 100 Figura 48. Representao esquemtica da transferncia de prton intramolecular no estado excitado (ESPT) da dioxibenzona (Adaptado de BAUGHMAN et al., 2009). ................................................................................................................................ 101

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NDICE DE TABELAS Tabela 1. Caractersticas tpicas de alguns cromforos (PAULA, 2003). ................. 32 Tabela 2. Estrutura qumica e valores de pEC50 (SUZUKI et al., 2005) da srie de 16 derivados da benzofenona ................................................................................... 54 Tabela 3. ngulos de inclinao para os confrmeros de menor energia da srie de derivados da benzofenona (01-16). (A/B = ngulo de inclinao (C7C4C10C13) formado entre os planos contendo os anis aromticos A e B). ............................... 63 Tabela 4. Parmetros calculados (volume, energia de HOMO e LUMO, dipolo molecular e cLogP) e atividade estrognica (pEC50) experimental (SUZUKI et al., 2005) dos derivados da benzofenona. ...................................................................... 72 Tabela 5. Distncia entre os tomos de oxignio das hidroxilas da posio para dos compostos em estudo e das hidroxilas do 17-estradiol. .......................................... 79 Tabela 6. Medida experimental dos comprimentos de onda mximos (mx em nm) para a benzofenona (01), oxibenzona (13) e dioxibenzona (14) em diferentes solventes. .................................................................................................................. 88 Tabela 7. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 01 (benzofenona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G), e os comprimentos de onda mximos do espectro eletrnico experimental (etanol)a ............................................................................................... 89 Tabela 8. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) das transies do derivado 01 (benzofenona). ................................................................ 91 Tabela 9. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 13 (oxibenzona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G), e os comprimentos de onda mximos do espectro eletrnico experimental (etanol)a ............................................................................................... 93

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Tabela 10. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) das transies do derivado 13 (dioxibenzona). ................................................................ 95 Tabela 11. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 14 (dioxibenzona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G). ........................................................................................................... 98 Tabela 12. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) do derivado 2,2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona (14)..................................................... 100

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NDICE DE QUADROS

Quadro 1. Mecanismos de alterao da homeostase de hormnios esterides sexuais1. .................................................................................................................... 26

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LISTA DE ABREVIATURAS

AM1 BFs BF-3 BF-4 BF-8 BF-5 CHELPG

Modelo Austin 1 (Austin Model 1) Benzofenonas Benzofenona-3 Benzofenona-4 Benzofenona-8 Benzofenona-5 Cargas de Potencial Eletrosttico (Charges from Electrostatic Potentials using Grid-Based Method)

CSD

Banco de dados estrututais de Cambridge (Cambridge Structural Database)

DDT DDE DES DFT DHHB ER ESPT

Dicloro-difenil-tricloro 2,2-bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno Dietiletilbestrol Teoria do Funcional da Densidade (Density Functional Theory) 2-(4-dietilamino-2-hidroxibenzoil)-benzoato de hexila Receptores de estrognio (Estrogen receptor) Transferncia de prton no estado excitado ( Excited Transfer) State Proton

hER HF HOMO

Receptores de estrognio humano Teoria de Hartree-Fock Orbital molecular ocupado de maior energia (High Occupied Molecular Orbital)

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HPTE IC ISC LBD LDA LUMO

2,2-dihidroxifenil-1,1,1-tricloroetano Converso interna (Internal Conversion) Converso intersistemas (Intersystem Crossing) Domnio de ligao do ligante (Ligand Binding Domain) Aproximao da densidade local (Local Density Approximation) Orbital molecular desocupado de menor energia (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)

MEP MM MMFF PDB PM3 PM5 PVC RDC RMN RMSD SAR StAR TD-DFT

Potencial eletrosttico molecular (Molecular Electrostatic Potential) Mecnica molecular (Molecular Mechanics) Campo de foras molecular da Merck (Merck Molecular Force Field) Banco de dados da protena (Protein Data Bank) Mtodo Paramtrico 3 (Parametric Method 3) Mtodo Paramtrico 5 (Parametric Method 5) Cloreto de polivinila Resoluo da Diretoria Colegiada Ressonncia magntica nuclear Raiz do Quadrado Mdio dos Desvios (Root Mean Square Deviation) Relao estrutura-atividade (Structure-Activity Relationship) Regulador da esteroidognese aguda (Steroidogenic Acute Regulator) Teoria do Funcional da Densidade Dependente do Tempo (Time dependent Density-Functional Theory)

UV

Ultravioleta

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SUMRIO

1. INTRODUO ................................................................................................... 22 1.1. DESREGULADORES ENDCRINOS ......................................................... 22 Sistema endcrino ................................................................................. 24 Alterao da homeostase de hormnios esterides sexuais ................. 26

1.1.1. 1.1.2. 1.2.

AGONISTAS NATURAIS DE RECEPTOR DE ESTROGNIO .................... 27 Receptores de estrognio ...................................................................... 27 Estrognios naturais .............................................................................. 29

1.2.1. 1.2.2. 1.3. 1.4.

FOTOFSICA E FOTOQUMICA MOLECULAR ........................................... 31 BENZOFENONAS........................................................................................ 35 Mecanismo de absoro da radiao UV .............................................. 37 Desregulao endcrina por derivados da benzofenona ....................... 38

1.4.1. 1.4.2. 1.5.

MODELAGEM MOLECULAR ....................................................................... 40 Mecnica molecular ............................................................................... 41 Mecnica quntica ................................................................................. 42 Teoria do Funcional da Densidade (DFT) .............................................. 45 Anlise conformacional .......................................................................... 47 Descritores moleculares ........................................................................ 48 Energia dos orbitais moleculares .................................................... 48 Densidades de HOMO e LUMO ...................................................... 49 Coeficientes de HOMO e LUMO ..................................................... 49 Momento de dipolo molecular ......................................................... 49 Mapa do Potencial Eletrosttico molecular ..................................... 50

1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.5.4. 1.5.5.

1.5.5.1. 1.5.5.2. 1.5.5.3. 1.5.5.4. 1.5.5.5.

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 51 3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 52 3.1. 3.2. OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 52 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................ 52

4. METODOLOGIA ................................................................................................. 53 4.1. DADOS BIOLGICOS: SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA ...... 53

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4.2. ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) DE UMA SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA (01-16) COM PERFIL DE ATIVIDADE ESTROGNICA ..................................................................................................... 55 4.2.1. 4.2.2. Construo e otimizao das estruturas tridimensionais ....................... 55 Clculo das propriedades eletrnicas .................................................... 56

4.3. ESTUDO DE DOCKING DO COMPOSTO MAIS ATIVO (09) DA SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA ........................................................................ 57 4.4. CLCULO DO ESPECTRO UV-VIS DOS COMPOSTOS (01, 13 e 14) DERIVADOS DA BENZOFENONAS ..................................................................... 58 4.4.1. Estudo do espectro eletrnico de absoro UV-Vis realizado no programa Spartan 08 ......................................................................................... 58 4.4.2. Estudo do espectro eletrnico de absoro UV-Vis realizado no programa GAMESS US ...................................................................................... 59 4.5. FLUXOGRAMA DA METODOLOGIA........................................................... 59

5. RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................... 61 5.1. ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA COM PERFIL ESTROGNICO.................................................. 61 5.1.1. Anlise conformacional .......................................................................... 61

5.1.2. Anlise dos dados de atividade estrognica e dos dados obtidos a partir dos clculos de modelagem molecular da srie de derivados da benzofenona (01-16) 65 5.1.2.1. 5.1.2.2. 5.1.2.3. 5.1.2.4. 5.1.2.5. 5.2. Parmetros estereoeletrnicos tericos .......................................... 71 Mapa da densidade LUMO ............................................................. 74 Mapa da densidade HOMO............................................................. 75 Mapa de potencial eletrosttico molecular (MEP) ........................... 77 Distncias interatmicas ................................................................. 79

ESTUDO DE DOCKING DO COMPOSTO MAIS ATIVO (09)...................... 80

5.3. ESTUDO TERICO DO ESPECTRO ELETRNICO DE ABSORO UV DE DERIVADOS DA BENZOFENONA .................................................................. 86 5.3.1. Estudo terico do espectro eletrnico do derivado (01) ......................... 88 Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 01 .........................................................................................................91

5.3.1.1. 5.3.2.

Estudo terico do espectro eletrnico do derivado 13 ........................... 93 Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 13 .........................................................................................................95

5.3.2.1.

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5.3.3.

Estudo do espectro eletrnico terico do derivado 14 ........................... 97 Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 14 .........................................................................................................99

5.3.3.1.

6. CONCLUSES E PERSPECTIVAS................................................................. 102 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................... 104

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1. INTRODUO

1.1.

DESREGULADORES ENDCRINOS

Os desreguladores, disruptores ou interferentes endcrinos so substncias exgenas, que atuam sobre as funes do sistema endcrino, resultando em efeitos adversos no desenvolvimento e nas funes reprodutivas de animais e seres humanos e seus descendentes. Essas alteraes podem ocorrer por diferentes mecanismos, como pelo dano ou alterao de um rgo endcrino; interao com receptores hormonais atuando como agonista ou antagonista; e interferncia na sntese, armazenamento, liberao, transporte, metabolismo e eliminao de hormnios endgenos (COM, 1999; BLAIR et al., 2000; BILA, 2005; BILA & DEZOTTI, 2007; GHISELLI & JARDIM, 2007). Os desreguladores endcrinos podem ser provenientes de diferentes fontes, incluindo pesticidas, substncias qumicas, farmacuticas e fitoqumicas, e a exposio humana pode ser pelo ambiente de trabalho, produtos de consumo (alimentos, cosmticos, saneantes) ou pelo ar, gua e solo, devido a poluentes ambientais (COM, 1999; GOLOUBKOVA; SPRITZER, 2000; SUZUKI et al., 2005; BILA, 2005). Inmeros compostos, com diferentes funes qumicas, podem atuar como desreguladores endcrinos, e por isso, torna-se mais difcil a predio dessa propriedade. So exemplos de xenoestrognios, isto xenobiticos com estrutura no esteride que apresentam atividade similar aos estrognios endcrinos, o organoclorado DDT (1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil) etano), um dos pesticidas mais utilizados em todo o mundo entre os anos de 1950 e 1960, e o Bisfenol A (4,4'dihidrxi-2,2-difenilpropano), monmero de plstico policarbonato, muito utilizado em

plsticos, revestimento de latas de alimentos, complexos dentrios para obturaes e embalagens de remdios (HESS, 2010). O ncleo esteride no essencial para a atividade agonista sobre os receptores de estrognio. O Bisfenol A e o DDT possuem pouca relao estrutural com o estradiol, estrognio humano, porm, so semelhantes ao dietiletilbestrol

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(DES), potente agonista de receptor de estrognio (Figura 1) (COM, 1999; GOLOUBKOVA; SPRITZER, 2000; SODERO, 2007).

Figura 1. Estrutura qumica do DDT, Bisfenol A, DES e Estradiol.

O DES, potente estrognio sinttico, era prescrito para mulheres grvidas, com o intuito de evitar abortos e promover o crescimento fetal. Porm, atua como desregulador endcrino para o feto em desenvolvimento. No perodo intra-uterino, a exposio ao DES pode resultar em anomalias congnitas e na puberdade e fase adulta, reduo na fertilidade, desordem no sistema imunolgico, gravidez anormal ou algum tipo raro de cncer vaginal (COM, 1999; GOLOUBKOVA; SPRITZER, 2000; SUZUKI et al., 2005; BILA, 2005). Outro exemplo de desregulador com atividade estrognica so os alquilfenis, substncias formadas por um grupo fenlico ligado a uma cadeia carbnica. Estes compostos so amplamente utilizados como componentes de detergentes, tintas, herbicidas, agentes humectantes, cosmticos, pesticidas e em muitos outros produtos domsticos e industriais (HESS, 2010). Os ftalatos, estrutura qumica geral ilustrada na Figura 2, possuem aplicao em materiais de construo, mveis, roupas, plsticos PVC e, como solventes, em adesivos, tintas, cosmticos, ceras, inseticidas e produtos farmacuticos e de uso

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pessoal. So amplamente empregados, por isso a contaminao pode ocorrer de diversas formas, como ingesto, inalao, absoro cutnes e at por administrao intravenosa. Podem causar disfunes no trato reprodutivo masculino, resultante em parte de sua atividade anti-andrognica, pelo decrscimo na sntese de testosterona (BOTELHO, 2009; HESS, 2010).

O OR OR' O
Figura 2. Estrutura qumica geral dos ftalatos.

1.1.1. Sistema endcrino

O sistema endcrino participa da regulao de diversas funes corporais. constitudo por diversas glndulas que secretam substncias qumicas,

denominadas de hormnios, que atuam em receptores hormonais desencadeando uma cascata de reaes na clula. So classificados em dois tipos principais segundo sua composio qumica: hormnios esterides e hormnios peptdeos ou proticos (GUYTON; HALL, 2002). Os hormnios esterides so derivados do colesterol e possuem uma estrutura geral, ilustrada na Figura 3, relacionada ao ciclopentaperhidrofenantreno, com 17 tomos de carbono dispostos em um anel de cinco membros (D) e um conjunto de trs anis (A, B e C) (SODERO, 2007).

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Figura 3. Estrutura comum dos hormnios esteroidais, representada pelo composto ciclopentaperhidrofenantreno. A numerao IUPAC (SODERO, 2007).

Os hormnios esterides so lipossolveis e, por isso, atravessam facilmente as membranas plasmticas para o interior das clulas alvo para regular a expresso gnica e a biossntese de protenas, via a formao de complexos esteride-receptor (GUYTON & HALL, 2002; SODERO, 2007). Os hormnios esterides sexuais so responsveis pela estimulao do desenvolvimento sexual e reprodutivo dos seres humanos. Os estrognios e andrognios so exemplos de esterides sexuais (GUYTON & HALL, 2002). Os estrognios so responsveis pelas caractersticas sexuais femininas e a principal funo atuar na proliferao celular e crescimento dos tecidos dos rgos sexuais e de outros tecidos relacionados com a reproduo. Possuem, tambm, efeitos sobre o esqueleto, aumentando a atividade osteoblstica, sobre a deposio protica e de gordura, a distribuio de plos e sobre o equilbrio eletroltico. No plasma feminino esto presentes apenas trs estrognios: estrona, estriol e o 17estradiol. Os andrognios, como testosterona e diidrotestosterona, so hormnios esterides com efeitos masculinizantes. A testosterona alm de atuar no desenvolvimento das caractersticas distintivas do corpo masculino, tambm apresenta efeitos na distribuio de plos no corpo, voz, desenvolvimento de acne, formao de protenas e desenvolvimento muscular, crescimento sseo, hemcias e equilbrio hdrico-eletroltico (GUYTON & HALL, 2002).

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1.1.2. Alterao da homeostase de hormnios esterides sexuais

Os desreguladores endcrinos que alteram o equilbrio de hormnios esterides podem acarretar danos no desenvolvimento sexual e reprodutivo dos seres humanos. Essas alteraes podem ocorrer por diversos mecanismos, conforme Quadro 1 (MORAES et al., 2008).
Quadro 1. Mecanismos de alterao da homeostase de hormnios esterides sexuais .
1

Atividade

Mecanismo de ao Alterao da expresso da protena esteroidognica reguladora aguda (StAR) a Inibio da enzima desmolase b

Inibio da sntese de testosterona Antiandrognica

Interao com receptores esteroidais Aumento do metabolismo da testosterona Induo da converso da testosterona a estrgeno Interao com receptores esteroidais Inibio da converso da testosterona a estrgeno

Antagonista de receptor andrgeno Induo da atividade das monoxigenases microssomais, enzimas hepticas que atuam na depurao de testosterona Induo da atividade da enzima aromatase c, e conseqente aumento dos nveis de estrgeno e diminuio da testosterona Agonista de receptor de estrognio Inibio da expresso da enzima aromatase c, e conseqente diminuio dos nveis de estrgeno e aumento da testosterona

Desreguladores endcrinos (exemplos) Praguicidas como dimetoato, glifosato e lindano Dimetoato, glifosato, 1,1,1-tricloro-2,2-bis (4hidrxi-fenil) etano (metablito do metoxiclor) e cetoconazol Fungicida vinclozolin, o DDT e DDE (principal metablito do DDT)

Anlogos do DDT

Antiandrognica e estrognica Atividade estrognica Antiestrognica e andrognica

1 a

Herbicidas 2-cloro-tiazina, como a propazina, simazina e atrazina

DDT e metoxicloro

Fungicidas fenarimol e procloraz

Adaptado de MORAES et al., 2008. A sntese dos hormnios esteroidais ocorre a partir do colesterol, que inicialmente transportado b para o interior da mitocndria pela protena esteroidognica reguladora aguda (StAR). Em seguida, c o colesterol convertido em pregnenolona, reao catalisada pela desmolase. A converso da testosterona a estrgeno catalisada pela enzima aromatase.

A exposio aos desreguladores endcrinos que atuam como agonistas de receptor de estrognio pode resultar, em mulheres, no desenvolvimento de

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endometriose, cncer de mama e tero e, em homens, em ginecomastia (crescimento das mamas), diminuio da libido, impotncia, diminuio dos nveis de andrgeno no sangue e diminuio da espermatognese. A atividade agonista ocorre pelo encaixe de um ligante no domnio de ligao do ligante (Ligand Binding Domain, LBD) do receptor de estrognio (HESS, 2010).

1.2.

AGONISTAS NATURAIS DE RECEPTOR DE ESTROGNIO

1.2.1. Receptores de estrognio

Os receptores de estrognio (ER, do ingls estrogen receptor) pertencem a famlia dos receptores nucleares de fatores de transcrio e possuem uma organizao estrutural modular, que apresenta quatro domnios de ligao (A/B, C, D, E/F), sendo que o domnio C apresenta a regio de ligao do DNA e o domnio E a seqncia especfica para o domnio de ligao do ligante (PIKE et al., 1999; SODERO, 2007). Os ERs existem em duas formas distintas, denominadas e (ER- e ER-). A Figura 4 ilustra a distribuio dos dois subtipos, ER- e ER-, em tecidos de ratos machos e fmeas. A expresso das duas formas variada nos tecidos. Os ovrios, por exemplo, expressam aproximadamente a mesma quantidade de ER- e ER-. O tero e os testculos expressam mais ER-, enquanto que prstata e bexiga apresentam maior expresso do ER-. Os rins e o fgado expressam apenas ER-, enquanto que pulmo e crebro expressam apenas ER- (PIKE et al, 1999; KATZENELLENBOGEN, 2000; SODERO, 2007).

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Figura 4. Diagrama esquemtico ilustrativo da distribuio de ER- e ER- no tecido de ratos machos e fmeas (FITOESTROGNIOS, 2010).

A Figura 5 apresenta a comparao dos dois subtipos ( e ). As duas formas apresentam uma modesta similaridade na seqncia global (47%). Para o LBD (domnio E) h uma divergncia considervel (55%), no entanto no domnio de ligao do DNA (domnio C) so praticamente idnticos (97%) (PIKE et al, 1999; KATZENELLENBOGEN, 2000; SODERO, 2007).

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Figura 5. Comparao entre as seqncias de aminocidos dos receptores de estrognio e (SODERO, 2007). Entre parnteses esto indicados o percentual de identidade entre as seqncias dos domnios A/B, C, D, E e F.

No LBD (domnio E), a ligao ocorre majoritariamente na regio C-terminal e diferentes ligantes podem ser reconhecidos, mesmo com grandes diferenas nas estruturas e massas moleculares, conformaes e propriedades fsico-qumicas (SODERO, 2007).

1.2.2. Estrognios naturais

Os estrognios endgenos ou naturais (17-estradiol, estrona e estriol; Figura 6) so hormnios esteroidais, sendo o estradiol o principal e mais potente estrognio secretado pelos ovrios (GUYTON & HALL, 2002).

Figura 6. Estruturas qumicas dos estrognios endgenos: 17-estradiol, estrona e estriol.

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O estradiol interage no stio do LBD (domnio E), uma cavidade predominantemente hidrofbica, via um conjunto de interaes, responsveis pelo reconhecimento do estradiol em afinidade subnanomolar em relao a uma grande variedade de esterides endgenos. A Figura 7 ilustra a estrutura tridimensional do LBD do ER- complexado ao 17-estradiol obtida por difrao de raios-X (cdigo PDB: 1ERE).

Figura 7. Representao da estrutura tridimensional do LBD do ER- complexado ao 17-estradiol obtida por difrao de raios-X (cdigo PDB: 1ERE): (A) principais estruturas secundrias ao redor do ligante; (B) interaes por ligao hidrognio do ligante com o LBD (SODERO, 2007).

A interao da hidroxila fenlica do anel A por ligao hidrognio com os resduos Glu353 e Arg394 e uma molcula de gua e responsvel pela alta afinidade de ligao aos receptores de estrognio. A hidroxila 17 do anel D tambm interage por ligao hidrognio com o resduo His524. Em complementaridade com as interaes por ligao hidrognio, o carter apolar do estradiol fornece as interaes com as regies hidrofbicas do receptor (SODERO, 2007).

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1.3.

FOTOFSICA E FOTOQUMICA MOLECULAR

O entendimento das propriedades fotofsicas e fotoqumicas de um composto relacionado interao da luz com a matria e ao espectro eletrnico de absoro e o espectro de emisso de uma molcula (PAULA, 2003). A partir do conhecimento dos processos de absoro e de emisso, um completo diagrama de estados pode ser deduzido e a dinmica dos inmeros processos que resultam a partir desses estados, fotoqumicos e/ou fotofsicos, pode, ento, ser compreendida (PAULA, 2003). As molculas apresentam transies nos estados rotacionais, vibracionais e eletrnicos. A Figura 8 apresenta o espectro eletromagntico e os tipos de transies.

Figura 8. Espectro eletromagntico e os tipos de transies (KLN & WIRZ, 2009)

As transies eletrnicas situam-se nas regies visvel e ultravioleta (UV) do espectro eletromagntico e formam o espectro eletrnico de absoro e o espectro de emisso de uma molcula. Determinados comprimentos de onda, na faixa da radiao UV e visvel, correspondem a energias capazes de promoverem a excitao eletrnica, isto , a transio eletrnica de um estado de menor energia para um maior nvel de energia. A excitao eletrnica ocorre devido absoro de ftons com energia suficiente para transferir eltrons situados no orbital HOMO (orbital molecular ocupado de maior energia) para o orbital LUMO (orbital molecular desocupado de

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menor energia). Ao retornarem ao estado inicial, o excesso de energia liberado. As transies eletrnicas que esto envolvidas no processo de absoro da luz UV envolvem a diferena de energia entre HOMO e LUMO. Observa-se que como o comprimento de onda inversamente proporcional energia, assim, a diminuio na diferena de energia HOMO-LUMO leva a um aumento no comprimento de onda de absoro (FLOR, DAVOLOS & CORREA, 2006). Geralmente, quando a excitao ocorre, o eltron promovido de HOMO para o orbital LUMO, embora as transies possam ocorrer de orbitais de menor energia que HOMO, como HOMO-1 ou HOMO-2, para orbitais de maior energia que LUMO, como LUMO+1. As transies eletrnicas que ocorrem durante o processo de absoro de luz so de diferentes naturezas e determinadas pela estrutura molecular responsvel pela absoro dessa energia em uma determinada faixa da radiao, denominada de cromforo. Qualquer alterao na estrutura do cromforo pode influenciar significantemente no comprimento de onda absorvido (FORESTIER, 2008). A Tabela 1 apresenta as transies que os cromforos envolvem.
Tabela 1. Caractersticas tpicas de alguns cromforos (PAULA, 2003).

Transies Comprimento de onda (nm) mx (dm.mol-1.cm-1) * n * * * n * n * n * n * * <180 <250 180 220 280 350 660 350 220 1000 1000 2000 20 100 200 30 20000

Cromforo C-C e C-H O-H, N-H e C-O-C C=C C=C-C=C C=O N=N N=O C=C-C=O C=C-C=O

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A Figura 9 uma representao esquemtica dos tipos de transies eletrnicas existentes.

Figura 9. Representao esquemtica dos tipos de transies eletrnicas.

A emisso de energia ocorre do nvel eletrnico excitado de mais baixa energia (Regra de Kasha); observa-se ento durante as transies processos de relaxamento vibracional: converso interna (IC, do ingls Internal Conversion) entre spins de mesma multiplicidade (singleto (S2) singleto (S1), tripleto (T2) tripleto (T1)) ou converso intersistemas (ISC, do ingls Intersystem Crossing) entre spins de diferentes multiplicidades (singleto tripleto). O diagrama de Jablnski (Figura 10) compreende os eventos que podem acontecer quando a radiao interage com a matria e possibilita um entendimento melhor dos processos de absoro e emisso de energia.

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Figura 10. Diagrama de Jablnski: Os processos fotofsicos so representados por (1) absoro de luz, (2) converso interna (IC), (3) fluorescncia, (4) cruzamento entre sistemas (ISC) e (5) fosforescncia (PAULA, 2003).

As transies eletrnicas entre estados so indicadas por linhas verticais. A absoro de energia promove a excitao eletrnica (1) da molcula para um estado eletrnico superior (S2) e a tendncia o relaxamento vibracional por converso interna (IC) at o primeiro estado singleto excitado (S1). A partir do primeiro estado singleto excitado, a molcula poder fluorescer (3) ou desativar-se por converso interna (2). Ainda possvel, a partir da, obter-se uma populao de um estado tripleto, atravs do cruzamento entre sistemas (ISC), processo de desativao vibracional que envolve a mudana de multiplicidade do spin eletrnico. A partir do estado tripleto (T2), a espcie excitada perde vibracionalmente parte do excesso de energia por converso interna, at atingir o estado T1. A partir desse estado, a molcula excitada pode desativar-se para o estado fundamental por dois caminhos: cruzamento entre sistemas (4) e fosforescncia (5) (PAULA, 2003).

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1.4.

BENZOFENONAS

As benzofenonas (BFs) so cetonas aromticas, naturais ou sintticas, de grande interesse cientfico e com inmeras aplicaes devido variedade de suas propriedades biolgicas e fsico-qumicas. So formadas por dois anis aromticos ligados por um grupo carbonila (Figura 11), podendo apresentar diferentes substituintes que alteram as caractersticas estereoeletrnicas e, com isso, suas propriedades (MANTAS, BLANCO & FERRETI, 2004).

Figura 11. Estrutura qumica da benzofenona.

As BFs possuem a habilidade de absorver e dissipar a radiao UV e, por isso, so muito utilizadas como filtros UV na indstria farmacutica, alimentcia e cosmtica (COX, DIMITRIOS & KELLY, 2008). Os filtros UV, tambm denominados de filtros solares, possuem a capacidade de absorver e/ou refletir e dissipar os raios UV protegendo a pele contra os riscos associados com a exposio cumulativa ou excessiva ao sol. Dependendo da sua estrutura qumica, so classificados com filtros orgnicos e inorgnicos (LOWE, 2006; FORESTIER, 2008). Os filtros orgnicos so capazes de absorver a radiao UV, na faixa do UVA (320 a 400 nm), do UVB (280 a 320 nm) ou em ambas as faixas, denominados de filtros de amplo espectro (UVA e UVB) (LAUTENSCHLAGER et al., 2007; FORESTIER, 2008). As benzofenonas se enquadram na classe dos filtros orgnicos de amplo espectro. A benzofenona-3 (Figura 12), atualmente muito utilizada, foi um dos primeiros filtros UV, de amplo espectro, empregado em formulaes fotoprotetoras (SUZUKI et al., 2005; MOLINA-MOLINA et al., 2008).

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OH

CH3

Figura 12. Estrutura qumica da benzofenona-3.

Esto includas na lista vigente de filtros ultravioleta permitidos para produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes, da Resoluo da Diretoria Colegiada (RDC) n 47 de 16 de maro de 2006: benzofenona-3 (BF-3; 2-Hidrxi-4metoxibenzofenona; oxibenzona); benzofenona-8 (BF-8; 2,2-Dihidrxi-4-

metoxibenzofenona); benzofenona-4 (BF-4; cido 2-hidrxi-4-metxi-5-sulfnico; sulisobenzona) e seu sal sdico, benzofenona-5 (BZF-5; sulisobenzona sdica); e 2(4-dietilamino-2-hidrxibenzoil)-benzoato de hexila (DHHB). Os filtros UV tambm possuem aplicao na proteo de produtos contra a degradao frente radiao UV. A 2,4-Dihidroxibenzofenona, 2,2,4,4tetrahidroxibenzofenona e 2,4,4-Trihidroxibenzofenonas so empregadas, com esta finalidade, em produtos cosmticos e em embalagens plsticas de alimentos. (SUZUKI et al., 2005; MOLINA-MOLINA et al., 2008). Diversas publicaes apontam a presena sistmica de benzofenonas aps aplicao cutnea ou ingesto de alimentos que mantiveram em contato direto com plsticos cuja composio apresenta benzofenonas. A benzofenona-3 o principal alvo desses estudos, devido sua elevada aplicao em formulaes fotoprotetoras. Diversas publicaes evidenciam a absoro, bioacumulao, metabolizao e excreo da benzofenona-3 (GONZALEZ, FARBROT & LARK, 2002; JANJUA et al., 2004; SCHLUMPF et al., 2004; SUZUKI et al., 2005; KAWAMURA et al., 2005; GONZALEZ et al., 2006; KUNZ & KENT, 2006; JEON et al., 2008; MOLINA-MOLINA et al., 2008).

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1.4.1. Mecanismo de absoro da radiao UV

As benzofenonas possuem o grupo carbonila (funo cetona) ligado a dois anis aromticos e apresentam transies * e n * (Figura 13), que resultam em dois picos na faixa do UV, geralmente um na faixa do UVA e outro na faixa do UVB, por isso so classificadas como filtros de amplo espectro.

Figura 13. Tipos de transies eletrnicas presentes na excitao fotoqumica das benzofenonas (S 0 estado fundamental, S1 primeiro estado excitado singleto, S2 segundo estado excitado singleto)

A Figura 14 apresenta o processo de emisso de energia da benzofenona. Nas benzofenonas, as molculas excitadas exibem ISC, por isso emitem energia na forma de fluorescncia e fosforescncia. Quando a emisso ocorre do estado singleto (S1) possvel observar o efeito de fluorescncia. Quando a emisso ocorre do estado excitado tripleto (T1) observa-se fosforescncia. A maioria das molculas excitada em singleto (S1) convertida em tripleto (T1).

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Figura 14. Processo de emisso de energia da benzofenona (Adaptado de BARTON et al., 2010)

1.4.2. Desregulao endcrina por derivados da benzofenona

Estudo realizado por Janjua e colaboradores (2004) e conduzido em 32 voluntrios, apontou a presena sistmica, em uma concentrao plasmtica de 200 ng/mL, e deteco na urina, aps a aplicao tpica (corpo inteiro) de uma formulao contendo 10% do filtro BF-3. Outras publicaes corroboram os resultados de Janjua e colaboradores (2004). A absoro percutnea de BF-3 foi avaliada em dois trabalhos de Gonzalez e colaboradores. No primeiro de 2002, 11 voluntrios fizeram a aplicao tpica de um protetor solar comercial, com concentrao conhecida de BF-3. Amostras de urina foram coletadas em um perodo de 48h aps a aplicao de cada um. Na urina, foi encontrada aproximadamente 0,4% da concentrao total de BF-3 aplicada na pele. No segundo de 2006 avaliou-se, tambm na urina, a concentrao de BF-3 excretada. Neste estudo, 25 voluntrios aplicaram topicamente uma formulao contendo 4% de BF-3 repetidas vezes (manh e noite, durante 5 dias). Os

voluntrios excretaram em mdia 3,7% da BF-3 total aplicada. Com este estudo tambm pode ser observado a bioacumulao de BF-3, porque depois de 5 dias da

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ltima aplicao tpica do protetor solar, os voluntrios ainda excretavam a BF-3 (GONZALEZ, FARBROT & LARK, 2002; GONZALEZ et al., 2006). Jeon e colaboradores (2008) observaram que aps a administrao oral de BF-3, em ratos, esta era convertida em 2,4-Dihidroxibenzofenona, 2,3,4Trihidroxibenzofenona e 2,2-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona (BF-8) e propuseram uma rota para esse processo (Figura 15).

Figura 15. Rota de metabolizao em ratos proposta para a benzofenona-3 (1. Formao dos produtos intermedirios: (2) 2,2-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona, (3) 2,4-Dihidroxibenzofenona e (4) 2,3,4-Trihidroxibenzofenona (JEON et al., 2008).

Do ponto de vista toxicolgico, diversos estudos avaliam a atividade das benzofenonas como desreguladores endcrinos. O foco principal para os estudos de desregulao endcrina relacionado ao estmulo aos receptores de estrognio (MOLINA-MOLINA et al., 2008). A atividade estrognica das benzofenonas identificada por uma srie de estudos in vitro, como ensaios de gene reprter com vrias linhagens de clulas, ensaios de ligao em receptores de estrognio humano (hER) e receptor de estrognio de peixes, e estudos in vivo, em ratos (SCHLUMPF et al., 2004; KAWAMURA et al., 2005; SUZUKI et al., 2005; KUNZ & KENT, 2006; MOLINAMOLINA et al., 2008; ). A aplicao tpica de 2mg/cm de um protetor solar contendo 10% de BF-3 no interferiu nos nveis endgenos de hormnios reprodutivos. Porm, o estudo foi realizado com 32 mulheres, voluntrias, sendo 15 com idade mdia de 26 anos e 17

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estavam no perodo ps-menopausa, com idade mdia de 65 anos. No entanto, crianas em pr-puberdade so consideradas mais sensveis devido ao baixo nvel endgeno de hormnios reprodutivos. Crianas apresentam o sistema de eliminao de substncias exgenas, menos desenvolvido e, alm disso, possuem maior superfcie corprea em relao ao peso, quando comparadas a adultos. Esses fatores podem conduzir a uma maior concentrao plasmtica da BF-3 e tambm maior bioacumulao (JANJUA et al., 2004) Alm da atividade estrognica, estudos apontam que algumas benzofenonas tambm podem apresentar atividade antiandrognica. Ambas as atividades podem ser observadas em benzofenonas hidroxiladas nas posies 2 e 4 (KAWAMURA et al., 2005; SUZUKI et al., 2005).

1.5.

MODELAGEM MOLECULAR

A modelagem molecular uma ferramenta de predio do comportamento de sistemas moleculares, por investigao de parmetros geomtricos e eletrnicos. Emprega-se um conjunto de ferramentas para a construo, edio e visualizao, anlise e armazenamento de sistemas moleculares e est associada a tcnicas computacionais, que possibilitam o clculo de sistemas mais complexos e, tambm, a representao tridimensional dos sistemas analisados (LEACH, 2001;

RODRIGUES, 2001; SANTOS, 2001; ARROIO; HONRIO; SILVA, 2010). A modelagem molecular pode ser aplicada em estratgias diretas e indiretas. Na abordagem direta, utiliza-se a estrutura do receptor conhecida, por exemplo, atravs de dados de difrao de raios-X ou de ressonncia magntica nuclear (RMN). Na abordagem indireta faz-se uma anlise comparativa das estruturas e atividades em nvel de um determinado receptor (BARREIRO et al., 1997). Para determinada estratgia de modelagem utiliza-se a qumica

computacional que engloba a mecnica molecular e mecnica quntica (LEACH, 2001).

41

1.5.1. Mecnica molecular

Mtodos de mecnica molecular (MM), tambm conhecidos como mtodos de campo de foras, calculam a energia do sistema em funo das posies nucleares. Considerando a aproximao de Born-Oppenheimer, em que os movimentos dos ncleos e dos eltrons podem ser tratados separadamente. A MM caracterizada por considerar os movimentos nucleares e no tratar os movimentos eletrnicos explicitamente, pois assume que os eltrons se movimentam rapidamente e se adaptam a posio dos ncleos, por isso, a MM no pode fornecer propriedades que dependem da distribuio eletrnica da molcula (LEACH, 2001; RODRIGUES, 2001). Na MM, a energia da molcula descrita pela superfcie de energia potencial em termos das posies nucleares. O clculo da superfcie de energia potencial, em funo de coordenadas geomtricas, usando um determinado campo de foras (COELHO et al., 1999; LEACH, 2001; RODRIGUES, 2001; CARVALHO et al., 2003). O modelo de mecnica molecular representa as molculas como de esferas (tomos) interligadas por molas (ligaes qumicas), isto , que os tomos so ligados por foras potenciais harmnicas. Essas foras ou interaes so descritas por funes de energia potencial parametrizadas no campo de foras. As funes de energia potencial so calculadas independentemente e somadas para obter a energia total da molcula (COELHO et al., 1999; LEACH, 2001; RODRIGUES, 2001; CARVALHO et al., 2003). Os campos de fora possibilitam calcular a energia relacionada com determinada conformao de uma molcula, e para isso se baseiam em parmetros referentes a interaes ligantes, como comprimento e ngulo de ligaes e ngulos de torso (diedros), e interaes no-ligantes, como elestrostticas e de van der Waals. Os clculos utilizam uma srie de equaes derivadas empiricamente para a superfcie de energia potencial, cujo formalismo matemtico est baseado num modelo de mecnica clssica de estrutura molecular (LEACH, 2001;

RODRIGUES,2001; CARVALHO et al., 2003). Um campo de foras adequado a uma investigao em particular deve ser cuidadosamente selecionado. Dentre os campos de foras comumente presentes em programas de modelagem computacional, o MMFF (Merck Molecular Force

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Field) um desenvolvido pela empresa farmacutica Merck e direcionado para estudos de sistemas orgnicos e biopolmeros. A parametrizao do MMFF94 foi baseada em dados experimentais e em clculos qunticos acurados. Este campo de foras capaz de gerar informaes quantitativas sobre conformaes e geometrias moleculares (HEHRE, 2003; HALGREN, 1996).

1.5.2. Mecnica quntica

Em 1926, a mecnica quntica teve seu incio marcado pelo fsico austraco Erwin Schrdinger (1887-1961), com a publicao de uma equao que determina a funo de onda quntica de um sistema. A equao de onda, ou equao de Schrdinger, considera a natureza ondulatria dos eltrons no clculo da energia total do sistema (LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES & BOTTI, 2010). Cada funo de onda, representada pela letra grega psi ( corresponde a

um estado diferente para o eltron. E, para cada estado h uma energia e uma posio particular, que pode ser calculada pela equao de onda. A funo de onda ao quadrado ( indica a densidade de probabilidade de um eltron, isto , a

probabilidade de se encontrar um eltron em uma localizao ( r) especfica no espao (LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES; BOTTI, 2010). Os mtodos de mecnica quntica descrevem as molculas em termos de interaes entre o ncleo e os eltrons, e o ponto de partida para o estudo desses mtodos a equao de Schrdinger, que no caso do tomo de Hidrognio (tomo com um eltron), pode ser resolvida exatamente (Eq. 1) (HEHRE, 2003).

Equao

A primeira contribuio, entre colchetes, descreve a energia potencial e cintica de um eltron a uma distncia r do ncleo de carga Z. E a energia eletrnica e a funo de onda que descreve os movimentos eletrnicos to

plenamente quanto possvel, em funo das coordenada eletrnica ( r) (LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES; BOTTI, 2010).

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Em um sistema multieletrnico e multinuclear, o nmero de termos aumenta e a funo de onda fica com mais variveis, com isso a dificuldade de se resolver a equao cresce exponencialmente. A Equao 2 apresenta uma forma simplificada da equao de Schrdinger para um sistema de muitos tomos (LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES; BOTTI, 2010).

Equao 2

Onde,

o operador Hamiltoniano, que representa a energia potencial e , as unidades atmicas so

cintica dos eltrons a uma distncia r do ncleo. No

dadas em funo da carga e massa nuclear, da massa dos eltrons e da distncia entre o ncleo e os eltrons (LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES; BOTTI, 2010). A equao de Schrdinger tem uma soluo exata em poucos casos, como exemplo, para o tomo de hidrognio. Na maioria dos casos, como em sistemas multieletrnicos e mutinucleares, a soluo da equao correspondente torna-se to complexa e demorada, que, durante anos, fsicos e qumicos buscaram aproximaes para resolver o problema de muitos corpos. Uma aproximao utilizada, conhecida como aproximao de Born-Oppenheimer, assume a

disparidade entre a massa e o movimento dos ncleos e eltrons, para tratar os ncleos como partculas fixas e bem localizadas. Os ncleos possuem movimentos lentos quando comparados velocidade dos eltrons. Com isso, para cada arranjo nuclear, r, fixado, tem-se uma densidade ou nuvem eletrnica associada. O arranjo nuclear determinado pela geometria de equilbrio, isto , uma distncia internuclear de equilbrio (TOSTES, 1998; LEACH, 2001; HEHRE, 2003; MARQUES & BOTTI, 2010). Dois mtodos principais, ab initio e semi-empricos, fornecem parmetros qunticos e possuem aplicao em qumica computacional. Permitem a definio de um grande nmero de propriedades atmicas e moleculares, caracterizando propriedades relacionadas reatividade, forma e modo de ligao de fragmentos e substituintes moleculares. Atravs desses mtodos, uma srie de descritores moleculares obtida, possibilitando a identificao de muitas propriedades

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geomtricas e eletrnicas das molculas e suas interaes (ARROIO, HONRIO & SILVA, 2010). Os mtodos ab initio representam um tratamento terico mais rigoroso e fornecem informaes relativamente mais precisas sobre o comportamento eletrnico, porm exigem um custo computacional maior em comparao aos mtodos semi-empricos (ARROIO, HONRIO & SILVA, 2010). Os mtodos semi-empricos so baseados no formalismo dos mtodos ab initio, no entanto, possuem simplificao dos clculos, pois utilizam parmetros obtidos de dados experimentais. Com isso, consegue-se uma reduo dos custos de memria e tempo computacional e elevao na velocidade de processamento dos clculos (MORGON & COUTINHO, 2007). Com o objetivo de se obter aproximaes mais precisas, os mtodos AM1 (Austin Model 1 ou Modelo Austin 1) e PM3 (Parametric Method 3 ou Mtodo Paramtrico 3) foram desenvolvidos. Ambos os mtodos incorporam aproximaes muito semelhantes, mas diferem nas suas parametrizaes. O aprimoramento da parametrizao resultou no modelo PM5 (Parametric Method 5 ou Mtodo Paramtrico 5), que possui cerca de 40% de reduo nos erros mdios comparados aos outros mtodos semi-empricos (ROCHA et al., 2006). Recentemente, o mtodo AM1 foi objeto de uma reparametrizao para os tomos de H, C, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, resultando no mtodo RM1 (Recife Model 1). Para entalpia de formao, momento de dipolo, potencial de ionizao e distncia interatmica, os erros mdios foram menores do que os gerados pelos mtodos AM1, PM3 e PM5 nas 1736 molculas estudadas. Apenas o ngulo de ligao calculado por RM1 obteve resultados com erro mdio levemente maior do que o obtido por AM1, mas, ainda, inferior ao erro mdio nos valores obtidos por PM3 e PM5 (Figura 16) (ROCHA et al., 2006).

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Figura 16. Erros mdios da entalpia de formao, momento de dipolo, potencial de ionizao e distncia interatmica, os erros mdios. Comparao entre os mtodos RM1, AM1, PM3 e PM5 (ROCHA et al., 2006).

Segundo Gonalves e col. (2010) uma anlise conformacional realizada pelo mtodo RM1 apresenta maior acurcia quando comparada a outros mtodos semiempricos, como AM1 e PM3, alm de exigir menor tempo de clculo quando comparado como a Teoria do Funcional da Densidade (DFT, do ingls Density Functional Theory).

1.5.3. Teoria do Funcional da Densidade (DFT)

Em 1964, o norte americano de origem austraca Walter Kohn e seu aluno francs Pierre Hohenberg publicaram um artigo com dois teoremas que reformulavam a mecnica quntica, baseando-se na densidade eletrnica ao invs das funes de onda. Os teoremas determinavam que todas as grandezas fsicas medidas em um sistema so unicamente determinadas pela densidade eletrnica,

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isto , so funcionais de densidade. Porm, Hohenberg e Kohn apenas provavam que os funcionais existiam, mas no os determinavam na prtica para um sistema real. No ano seguinte, outro artigo foi publicado por Kohn, agora com Lu Sham, trazendo a soluo exata para se encontrar os funcionais e tambm a aproximao da densidade local (LDA, do ingls Local Density Approximation), que baseada na densidade eletrnica, em que os ncleos so substitudos por uma carga positiva contnua e constante (MARQUES & BOTTI, 2010). A teoria de Thomas-Ferni, desenvolvida no final de 1920, continha alguns desses elementos presentes na Teoria do Funcional da Densidade, porm foram esses dois artigos de Kohn que legitimaram os seus fundamentos (MORGON; COUTINHO, 2007; MARQUES & BOTTI, 2010). Alm dos desenvolvimentos tericos, pode ser observado, nas ltimas dcadas, um grande avano no desenvolvimento computacional. Com isso, atualmente possvel clculos cada vez mais sofisticados de sistemas cada vez maiores (MARQUES & BOTTI, 2010). Desta forma, o mtodo DFT tornou-se importante para o estudo das propriedades estruturais e eletrnicas das molculas, pois apresenta resultados com preciso qumica aceitvel e boa correlao com resultados experimentais. Utiliza a densidade eletrnica como varivel necessria para o clculo das propriedades eletrnicas, diferente da Teoria de Hartree-Fock (HF), que utiliza a funo de onda de N eltron, em que N representa o nmero de eltrons de uma molcula (MORGON & COUTINHO, 2007). Para o estudo de molculas em estados excitados, como o caso dos estudos em que so descritas transies eletrnicas, so utilizados recursos adicionais, como a Teoria do Funcional da Densidade Dependente do Tempo (TDDFT, do ingls Time Dependent Density Functional Theory). A TD-DFT se baseia em princpios da mecnica quntica dependente do tempo utilizando funcionais da densidade. Devido ao sucesso de aplicao da DFT em estados estacionrios, a descrio de estados dependentes do tempo (excitados) em termos do funcional da densidade tem sido realizada e a fotoabsoro de tomos tm sido tratada com sucesso nessa abordagem (DAMASCENO, 2009). O clculo das intensidades de absoro feito considerando-se as probabilidades de absoro entre os estados de energia envolvidos na transio.

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Robert Sanderson Mlliken, um dos pioneiros no trabalho da teoria da Orbital molecular, relacionou a quantidade de absoro com uma medida de intensidade, qual denominou fora de oscilador (PAULA, 2003).

1.5.4. Anlise conformacional

A estrutura tridimensional ou conformacional de uma molcula est intimamente relacionada com as suas propriedades fsico-qumicas e biolgicas. A anlise conformacional o estudo dos diferentes arranjos espaciais em busca de uma conformao mais estvel, a que determina o comportamento estereoeletrnico de uma molcula (LEACH, 2001; RODRIGUES, 2003). A conformao de uma molcula definida pelo arranjo rotacional dos ngulos de torso ou diedros e o equilbrio conformacional determinado por interaes estricas, relacionadas com a proximidade dos tomos; eletrnicas, provenientes de interaes entre os orbitais; e eletrostticas, resultante da interao entre dipolos e/ou ons de cargas opostas (DOMINGUES, 2007; LEACH, 2001; RODRIGUES, 2003). A anlise conformacional pode ser realizada por diferentes estratgias, como: busca sistemtica; busca randmica (aleatria); simulao por dinmica molecular ou Monte Carlo; construo da conformao molecular a partir de fragmentos moleculares, com estruturas tridimensionais previamente conhecidas; e

sobreposio molecular (VERDI, 2010). A busca sistemtica realizada pela identificao de todas as ligaes rotveis (graus de liberdade ou diedros livres) e utilizao de um incremento prdeterminado (geralmente 30), para a rotao desses diedros, de 0 a 360. Cada conformao assim obtida submetida uma minimizao de energia para a obteno do calor de formao. O nmero de confrmeros a serem obtidos cresce exponencialmente de acordo com o nmero de graus de liberdade a serem analisados (VERDI, 2010).

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1.5.5. Descritores moleculares

Descritores moleculares so o resultado de um procedimento lgico e matemtico que transforma informaes qumicas em uma importante ferramenta de predio das propriedades moleculares, fornecendo subsdios sobre a natureza fsico-qumica da atividade em estudo. Os descritores traduzem propriedades estereoeletrnicas que possibilitam o estudo de relao estrutura-atividade de uma srie de compostos (ARROIO; HONRIO; SILVA, 2010).

1.5.5.1.

Energia dos orbitais moleculares

A energia dos orbitais de fronteira, que envolvem o orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO, do ingls Highest Occupied Molecular Orbital) e o orbital molecular desocupado de menor energia (LUMO, do ingls Lowest Unoccupied Molecular Orbital) so descritores qumico-qunticos bastante utilizados que desempenham um papel importante nas reaes qumicas e na formao de diversos complexos de transferncia de cargas (SANTANNA, 2002). A energia de LUMO mede o carter eltron-aceptor e est relacionada afinidade eletrnica de uma molcula e sua reatividade como eletrfilo. A energia de HOMO mede o carter eltron-doador e est relacionada ao potencial de ionizao de uma molcula e a sua reatividade como nuclefilo (ARROIO, HONRIO & SILVA, 2010). A estabilidade molecular pode ser indicada pelo gap HOMO-LUMO, que representa a diferena entre as energias desses orbitais. Alto valor de gap indica alta estabilidade da molcula, no sentido de baixa reatividade nas reaes qumicas, enquanto molculas com baixo valor de gap so geralmente mais reativas (ZHANG & MUSGRAVE, 2007).

49

1.5.5.2.

Densidades de HOMO e LUMO

A densidade eletrnica dos orbitais de fronteira fornece uma caracterizao detalhada das interaes doador-aceptor. A maioria das reaes qumicas ocorre no local de maior densidade nos orbitais de fronteira, que so definidos de acordo com o tipo de reao: a densidade de HOMO representa reas suscetveis a ataques eletroflicos, enquanto a densidade de LUMO representa as reas mais suscetveis a ataques nucleoflicos (GRANT & RICHARDS, 1996).

1.5.5.3.

Coeficientes de HOMO e LUMO

Os coeficientes de HOMO e LUMO representam a contribuio do potencial de cada orbital atmico no orbital molecular. Aqueles orbitais atmicos que contribuem mais tero maiores coeficientes nos orbitais moleculares. Um maior valor de coeficiente no LUMO est de certa forma relacionando a uma maior deficincia eletrnica nas vizinhanas do tomo em questo. Um maior valor de coeficiente no HOMO est de certa forma relacionando a uma maior densidade eletrnica nas vizinhanas do tomo em questo (BRAIBANTE & BRAIBANTE, 2010).

1.5.5.4.

Momento de dipolo molecular

Esta propriedade importante, pois a interao-frmaco receptor dada tambm em funo da complementaridade de cargas. O momento dipolo fornece a polaridade global da molcula. uma propriedade que mede a deslocalizao de carga quando tomos de eletronegatividade diferentes esto interligados. A direo do momento dipolar de uma molcula baseada nas eletronegatividades relativas dos tomos desta

50

molcula e o valor obtido pelo vetor resultante dos momentos de dipolo de cada ligao presente na molcula (ARROIO; HONRIO & SILVA, 2010).

1.5.5.5.

Mapa do Potencial Eletrosttico molecular

O mapa do potencial eletrosttico molecular (MEP, de molecular electrostatic potential) calculado em uma grade de pontos localizados em diferentes camadas em torno da molcula. Essas camadas so construdas como uma sobreposio de esferas de van der Waals em cada tomo (RAMACHANDRAN; DEEPA; NAMBOORI, 2008). O MEP pode ser utilizada com o intuito de compreender a contribuio eletrosttica de uma srie de derivados para a atividade. As superfcies tridimensionais dos MEPs so geradas aps a sobreposio na molcula de uma partcula carregada positivamente que percorre a superfcie de contato de van der Waals e ao revelar uma regio de repulso, representa o potencial positivo, de colorao azul, e uma regio de atrao representa o potencial negativo de colorao vermelha.

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2. JUSTIFICATIVA

As benzofenonas, por absorverem radiao UV, so empregadas como protetor solar e em embalagens de alimentos para prevenir a degradao ou mudana de qualidade dos mesmos. Porm, diversos estudos realizados, in vivo e in vitro, indicam a atividade estrognica para diversos compostos dessa classe (BLAIR et al., 2000; JANJUA et al., 2004; SUZUKI et al., 2005; MOLINA-MOLINA et al., 2008). A benzofenona-3 alvo principal desses estudos por ser muito utilizada na proteo solar e por apresentar permeao cutnea, podendo ser identificada no sangue e urina pouco tempo depois de sua aplicao tpica, alm de produzir metablitos que podem apresentar atividade estrognica. Acredita-se que este trabalho possa gerar informaes estruturais e eletrnicas importantes sobre os derivados da benzofenona para o desenvolvimento de novos compostos que possam ser utilizados como filtros UV, mas que no apresentem atividade estrognica, portanto, eficazes e mais seguros.

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3. OBJETIVOS

3.1.

OBJETIVO GERAL

Aplicar tcnicas de modelagem molecular em uma srie de derivados da benzofenona visando gerar informaes importantes para o desenho racional de compostos com atividade fotoprotetora, mas que no apresentem atividade estrognica evidenciada em muitos desses compostos. Avaliar fatores que contribuem com a atividade estrognica indesejvel e obter uma metodologia robusta para avaliar a faixa de absoro de novos composto.

3.2.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Realizar estudos tericos atravs de mtodos rpidos e precisos para a obteno de parmetros estruturais e eletrnicos que possam ser correlacionados com a atividade estrognica de uma srie de derivados da benzofenona. Realizar um estudo de docking com o derivado mais ativo no receptor de estrognio, visando observar os principais stios de interao ligante-receptor. Empregar a Teoria do Funcional da Densidade Dependente do Tempo (TDDFT) no estudo terico do espectro eletrnico de absoro e das transies eletrnicas de derivados da benzofenona. Comparar os resultados tericos com dados experimentais do espectro UV em diferentes solventes e avaliar a capacidade de predio do espectro eletrnico de derivados da benzofenona.

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4. METODOLOGIA

4.1.

DADOS BIOLGICOS: SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA

Suzuki e colaboradores (2005) avaliaram a atividade estrognica de uma srie de derivados da benzofenona, utilizados como estabilizadores e filtros UV. A srie apresenta 16 compostos, incluindo a benzofenona (composto 01), que foram utilizados para o estudo de SAR. A Tabela 2 descreve a estrutura qumica dos 16 compostos e suas respectivas atividades, as quais so definidas pelos valores de pEC 50. Os valores de pEC50 correspondem a log EC50 (M). Para a determinao do EC50, Suzuki e colaboradores (2005) utilizaram o ensaio reprter in vitro de ERE-luc com MCF-7. Este ensaio avalia a proliferao de clulas cancergenas mamrias humanas, isto , clulas de linhagem celular MCF-7, em resposta a exposio a substncias estrognicas cuja atividade avaliada pela enzima luciferase (BILA, 2005). O valor de EC50 representa a dose mnima capaz de estimular 50% da proliferao de clulas MCF-7. A Figura 17 apresenta a distribuio dos compostos em relao atividade estrognica, em que se verifica que os valores de pEC50 variam de 1,00 a -2,00, ou seja, uma faixa de trs unidades logartmicas.

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Tabela 2. Estrutura qumica e valores de pEC50 (SUZUKI et al., 2005) da srie de 16 derivados da benzofenona

# 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Benzofenona

Nome

X2 H OH H H OH OH H OH OH OH OH OH OH OH OH OH

X3 H H OH H H H H OH H H OH H H H H H

X4 H H H OH H OH OH OH OH OH OH OH CH3O CH3O CH3O CH3O

X5 H H H H H H H H H H H H H H H SO3H

X2 X3 H H H H H H H H

X4 H H H H H H OH H OH OH OH

pEC50 (M) 1,70 1,96 2,42 2,75 <0,61 2,51 3,46 1,53 3,61 3,13 1,11 3,46 1,32 <0,61 <0,61 <0,61

2-Hidroxibenzofenona 3-Hidroxibenzofenona 4-Hidroxibenzofenona 2,2'-Dihidroxibenzofenona 2,4-Dihidroxibenzofenona 4,4'-Dihidroxibenzofenona 2,3,4-Trihidroxibenzofenona 2,4,4'-Trihidroxibenzofenona 2,2',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona 2,3,4,4'-Tetrahidroxibenzofenona 2,3',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona 2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona 2,2'-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona 2,2'-Dihidrxi-4,4'-dimetoxibenzofenona cido 2-Hidrxi-4- metoxibenzofenone-5-sulfnico

OH H H H H H H H H H

OH H H H

H OH OH H H H H

OH H

OH H CH3O H H H

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pEC50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 Figura 17. Distribuio dos valores de atividade (pEC 50) dos 16 derivados da benzofenona selecionados para o estudo de SAR (SUZUKI et al., 2005). pEC50

4.2.

ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) DE UMA SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA (01-16) COM PERFIL DE ATIVIDADE ESTROGNICA

A primeira etapa do trabalho consistiu no estudo da relao estruturaatividade (SAR) de uma srie de derivados da benzofenona, pela avaliao da importncia dos grupos substituintes e o efeito no perfil de atividade estrognica. Para o estudo da relao estrutura-atividade (SAR) foram necessrios os clculos dos descritores moleculares por tcnicas de modelagem molecular. Para isso, utilizou-se o programa Spartan08 (Wavefunction Inc., em ambiente Windows ) disponvel no Laboratrio de Modelagem Molecular & QSAR-3D (ModMolQSAR3D) da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

4.2.1. Construo e otimizao das estruturas tridimensionais

Inicialmente, foi realizado o desenho e a minimizao de energia da estruturas 3D de cada um dos 16 compostos da srie.

56

Para a determinao da Superfcie de Energia Potencial mnima das benzofenonas no vcuo realizou-se uma busca sistemtica pelo mtodo de mecnica molecular, utilizando o campo de foras Merck Molecular Force Field (MMFF) disponvel no programa Spartan08. As energias das estruturas moleculares foram calculadas em funo dos principais ngulos de diedros usando incrementos de 120 . Os confrmeros de menor energia obtidos atravs da busca foram otimizados pelo mtodo semi-emprico, modelo RM1 (Recife Model 1). A Figura 18 ilustra o sistema de numerao dos tomos adotado para as benzofenonas neste estudo.

Figura 18. Numerao dos tomos na benzofenona.

4.2.2. Clculo das propriedades eletrnicas

As estruturas otimizadas foram submetidas a clculos de Teoria de Densidade Funcional (DFT, do ingls Density Functional Theory), em ponto nico (single point), utilizando o funcional de correlao-troca B3LYP e conjunto de base 6-31G*. Desta forma, foram obtidas propriedades empregadas como potenciais descritores moleculares: momento de dipolo molecular, mapa de potencial eletrosttico molecular (MEP), mapa de densidade eletrnica HOMO, mapa de densidade eletrnica LUMO, energias e coeficientes dos orbitais HOMO e LUMO e

57

lipofilicidade. Os valores de lipofilicidade (cLogP) foram obtidos pelo modelo de Crippen, disponvel tambm no pacote Spartan08.

4.3.

ESTUDO DE DOCKING DO COMPOSTO MAIS ATIVO (09) DA SRIE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA

Realizou-se um estudo de docking do composto mais ativo (09) no receptor de estrognio (cdigo PDB: 1ERE) para complementar ao estudo de SAR. A estrutura tridimensional do ligante (derivado 09) otimizada no programa Spartan 08 e salva no formato mol2 foi convertida para o arquivo de entrada do programa GAMESS US no programa Open Babel (ambos em ambiente Linux). Depois da preparao do arquivo de entrada para o GAMESS US (*.inp) obteve-se as cargas CHELPG (do ingls Charge Electrostatic Potential Grid). O programa de interface grfica AutoDockTools (ADT) foi utilizado para gerar arquivo de entrada da protena, receptor de estrognio (cdigo PDB: 1ERE), e do ligante para o programa Autodock. Para o docking, uma caixa de 60x60x60 foi construda centralizada no LBD. O espaamento de grade de 0,375 (aproximadamente da distncia de uma ligao covalente C-C) e uma funo da constante dieltrica dependente de distncia foram utilizados para o clculo dos mapas de energia. Foram obtidas 20 poses para o ligante. O estudo de docking foi realizado aplicando-se o algoritmo gentico de busca Lamarckiano e um protocolo padro com uma populao inicial de 150 indivduos aleatrios, um nmero mximo de 2,5x106 avaliaes de energia e um mximo de 2,7 104 geraes. Foram mantidas a taxa de mutao de 0,02 e a taxa de crossover de 0,8. Resultados de docking que apresentaram um RMSD inferiores a 2.0 foram agrupados e o resultado da melhor energia de docking foi selecionado como o melhor complexo resultante (MORRIS et al., 1998).

58

4.4.

CLCULO DO ESPECTRO UV-VIS DOS COMPOSTOS (01, 13 e 14) DERIVADOS DA BENZOFENONAS

A ltima etapa referente ao estudo terico do espectro eletrnico de absoro do derivado 01 (benzofenona) e os derivados includos na lista de filtros solares permitidos pela ANVISA vigente (RDC n 47 de 16 de maro de 2006): composto 13 (BF-3; 2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona; oxibenzona) e composto 14 (BF-8; 2,2-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona; dioxibenzona). Para o clculo do espectro eletrnico UV-vis utilizaram-se os programas Spartan08 (Wavefunction Inc., em ambiente Windows - Microsoft Corporation) e GAMESS US (em ambiente Linux) disponveis no Laboratrio de Modelagem Molecular & QSAR-3D (ModMolQSAR-3D) da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Em ambos os programas utilizou-se a Teoria de Densidade Funcional Dependente do Tempo (TD-DFT) com o funcional de correlao-troca B3LYP e conjunto de base 6-31G* para o estudo em estado excitado. As mesmas conformaes obtidas na anlise conformacional realizada para o estudo de SAR, otimizadas pelos mtodos de mecnica molecular (MMFF) e semiempricos (RM1), foram utilizadas nesta etapa do trabalho. Ambos os estudo do espectro eletrnico, usando os programas Spartan08 e GAMESS US, foram realizados em single point.

4.4.1. Estudo do espectro eletrnico de absoro UV-Vis realizado no programa Spartan 08

Para o estudo do espectro eletrnico de absoro realizado no programa Spartan08, os clculos em estado excitado foram realizados no vcuo e em etanol (modelo de solvatao implcito mtodo SM8). No mtodo de solvente implcito, o efeito do solvente includo simulando sua capacidade de modular as propriedades eletrostticas do meio, isto , considerando apenas a constante dieltrica () do solvente.

59

Com esses clculos, obtiveram-se os comprimentos de onda () absorvidos e a respectiva fora de oscilao (). A fora de oscilao uma dimenso quantitativa utilizada para expressar a fora de transio eletrnica de um estado para outro, em uma molcula, devido absoro de luz.

4.4.2. Estudo do espectro eletrnico de absoro UV-Vis realizado no programa GAMESS US

A conformao de menor energia obtida na anlise conformacional realizada no Spartan08, na primeira etapa do trabalho, foi salva em formato mol2 e convertida para o arquivo de entrada do GAMESS US (*.inp) com o auxlio do programa Open Babel (em ambiente Linux). Depois da preparao do arquivo de entrada para o GAMESS US os clculos no estado excitado, mtodo TD-DFT/B3LYP/6-31G*, foram executados. Com esses clculos, obtiveram-se os comprimentos de onda () absorvidos com a respectiva fora de oscilao () e a contribuio dos orbitais moleculares que participam da excitao eletrnica. O arquivo de sada do GAMESS US (*.out) foi lido com o auxlio do programa Chemissian (ambiente Windows).

4.5.

FLUXOGRAMA DA METODOLOGIA

A Figura 19 ilustra o fluxograma da metodologia utilizada no estudo dos derivados da benzofenona.

60

METODOLOGIA
SPARTAN O8 DESENHO DAS ESTRUTURAS 3D ARQUIVO DE ENTRADA (*.inp) GAMESS US

MECNICA MOLECULAR

MMFF

DISTRIBUIO DE CONFRMEROS OPEN BABEL

ENERGIA

ESTADO FUNDAMENTAL MECNICA QUNTICA OTIMIZAO GEOMTRICA ARQUIVO (*.mol2) DFT/B3LYP 6-31G*

ESTADO EXCITADO

VCUO

RM1

TD-DFT/ B3LYP 6-31G*

ENERGIA

ARQUIVO DE SADA (*.out) VCUO ESTADO FUNDAMENTAL ESTADO EXCITADO ETANOL (SM8) DFT/B3LYP 6-31G* TD-DFT/ B3LYP 6-31G* NEDIT CHEMISSIAN

CARGA CHELPG

ESPECTRO ELETRNICO

DADOS BIOLGICOS

SAR

DESCRITORES MOLECULARES

ESPECTRO ELETRNICO

DOCKING

ABSORO UV

Figura 19. Fluxograma da metodologia.

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5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1.

ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE DERIVADOS DA BENZOFENONA COM PERFIL ESTROGNICO

5.1.1. Anlise conformacional

A anlise conformacional dos compostos em estudo foi realizada atravs de uma busca sistemtica com variao de ngulos torsionais em incrementos regulares de 120. Com a rotao dos ngulos que envolvem a ligao simples entre os anis (A e B) e a funo carbonila, obteve-se as conformaes de menor energia que representam os possveis mnimos de energia. Para isso, empregou-se a mecnica molecular como mtodo de clculo e o campo de foras MMFF. Os confrmeros tiveram a sua geometria otimizada pelo mtodo semi-emprico RM1. O estudo foi realizado no vcuo e, por isso, as conformaes encontradas so influenciadas apenas pelas caractersticas e propriedades qumicas de seus substituintes. Na Figura 20, esto ilustrados os confrmeros de menor energia da srie de derivados da benzofenona (01-16).

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Figura 20. Confrmero de menor energia de cada composto da srie (01-16) obtido por clculos de mecnica molecular (MMFF) e mtodo semi-emprico RM1.

A estrutura geral das benzofenonas no planar, pois o arranjo conformacional influenciado pela interao estrica entre tomos de hidrognio aromticos orto (Figura 21) que impedem a co-planaridade entre os dois anis ligados pelo grupo carbonila (COX et al., 2008).

Figura 201. (a) Estrutura da benzofenona no otimizada - Impedimento estrico, entre os tomos de hidrognio destacados em amarelo, observado na estrutura da benzofenona que apresenta planaridade entre os anis (Modelo CPK). (b) Estrutura da benzofenona otimizada (Modelo de varetas) (c) Estrutura da benzofenona otimizada em modelo CPK (Corey Pauling Koltum).

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A Tabela 3 apresenta os ngulos de inclinao entre os planos dos dois anis (A e B) calculados para os confrmeros de menor energia da srie em estudo. Para medir o ngulo de inclinao entre os planos dos anis ( A/B) foram utilizados os tomos C7C4 e C10C13, de acordo com a numerao apresentada na Figura 18.
Tabela 3. ngulos de inclinao para os confrmeros de menor energia da srie de derivados da benzofenona (01-16). ( A/B = ngulo de inclinao (C7C4C10C13) formado entre os planos contendo os anis aromticos A e B).

# 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16

A/B () 62,05 54,56 62,36 61,36 42,68 54,40 60,83 54,70 53,20 40,79 53,49 54,05 54,41 41,67 40,58 53,05

O ngulo entre os planos dos anis A e B (A/B) variaram entre 40,58 (derivado 15) e 62,36 (derivado 03). Mantas e colaboradores (2004) tambm estudaram a conformao de benzofenonas substitudas e observaram que a inclinao dos planos contendo os anis aromticos A e B dos compostos calculados por eles compreendiam a faixa de 49,7-51,1 (vcuo) e 49,7-51,2 (gua). A diferena de energia entre os compostos estudados no vcuo e em gua era menor do que 1kcal/mol.

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Realizou-se a comparao dos ngulos calculados com os ngulos de benzofenonas substitudas presentes no banco de dados estruturais de Cambridge (CSD, do ingls Cambridge Structural Database). A estrutura cristal da benzofenona (derivado 01) disponvel no CSD apresenta um ngulo entre os planos dos dois anis igual a 65, prximo ao obtido na anlise conformacional realizada (62,05). A insero de substituintes doadores de eltrons no derivado 01

(benzofenona) aumenta a planaridade dos confrmeros (MANTAS et al., 2004). Esse efeito pde ser observado nos compostos substitudos da srie analisada, exceto para o derivado 03, que apresentou um ngulo um pouco maior do que o da benzofenona (01). O ngulo calculado e o observado na estrutura cristal da 2,2',4,4'Tetrahidroxibenzofenona (derivado 10) so muito prximos, 40,79 e 43, respectivamente. Para o derivado 13 (2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona), tambm foi observada pequena variao, o ngulo calculado foi de 54,41, aproximadamente 4 de desvio do ngulo disponvel no CSD. Os compostos (05, 10, 14 e 15) apresentam os menores ngulos entre os planos dos anis (< 50). Todos esses derivados so substitudos por uma hidroxila em cada anel na posio orto. A formao simultnea de duas ligaes hidrognio intramoleculares envolvendo a carbonila favorece a co-planaridade entre os anis (COX et al., 2000). Cox e colaboradores (2000) tambm observaram um ngulo menor entre os anis do composto di-orto-substitudo, 2,2'-Dihidrxi-4,4'-dimetoxibenzofenona, quando comparado aos ngulos dos outros compostos estudados por eles. Os mnimos de energia encontrados para cada uma das estruturas dos derivados nas condies do estudo (vcuo) podem ser outros em diferentes ambientes, como no cristal da substncia pura ou em soluo aquosa. Contudo, os valores calculados apresentaram coerncia quando comparados com os dados da estruturas cristal disponveis no CSD. As conformaes de menor energia (mais estveis) obtidas por clculos de mecnica molecular e quntica foram utilizadas para os clculos de energia em single point. Considerou-se que a conformao mais estvel deve estar em maior nmero durante o processo de interao com o receptor. No entanto, deve-se ressaltar que no h uma relao direta entre a conformao mais estvel e a

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conformao bioativa, pois a primeira pode sofrer mudanas na sua conformao original no momento em que se aproxima do stio receptor (RODRIGUES, 2001).

5.1.2. Anlise dos dados de atividade estrognica e dos dados obtidos a partir dos clculos de modelagem molecular da srie de derivados da benzofenona (01-16)

A atividade estrognica da srie de derivados da benzofenona (01-16) foi estudada por Suzuki e colaboradores (2005) com o intuito de avaliar a atividade das mesmas como desreguladores endcrinos. A srie totaliza 16 compostos, que possuem ao menos um grupo hidroxila como substituinte comum, exceto para a benzofenona (composto 01). Todos os compostos exibiram atividade estrognica no ensaio reprter in vitro de ERE-luc com MCF-7, com um amplo perfil de atividade. Os derivados mono-hidroxilados (02-04), em que o composto (02) ortosubstitudo (X2), (03) meta-substitudo (X3) e (04) para-substitudo (X4) compreendem a faixa de atividade (pEC50) 1,96 a 2,75, sendo o composto parasubstitudo (04) o que possui maior atividade entre eles (Figura 23). Segundo Suzuki e colaboradores (2005), o grupo 4-hidroxila da benzofenona importante para a ligao com o stio LBD do receptor de estrognio, como o grupo 3-hidroxila do 17estradiol.

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3.00 2.50 2.00 pEC50 1.50 1.00 0.50 0.00 (01) (02) (03) (04)

Figura 21. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados monohidroxilados: derivado orto-substitudo (02), meta-substitudo (03) e para-substitudo (04).

A substituio do grupo em meta (derivado 03) no reduz a atividade tanto quanto a substituio em orto (derivado 02). Segundo Kawamura e col. (2003), os anis ligados a carbonila no so fixos, apresentam rotao livre referente ao ngulo de torso entre o plano da carbonila e do anel que permite a interao semelhante do grupo 3-hidroxila do grupo 4-hidroxila no LBD do receptor de estrognio. Os compostos (05-07) di-hidroxilados apresentam a atividade estrognica na ordem: 4,4'-Dihidroxibenzofenona (07) (pEC50 = 3,46) > 2,4-Dihidroxibenzofenona (06) (pEC50 = 2,51) > 2,2'-Dihidroxibenzofenona (05) (pEC50 = 0,61) (Figura 24).

4 3.5 3 2.5 pEC50 2 1.5 1 0.5 0 (04) (05) (06) (07)

Figura 22. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados 4-Hidroxibenzofenona (04), 2,2'Dihidroxibenzofenona (05), 2,4-Dihidroxibenzofenona (06) e 4,4'-Dihidroxibenzofenona (07).

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A adio do grupo 4-hidroxila na 4-hidroxibenzofenona (04) resultou em um aumento da atividade estrognica. Em ensaios realizados por Kawamura e col. (2003), a atividade estrognica de benzofenonas no hidroxiladas na posio para tambm foi baixa. A baixa atividade da 2,2'-Dihidroxibenzofenona (composto 05) refora a importncia do grupo 4-hidroxila para a atividade. Os derivados (08-09) so tri-hidroxilados. O derivado (09), 2,4,4'-

Trihidroxibenzofenona, foi o que apresentou maior atividade estrognica (pEC50 = 3,61). Na srie o derivado (08), 2,3,4-Trihidroxibenzofenona, atividade (pEC50 = 1,53). Dos compostos tetrahidroxilados (10-12), os derivados 10 e 12 exibiram elevada atividade estrognica. A atividade de (12) 2,3',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona (pEC50 = 3,46) foi maior que a de (10) 2,2',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona (pEC50 = 3,13). J o derivado 11, 2,3,4,4'-Tetrahidroxibenzofenona, atividade (pEC50 = 1,11). Os derivados di-para-hidroxilados, exceto 11, apresentaram os maiores valores de atividade estrognica. A ordem crescente da atividade dos derivados mais ativos : 2,2',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona (10) < 4,4'-Dihidroxibenzofenona (07) e 2,3',4,4'-Tetrahidroxibenzofenona (12) < 2,4,4'-Trihidroxibenzofenona (09) (Figura 25). Os resultados dos ensaios realizados por Kawamura e col. (2005) apontaram a 2,4,4'-Trihidroxibenzofenona (09) como responsvel pela maior atividade estrognica, corroborando a pesquisa de Suzuki e col. (2005). A atividade estrognica do derivado 09 foi confirmada in vivo por ensaio uterotrfico em ratas (SUZUKI et al., 2005). apresentou baixa apresentou baixa

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3.7 3.6 3.5 3.4 pEC50 3.3 3.2 3.1 3 2.9 2.8 (10) (07) (12) (09)

Figura 23. Atividade estrognica (pEC50) dos derivados mais potentes do estudo de SUZUKI et al., 2005.

Pode ser observado entre os compostos 07 e 09 um aumento de atividade promovido pela presena do grupo 2-hidroxila na 4,4-hidroxibenzofenona. A Figura 26 apresenta o alinhamento e sobreposio dos compostos 07 e 09. O composto 09 apresenta maior rigidez devido ligao hidrognio intramolecular entre o grupo 2-hidroxila e o tomo de oxignio da carbonila, o que pode influenciar para uma melhor interao no LBD do receptor de estrognio.

Figura 24. Alinhamento e sobreposio dos compostos 07 e 09. Tracejado amarelo aponta a interao por ligao hidrognio do grupo 2-hidroxil com a carbonila.

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O anel 2,4-dihidroxilado do composto 09 apresenta menor ngulo de torso (O1C2C9C10) entre o plano do anel e da carbonila (10,44) do que o anel 4hidroxilado do composto 07 que apresentou um ngulo diedro de 34,74. Segundo Kawamura e col. (2003; 2005), a presena do grupo 2-hidroxil pode favorecer a atividade de benzofenonas 4,4-dihidroxiladas por uma interao de ligao hidrognio entre o grupo 2-hidroxila e o grupo carbonila, que promove uma rigidez na estrutura, possibilitando uma melhor interao da regio hidrofbica no LBD do receptor de estrognio. Entre as benzofenonas para-dihidroxiladas, apenas o derivado 11 apresentou baixa atividade estrognica. Se comparada as atividades dos compostos 06 (pEC50=2,51) e 08 (pEC50=1,53) e dos compostos 09 (pEC50=3,61) e 11 (pEC50=-1,11), observa-se que a insero do grupo 3-hidroxila prejudica a atividade estrognica. Em ensaios realizados por Kawamura e colaboradores (2003), para a avaliao da atividade estrognica, a presena do grupo 3-hidroxila em benzofenonas 2,4-hidroxiladas tambm foi desfavorvel para a atividade. A Figura 27 ilustra, em modelo CPK, a estrutura dos compostos 06, 08, 09 e 11 e rea exposta () dos tomos de oxignio e hidrognio dos substituintes parahidroxila.

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Figura 25. Estrutura dos compostos 06 (pEC50=-0,10) e 08 (pEC50=-1,07) e dos compostos 09 (pEC50=1,00) e 11 (pEC50=-1,50) em modelo CPK e rea exposta () dos tomos de oxignio e hidrognio dos substituintes para-hidroxila.

possvel observar uma pequena diminuio na rea exposta dos doadores e aceptores de ligao hidrognio do grupo para-hidroxila. Segundo Suzuki e col. (2005), benzofenonas com trs hidroxilas adjacentes (2,3,4-trihidroxiladas) podem apresentar atividade reduzida. Presume-se que as 3 hidroxilas adjacentes dificultam a ligao hidrognio do derivado no stio LBD do receptor. Os derivados (13-16) possuem substituintes metoxila, alm de hidroxila, sendo que o composto (16) o nico que apresenta tambm o grupo sulfnico (substituinte em X5). A benzofenona-3 (13) o derivado mais utilizado em formulaes para a proteo solar. No estudo de Suzuki e col. (2005), a BF-3 apresentou atividade estrognica mais fraca no ensaio in vitro mais fraca (pEC50 = 1,32) do que os derivados substitudos apenas por hidroxila, exceto os compostos 05 e 11 (pouco ativos). No ensaio in vivo realizado por Suzuki e col. (2005) a BF-3 no exibiu atividade estrognica. As benzofenonas (14-16) exibiram atividade muito fraca (pEC50 = < 0,61). Segundo Kawamura e col. (2005), no ensaio com hER , 2-Hidrxi-4metoxibenzofenona (13), 2,2'-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona (14) e 2,2'-Dihidrxi-

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4,4'-dimetoxibenzofenona (15) apresentam baixa atividade estrognica, e o cido 2Hidrxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfnico (16) no exibiu atividade.

5.1.2.1.

Parmetros estereoeletrnicos tericos

Realizou-se um estudo dos principais parmetros estereoeletrnicos tericos dos derivados da benzofenona (01-16) com o intuito de obter informaes importantes sobre a modulao da atividade estrognica desses derivados. A partir do confrmero de menor energia de cada composto da srie (01-16), os descritores moleculares foram calculados utilizando-se a Teoria do Funcional da Densidade (DFT). A Tabela 4 apresenta os parmetros obtidos (volume molecular, energias de HOMO e LUMO (EHOMO e ELUMO), cLogP e momento de dipolo molecular) a partir dos clculos de modelagem molecular de todos os derivados.

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Tabela 4. Parmetros calculados (volume, energia de HOMO e LUMO, dipolo molecular e cLogP) e atividade estrognica (pEC50) experimental (SUZUKI et al., 2005) dos derivados da benzofenona.

# 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16

Volume (3) 202,29 208,12 209,38 209,32 213,96 215,12 216,37 222,14 222,13 227,86 229,15 229,19 235,10 240,90 267,82 252,78

EHOMO (eV) -6,54 -6,10 -6,20 -6,19 -6,19 -6,06 -6,05 -5,95 -5,97 -5,96 -5,88 -5,87 -5,96 -6,02 -5,84 -6,74

ELUMO (eV) -1,54 -1,72 -1,56 -1,36 -2,06 -1,49 -1,18 -1,53 -1,37 -1,69 -1,40 -1,31 -1,46 -1,84 -1,64 -1,99

Dipolo (Debye) 3,18 3,32 2,20 2,73 2,87 2,21 1,64 1,64 2,17 1,31 2,49 3,08 2,52 2,95 1,90 3,35

cLogP 3,24 2,85 2,85 2,85 2,46 2,46 2,46 2,07 2,07 1,69 1,69 1,69 2,72 2,34 2,21 1,62

pEC50 1,70 1,96 2,42 2,75 <0,61 2,51 3,46 1,53 3,61 3,13 1,11 3,46 1,32 <0,61 <0,61 <0,61

A correlao linear de Pearson dos derivados foi verificada para os parmetros calculados e a atividade estrognica. Observou-se uma correlao linear moderada positiva (r= 0,7007; p=0,0025) entre a energia de LUMO e a atividade estrognica (pEC50) da srie de derivados (01-16). A Figura 28 apresenta o grfico de disperso entre a energia de LUMO (ELUMO) e a atividade estrognica (pEC50).

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Figura 26. Correlao linear de Pearson: Energia de LUMO (ELUMO) e atividade estrognica (pEC50) da srie de derivados da benzofenona (01-16).

A reao entre um cido de Lewis e uma base de Lewis consiste na transferncia de eltrons, por interao entre os orbitais de HOMO e LUMO de dois compostos. O composto que reage via orbital HOMO chamado de eltron-doador (base de Lewis) e aquele que reage via orbital LUMO denominado de eltronaceptor (cido de Lewis). Quanto maior a energia do HOMO, maior a capacidade eltron-doadora. Quanto menor a energia do LUMO, menor ser a resistncia para aceitar eltrons. A correlao da atividade estrognica com a energia de LUMO, da srie de derivados da benzofenona, pode estar relacionada com o mecanismo de interao com o LBD do receptor de estrognio, em funo da energia necessria para as interaes que possam ocorrer entre orbitais HOMO do receptor e orbitais LUMO dos derivados.

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Os compostos metoxilados (13-16) possuem os maiores volumes. O volume molecular pode interferir negativamente com o encaixe e as interaes do ligante no stio de ligao do receptor. Foi possvel observar, como ilustrado na Figura 29, um aumento do tamanho do composto de aproximadamente 2,3 com a troca da hidroxila pela metoxila e o aumento do volume molecular, de 227,86 3 (composto 10) para 267,82 3 (composto 15).

Figura 27. Distncia entre os tomos de hidrognio dos compostos 10 (esquerda) e 15 (direita) (modelo CPK).

Os outros parmetros, como energia de HOMO, momento de dipolo molecular e cLogP, no forneceram, aparentemente, nenhuma correlao com a atividade estrognica.

5.1.2.2.

Mapa da densidade LUMO

O mapa da densidade LUMO descreve reas deficientes em eltrons que podem ser suscetveis interao com regies de alta densidade eletrnica do stio LBD do receptor. A rea deficiente em eltrons (cor azul) dos derivados da benzofenona est concentrada no tomo de carbono (C2) da carbonila (Figura 18). A Figura 30 ilustra o mapa da densidade eletrnica de LUMO para todos os compostos da srie.

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Figura 28. Mapa de densidade do Orbital Molecular de Menor Energia Desocupado (LUMO) da srie de derivados (01-16) codificado na faixa de vermelho profundo (0,00) a azul profundo (0,02) sobre 3 uma superfcie de densidade eletrnica constante de 0,002 eV/ua , as reas azuis e vermelhas indicam menores e maiores valores de energia LUMO, respectivamente.

Esta observao indica que a baixa densidade eletrnica LUMO sobre o tomo de carbono da carbonila dos derivados pode auxiliar, porm, no deve ser determinante para uma melhor interao entre a molcula e o stio LBD, pois tanto os derivados mais ativos, quanto os menos ativos apresentaram a deficincia eletrnica na mesma regio.

5.1.2.3.

Mapa da densidade HOMO

A Figura 31 ilustra o mapa da densidade eletrnica de HOMO, que varia do vermelho (baixa densidade de HOMO) ao azul (alta densidade de HOMO), da srie de derivados da benzofenona (01-16).

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Figura 29. Mapa de densidade do Orbital Molecular de Maior Energia Ocupado (HOMO), codificado na faixa de vermelho profundo (0.00) a azul profundo (0.02) sobre uma superfcie de densidade 3 eletrnica constante de 0,002 eV/ua , as reas azuis e vermelhas indicam maiores e menores valores de energia de HOMO, respectivamente.

Nos mapas de HOMO possvel observar dois perfis de distribuio da densidade eletrnica: densidade deslocalizada, isto , distribuda uniformemente na estrutura (compostos 01, 05, 07, 10, 12, 14 e 15) e densidade localizada no anel com maior nmero de substituintes hidroxila e/ou metila (Compostos 02, 03, 04, 06, 08, 09, 11, 13 e 16). Os compostos 01, 05, 07 e 15 apresentam simetria estrutural, o que explica a deslocalizao eletrnica no mapa de HOMO. Sendo que, o composto 01, por no possuir substituintes nos anis, exibe alta densidade eletrnica no tomo de oxignio da carbonila. Essa deslocalizao do mapa de HOMO pode ser observada tambm no composto 12, que mesmo no possuindo simetria, apresenta a mesma quantidade de grupos hidroxila nos dois anis, com diferena apenas nas suas posies.

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O composto 15 tambm apresenta o mesmo nmero de grupos hidroxila nos anis, porm possui adicionalmente uma metoxila em apenas um deles, lembrando que o grupo metoxila tem carter doador de eltron. A deslocalizao da densidade eletrnica de HOMO no pode ser correlacionada com a atividade estrognica, visto que os compostos 07, 12 e 10 esto no grupo dos compostos mais ativos e os derivados 05, 14 e 15 no grupo dos menos ativos. Quando comparado com os compostos 07, 10 e 12, o composto 09, derivado mais ativo, apresenta menor densidade eletrnica em HOMO no anel B, incluindo a hidroxila (posio para, X4) e maior densidade no anel A. Esse efeito pode favorecer o carter aceptor/doador de ligao hidrognio do grupo hidroxila. importante destacar que o reconhecimento do ligante no stio LBD do receptor de estrognio obtido por ligaes hidrognio (SODERO, 2007).

5.1.2.4.

Mapa de potencial eletrosttico molecular (MEP)

Os mapas de potencial eletrosttico molecular (MEP) dos derivados (Figura 32) mostram uma densidade eletrnica similar, em todos os derivados, concentrada principalmente, nos grupos hidroxila e carbonila.

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Figura 30. Mapa do potencial eletrosttico molecular (MEP) codificado na faixa de -100 a 100 kJ/mol 3 sobre uma superfcie de densidade eletrnica constante de 0,002 eV/ua . Compostos destacados (07, 09, 10 e 12) apresentam maior atividade estrognica.

Os compostos mais ativos (07, 09, 10 e 12) so di-para-hidroxilados e por isso apresentam alta densidade eletrnica na posio para dos anis A e B. Essa caracterstica muito importante para a interao com o sitio LBD receptor de estrognio, que foi possvel observar que os derivados menos ativos, exceto 11, no possuem alta densidade eletrnica na posio para. O composto 11 tambm apresenta grupos hidroxila em X4 e X4, no entanto, possui um grupo 3-hidroxila em X3 que desvaforece a interao no stio de ligao, visto que o mesmo apresentou baixa atividade. A troca do grupo hidroxila por metoxila em compostos di-para-substitudos resulta na diminuio da atividade estrognica. possvel observar uma diminuio da densidade eletrnica no tomo de oxignio ligado ao grupo metila. Sugere-se que essa reduo da densidade eletrnica nas posies para de ambos os anis desvaforece a interao de benzofenonas metoxiladas com o stio LBD do receptor de estrognio. Adicionalmente, o grupo metoxila pode dificultar as interaes, principalmente das ligaes de hidrognio, entre o ligante e o stio LBD, por

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impedimento estrico, pois torna os tomos de oxignio (aceptores de ligao hidrognio) menos acessveis. Alm disso, o grupo metoxila apenas aceptor de ligao hidrognio, diferente do grupo hidroxila, que alm de aceptor tambm doador de ligao hidrognio. A metilao exclui a capacidade de doao de ligao hidrognio. Contudo, estudos em ratos apontam que a 2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona (benzofenona-3), muito utilizada na proteo solar, pode ser convertida em metablitos desmetilados e em funo disso contribuir com a atividade estrognica (JEON et al., 2008).

5.1.2.5.

Distncias interatmicas

Realizou-se a comparao da distncia entre os tomos de oxignio das posies para dos derivados di-para-hidroxilados em estudo e do 17-estradiol. A estrutura do hormnio foi extrada do arquivo de raios-x do domnio de ligao do ligante do receptor de estrognio humano complexado com o 17-estradiol (PDB: 1ERE). Na Tabela 5 esto agrupadas essas distncias.
Tabela 5. Distncia entre os tomos de oxignio das hidroxilas da posio para dos compostos em estudo e das hidroxilas do 17-estradiol.

Composto 17-estradiol 07 09 10 11 12

Distncia () 10,8 9,50 9,65 9,75 9,65 9,68

Observa-se uma proximidade das distncias entre os tomos de oxignio das hidroxilas dos compostos em estudo e do 17-estradiol. Sugere-se que as benzofenonas di-para-hidroxiladas apresentam interao com os mesmos resduos de aminocido que o 17-estradiol.

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As hidroxilas para substitudas nos anis A e B (X4 e X4) das 4,4hidroxibenzofenonas em analogia com a hidroxila fenlica do anel A do 17-estradiol e a hidroxila do anel de cinco membros, anel D, podem interagir por ligao hidrognio com os mesmos resduos de aminocidos do stio LBD favorecendo a atividade. A Figura 33 demonstra o alinhamento e sobreposio das benzofenonas mais ativas (07, 09, 10 e 12) e do 17-estradiol, onde possvel observar que as 4,4hidroxilas ficam em posies semelhantes hidroxila fenlica do anel A e a hidroxila do anel D de cinco membros.

Figura 31. Alinhamento e sobreposio das benzofenonas mais ativas ( 07, 09, 10 e 12 em cinza) e do 17-estradiol (em rosa).

5.2.

ESTUDO DE DOCKING DO COMPOSTO MAIS ATIVO (09)

O estudo de docking foi realizado em colaborao com a aluna de doutorado Alessandra Mendona Teles de Souza do Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal Fluminense, Rio de janeiro (UFF - RJ). Os estudos de encaixe molecular (docking) do derivado mais ativo (09) no LBD do receptor de estrognio (cdigo do PDB: 1ERE) obtido no banco de dados de protenas, Protein Data Bank, usando o Autodock. Retirou-se o ligante complexado

81

(17-estradiol),

excluiu-se

as

molculas

de

gua

presentes

na

estrutura

cristalogrfica e fez-se a docagem do derivado (09) mais ativo do estudo. Diversos poses foram gerados e agrupados em trs clusters (RMSD inferiores a 2.0 ) (Figura 34). O cluster de menor energia (-3,7 kcal/mol) apresenta 10 poses.

Figura 32. Agrupamento em clusters (RMSD inferiores a 2.0 ) dos poses do derivado 09. Em vermelho, cluster de menor energia com 10 poses.

Na soluo de menor energia (-3,7 kcal/mol) ocorrem trs interaes por ligao hidrognio. A Figura 35 ilustra estas interaes por ligao hidrognio entre o ligante (derivado 09) e o LBD do receptor de estrognio.

82

Figura 33. Ligaes de hidrognio do derivado 09 com os resduos de aminocido Arg394, Glu353 e Thr347 do LBD do receptor de estrognio (ER-) (cdigo do PDB: 1ERE).

O estudo de docking com a 2,2,4-Tetrahidroxibenzofenona (09) demonstra que o anel B (mono-substitudo) do derivado (09) est localizado, aproximadamente, no mesmo local que o anel A do estradiol se localiza, onde se observa duas interaes por ligao hidrognio entre a hidroxila fenlica (X4) e os resduos Glu353 e Arg394 (Figura 35). Essas mesmas interaes so observadas na estrutura tridimensional do LBD do receptor de estrognio complexado ao 17 estradiol (cdigo do PDB: 1ERE) (Figura 7). O anel A (di-substitudo) faz uma interao por ligao hidrognio entre a hidroxila fenlica substituda em para (X4) e o resduo Thr347 (Figura 35). A hidroxila substituda em orto (X2) faz interao intramolecular por ligao hidrognio com a carbonila (Figura 36), diminuindo a liberdade conformacional, o que pode favorecer as interaes hidrofbicas entre o ligante e o receptor. O anel A do derivado 09 realiza interaes de van der Waals com os resduos Leu525, Ala 350, Leu346 e Met343. O anel B realiza interaes hidrofbicas com os

83

resduos Phe404, Leu387 e Leu391. A Figura 36 aponta as interaes hidrofbicas entre o ligante (derivado 09) e o receptor de estrognio.

Figura 34. Interaes de van der Waals observadas entre o ligante (derivado 09) e o LBD do receptor de estrognio (ER-) (cdigo do PDB: 1ERE).

O anel D do 17-estradiol realiza interaes de van der Waals com os resduos Leu525, Gly521 e Ile424. De acordo com os resultados do estudo de docking, a interao do derivado 09 no LBD do receptor de estrognio deve ocorrer, aproximadamente, no mesmo local em que o ligante natural, 17-estradiol, realiza suas interaes especficas e inespecficas. O grupo hidroxila em X2, como observado no estudo de SAR, promove uma rigidez na estrutura devido ligao hidrognio intramolecular da 2-hidroxila com a carbonila. Essa interao intramolecular foi observada na conformao que

84

apresentou melhor interao com o receptor de estrognio e, por isso, presume-se que seja favorvel para a interao do derivado 09 no LBD do receptor. Foram observadas no derivado 09 interaes semelhantes delfinidina, antocianidina presente em plantas, que possui atividade agonista do receptor de estrognio (ER-). Segundo Chalopin e col. (2010), a delfinidina interage diretamente no receptor de estrognio. O modo de ligao da delfinidina sobre o domnio de ligao do receptor de estrognio (Figura 37) relativamente semelhante aquele observado na estrutura de raios-X do estradiol com o receptor de estrognio. Chalopin e col. (2010) observaram contatos apolares dos trs anis da delfinidina com resduos hidrofbicos (Leu346, Ala350, Leu384, Leu387, Met388, Leu391, Phe404, Met421, Ile424, Leu428, Leu525 e Phe404). Tambm foi observada a interao por ligao hidrognio com o resduo Glu353, no entanto, as interaes com os resduos Arg394 e His524, que o estradiol faz, foram perdidas e compensadas por ligao hidrognio com a Leu346.

Figura 35. Modo de ligao da delfinidina no LBD do receptor de estrognio (ER-) (Adaptado de CHALOPIN et al., 2010)

85

Celik e col. (2008) realizaram um estudo das possveis interaes entre desreguladores endcrinos e o receptor de estrognio. Diversos desreguladores endcrinos apresentaram ligao no LBD do receptor de estrognio, como o DDT e e o HPTE (2,2-dihidroxifenil-1,1,1-tricloroetano) (Figura 38), que ligam-se de maneira forte ao receptor.

Figura 36. Estrutura qumica do DDT e o HPTE.

Para os compostos DDT e HPTE, um dos anis fica posicionado na direo dos resduos Glu353 e Arg394 enquanto o outro na direo do Thr347. A Figura 39 ilustra a ligao desses desreguladores endcrinos no LBD do receptor de estrognio.

86

Figura 37. Ligao do (A) DDT, (B) HPTE (conformao 1) e (C) HPTE (conformao 2) no stio de ligao do receptor de estrognio (Adaptado de CELIK et al., 2008).

O DDT, pesticida organoclorado que apresenta atividade similar aos estrognios endcrinos, e o HPTE interagem no LBD de modo semelhante ao derivado 09, realizando interaes por ligao hidrognio com os mesmo resduos. O estudo de docking realizado no presente trabalho essencial para a racionalizao de novos derivados que possam atuar como fotoprotetores, visto que esses no devem interagir da mesma forma que o estradiol e o derivado 09 no receptor de estrognio.

5.3.

ESTUDO TERICO DO ESPECTRO ELETRNICO DE ABSORO UV DE DERIVADOS DA BENZOFENONA

Nesta terceira parte do trabalho utilizou-se apenas o derivado 01 (benzofenona) e os derivados includos na lista vigente de filtros solares permitidos pela ANVISA (RDC n 47 de 16 de maro de 2006): 13 (BF-3; 2-Hidrxi-4metoxibenzofenona; oxibenzona) e 14 (BF-8; 2,2-Dihidrxi-4-metoxibenzofenona; dioxibenzona).

87

Com o intuito de comparar os espectros eletrnicos de absoro experimental e terico desses derivados da benzofenona realizaram-se clculos qunticos usando a Teoria do Funcional da Densidade Dependente do Tempo (TD-DTF/ B3LYP/631G*). Para o estudo de SAR, realizado na primeira etapa do presente trabalho, j havia sido realizada a anlise conformacional para a obteno das geometrias otimizadas. Ento, para essa segunda etapa, utilizaram-se as mesmas geometrias para os clculos do espectro eletrnico em ponto nico (single point) em dois programas, Spartan08, simulando o vcuo e em etanol (solvente implcito, mtodo SM8) e GAMESS US, simulando o vcuo. Os mximos de absoro experimentais do derivado (01) foram obtidos por Dilling (1966) e dos derivados 13 e 14 por Baughman e colaboradores (2009), em diferentes solventes. A Tabela 6 apresenta os mximos de absoro experimentais (nm) da benzofenona (01), oxibenzona (13) e dioxibenzona (14), em diferentes solventes.

88

Tabela 6. Medida experimental dos comprimentos de onda mximos ( mx em nm) para a benzofenona (01), oxibenzona (13) e dioxibenzona (14) em diferentes solventes.

Solvente Diclorometano Dietil ter Clorofrmio Tetracloreto de carbono Tolueno Hexano Ciclohexano Acetonitrila Tetraidrofurano Metanol Etanol Propanol Butanol

01* mx (1) 249 247,5 248,5 252,5 252 252,5 252,5 mx (2) 344 346,5 346,5 331,5 332,5 333,5 333,5

13** mx (1) 287,96 289,05 286,94 287,96 287,05 287,96 287,01 287,01 287,96 287,96 mx (2) 326,94 328,04 327,96 328,05 324,01 327,58 323,98 325,07 326,01 326,94

14** mx (1) 297,92 297,92 296,04 299,02 285,91 283,96 284,03 284,03 284,03 283,96 mx (2) 351,98 353,06 353,06 354,93 331,02 330,00 326,03 326,96 328,99 330,00

* Referncia: DILLING, 1966. ** Referncia: BAUGHMAN et al., 2009.

5.3.1. Estudo terico do espectro eletrnico do derivado (01)

O espectro de absoro UV das benzofenonas caracterizado por duas bandas. Uma mais fraca, na faixa do UV prximo (300 400 nm), que corresponde a transies do tipo n *, e outra mais forte e larga, na faixa do UV mdio (200 300nm), do tipo * (URAHATA & CANUTO, 2000). Nas medidas experimentais dos mximos de absoro, observou-se para as transies na faixa do UV mdio (200-300 nm) um efeito solvatocrmico positivo pequeno (5 nm), isto , com o aumento da polaridade do solvente houve um

89

deslocamento batocrmico (aumento do comprimento de onda), que caracteriza transies do tipo *. No caso das transies de menor energia, na faixa de 300-400nm, ocorre um efeito solvatocrmico negativo (15 nm), isto , com o aumento da polaridade do solvente ocorre uma dimimuio do comprimento de onda (deslocamento hipsocrmico) que caracteriza transies do tipo n *. Na Tabela 7 esto agrupados os comprimentos de onda calculados com suas respectivas foras de oscilao e os mximos de absoro experimentais medidos em etanol (DILLING, 1966).
Tabela 7. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 01 (benzofenona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G), e os comprimentos de onda mximos do espectro eletrnico experimental (etanol) a

Vcuo

Etanol 0,003800 0,042622 0,244445 0,050393 0,019611 0,001742 -

Vcuo-G (nm) 216,73 216,96 229,86 234,77 245,35 249,24 257,25 264,03 344,79 0,013 0,002 0,008 0,021 0,034 0,163 0,061 0,018 0,001

(nm) (nm) 233,46 0,028405 222,05 239,05 0,038947 242,41 246,53 0,182513 252,47 254,81 0,049770 261,40 261,46 0,017308 269,43 339,55 0,001622 316,81 a Referncia: DILLING, 1966

Experimental Etanol (nm)

252,0

332,5

O comprimento de onda mximo calculado no Spartan 08 foi de 246,53 nm (vcuo) e 252,47 nm (etanol) e no GAMESS US, 249,24 nm (vcuo). Valores muito prximos ao observado experimentalmente em etanol por Dilling (1966) (252 nm). A absoro em 332,5 nm (experimental) tambm pode ser observada nos clculos em 339,55 nm (Vcuo), 316, 81 nm (Etanol) e 344,79 (Vcuo-G). A fora de oscilao calculada extremamente baixa (0,001) para essas transies consistente com o fato de que a transio experimental correspondente muito fraca. O efeito do solvente pde ser caracterizado no espectro calculado no programa Spartan08. A diferena entre os mximos de absoro dos clculos realizados no vcuo (246,53 nm) e em etanol (252,47 nm), Spartan08, foi de aproximadamente 6 nm. O efeito solvatocrmico observado experimentalmente positivo (deslocamento batocrmico) e baixo (5 nm) para as transies de menor

90

energia (200-300 nm). A variao entre os espectros calculados no vcuo (339,55 nm) e em etanol (316,81 nm), programa Spartan08, de aproximadamente 23 nm. No espectro experimental, foi observado um deslocamento hipsocrmico (15 nm) para as transies de menor energia (300-400 nm). A Figura 40 apresenta uma comparao entre os espectros tericos normalizados da benzofenona (derivado 01) calculados no presente trabalho (mtodo TD-DFT) usando os programas Spartan 08 (Vcuo e Etanol) e GAMESS US (Vcuo-G) e nos trabalhos de GEORG e col. (2006) e URAHATA e col. (2000) (mtodo INDO/CIS). A intensidade a fora de oscilao da transio calculada. A normalizao do espectro realizada em funo do mximo de intensidade de cada espectro. Desta forma, eliminam-se as diferenas de intensidade devido as variaes dos mtodos, e os espectros podem ser comprados dentro e uma mesma ordem de grandeza, variando todos em intensidade de 0 a 1.

Intensidade normalizada

1 Vcuo Vcuo-G 0.5 Etanol GEORG et al., 2006 (vcuo) URAHATA et al., 2000 (vcuo) URAHATA et al., 2000 (gua) 0 200 250 300 Comprimento de onda (nm) Figura 38. Comparao entre os espectros eletrnicos calculados da benzofenona ( 01). 350 400

Grficos semelhantes foram obtidos comparando os clculos realizados no presente trabalho e os clculos realizados por GEORG e col. (2006) no vcuo usando o mtodo INDO/CIS. Os espectros obtidos por URAHATA e col. (2000), em gua e no vcuo usando o mtodo INDO/CIS, apresentaram-se deslocados para comprimentos de

91

onda menores, mximos de absoro em 231 nm (vcuo) e 238 nm (gua), em relao aos calculados no presente trabalho. O mtodo terico aplicado no presente trabalho para o estudo do espectro eletrnico de absoro da benzofenona (01) foi apresentou boa proximidade com os resultados experimentais para a absoro de maior energia (252 nm). A presena de apenas uma banda intensa no espectro calculado conseqncia da baixa absoro na faixa que compreende 332,5 nm, que corresponde a transies do tipo n *. Esse tipo de transio caracterstico do grupo carbonila, cromforo de baixa absortividade.

5.3.1.1.

Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 01

A configurao das transies eletrnicas observadas no espectro da benzofenona (01) obtido com o programa GAMESS US encontra-se na Tabela 8.
Tabela 8. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) das transies do derivado 01 (benzofenona).

Estados 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MO H L (88%) H-1 L (86%) H-2 L (86%) H-4 L (83%) H-3 L (79%) H L+1 (88%) H L+2 (92%) H-1 L+2 (70%) H L+3 (80%)

E (eV) 3,62 4,70 4,82 4,98 5,00 5,28 5,40 5,72 5,73

(nm) 344,79 264,03 257,25 249,24 245,35 234,77 229,86 216,96 216,73

0,001 0,018 0,061 0,163 0,034 0,021 0,008 0,002 0,013

Na absoro mxima calculada, localizada em 249,24 nm e com fora de oscilao de 0,163, predomina a transio HOMO-4 LUMO. Para a absoro em 344,79 nm, a principal transio HOMO LUMO. As transies que apresentam comprimentos de onda maiores do que 240 nm envolvem transies para o orbital LUMO, que possui carter *.

92

A Figura 41 ilustra os coeficientes dos orbitais de fronteira HOMO-4 e LUMO calculados no vcuo, programa Spartan08 (DFT/B3LYP/6-31G*) para a

benzofenona (01).

Figura 39. Coeficientes dos orbitais envolvidos na transio mais intensa ( *) para a benzofenona (01).

Nos dois orbitais moleculares, HOMO-4 e LUMO, observa-se a densidade eletrnica distribuda em ambos os anis. A presena de superfcies nodais adicionais nos anis uma caracterstica indicativa de transio *. Na faixa do UV prximo (300 400 nm) observa-se apenas o comprimento de onda de 335,8 nm, que apresenta baixa intensidade de absoro. Essa transio envolve os orbitais de HOMO e LUMO (Figura 42).

Figura 40. Coeficientes dos orbitais envolvidos na transio de menor energia para a benzofenona (01).

Empiricamente, as transies de menor energia so descritas como transies n * do grupo carbonila. Contudo, no orbital ocupado (HOMO) observam-se orbitais n da carbonila combinados com orbitais dos anis fenila e, por isso, transies de HOMO LUMO possuem carter n * (carbonila) e carter * (anis).

93

5.3.2. Estudo terico do espectro eletrnico do derivado 13

espectro

eletrnico

experimental

do

derivado

13

(2-Hidrxi-4-

metoxibenzofenona) possui um efeito solvatocrmico pequeno, pois o uso de solventes com diferentes polaridades e constantes dieltricas, hexano ( = 1,88) e acetonitrila ( = 35,68) (WINGET et al., 1999), causou um deslocamento mnimo nos mximos de absoro (Tabela 6). Na Tabela 9 esto agrupados os comprimentos de onda calculados com suas respectivas foras de oscilao e os mximos de absoro experimentais medidos em etanol (Baughman et al., 2009).
Tabela 9. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 13 (oxibenzona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G), e os comprimentos de onda mximos do espectro eletrnico experimental (etanol) a

Vcuo

Etanol

Vcuo-G (nm) 220,78 221,92 239,06 242,95 249,44 253,99 272,98 310,07 313,36 0,013 0,004 0,039 0,033 0,090 0,009 0,189 0,133 0,034

(nm) (nm) 241,23 0,016019 234,81 0,067478 247,09 0,100608 251,16 0,032955 252,44 0,009292 261,1 0,018132 267,73 0,233318 270,74 0,29467 301,05 0,166287 298,74 0,077746 311,24 0,013401 303,39 0,114832 a Referncia: BAUGHMAN et al., 2009

Experimental Etanol (nm)

287,01 325,07

No espectro calculado, usando o programa Spartan 08, observou-se uma intensa absoro em 267,73 e 301,05 nm no vcuo e em 270,74 nm e 303,39 nm no etanol (mtodo de solvatao implcita), variao aproximada de 2 nm entre os mximos no vcuo e no etanol. Os mximos de absoro calculados no GAMESS US (Vcuo G) foram em 272,98 e 310,07 nm. Os espectro calculados esto de acordo com a absoro em 287 nm, no entanto, no abrangem a faixa que compreende o mximo em 325 nm, observado experimentalmente em etanol.

94

Alm dos mximos de absoro obtidos por Baughman e col. (2009), utilizouse uma varredura do espectro UV da benzofenona-3 realizada no Laboratrio de Desenvolvimento Galnico (LADEG) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) pela a aluna de mestrado Dbora Freitas do Nascimento do Programa de Ps-Graduao em Cincia Farmacuticas. O espectro foi obtido a partir de uma soluo de benzofenona-3 em diclorometano, na concentrao de 10g/mL, em Espectrofotmetro V630 (Jasco). A varredura do espectro UV, obtida no LADEG-UFRJ, apresenta os mximos de absoro em 288 nm e 324 nm. A Figura 43 apresenta uma comparao entre os espectros tericos normalizados da oxibenzona (derivado 13) calculados no presente trabalho (mtodo TD-DFT), usando os programas Spartan 08 (Vcuo e Etanol) e GAMESS US (Vcuo-G), e o experimental (obtido no LADEG-UFRJ).

1.2 1 0.8 Vcuo 0.6 0.4 0.2 0 200 250 300 350 400 Etanol Vcuo-G Experimental

Figura 41. Comparao entre os espectros de absoro calculados e experimental da benzofenona-3 (derivado 13).

Nos espectros tericos e experimental foi possvel identificar absoro na faixa de 200-250 nm, que corresponde radiao UVC. Para filtors UV utilizados na proteo solar, a absoro nessa faixa no relevante, pois estes comprimentos de onda altamente danosos so absorvidos pela camada de oznio e, por isso, no chegam superfcie da pele.

95

Nos espectros calculados no presente trabalho foi possvel observar intensa absoro na faixa UVB (283-400). No entanto, no foi identificada absoro na faixa UVA (320-400 nm) nos clculos realizados tanto no vcuo, como no etanol. Baughman e col. (2009) calcularam os espectros de absoro da benzofenona-3 livre e complexada (1:1) com o metanol, tetraidrofurano e acetonitrila. Utilizaram dois mtodos, TD-DFT e ZINDO. Observaram os mximos de absoro na faixa de 312 nm (BF-3 complexada com tetraidrofurano; mtodo ZINDO) 345 nm (BF-3 complexada com metanol; mtodo TDDFT).

5.3.2.1.

Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 13

A configurao das transies eletrnicas observadas no espectro da oxibenzona (13) obtido com o programa GAMESS US encontra-se na Tabela 10.
Tabela 10. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) das transies do derivado 13 (dioxibenzona).

Estados 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MO H-2 L (80%) H L (83%) H-1 L (82%) H-3 L (91%) H-4 L (71%) H L+1 (77%) H L+2 (88%) H-2 L+1 (81%) H L+3 (59%)

E (eV) 3,961 4,003 4,547 4,887 4,976 5,109 5,192 5,593 5,622

mx (nm) 313,36 310,07 272,98 253,99 249,44 242,95 239,06 221,92 220,78

0,034 0,133 0,189 0,009 0,090 0,033 0,039 0,004 0,013

Os mximos de absoro calculados, localizados em 272,98 (= 0,189) e 310,07 nm (= 0,189), apresentam como principais transies HOMO-1 LUMO e HOMO LUMO, respectivamente. Para a absoro em 313,36 nm, a principal transio de HOMO-2 LUMO. As transies que apresentam comprimentos de onda maiores que 245 nm envolvem transies para o orbital de LUMO, que possui carter *.

96

A Figura 44 ilustra os coeficientes dos orbitais de fronteira HOMO, HOMO-1, HOMO-2 e LUMO calculados no vcuo, programa Spartan08 (DFT/B3LYP/6-31G*) para a benzofenona (01).

Figura 42. Coeficientes dos orbitais envolvidos nas transies eletrnicas do derivado 13.

Os coeficientes dos orbitais indicam o envolvimento do anel A na transio HOMO LUMO e HOMO-1 LUMO e do anel B na transio HOMO-2 LUMO. As superfcies nodais adicionais observadas em LUMO, anel A e B, indicam transies do tipo *. No orbital ocupado HOMO-2, observam-se orbitais n da carbonila e da hidroxila (X2) combinados com orbitais do anel fenila B. Transies HOMO-2 LUMO combinam carter n * (carbonila e hidroxila) e carter * (anel). Segundo Baughman e col. (2009), benzofenonas o-hidroxiladas no apresentam transies do tipo n * e transies de baixa energia so atribudas ao processo denominado de transferncia de prton no estado excitado (ESPT, do ingls Excited State Proton Transfer) que envolvem a hidroxila e a carbonila. A Figura 45 apresenta uma ilustrao esquemtica do processo ESPT.

Figura 43. Representao esquemtica da transferncia de prton intramolecular no estado excitado (ESPT) (Adaptado de BAUGHMAN et al., 2009).

Baughman e col. (2009) caracterizaram as principais transies da benzofenona-3 como sendo entre orbitais HOMO, HOMO-1 e LUMO e atriburam a

97

transferncia de prton intramolecular transio HOMO LUMO, em funo da diminuio da densidade eletrnica no tomo de oxignio da hidroxila. Os orbitais HOMO, HOMO-1 e LUMO calculados no presente trabalho so semelhantes aos calculados por Baughman e col (2009). possvel observar na transio HOMO LUMO essa mesma diminuio da densidade eletrnica na hidroxila. No entanto, eles no descreveram transies HOMO-2 LUMO, que segundo o presente estudo apresentou carter n *. Dilling (1966) avaliou o efeito dos solventes na energia das transies n * e * de derivados da benzofenona hidroxilados e observaram que as bandas n * no foram discernveis, isto , a absoro no foi suficientemente bem

resolvida de outras bandas mais intensas. Em funo disso, consideraram as transies * como produto de dois cromforos diferentes, o grupo benzola e o grupo benzola-hidroxila. Transies envolvendo o grupo benzola-hidroxila foram denominadas de transies ESPT. Baseando-se no presente estudo sugere-se que as transies de menor energia da benzofenona-3 apresentam carter n * e ESPT. Contudo, as transies que envolvem o processo ESPT apresentam maior intensidade de absoro e envolvem energias maiores do que as de carter n *.

5.3.3. Estudo do espectro eletrnico terico do derivado 14

No espectro eletrnico de absoro experimental obtido por Baughman e col. (2009) (Tabela 6), foi possvel observar efeito solvatocrmico em ambos os comprimentos de onda mximos do derivado 14 (2,2-Hidrxi-4-metoxibenzofenona). Os mximos de absoro, nos diversos solventes, das transies de maior energia variaram em 15,06 nm, de 283,96 (em tetraidrofurano e butanol) nm a 299,02 (em tolueno), e de menor energia em 28,9 nm, de 326,03 nm (em metanol) a 354,93 (em tolueno). O aumento da polaridade do solvente resultou em um deslocamento hipsocrmico (diminuio do comprimento de onda) denominado de

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solvatocromismo negativo. A transio de menor energia a que sofreu maior efeito hipsocrmico. Na Tabela 11 esto agrupados os comprimentos de onda calculados com suas respectivas foras de oscilao e os mximos de absoro experimentais obtidos por Baughman e col. (2009) em etanol.
Tabela 11. Comprimentos de onda () e fora de oscilao () do derivado 14 (dioxibenzona). Transies calculadas utilizando o mtodo TD-DFT (B3LYP/6-31G*) no vcuo e etanol, programa Spartan 08 e apenas no vcuo, programa GAMESS US (Vcuo-G).

Vcuo (nm) 235,96 0,06111 252,09 0,085071 281,71 0,19553 305,46 0,002134 319,69 0,024338 335,87 0,31618 -

Etanol (nm) 235,61 0,055594 252,6 0,09707 285,93 0,200855 301,23 0,004222 321,25 0,018597 335,52 0,328909 -

Vcuo-G (nm) 217,60 0,004 222,96 0,012 237,74 0,097 241,30 0,041 257,09 0,075 286,86 0,147 308,23 0,003 327,67 0,019 344,88 0,262

No espectro calculado para o derivado 14 usando o programa Spartan 08, os mximos de absoro foram em 281,71 e 335,87 nm, no vcuo, e 285,93 nm e 335,52 nm, em etanol. No GAMESS US (Vcuo-G) os mximos de absoro calculados foram em 286,86 nm e 344,88 nm. O efeito do solvente no pde ser caracterizado no espectro eletrnico terico. No entanto, os mximos tericos esto de acordo com as faixas dos mximos de absoro obtidos experimentalmente Baughman e col. (2009) nos diversos solventes, que foram de 283,96 (tetraidrofurano e butanol) a 299,02 (tolueno), para as absores de maior energia, e 326,96 (metanol) a 354,93 (tolueno), para as absores de menor energia. A Figura 46 apresenta uma comparao entre os espectros tericos normalizados da benzofenona (derivado 14) calculados no presente trabalho (mtodo TD-DFT), usando os programas Spartan 08 (Vcuo e Etanol) e GAMESS US (Vcuo-G).

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1.2 Intensidade normalizada 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 200 250 300 Comprimento de onda (nm) Figura 44. Comparao entre os espectros eletrnicos calculados para o derivado 14. 350 400 Vcuo Etanol Vcuo-G

Os espectros eletrnicos calculados, usando os programas Spartan08 (Vcuo e Etanol) e GAMESS US (Vcuo-G), apresentaram o mesmo perfil de absoro. Observa-se uma banda larga e intensa na faixa do UVB, centrada entre 281-287 nm, e uma de maior intensidade na faixa do UVA, com absoro mxima na faixa de 335-345 nm.

5.3.3.1.

Configurao das principais transies eletrnicas do derivado 14

A Tabela 12 apresenta as configuraes de transio calculadas usando o programa GAMESS US.

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Tabela 12. Transies calculadas (eV e nm) dos nove estados de menor energia, fora de oscilao () e composio em termos dos orbitais moleculares (MO) do derivado 2,2 -Hidrxi-4metoxibenzofenona (14).

Estados 1 2 3 4 5 6 7 8 9

MO H L (92%) H-1 L (90%) H-4 L (69%) H-2 L (83%) H-3 L (58%) H L+1 (75%) H-1 L+1 (87%) H L+2 (74%) H L+3 (61%)

E (eV) 3,599 3,788 4,027 4,327 4,828 5,144 5,221 5,567 5,704

mx (nm) 344,88 327,67 308,23 286,86 257,09 241,3 237,74 222,96 217,6

0,262 0,019 0,003 0,147 0,075 0,041 0,097 0,012 0,004

Os mximos de absoro calculados, localizados em 286,86 (= 0,147) e 344,88 nm (= 0,262), apresentam as transies HOMO LUMO e HOMO-2 LUMO, respectivamente, como principais (Figura 47).

Figura 45. Coefientes do orbitais de HOMO-2, HOMO e LUMO do derivado 14.

Os coeficientes dos orbitais envolvidos nas transies eletrnicas indicam um envolvimento dos anis A e B na transio HOMO LUMO, caracterizando transies do tipo *. As transies entre HOMO-2 e LUMO envolvem apenas o anel A. As transies de menor energia envolvem os orbitais de HOMO-LUMO. No espectro experimental, as transies de menor energia sofreram maior efeito hipsocrmico. O efeito hipsocrmico indicativo de transies n *. No entanto, o tomo de oxignio do grupo carbonila no HOMO apresenta baixa densidade eletrnica, devido a presena de grupos hidroxila na posio orto dos dois anis. Na comparao dos coeficientes de HOMO e LUMO, observou-se aumento na densidade no grupo carbonila e diminuio nos grupos hidroxila em LUMO. Segundo Baughman e col. (2009), essas alteraes so devidas ao processo de

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transferncia de prton no estado excitado (ESPT), Figura 48, no transies do tipo n *.

Figura 46. Representao esquemtica da transferncia de prton intramolecular no estado excitado (ESPT) da dioxibenzona (Adaptado de BAUGHMAN et al., 2009).

Baughman e col. (2009) calcularam as transies eletrnicas da dioxibenzona (14) livre e complexada (1:1) com o metanol, tetraidrofurano e acetonitrila. Utilizaram dois mtodos, TD-DFT e ZINDO. Observaram os mximos de absoro na faixa de 319 nm (dioxibenzona complexada com metanol; mtodo ZINDO) 369 nm (dioxibenzona livre; mtodo TD-DFT) e caracterizaram as transies como sendo entre orbitais HOMO, HOMO-2 e LUMO. Os orbitais de HOMO, HOMO-2 e LUMO calculados no presente trabalho so semelhantes aos calculados por Baughman e col (2009).

102

6. CONCLUSES E PERSPECTIVAS

A atividade estrognica, indesejvel para a fotoproteo, favorecida em benzofenonas di-para-hidroxiladas (X4 e X4). A alta densidade eletrnica na posio para dos anis A e B (X4 e X4) uma caracterstica importante para a interao com o receptor de estrognio. O derivado 09 (2,4,4-hidroxibenzofenona) possui maior atividade estrognica entre os compostos estudados. A hidroxila substituda em X2 diminui a liberdade conformacional devido ligao hidrognio intramolecular e com isso favorece a atividade. A atividade estrognica desfavorecida com a substituio do grupo hidroxila (-OH) pelo grupo metoxila (-OCH3) (derivados 13-16), pois alm do aumento do volume molecular gerado pelo grupo metoxil, a metilao tambm exclui a capacidade de doao de ligao hidrognio. Contudo, derivados metoxilados so metabolizados em derivados desmetilados. No estudo de docking do composto 09, a ligao hidrognio intramolecular foi observada no confrmero que apresentou melhor interao no stio de ligao. O derivado 09 faz trs interaes por ligao hidrognio, duas com os mesmos resduos que o 17-estradiol faz, Glu353 e Arg394, e uma com o resduo Thr347. Foram observadas tambm interaes hidrofbicas. Na ltima etapa do trabalho avaliou-se o espectro eletrnico terico da benzofenona (01) e seus derivados (13 e 14) utilizando um estudo por TD-DFT. Os clculos permitiram observar as contribuies em termos de orbitais moleculares das principais transies eletrnicas. Os espectros eletrnicos tericos foram

comparados com os espectros experimentais. Para os trs derivados, os mximos tericos esto de acordo com as faixas dos mximos de absoro obtidos experimentalmente, exceto para o derivado 13 na faixa do UVA. Para o derivado 01, o efeito do solvente pde ser caracterizado no espectro eletrnico terico. O presente trabalho compila informaes estruturais e eletrnicas importantes sobre as benzofenonas, que podem ser racionalizadas em estudos posteriores visando o desenvolvimento de novos compostos utilizados como absorvedores UV, mas que no apresentem atividade estrognica, portanto, eficazes e mais seguros. Julga-se importante a realizao de novos clculos com intuito de se conseguir resultados mais acurados para a absoro da oxibenzona na faixa do

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UVA e destaca-se a necessidade de se avaliar o efeito dos substituintes no espectro eletrnico de absoro UV de derivados da benzofenona para a racionalizao dos dados e proposta de novos derivados que apresentem absoro da radiao UV nas faixas do UVA e do UVB.

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