I.S.P.I.

N 9009 San Juan Bautista de La Salle

Obtencin de plantas resistentes a insectos.

Biotecnologa Vegetal
Garrocq, Laura Traferri, Cecilia Ao 2013

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Obtencin de plantas resistentes a insectos

Introduccin. La preocupacin pblica por los riesgos inherentes al uso de pesticidas para el control de insectos estimul la bsqueda y el desarrollo de alternativas menos riesgosas para el ambiente. La adicin de genes mediante la ingeniera gentica para desarrollar variedades vegetales con resistencia a insectos es una herramienta muy til para complementar el mejoramiento gentico vegetal. Mediante diversos mtodos, ya se han transferido a varias especies vegetales numerosos genes provenientes de un amplio rango de plantas y bacterias, que confieren resistencia a insectos, enfermedades y tolerancia a herbicidas. En la experiencia sumada hasta el momento, los genes transferidos son heredados normalmente a las progenies sin efectos adversos en las plantas que los contienen, y las plantas transgnicas han mantenido los niveles de resistencia a campo. En todos los casos, la transgnesis debe estar integrada a un sistema de manejo de plagas ecolgicamente sustentable. Ya se han obtenido transformaciones estables en unas 100 especies vegetales, entre las cuales se incluyen maz, trigo, soja, tomate, algodn, papa y arroz. Dada la numerosa cantidad de genes relevados e identificados como posibles fuentes de resistencia a insectos, se podran agrupar segn el origen de las secuencias candidatas en: i) genes de origen bacteriano, Bacillus thuringiensis (Bt); ii) genes de origen vegetal (inhibidores de proteasas, quitinasas, avidina, lectina); iii) secuencias de insectos (estrategia de RNA de interferencia -RNAi-). En el presente trabajo se describir en qu consisten cada una de las anteriormente mencionadas fuentes de genes candidatos a aportar resistencia a distintas plagas y a continuacin se citarn dos ejemplos de la tecnologa Bt aplicada en Argentina, ya que estos genes son los ms explorados y los nicos que hasta el momento tienen aplicacin comercial.

Genes de origen bacteriano. Bacillus thuringiensis (Bt) El microorganismo Bacillus thuringiensis, comnmente conocido como Bt, es una bacteria aerbica, gram positiva que se encuentra naturalmente en el suelo y ha sido utilizada como insecticida biolgico desde hace ms de medio siglo. Esta bacteria produce protenas de inclusin en forma de cristales, llamadas -endotoxinas o protenas Cry, durante la esporulacin. Estos cristales son especficamente txicos para insectos, especialmente los lepidpteros. Luego de la ingestin, los cristales son
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disueltos por los jugos alcalinos del intestino que convierten a las protoxinas en fragmentos txicos -toxinas- que daan las clulas del epitelio intestinal de las larvas. (1) Una vez activada, la toxina se une a unos sitios de accin especficos en la membrana intestinal y permite la formacin de poros, alterando el funcionamiento del tracto digestivo, lo que en pocos minutos paraliza su actividad. Si bien la larva muere en pocos das, deja de alimentarse en minutos y por lo tanto deja de ejercer dao en forma casi inmediata. (2) En mamferos superiores no existen sitios de reconocimiento de estas toxinas, razn por la cual no resultan txicas para humanos. Por tratarse de eventos que contienen un gen codificante para un tipo de toxina, se observa que la actividad insecticida es especfica hacia los insectos plaga que se quiere controlar en cultivos que expresan estas protenas. Esto constituye una ventaja sobre otros sistemas de control, ya que los insectos que no son plaga, as como los insectos benficos, no son afectados. Adems, esta especificidad permite implementar sistemas de manejo integrado de plagas para combatir otros insectos que no son controlados por estas toxinas. (1) Durante su etapa vegetativa, Bacillus thuringiensis produce las protenas Vip (Vegetative insecticidal protein, por sus siglas en ingls) que tambin tienen accin insecticida sobre lepidpteros. Estn presentes en la planta como protoxina, que necesita ser activada para cumplir su funcin. En su forma activa, estas protenas se unen a la membrana vesicular de la mucosa del intestino medio de las especies susceptibles. El sitio de unin de las protenas Vip es diferente al sitio de unin las protenas Cry, pero el resultado final de la accin insecticida es similar: lisis celular y muerte por inanicin y septicemia. (2) Manejo del cultivo Bt: refugios Para que el uso y la aplicacin exitosa de la tecnologa de resistencia mediante la expresin de genes derivados de Bt pueda perpetuarse en el tiempo se debe considerar el uso de refugios. Los refugios son reas con ningn o muy poco uso de plaguicida, que promueven la supervivencia de organismos beneficiosos para el cultivo y preservan la susceptibilidad de la plaga. Para los organismos beneficiosos, los refugios suministran recursos necesarios de alimentos, como plantas hospedadoras, nctar o polen, lo necesario para su supervivencia y reproduccin. (3)

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El refugio funciona como una pequea fuente (o refugio) de individuos

susceptibles. stos al cruzarse con los eventuales adultos resistentes sobrevivientes del lote Bt originarn descendencia

susceptible a las altas dosis de toxinas, restablecindose en la poblacin los alelos susceptibles removidos por la seleccin. Los alelos susceptibles provistos por el refugio diluyen los alelos resistentes que puedan surgir en el lote de cultivo Bt despus de la seleccin, convirtindolos nuevamente en poco frecuentes. Al favorecer la reintroduccin de los alelos susceptibles desde el refugio, se mantiene la proporcin natural (inicial) de individuos susceptibles y resistentes dentro de la poblacin y se evita el desarrollo de resistencia, preservando la tecnologa. (2) Los refugios pueden adoptar variadas formas, dependiendo de la abundancia de vegetacin de cultivo o silvestre y de las prcticas de uso de insecticidas en el rea. En la figura 1 se ilustran ejemplos de refugio de maz no-Bt que pueden sembrarse en asociacin con maz Bt protegido de insectos. (3) Beneficios de la Tecnologa Bt Control biolgico: Los enemigos naturales, como los predadores y parasitoides, cumplen una funcin ecolgica y econmica importante en cuanto al mantenimiento de la poblacin de insectos herbvoros por debajo de los umbrales de dao econmico. De esta manera contribuyen a los sistemas sustentables de manejo integrado de plagas. Se ha comprobado que los cultivos transgnicos disponibles a la fecha que expresan protenas Cry derivadas de Bacillus thuringiensis, no tienen efectos sobre los enemigos naturales debido a su restringido espectro de actividad y que la disminucin en el uso de insecticidas en los cultivos Bt, beneficia significativamente a los organismos de control biolgico. Como consecuencia, esta tecnologa puede contribuir a la conservacin de los enemigos naturales, deviniendo en una herramienta muy til para el manejo integrado de plagas. Reduccin de micotoxinas: Las micotoxinas son metabolitos secundarios de los hongos que colonizan los cultivos. El dao por insectos es uno de los factores que predisponen
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Figura 1: ejemplos de plantacin de refugios.

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a la contaminacin por micotoxinas en maz debido a que abren la puerta de entrada a los hongos a travs de los canales que realizan en los tallos. Por esta razn, cualquier mtodo que reduce el dao de orugas, tambin reduce el riesgo de contaminacin por hongos, y se ha observado que los maces Bt muestran una reduccin significativa del nivel de las micotoxinas ms comunes. Reduccin de plaguicidas: La adopcin de cultivos resistentes a insectos redujo el uso de insecticidas, disminuyendo as el impacto del uso de los mismos sobre el medio ambiente. Adems, la reduccin del uso de insecticidas benefician directamente a los productores, aumentando el margen bruto. Aumento del rendimiento: Todos los reportes acerca de los beneficios de la adopcin de cultivos Bt mencionan como un punto de gran relevancia el aumento de los rindes en comparacin con las tecnologas convencionales. Menor uso de agua: Al disminuir el nmero de pulverizaciones con insecticidas, la tecnologa Bt contribuye al uso racional del agua. (1,2)

Genes de origen vegetal Inhibidores de proteasas: Los inhibidores de proteasas (IP) son candidatos posibles para mejorar la toxicidad de Bt contra lepidpteros, agregando la posibilidad de control de colepteros, dpteros y otros insectos. Los IP son parte del sistema de defensa de la planta contra el ataque de los insectos y se pueden encontrar en hojas, frutos, tubrculos o semillas. Para poder digerir sus alimentos, muchos insectos producen proteinasas, como la tripsina, o enzimas semejantes a la quimotripsina. Las protenas antimetablicas, como las IP, interfieren en el proceso digestivo de los insectos susceptibles y, de esta manera, afectan su crecimiento y desarrollo. Tomando este concepto, se han transformado plantas con secuencias de genes IP que, escoltados por promotores adecuados, pueden expresar altos niveles de estas protenas. Los IP se encuentran comnmente en los alimentos derivados de vegetales y son fcilmente inactivados con la coccin. Teniendo en cuenta esta precaucin, la expresin de genes que codifican para IP en plantas se puede considerar como una estrategia segura. Se ha observado que no siempre estos genes actan como antimetabolitos efectivos, sino que hay un gradiente de efectividad frente a diferentes insectos y que, adems, muchas veces no son tan efectivos como los genes Bt.

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Para que las plantas transgnicas puedan ser utilizada de manera precisa y sostenible, es necesario un conocimiento detallado de la fisiologa digestiva de la plaga a combatir. En base a estas observaciones se debe optimizar la interaccin entre el IP introducido y la proteasa blanco del insecto para incrementar la accin del gen expresado en la planta transgnica. Otra estrategia para mejorar los niveles de control puede ser utilizar ms de un gen IP para interferir en diferentes proteasas del insecto. Tambin se ha propuesto el uso de IPs en combinacin con los genes Bt. (1,4) Genes inhibidores de alfa amilasa: as como los IP, los inhibidores de -amilasa son producidos por las plantas como un mecanismo natural de defensa contra insectos. La toxicidad de los inhibidores de -amilasa se produce mediante la interferencia en la digestin de los carbohidratos. El inhibidor impide la accin de las -amilasas del sistema digestivo del insecto impidiendo que la larva del mismo pueda utilizar almidones de la semilla como fuente de energa para su desarrollo. (5) Lectinas: son protenas con unin especfica a carbohidratos. El rol principal que se les atribuye es el fenmeno de reconocimiento biolgico que involucra clulas y protenas. Para ser clasificadas como lectinas, las protenas de unin a carbohidratos deben poseer por lo menos dos sitios de unin. Esta caracterstica les permite aglutinar o precipitar estructuras que contienen residuos de azcares. Se ha determinado que algunas lectinas vegetales poseen un mayor o menor efecto entomotxico o actividad insecticida. La toxicidad sera consecuencia de la interaccin con las glicoprotenas intestinales. Como en otros casos de genes provenientes de plantas, las lectinas pueden combinarse con otros genes, como por ejemplo, con distintos tipos de Bts, para combatir plagas de lepidpteros y de hompteros a la vez. Algunas lectinas tienen limitaciones en su aplicacin en alimentacin de mamferos superiores debido a su toxicidad. Quitinasas: son enzimas digestivas que rompen las uniones glucosdicas de la quitina, sustancia que compone las paredes celulares de hongos, el exoesqueleto de algunos gusanos, y cutculas de insectos, nematodes y artrpodos. Se encuentran en organismos que deben digerir su propia quitina o la de otros individuos como hongos o animales. Pueden funcionar como txicas para insectos si son capaces de degradar la capa de quitina de las membranas que protegen el epitelio intestinal. En plantas superiores la expresin gnica de las quitinasas se activa por la invasin de patgenos, por lo que se cree que cumplen un rol importante de defensa. Ya se ha comprobado la accin
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inhibitoria sobre el crecimiento de hongos, pero la aplicacin en el control de insectos an no est fehacientemente descripta. Avidina: es una glicoprortena que se encuentra en la clara del huevo de gallina y tiene la propiedad de secuestrar la vitamina biotina. La avidina puede ocasionar una deficiencia letal de esta vitamina y evitar el desarrollo de insectos durante el almacenamiento de granos. Por lo tanto, la avidina expresada en los granos puede ser efectiva como biopesticida para un amplio espectro de especies de insectos. Los datos sobre la efectividad y especificidad de accin de las avidinas no estn tan completos como en el caso de las entomotoxinas Bts, pero se considera que podran usarse como alternativa o complemento de esta tecnologa. Polifenol oxidasas: las enzimas llamadas polifenol oxidasas (PPOs) catalizan la oxidacin de compuestos fenlicos a quinonas. Frecuentemente su induccin se asocia con la respuesta de las plantas a seales o daos producidos por patgenos o insectos. Por estas observaciones se sugiere que tendran la capacidad de conferir resistencia tanto a enfermedades provocadas por bacterias como por insectos. La manipulacin de la actividad de PPOs para generar resistencia tambin podra ser un componente del manejo integrado de plagas. Combinacin de genes: muchos de los genes candidatos para resistencia a insectos plaga que pueden ser usados en transformacin gentica son muy especficos o a veces medianamente efectivos. Para cubrir ms posibilidades de control y evitar las posibles apariciones de resistencia, es recomendable plantear sistemas de apilamiento de distintos genes en la misma planta. Asimismo, sera ms efectivo combinar sistemas de genes que participen en sistemas metablicos diferentes. Para efectuar una sinergia efectiva entre la biotecnologa y el mejoramiento gentico, las distintas estrategias planteadas de expresin de genes en plantas, a su vez, deben ser incluidas dentro del sistema de manejo integrado de plagas. (1)

Estrategias de ARN de interferencia (ARNi) Los organismos eucariticos poseen una maquinaria comn de silenciamiento gnico de secuencias especficas que es disparado por la presencia de ARNs de doble cadena (dsRNA), que sirve para regular la expresin de ciertos genes. El mecanismo de RNAi implica que molculas largas de dsRNA sean cortadas en fragmentos pequeos por
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enzimas que degradan RNA. Los RNAi resultantes son incorporados a un complejo de numerosas protenas celulares que influyen en la separacin de la doble cadena en dos cadenas sencillas, una de las cuales (cadena gua) se mantiene asociada al complejo y sirve para identificar al RNA mensajero (mRNA) con la secuencia complementaria. La interaccin entre el RNAi y este mRNA desemboca en el corte del mRNA y su posterior degradacin. De esta forma, la expresin del gen que presenta la misma secuencia que los dsRNA, se inhibe. (6) Este proceso se conoce como interferencia del RNA (RNAi) en animales ysilenciamiento gnico post transcripcional en plantas (PTGS). El silenciamiento de algunos genes esenciales en insectos, mediado por los dsRNA, puede inducir el cese de la ingestin y, eventualmente la muerte. La utilizacin de la estrategia de ARN de interferencia para control de insectos requiere de una llegada eficiente al sitio de accin (tanto va ingestin o por aplicacin tpica) de las molculas de dsRNA. Los genes candidatos blanco ideales para silenciar de esta manera podran ser los que codifican para protenas con funciones esenciales para el insecto. Asimismo, se ha estudiado la posibilidad de control combinando mediante el uso de ARN de interferencia, de ms de un gen. Este enfoque alternativo al control de plagas puede ser efectivo tambin en combinacin con genes Bt, tanto para control de lepidpteros como de colepteros, segn la secuencia que se introduzca en la planta. (1)

Beneficios e impactos de la tecnologa Bt en Argentina En el ao 1998 se han aprobado por primera vez en Argentina los eventos de maz y algodn con resistencia a insectos para su produccin y comercializacin. Maz Bt: El beneficio de la adopcin de la tecnologa Bt consiste en la prevencin de las prdidas de rendimiento causadas por el ataque de Diatraea saccharalis (barrenador del tallo) en su estado larval. Los maces Bt actualmente en el mercado producen tanto protenas Cry como Vip y centran su control en el barrenador del tallo (Diatraea saccharallis), pero tienen tambin un gran potencial para el control de otros insectos lepidpteros y colepteros. La resistencia a insectos en algunos eventos de maz Bt se presenta junto con la caracterstica de tolerancia a herbicidas (glufosinato de amonio y/o glifosato). (2)

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Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), cuyo estado larval es conocido popularmente como barrenador del tallo, es la plaga de mayor impacto econmico en la regin pampeana de la Argentina. Las prdidas de rendimiento se originan por el hbito barrenador de las larvas, cuya accin
Figura 2: barrenador del tallo.

produce un dao de tipo fisiolgico

al disminuir el flujo de agua y nutrientes de la planta y un dao de tipo mecnico que consiste en la fractura de tallos y la cada de espigas, con la consiguiente repercusin sobre el rendimiento. (7) Por otra parte, los orificios provocados en la superficie de la planta posibilitan el ingreso de hongos que producen sustancias que son altamente txicas para animales y humanos, las denominadas micotoxinas. En la figura 2 se puede observar el dao causado por las larvas de Diatraea saccharalis en los tallos de plantas de maz. Al realizar un control casi absoluto de las plagas objetivo, el maz Bt permite expresar el potencial de rendimiento an en presencia de ataques importantes de plagas como Diatraea saccharalis. Adems, debido a su toxicidad selectiva, el maz Bt colabora en la preservacin de poblaciones de insectos benficos que pueden verse amenazados por el uso de insecticidas no selectivos. (2) Algodn Bt: El algodn Bt actualmente en el mercado expresa una protena Cry, que tiene actividad contra un espectro reducido de insectos. El algodonero, por sus caractersticas de prolongada vegetacin y fructificacin, es atacado por numerosas plagas en distintos momentos del ciclo. stas afectan su rendimiento y calidad final de fibra y semillas y constituyen uno de los principales factores limitantes para la produccin. Entre las plagas presentes en el agro-ecosistema algodonero argentino, las de mayor relevancia son orugas de lepidpteros como Helicoverpa gelotopoeon, que se ilustra en la figura 3. El algodn Bt provee resistencia a esta plaga pero no provee resistencia contra insectos colepteros o succionadores (chinches y hompteros).

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Helicoverpa gelotopoeon procura satisfacer sus necesidades nutritivas buscando alimentos con elevados contenidos proteicos. En algodn ataca la bellota, dejando la entrada rodeada de sus

excrementos. En la primera generacin cuando la planta an no tiene fructificacin, la larva se alimenta de brotes terminales en cuyo caso, la planta si se recupera emite brotes axilares y se ramifica. En
Figura 3: Helicoverpa gelotopoeon

la segunda generacin el dao suele ser ms importante, porque ya afecta los rganos reproductivos prefiriendo botones florales y pequeas cpsulas an inmaduras. Est comprobado que el algodn Bt sufre menos dao por parte de las plagas objetivo y puede desarrollarse con menos tratamientos de insecticidas, reducindose as el impacto ambiental de la produccin de cultivos. (2)

Conclusin La Biotecnologa y la Ingeniera Gentica se han introducido en nuestra vida. La expansin de la investigacin biolgica est generando un conocimiento mucho ms profundo del funcionamiento de los seres vivos. Como consecuencia, se abren mltiples posibilidades de desarrollar nuevas tecnologas de produccin o de generar nuevos productos, que pueden tener un gran impacto en la industria, en el medio ambiente, y ms directamente en la alimentacin y en la salud de las personas. Toda nueva tecnologa genera recelo y siendo en principio neutra su aplicacin puede resultar ms positiva o ms negativa dependiendo de cmo se utilice. Es lgico por tanto que se plantee el debate entre distintos sectores que observan de manera diferente los aspectos positivos y negativos de su aplicacin. Tanto las tcnicas de transformacin gentica vegetal como las de ingeniera gentica ya son rutina en muchos laboratorios de desarrollo tecnolgico e investigacin. No obstante, algunos aspectos como el aislamiento de genes candidatos y su efectiva expresin en plantas an son estudiados y ajustados. Muchos son los beneficios que aportan las tecnologas destinadas a la generacin de plantas con resistencia a insectos, aunque cabe aclarar, que an no se conocen con certeza los posibles efectos a largo plazo.
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Es importante en todo caso que tanto agricultores, como empresarios y cientficos tengan la capacidad de pensar en el maana, ms all de sus propios beneficios y ambiciones. Al constituir el conocimiento biolgico un centro de la economa y ser centro de la vida, parece imprescindible eliminar fronteras entre responsabilidad tcnica y responsabilidad social y ecolgica. Slo as los conocimientos y las nuevas tecnologas que surjan en este campo podrn constituir un factor de progreso para la Humanidad.

Bibliografa (1) Dalia Lewi; Clara Rubinstein. Obtencin de plantas resistentes a insectos. www.argenbio.org (2) Manejo de resistencia de insectos. www.programamri.com (3) Rol del refugio en el manejo de plagas. www.monsanto.com (4) Protenas insecticidas y proteasas digestivas. Centro de investigaciones biolgicas. www.cib.csic.es (5) Biocontrol de insectos. Agrobiotecnologa, 2013. www.fbmc.fcen.uba.ar (6) Toms Lpez, Daniela Silva, Susana Lpez y Carlos Arias. RNA de interferencia: el silencio de los genes.

www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_10.pdf (7) Serra, G. y Trumper, E. Estimacin de incidencia de daos provocados por larvas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) en tallos de maz mediante evaluacin de signos externos de infestacin. Agriscientia, 2006, vol. XXIII (1): 1-7.

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