ndice

Introduccin......................................................................................... 1 Resultado .............................................................................................. 3 Medio de cultivo solido: ................................................................. 3 PDA (Agar papa dextrosa) ............................................................. 3 Agar nutritivo .................................................................................... 8 Medio de cultivo liquido: ............................................................. 10 Caldo nutritivo EC (Escherichia coli). ......................................... 10 Discusin de resultados .................................................................. 12 Conclusin ........................................................................................... 13 Paginas consultadas......................................................................... 15

Introduccin

En Microbiologa la esterilizacin se define como el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie y su uso garantiza la ausencia de

microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados.

Existen diversos mtodos de esterilizacin, entre ellos: calor (seco o hmedo), filtracin (para sustancias termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin de gas de oxido de etileno (para jeringas y cajas de plstico). Pero nos enfocaremos a mtodos de calor que son los que hemos utilizaremos.

El medio de cultivo es un sistema para el reconocimiento de microorganismos, en donde se puede observar su crecimiento. ste es una mezcla de nutrientes que cuenta con concentraciones adecuadas y optimas condiciones fsicas con el fin de que el microorganismo se desarrolle.

Por lo que se debe tener un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso para asegurarnos de la confiabilidad de los resultados a obtener.

Existen diversos tipos de medios de cultivo que pueden prepararse en diferentes formas liquida (caldo) o en forma solida (agar, gelatina o slicagel). .

Resultado
Medio de cultivo solido:
PDA (Agar papa dextrosa)

USO Para cultivo y recuento de hongos y levaduras en productos lcteos, bebidas embotelladas y alimentos. Como medio preparado para la cuenta de hongos y levaduras en lquidos. PRINCIPIO La infusin de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos y levaduras, agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45C, 14 ml de una solucin estril de cido tartrico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. Sembrar el medio de cultivo por estra en la superficie o adicionar la muestra para la tcnica de vaciado en placa. Incubar hasta 7 das a temperatura ambiente. FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA Agar Dextrosa Infusin de papa 15.0 20.0 4.0 pH 5.6 0.2

PREPARACION Rehidratar 39 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar de acuerdo a la tcnica a seguir en cajas de Petri estriles. Cuando se requiera el medio inclinado en tubo, distribuirlo antes de esterilizar. Si se acidifica el medio, no sobrecalentar y fundir solo una vez, para evitar la hidrlisis del agar.
Peso del PDA (5.85 gr) para preparar 150 ml de cultivo

CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO CEPA ATCC 10231 ATCC 9763 ATCC 9533 ATCC 16404 RESULTADO Colonias crema, lisas. Colonias crema, lisas. Colonias blancas, reverso blanco a marrn, algodonosas. Colonias de apariencia lanosa de blanco a negro, reverso amarillo.

Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Trichophyton mentagrophytes Aspergillus niger

Candida albicans Descripcin micolgica Hongo dimorfo que forma largas seudohifas, hifas y blastoconidios (clulas gemantes subesfricas de 3-8 x 2-7 m). Asimilan y fermentan azcares. Numerosas clamidosporas unicelulares, redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente (8-16 m de dimetro),

situadas al final de las hifas, seudohifas o laterales sobre blastoconidios ovalados. Colonias de crecimiento rpido, circulares, lisas, blancas o cremosas, pastosas y blandas, de bordes precisos, centro ligeramente prominente, con olor a levadura. Ecologa Candida albicans est asociada ecolgicamente a seres vivos de sangre caliente. Su temperatura ptima de crecimiento es 37 C. Los tractos digestivo y respiratorio, junto con la mucosa genital (vagina), son los reservorios ms importantes en los seres humanos y origen de candidiasis endgenas. En estas localizaciones se comporta como un saprobio y su aislamiento no implica por s solo la presencia de infeccin. Candida albicans no sobrevive durante mucho tiempo en superficies secas pero su supervivencia es mayor cuando hay humedad y se ha aislado de los cepillos dentales, cremas de manos, cosmticos y ropa. Enfermedad humana La asociacin entre Candida albicans y alergia es controvertida a excepcin de las canddides que con escasa frecuencia son observadas en pacientes con colonizacin o infeccin cutneo mucosa por Candida. Sin embargo, las pruebas de reactividad cutnea con extractos de Candida albicans son positivas en un elevado nmero de personas y las pruebas de provocacin bronquial han mostrado la reactividad clnica en algunos pacientes. Se han detectado anticuerpos IgE en pacientes con rinitis alrgica y asma y en pacientes con urticaria crnica o recurrente se han observado reacciones de hipersensibilidad de tipo I, III y IV. Candida albicans puede producir infecciones superficiales que afectan a piel, uas y mucosas. La piel hmeda y las mucosas oral y vaginal son lugares donde la infeccin candidisica es frecuente.

Saccharomyces cerevisiae Conocida desde la antigedad, la levadura del pan, del vino y de la cerveza, Saccharomyces cerevisiae, se ha convertido en un organismo de estudio comn en el laboratorio. La investigacin biotecnolgica ha mantenido el uso tradicional que se ha hecho de esta levadura, mejorando e innovando los procesos de panificacin y de produccin de bebidas alcohlicas. A la vez, este organismo ha ganado protagonismo en el

laboratorio al convertirse en un potente modelo biolgico de organismos eucariotas. El microorganismo que da cuerpo al pan Saccharomyces cerevisiae es una levadura, un hongo unicelular, del grupo de los ascomicetos. Este grupo incluye a ms de 60000 especies, entre ellas las trufas, las colmenillas o el Penicillium, el hongo que produce la penicilina, pero tambin a hongos patognicos tanto de plantas como de animales, el ms conocido de los cuales es Candida. En la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azcares o en los exudados y savias dulces de algunas plantas. El trmino "levadura" (de "levare" en la acepcin de subir o levantar) remite a la experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando se aade levadura a la harina. Su nombre alternativo de "fermento" viene del latnfervere, que quiere decir hervir y proviene del movimiento del mosto durante la produccin de vino o cerveza. Por lo tanto, el conocimiento y percepcin de la levadura est absolutamente condicionado por sus propiedades de fermentacin del pan, el vino o la cerveza.

Trichophyton mentagrophytes Las dermatofitosis o tias (Tinea) son micosis superficiales causadas por un grupo de hongos queratinoflicos estrechamente relacionados, denominados dermatofitos. Estos afectan la capa crnea de la piel, pelos y uas. Los dermatofitos se dividen en tres gneros que se distinguen por las caractersticas morfolgicas de sus macroconidios: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton. El gnero Trichophyton tiene macroconidios alargados cuya porcin distal es redondeada, de pared delgada y lisa, miden de 8 a 50 m, el nmero de septos va de 4 a 6. En la actualidad se consideran 40 las especies causantes de enfermedad, de las cuales cinco son las ms frecuentes: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum. El dermatofito que causa el 80-90% de esta micosis es T. rubrum. La mayora de los dermatofitos tienen una amplia distribucin mundial, aunque algunos estn geogrficamente restringidos, como T. concentricum.

Ecologa. Los dermatofitos se clasifican en tres grupos ecolgicos en base a su hbitat natural y su preferencia por el hospedero.

Antropoflicos, grupo de dermatofitos que parasitan el tejido humano. Se ha descrito que estas especies evolucionaron de los hongos zooflicos y que gradualmente perdieron su afinidad por la queratina del animal. Las especies ms importantes son: T. rubrum, T. tonsurans, T. violaceum, T. schoenleinii, T. mentagrophytes var interdigitale, M. audouinii y E. floccosum. En casos excepcionales M. audouinii y T. rubrum han sido aislados de escamas y pelos de animales. Zooflico, son dermatofitos que afectan a una gran variedad de aves y mamferos que actan como hospedero. Los principales son M. canis, T. equinum y T. gallinae. Geoflico, grupo de dermatofitos que viven en el suelo. La mayora de las especies no son patgenas: M. gypseum, M. fulvum, T. terrestre.

Aspergillus niger

Una de las especies de hongos filamentosos ms comunes es el gnero Aspergillus. ste fue descrito por primera vez por Micheli en 1729, que lo denomin con este nombre por su parecido con un "aspergillum" (instrumento religioso utilizado para dispersar el agua bendita). Aspergillus es un hongo filamentoso del grupo Deuteromycetes u hongos Imperfectos, se caracteriza por unas estructuras esporferas o reproductoras llamadas conidias. El Aspergillus es un hongo ampliamente difundido en la naturaleza ya que se llega a desarrollar en vegetales en descomposicin, granos de cereal, tejidos de algodn y, lana y plumas; su medio es un ambiente oscuro, hmedo y cerrado.

Es posible encontrar esporas de Aspergillus en los depsitos de cereal, en los edificios en obras, en los aparatos de aire acondicionado y en los alimentos enmohecidos. Las esporas de este hongo pueden sobrevivir en condiciones adecuadas, durante miles de aos; se han encontrado esporas de A. niger y flavus en a comida, ropas, flores y otros objetos de las tumbas de los faraones del antiguo Egipto. Tambin haba una notable presencia de ambas especies en los restos del rey Casimiro de Polonia y en la momia y el sarcfago de Ramses II. Al comienzo de su crecimiento Aspergillus niger forma colonias miceliales lanosas blancas o amarillentas; a medida que ste se desarrolla la superficie micelar se va cubriendo de puntos negros: son las cabezas aspergiares que pueden llegar a medir hasta 1 mm de dimetro, stas se encuentran cargadas de esporas negras. Este hongo es un importante agente productor de cidos orgnicos, principalmente glucnico, ctrico y oxlico; tambin es utilizado para la obtencin de enzimas como la glucoamilasa y del 1--galactosidasa, por lo que es ampliamente cultivado para la produccin industrial de estos compuestos qumicos.

Agar nutritivo
Es un medio de cultivo enriquecido sin aditivos preparado para la recuperacin y aislamiento de toda clase de microorganismos gram-positivos y gram-negativos, hongos y levaduras que no requieren elementos especiales para su crecimiento, se usa principalmente para el mantenimiento de cepas, realizacin de subcultivos para confirma la pureza de los aislamientos. USO Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento y recuento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso est descripto en procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

FUNDAMENTO Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrgeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estril para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualizacin de las reacciones de hemlisis. FRMULA Pluripeptona................................................................................................................5.0 g Extracto de carne........................................................................................................3.0 g Cloruro de Sodio.........................................................................................................8.0 g Agar..........................................................................................................................15.0 g Agua purificada......................................................................................................1000 ml pH final: 7.3 0.2 INSTRUCCIONES Colocar los frascos cerrados en bao mara y llevar a ebullicin para fundir el medio de cultivo slido contenido en los mismos. Una vez que se ha fundido el medio de cultivo, retirar cuidadosamente los frascos del bao mara y dejar enfriar. Cuando alcanzan temperatura 45-50 C, abrirlos y distribuir aproximadamente 15 ml en placas de Petri estriles. PROCEDIMIENTO Siembra En superficie: inocular directamente la muestra por estra. En profundidad: inocular una alcuota de la muestra directa o de su dilucin. Verter un volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40-45C. Homogeneizar mediante movimientos de vaivn y rotacin. Dejar solidificar.

Incubacin El tiempo, la temperatura, y la atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se quiera recuperar. En general se recomienda: Bacterias de fcil crecimiento: en aerobiosis, a 35-37 C durante 18 a 24 horas. Bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales: en atmsfera con 5-10 % de CO2, a 35-37 C durante 24-48 horas. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS: Ya que para la utilizacin de este medio se deben manipular microorganismos patgenos, se deben guardar las ms estrictas normas de asepsia y antisepsia, los cultivos una vez ledos deben esterilizarse y luego colocarse en bolsa roja identificada y entregada a la compaa especializada en recoleccin de productos biolgicos de desecho.

Medio de cultivo liquido:

Caldo nutritivo EC (Escherichia coli).
USO Medio de cultivo selectivo para determinar la presencia de organismos coliformes y Escherichia coli a partir de diversas muestras. PRINCIPIO La lactosa es la fuente de energa para los microorganismos lactosa positiva, especialmente coliformes y Escherichia coli con produccin de gas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Gram positivos. La peptona de casena proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de las bacterias y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico.

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De acuerdo al volumen de la muestra en estudio, se siembra en el medio de cultivo. Si es de 1 ml, se incorpora directamente al Caldo de concentracin sencilla y si es mayor, al Caldo de concentracin doble para que la concentracin final sea la adecuada. Incubar 48 h a 35C.

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico

5.0 4.0 1.5

Lactosa Sales biliares Peptona biotriptasa

pH 6.9 0.2

5.0 1.5 20.0

REPARACION Rehidratar 37 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo. Cuando la porcin de la muestra a analizar es de 10 ml preparar el medio a concentracin doble. Distribuir en tubos de ensayo o frascos con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C. CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO Escherichia coli Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae CEPA ATCC 25922 ATCC 14028 ATCC 27853 ATCC 10031 ATCC 8090 CRECIMIENTO Bueno Bueno Moderado Bueno Bueno GAS + + +

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Discusin de resultados
En un laboratorio es muy importante utilizar material estril, puesto que todo, incluido el aire y las personas estamos cubiertos de bacterias y esporas, y esto podra ver afectado nuestro medio de cultivo y as los resultados no son confiables. Los medios de cultivo artificiales renen una serie de condiciones fsicas (temperatura, humedad, presin, acidez o alcalinidad) y adems contener nutrientes necesarios para el crecimiento de los organismos. Existen medios de cultivos lquidos, slidos y semislidos.

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Conclusin
Como sabemos la esterilizacin es la eliminacin total de todos los microorganismos incluyendo las esporas. En esta prctica, utilizamos la esterilizacin por calor hmedo (autoclave) para preparar medios de cultivo en agar, agar dextrosa papa y el caldo nutritivo y adems el calor seco para la esterilizacin de la mesa y dems materiales Una de las grandes importancias del medio de cultivo es que te permite la observacin e identificacin del microorganismo para su estudio. Un ejemplos es el diagnostico de bacterias patgenas. En la prctica que hicimos primero esterilizamos el material procedimos a preparar los cultivos pesando exactamente la cantidad a utilizar en el caso del PDA con una regla de 3: 1000 ml--------------39 gr 150 ml-------------5.85 gr Y as mismo preparamos las soluciones bfer, donde la cantidad a utilizar fueron: 1000 ml--------------20 gr y 0090 ml-------------1.8 gr 0070 ml-------------1.4 gr 1000 ml--------------20 gr

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Una preparacin de bfer se vaci en tubos de ensayo y la otra preparacin se guardo para uso posterior. Y despus se puso a calentar hasta logar un color transparente, cuando vallamos a proceder con los vaciados se ponen los cultivos ya preparados a esterilizar con el dems material. Al proceder al vaciado de los recipientes en la caja de petri o placa y en los tubos de ensayo se esteriliza la mesa con alcohol etlico y benzal pasamos despus el mechero encendido en la mesa para dejar esterilizado el lugar para vaciar los medios de cultivo cerca del mechero Los cultivos usados como el PDA se usan en el recuento de hongos y levaduras en productos lcteos, bebidas embotelladas y alimentos El agar nutritivo es usado para la recuperacin y aislamiento de toda clase de microorganismos gram-positivos y gram-negativos, hongos y levaduras Y el caldo nutritivo EC es un medio de cultivo selectivo para determinar la presencia de organismos coliformes y Escherichia coli a partir de diversas muestras. Hay distintos tipos de cultivos para preparar, pero nosotros solo utilizamos estos 3 para el cultivo de microorganismos para despus proceder al cultivo y estriado.

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Paginas consultadas.
Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 13th De. APHA. Inc, New York 1960 American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological examination of foods. Segunda Edicin. 1984. Standard Methods for examination of water and wastewater 15th edition; Ed. American Public Health Association: Washington D. C. 1980. Bial, Arstegui. Candida albicans. (2002) Espaa. [En lnea]. Disponible en: http://hongos-alergenicos.reviberoammicol.com/files/025.PDF, [Consultado 29 de septiembre, 2013]. Seres modlicos Entre la naturaleza y el laboratorio. La levadura de la cerveza y... del laboratorio. Espaa. [En lnea]. Disponible en: http://www.seresmodelicos.csic.es/llevat.html [Consultado 29 de septiembre, 2013]. UNAM, Dermatofitosis. (2013) Mxico. [En lnea]. Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/dermatofitosis. html [Consultado 29 de septiembre, 2013]. UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, Difusin y Crecimiento Microbiano de Aspergillus niger sobre un Medio Slido. (2006) Mxico. [En lnea]. Disponible en: http://148.206.53.231/UAMI14642.pdf [Consultado 29 de septiembre, 2013].

Britania, Nutritivo Agar. (2010) Argentina. [En lnea]. Disponible en: http://www.britanialab.com/productos/234_inserto_es.pdf [Consultado 29 de septiembre, 2013].

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