Transporte polar de la Auxina y su rol en la respuesta gravitrpica.

Un tipo de respuesta de la planta corresponde al fototropismo, que se evidencia en la curvatura de esta en respuesta a la luz. Particularmente, como se vio antes, es el coleptilo quien responde a este estmulo. Cmo participa la auxina de este proceso? Hay auxinas naturales y otros compuestos que actan de forma similar a la auxina. Otro punto importante es que Auxina es el nombre genrico para la hormona (son un grupo o familia de fitohormonas), mientras que el cido indol actico es una de las formas predominantes de auxina en las plantas. Hay muchas tipos de auxina en una planta, y dems hay otros compuestos qumicos que inducen su produccin, as como hay otros compuestos qumicos que tienen actividad de auxina. Rol fisiolgico de las Auxinas: Regulan el crecimiento celular y la divisin celular. El crecimiento lo regulan por expansin o diferenciacin celular. Genera patrones celulares en el embrin. Desarrollo y formacin del tejido vascular (xilema) Participa en el desarrollo y maduracin de los frutos. (Por ejemplo, en las frutillas el verdadero fruto son los aquenios [pepitas]. Los aquenios producen auxina. Si uno remueve los aquenios, de una frutilla en desarrollo, se obtendrn frutillas ms pequeas, de color y forma diferente. Si uno toma un fruto cuyos aquenios fueron removidos durante el desarrollo, pero se le roca con auxina, se ver un cierto grado de reversin en el fenotipo en trminos del color, pero la forma ya no se recupera. ) Desarrollo de races principales y laterales (raz principal crece hacia el fondo en busca de agua. En algunas plantas, esta se arboriza y genera races laterales para poder asentarse y adems buscar agua) Regula algunas respuestas celulares como son, expansin y/o polaridad celular a travs de efectos directos sobre el citoesqueleto y trfico de protenas a nivel de membranas. Regulas respuestas fototrpicas y gravitrpicas. Regula la expresin de muchos genes que dirigen la mayora de las respuestas con relacin al desarrollo. Cambios a nivel postraduccional. (notar que respuestas foto y gravitrpicas son rpidas y no siempre dependen de transduccin gnica)

Las hormonas actan en conjunto y bajo ciertas concentraciones (niveles hormonales) producen algn efecto en particular. Las hormonas no comandan procesos por s mismas, sino que lo hacen en un contexto hormonal general de la planta. Rol de la auxina en el desarrollo: Tomando como ejemplo a Arabidopsis. Se tiene la estructura clsica de una planta: raz, tallo, hojas y flores (S. reproductivo). La auxina participa a en todos los procesos de desarrollo de todas estas estructuras:

Desarrollo floral, desarrollo de los frutos, desarrollo del embrin en semillas, filotaxis (patrn de crecimiento de las hojas), elongacin de races (una de las imgenes se muestra una microscopia de fluorescencia que da cuenta del patrn de los niveles de auxina. En verde es donde hay ms). Dominancia apical (nmero de tallos que genere la planta). Forma de las hojas y patrn de desarrollo de venas en ellas. Patrn de las races (tipos celulares presentes en las distintas zonas de una raz, es decir, tejidos). Formacin de races laterales. Desarrollo vascular, etc.

Transporte polar de la auxina Una vez que se descubri la existencia de la auxina y su importancia en las respuestas fisiolgicas, surgen las preguntas: En qu tejido se produce? En forma mayoritaria se produce en el pice de la planta, particularmente en el citoplasma de las clulas del pice, pero su efecto es producido en otras clulas distintas. A partir de qu metabolito deriva? Triptfano Se hicieron experimentos para ver cmo viajaba la auxina hacia otras regiones de la planta. Lo que se vio fue que si uno cortaba el pice, particularmente el hipoclito, y se pona en la misma orientacin en la que deba estar en la planta entre dos placas de agar (donde la placa de arriba contena auxina marcada radioactivamente), haba un transporte de auxina hacia la placa inferior. Si se invierte la orientacin del hipoclito, pero se mantiene el orden de las placas (donante arriba- receptor abajo), no se encuentra transporte de auxina. Esto quiere decir que la auxina solo es transportada en un sentido: de pice a base. Este sentido se conoce como basiptalo (porque va hacia la base) [el sentido contrario se le conoce como acroptalo]. Entonces, es lgico pensar que existe un mecanismo en las clulas de este tejido que permita el flujo en sentido basiptalo y no en el sentido contrario. [Auxina no se mueve por difusin, a diferencia del etileno] Inicialmente se pensaba que el transporte era por gravedad, sin embargo, en un experimento con tallos de bamb, donde se hacan crecer de forma invertida, pero de todos modos la raz creca arriba, lo que lleva a pensar que hay un grupo de clulas que est destinada a ser raz, independiente de la orientacin en la que se pongan. 2

Ahora se sabe que la diferenciacin de la raz requiere de auxina, y que esta debe ser transportada de forma polar, es decir, no se produce en cualquier sentido, ni tampoco es afectada por la gravedad. La auxina se mueve a travs de la planta por medio del tejido vascular (floema). Pero tambin existe un transporte clula a clula (no por los espacios intercelulares) siempre en sentido apical a basal. Una vez que llega a la raz, puede tener ambos tipos de transporte (basiptalo y acroptalo), es decir, devolverse desde la punta de la raz hasta el pice de la raz. La auxina siempre se concentra en el pice de la raz, desde ah difunde hacia los extremos y la base (pero luego se devuelve). En hojas, la auxina tambin se mueve en una sola direccin: desde el extremo de la hoja, hasta la base de esta (basiptalo). Procesos en el desarrollo son controlados por el flujo de auxina. En la imagen, las flechas indican el sentido en el que se mueve la auxina. e) En la raz, la auxina fluye por el tejido central hacia la punta, y luego cambia su sentido y se devuelve. Si uno interfiere en este flujo normal, se va a observar que el patrn en los tejidos y la forma de la raz cambian radicalmente. Entonces, tanto el flujo de la hormona, como la concentracin en la que se encuentre, estn muy ligados al crecimiento de la raz en la tierra, y por ende tambin a la captacin de nutrientes y la capacidad de la planta para crecer. En a) se muestra el desarrollo de una raz lateral. Tambin existe un transporte hacia la punta. Cuando se forma un nuevo rgano, los flujos pueden cambiar, sin embargo, una vez que se forma la raz lateral, el flujo se restaura. Ac se ve el mismo fenmeno de transporte acroptalo. En b) se muestra un embrin. Se sabe que la auxina migra hacia la punta de los cotiledones, pero luego se devuelve.

Todos los procesos (funciones) sealados anteriormente, tiene que ver con la sensibilidad que poseen ciertos tejidos a distintas concentraciones de auxina. Pero tambin es importante la interaccin con otras hormonas. La forma en cmo se combinan va a activar un cierto patrn de expresin gnica que va a determinar la diferenciacin hacia un tipo de tejido en particular o desarrollar algn tipo de proceso.

La hiptesis quimiosmtica Ya se dijo que la auxina se mueve a travs de los haces vasculares y por transporte clula-clula, siendo este ltimo el ms importante y el que tiene que ver con la respuesta fisiolgica en las plantas. El medio extracelular posee un pH ~5.5 por lo que en este medio, la auxina se encuentra protonada. En esta condicin, IAA-H es capaz de atravesar las membranas lipdicas. Sin embargo, en el citoplasma de la clula el pH ~7, esto hace que IAA se desprotone. IAA- es incapaz de atravesar la membrana. Existen transportadores en la membrana que permiten, por una parte, el ingrese de IAA- desde el espacio extracelular al citoplasma (Transportadores de entrada), y otros transportadores que permiten la salida de IAA- hacia el espacio extracelular (Transportadores de salida). En el transporte clula-clula, la auxina ingresa al citoplasma (ya sea porque est protonada o usando un transportador), ejerce su efecto al interior de la clula y luego es transportado hacia el otro lado del espacio extracelular, donde puede volver a ser captada por la clula ubicada abajo. Estos transportadores se ubican de forma especfica en la membrana de forma asimtrica, lo que permite que el flujo de la hormona sea polar, es decir, que siga una direccin determinada. (No se transporta a travs del plasmodesmo!). Es ms adecuado hablar de facilitador de auxina, ms que de transportador. Estas protenas facilitan el paso de la auxina al interior o al exterior de la clula, pero no se ha comprobado si efectivamente la auxina se une a esta protena. Un transportador requiere la unin del sustrato que involucra un cambio conformacional del transportador un translocacin al interior de la clula, donde pierde afinidad por el sustrato y lo suelta, a diferencia de un canal que no requiere interaccin directa (solo por cargas). Lo mismo pero un poco ms detallado. Recordar que el crecimiento de la pared celular se da por una acidificacin del medio. Esto hace que IAA pueda protonarse e ingresar pasivamente a la clula o ingresar mediante un transportador. Una vez dentro de la clula IAA se va a desprotonar. Estos H+ sern devueltos a la pared celular mediante ATPasas (bombas de H+), lo que permite conservar el pH en el citoplasma y 4

acidificar el medio de la pared lo que permite la elongacin celular. IAA- ser transportado al exterior de la clula mediante un facilitador, permitiendo que sea captado nuevamente por otra clula que est abajo. Transportadores Los transportadores de entrada de denominan Influx, mientras que los de salida Efflux. En los primeros se cuentan los transportadores AUX y PGP, mientras que los transportadores PIN son los principales encargados de la salida (existe desde PIN1 al PIN8). En la imagen de abajo, se muestran distintas capas celulares de la raz (tejidos). Se ve que existen filas de clulas que tienen la misma identidad, los cuales se disponen de forma concntrica hasta llegar a la base de la planta. Estos patrones de tejidos se originan en el meristema (en rojo en la imagen) las clulas alrededor de esta zona estn en activa divisin, ms hacia arriba viene una zona de elongacin celular y otra de diferenciacin, lo que origina la formacin de pelos radiculares, races laterales y otros rganos. Nuevamente se muestra con flechas el flujo de auxina a travs de los distintos tejidos. Distintos transportadores PIN se localizan en diversos tejidos. Por ejemplo, en la epidermis (regin caf) se encuentra a PIN2 orientado hacia la base de la clula (imgenes de microscopa confocal. Transportadores PIN fueron marcados con GFP). Los transportadores PIN periten la salida de auxina, su orientacin en la clula determinan el flujo polarizado de auxina. Como se mencion antes, si se invierte el flujo de auxina en la raz, se obtienen plantas con fenotipos bastante aberrantes. Por este motivo, los mecanismos que determinan la correcta localizacin de estos transportadores en la clula, son muy importantes. PIN4 permite el flujo solo hacia la base y se expresa en solo en la parte central de la raz (estela). En el caso de PIN3 se ve que se expresa en todas las caras de la clula, esto ocurre porque se presenta en clulas del meristema, y ac el flujo de auxina ocurre hacia todos lados. En resumen: estn las distintas capas celulares que forman la raz, en cada una de ellas existe un patrn de flujo de auxina determinado por la orientacin en la membrana de los distintos transportadores PIN. Esto permite distribuir la auxina de forma no homognea. Segn los niveles de auxina, la respuesta en las clulas es diferente. 5

A lo largo de casi toda la raz, los transportadores PIN y AUX/PGP se ubican de forma opuesta en la membrana (lgico, por un lado entra IAA y por el otro sale). La nica excepcin son las clulas del meristema, en donde se ubican en cualquier posicin ya que la auxina se distribuye en todas las direcciones. Cmo se establece la polaridad en la localizacin de los transportadores en los distintos tejidos? Se sabe que estas protenas poseen un pptido seal que las destina a la membrana plasmtica. Sin embargo, esto no es suficiente para explicar por qu se ubican en una cara de la clula y en la otra no. Estas protenas estn constantemente yendo en vesculas desde la membrana hacia el endosoma y luego van de vuelta a la membrana. Cuando aumenta la concentracin de auxina en el medio, este ciclaje es inhibido. Esto ocurre para protenas influx y efflux, ubicadas ya sea en la cara basal o apical de la clula. En este experimento se muestran protenas marcadas con GFP en clulas de la raz. A tiempo 0, PIN1 se localiza en la base de la clula. Se realiza con fotoblanqueamiento de la protena, sobre-excitndola y haciendo que el fluorsforo se inactive (que es lo que se observa a los 2 minutos). La inactivacin es irreversible. Cuando uno espera una cierta cantidad de minutos, se sintetizan nuevas protenas que vienen con el fluorsforo activo. A los 100 minutos es posible ver que la nueva protena PIN recin sintetizada se localiza en todas las caras de la membrana, sin embargo, a los 200 minutos la protena nuevamente empieza a localizarse de forma polarizada en la membrana. La polarizacin ocurre luego de haber pasado por el endosoma, segn el tipo de protena que sea. Hay que recordar que las protenas tienen una cierta vida media, por lo que estn constantemente siendo sintetizadas y degradadas. Como no es posible seguir una nica protena, no es posible determinar si esta protena una vez que pasa por el endosoma se queda definitivamente en una de las caras de la membrana o si vuelve a ser endocitada. 6

Tambin existe la opcin de que la velocidad en que ocurre el proceso de destinacin a una cara correcta de la membrana, luego de pasar por el endosoma, sea mayor a la velocidad con que las protenas inmaduras son enviadas por primera vez a cualquier sitio de la membrana. Pero tampoco se sabe. Se han buscado protenas accesorias que permitan entender cmo se establece la polaridad. En la imagen se muestran dos modelos, del proceso que ocurre normalmente en las clulas. PIN2 se ubica en la cara apical y PIN1 en la cara basal. Cuando hay un aumento de la concentracin de auxina en el medio extracelular, ingresa mucha auxina al citoplasma, lo que significa que tiene que salir ms. Entonces, se inhibe la endocitosis de los transportadores, y se destinan ms de ellos hacia la cara correspondiente de la clula, permitiendo el flujo de auxina. Durante el proceso de internalizacin al endosoma de los transportadores PIN, existira una interaccin con otras protenas y compartimentos subcelulares (seguir el sentido de las flechas en la imagen) que permiten la mantencin o el enriquecimiento de una de estas protenas en una cara de la membrana. Respuesta a Auxina Una vez que la auxina ingresa a la clula (protonada o desprotonada), se encuentra con un receptor de auxina: receptor SCF, que es un complejo proteico que posee actividad ubiquitina ligasa y que solo se activa en presencia de auxina. En el citoplasma estn los factores de transcripcin ARFs (Auxin response factors) que normalmente estn formando complejos con las protenas AUX/IAA (represores transcripcionales). Existen muchas protenas tipo AUX/IAA as como muchos tipos de factores de transcipcin tipo ARF que generan respuestas distintas en la clula. La diferencia en las respuestas celulares producidas por auxina estara dada por el tipo de clula, la concentracin de auxina, los tipos de AUX/IAA y ARFs que se estn expresando (que depende del pH celular) y el tipo de respuesta segn el proceso celular. Cuando auxina se une al receptor SCF, este va a ubiquitinar a AUX/IAA que est unida a ARF. Dependiendo del proceso celular, se ubiquitinan a distintos AUX/IAA. Cuando AUX/IAA es ubiquitinada, pierde afinidad por ARF, 7

por lo que el complejo se disocia y entonces el represor va a ser degradado en el proteosoma. ARF libre puede viajar al ncleo y activar la transcripcin de distintos genes, segn la respuesta requerida. Ac se midi la actividad transcripcional de distintos genes segn la concentracin de auxina en el medio. En la primera imagen, los dos primeros genes se encuentran inactivos inicialmente, pero cuando se llega a una concentracin umbral de auxina, se ve como se enciende la actividad transcripcional. En el tercer caso es un gen que se expresa constitutivamente, pero al llegar a una cierta concentracin de auxina, la expresin aumenta considerablemente. En la segunda imagen se analiza un mismo gen y su expresin en el tiempo, en tratamientos con y sin auxina. En el primer caso, el gen se expresa constitutivamente, incluso en ausencia de auxina, al recibir el tratamiento, su expresin empieza a aumentar en el tiempo. En el segundo caso el gen se expresa solo en presencia de auxina. En el tercer caso, el tratamiento con auxina no afecta la expresin del gen, es insensible a auxina. Expresin de genes A partir de estos estudios se determin que existen genes que se activan a los pocos minutos de recibir el tratamiento con auxina (genes tempranos) y otros que se activan horas despus (genes tardos) Genes tempranos o genes de respuesta primaria: son genes que son estimulados por factores de transcripcin preexistentes al momento de la exposicin con la auxina (es decir, no requiere sntesis de protenas para activar su expresin). La expresin de estos genes no puede ser bloqueada por inhibidores de sntesis de protena Genes tardos o genes de respuesta secundaria: Requeridos para respuesta a largo plazo. La expresin de estos genes requiere sntesis de protena

Entonces, los genes tempranos permiten la sntesis de factores de transcripcin que luego permitirn activar a los genes tardos. En la imagen se muestran algunos de los genes tempranos activados por auxina. Tambin se activan algunos genes de respuesta a estrs. Gravitropismo Se produce como repuesta a la polaridad en el transporte de auxina (determinado por la orientacin polar de los transportadores en la membrana). Es la capacidad de las plantas de orientar su crecimiento segn el vector de gravedad.

En la imagen se muestra cmo plantas de Arabidopsis son capaces de reorientar el sentido del crecimiento de sus tallos (contra el sentido de la gravedad) a las pocas horas luego de cambiar la orientacin de la maceta en la que crecen. El mismo tipo de respuesta se observa en races, orientndose a favor del vector de gravedad. La radcula, que es lo primero que crece en semillas recin germinadas, inicialmente crecer en cualquier direccin (determinada por la posicin del embrin en la semilla). Sin embargo, una vez que empieza a asentarse en la tierra, las races crecern a favor del vector de gravedad y el tallo (cotiledones en este caso), crecern en contra del vector de gravedad. Si se cambia el sentido del vector de gravedad, la planta se va a curvar, para restablecer el patrn de orientacin original. La planta es capaz de sensar la gravedad por medio de los amiloplastos (si bien es cierto, hay plantas que no producen almidn, y que igual responden a los cambios gravitrpicos, su respuesta no es tan eficiente como en plantas que s tienen amiloplastos). La curvatura se produce segn la concentracin desigual de auxina. El lado que posea una concentracin mayor elongar produciendo la curvatura hacia el otro sentido. A nivel de transportadores PIN, en una clula del hipocotilo normal, estos se encuentran en la cara basal. Cuando se cambia la orientacin de la planta, los receptores PIN tambin cambian su distribucin en la membrana. Una planta que no ha sido graviestimulada tiene el crecimiento normal de su raz, a favor de la gravedad. En la punta de la raz existe una capa de clulas que cubren al meristema, llamada Cap de la raz. Si se remueve totalmente el cap, la planta sigue creciendo, pero disminuye su tasa de crecimiento. Sin embargo, si se remueve solo la mitad del cap, la raz se curvaba sin ser estimulada gravitrpicamente (figura A). Si ahora se cambia la orientacin de la planta. Si la raz tiene cap, esta es capaz de curvarse para crecer en el sentido de la gravedad. Si el cap fue removido totalmente, la raz no se curvar y seguir creciendo en el mismo sentido que tena originalmente (figura B) En el cap de la raz existe una distribucin mayor de auxina. Recordar que en el transporte de auxina, una vez que llega a la base, esta se devuelve. El cap est asociado a este proceso.

Hay transportadores PIN localizados en el cap. En este experimento se une GFP a un gen que responde a la concentracin de auxina (entre ms verde se ve, mayor concentracin). En d) y e) se muestran plantas sin estimulacin gravitrpica. Se aprecia una distribucin bastante simtrica de auxina. Sin embargo, luego de graviestimular a las plantas (figura f), la distribucin es desigual, siendo mayor en la parte inferior. En e) y g) se muestra la planta que se trat con una droga que inhibe la endocitosis de los transportadores; se ve que no solo hay ms auxina, si no que en la punta hay mucha ms en comparacin al control. Cuando se aplica el estmulo, no ocurre una distribucin asimtrica de auxina entre las caras de arriba y abajo, y adems, estas plantas no son capaces de curvarse. A nivel molecular, en condiciones normales, los transportadores PIN3 del meristema se localizan en la cara basal. Cuando se produce el estmulo gravitrpico, estos transportadores ahora se localizan en uno de los laterales, de forma tal que ahora la distribucin de auxina ya no ser homognea y se concentrar en la parte inferior. Adems, tambin es necesario que exista un mayor nmero de transportadores PIN, para que puedan localizarse ahora en el lateral y permitir el flujo de auxina en esa direccin. Cabe preguntarse: hay mayor produccin de transportadores PIN en una cara de la membrana? O hay mayor degradacin de estos transportadores en la cara superior? En k) se ve que los transportadores ubicados en la cara superior son transportados hasta la vacuola para ser degradados (mirar en la pgina 7, la primera figura, que en la ruta el endosoma puede irse a la vacuola). Esto genera que el transporte de auxina sea mayoritariamente hacia la cara inferior, tal como se muestra en las figuras. En la imagen de ms abajo, las flechas sealan la vacuola. En el caso de la raz, se est creciendo menos donde hay ms auxina. La auxina no promueve el crecimiento, sino que lo regula, promovindolo o inhibindolo segn el caso. El tipo de regulacin positiva o negativa depende del tejido en el que actue.

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Un poco ms de lo mismo. Se tiene a PIN2-GFP y se muestran plantas que fueron graviestimuladas y se observaron a los 90 y 360 minutos. En b), a los 90 min se observa que hay menos PIN en la cara superior. En c) se ve que a los 360 min, una vez que se reestablece el crecimiento a favor de la gravedad, tambin se reestablece la distribucin de los transportadores PIN. En la tercera columna se ve el efecto de una droga que perturba el trfico de PIN en la membrana y el endosoma. En estos casos, independiente de cunto tiempo ha transcurrido, no se observa una distribucin asimtrica de los transportadores debido a que no ocurre esta degradacin diferencial en la cara superior. Estas plantas no son capaces de curvarse. Mecanotransduccion en clulas que sensan la gravedad

La clulas de la raz poseen amiloplastos, que son estructuras densas al estar llenas de almidn, por eso se ubican en la base de la clula. Cuando se cambia la orientacin de la planta, los amiloplastos son capaces de moverse. Por mucho tiempo se pens que estos se caan debido a su peso, sin embargo, luego se descubri que en realidad el movimiento est asociado al citoesqueleto. Tambin existen mecanosensores que estn en la membrana plasmtica y que se asocian con los amiloplastos. Cuando los amiloplastos se mueven, cambiaran algunos parmetros en otros organelos asociados a ciertas regiones de la clula. Por ejemplo, presionando 11

distintos lugares del retculo endoplasmtico y la vacuola tendra que reacomodarse en este espacio. Eso gatillara cambios en las vas de transduccin de las seales de los mecanosensores asociados al amiloplasto (mostradas como puntitos negros en el dibujo). En una curva de tiempo, al primer segundo estos mecanosensores se activaran, los amiloplastos empiezan a migrar al igual que los mecanosensores, que pueden viajar a la membrana plasmtica o a organelos asociados a ella (retculo principalmente) iniciando una cascada de transduccin de seales. An se desconocen cules son las protenas que transduciran esa seal, sin embargo, lo que s se sabe es que finalmente esta sealizacin permite reorganizar la orientacin de las protenas PIN en la membrana; en el meristema permitira que PIN3 sea degradado preferencialmente en la cara de la raz que queda hacia arriba, lo que origina el flujo desigual de auxina que inhibe el crecimiento en esa cara de la raz. Los mecanosensores son protenas asociadas en forma inactiva al amiloplasto. Cuando el amiloplastos se mueve, estos se activaran e iran a la membrana a activar a otras protenas. La presin que ejerce el amiloplasto sobre el retculo al moverse, sera la seal que activara a los mecanosensores. No todas las clulas son importantes para la respuesta gravitrpica asociada a amiloplasto. Se ha hecho un mapeo de cules clulas son importantes, mediante microciruga, donde se van extrayendo clulas del tejido y luego se estimula la raz para ver si responde o no. Hoy se sabe que solo algunas clulas en el meristema son importantes para esta respuesta. Es difcil establecer si es el aumento de auxina el que produce la curvatura, o si luego de la curvatura aumentan los niveles de auxina. En la parte apical de la planta, el hipocotilo tambin sensa la gravedad, solo que la curvatura se produce por mecanismos distintos, en estos casos, el aumento de auxina promueve el crecimiento (al revs que en la raz). Se ha estudiado ms la raz, ya que el problema de ver el hipocotilo es que adems del efecto de la gravedad, se tiene un efecto fototrpico actuando simultneamente, en cambio en la raz es mucho ms fcil separar ambos procesos, aunque las races tambin son capaces de sensar la luz.

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