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EJEMPLOS DE MTODOS DE PRUEBA SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS Los mtodos de dilucin El mtodo de dilucin en caldo consiste en someter y aislar a una

serie de concentraciones de bacterias en un entorno de caldo. La prueba de micro dilucin utiliza alrededor de 0,05 a 0,1 ml de volumen de caldo total y se puede llevar a cabo convenientemente en un formato de micro titulacin. Pruebas de macro dilucin utiliza volmenes de caldo de aproximadamente 1,0 ml en tubos de ensayo estndar. La concentracin inhibitoria mnima o MIC se define y se registra para ambos mtodos de dilucin en caldo como la concentracin ms baja a la que la bacteria es completamente inhibida (como se evidencia por la ausencia de crecimiento bacteriano visible). El MIC es por lo tanto la concentracin mnima del antibitico que inhibe esta bacteria a aislar. La prueba slo es vlida si el control positivo muestra el crecimiento y el control negativo no muestra crecimiento. Un procedimiento similar al de dilucin en caldo es de dilucin en agar. Mtodo de dilucin en agar sigue el principio del establecimiento de la concentracin ms baja de la concentracin del antibitico diluido en se rie en el que el crecimiento bacteriano est inhibido todava. Ensayos fenotpicos se basan en la inhibicin in vitro del crecimiento de un microorganismo en la presencia de un antibitico. Ensayos de prueba genotpica para la presencia de genes de resistencia fenotpica que confieren resistencia. A pesar de que son indirectos, los anlisis genotpicos son importantes para los organismos. Mtodo de difusin en disco El mtodo de difusin en disco de las pruebas de susceptibilidad a los antibiticos es el mtodo ms prctico para la determinacin de la susceptibilidad antibitica / resistencia de los microorganismos a diferentes agentes antimicrobianos. La precisin y la reproducibilidad de esta prueba son depende del mantenimiento de procedimientos estndar.

Para este mtodo se necesita un medio de crecimiento, por lo general de agar de Mueller -Hinton , se siembra uniformemente a travs de la placa con la bacteria de inters que se ha diluido a una concentracin estndar. Los discos preparados comercialmente, cada uno de los cuales estn pre - impregnados con una concentracin estndar de un antibitico en particular , a continuacin, se dispensarn de manera uniforme y ligeramente en posicin sobre la superficie de agar . El antibitico de ensayo comienza inmediatamente a difundirse hacia el exterior de los discos , creando un gradiente de concentracin de antibitico en el agar de tal manera que la concentracin ms alta se encuentra cerca del disco con la disminucin de las concentraciones ms lejos del disco . Despus de una noche de incubacin, se observar el crecimiento bacteriano alrededor de cada disco. Si la prueba de aislar es susceptible a un antibitico en particular, una zona clara de " no crecimiento" se observar alrededor de ese disco en particular. La zona alrededor de un disco de antibitico que no tiene crecimiento que se conoce como la zona de inhibicin ya que este se aproxima a la concentracin mnima de antibitico suficiente para evitar el crecimiento. Esta zona se mide a continuacin, en mm y se compara con una tabla de lectura estndar utilizada para categorizar el aislado como susceptibles , de sensibilidad intermedia o resistente . Cuantificacin de bacterias no puede determinarse a partir de esta prueba cualitativa , que simplemente clasifica el aislado como susceptibles , intermedia o resistente .

Sistemas automticos pruebas de sensibilidad antimicrobiana Varios sistemas comerciales se han desarrollado que proporcionan paneles de microdilucin convenientemente preparados y formateado, as como la instrumentacin y la lectura automtica de placas. Estos mtodos estn diseados para reducir los errores tcnicos y tiempos prolongados de preparacin. Sistemas de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos ms automatizadas proporcionan inoculacin automtica, la lectura y la interpretacin. Estos sistemas tienen la ventaja de ser rpido (algunos resultados pueden ser generados dentro de horas) y una limitacin importante para la mayora de laboratorios es el coste que supone en la compra inicial , operacin y mantenimiento de la maquinaria . Algunos ejemplos de estos incluyen : sistema Vitek ( bioMrieux , Francia ) , Walk -Away System (Dade

International, Sacramento , California ) , Sensititre ARIS ( Trek Diagnostic Systems , East Grinstead, Reino Unido ) , Avantage Prueba del Sistema (Abbott Laboratories , Irving , texas) , Micronaut (Merlin , Bornheim - Hesel , Alemania ) , Phoenix ( BD Biosciences , Maryland ) y muchos ms . Mecanismo de pruebas especficas La resistencia tambin puede establecerse a travs de pruebas que detectan directamente la presencia de un mecanismo de resistencia en particular. Por ejemplo, la deteccin de -lactamasa se puede lograr usando un ensayo tal como el ensayo cromognico cefalosporinasa (Cefinase disco por BD Microbiology Systems, Cockeysville, MD y DrySlide de nitrocefina BBL, Becton Dickinson, Sparks, MD) y la deteccin de enzima modificadora de cloranfenicol (CAT) con un kit de reactivos de ensayos colorimtricos comerciales.

Mtodos genotpicos Como los rasgos de resistencia se pueden encontrar codificados genticamente, a veces podemos probar los genes especficos que confieren resistencia a los antibiticos. Los sistemas de deteccin basados en cidos nucleicos son generalmente rpidos y sensibles, es importante recordar que la presencia de un gen de resistencia no es necesariamente equivalente al fracaso del tratamiento, ya que la resistencia tambin depende del modo y el nivel de expresin de estos genes. Tcnicas moleculares Algunas de las tcnicas moleculares ms comunes utilizados para la deteccin de resistencia a los antimicrobianos son: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR ) es una de las tcnicas moleculares ms comnmente usados para la deteccin de determinadas secuencias de ADN de inters . Esto implica varios ciclos de desnaturalizacin de la muestra de ADN , hibridacin de los cebadores especficos para la secuencia diana ( si est presente ) , y la extensin de esta secuencia facilitada por una polimerasa termoestable que conduce a la replicacin de una secuencia de ADN duplicado , de una manera exponencial , a un punto que ser visiblemente detectable por electroforesis en gel con la ayuda de un 11 producto qumico de ADN - intercalante que emite fluorescencia bajo luz UV .

Hibridacin de ADN . Esto se basa en el hecho de que las pirimidinas de ADN ( citosina y timidina ) Par especficamente con purinas ( adenina y guanina , uracilo o de ARN ) . Por lo tanto, una sonda marcada con u na secuencia especfica conocida puede emparejar con ADN abierto o ADN desnaturalizado de la muestra de ensayo , siempre y cuando sus secuencias se complementan entre s . Si se produce esta " hibridacin " , la sonda de etiqueta este detectable con un istopo radiactivo , sustrato antignico , enzima o un compuesto quimioluminiscente . Considerando que, si hay una secuencia diana o el aislado no tiene el gen especfico de inters, sin la unin de las sondas se producir, y por lo tanto se detectan seales. Modificaciones de PCR y de hibridacin de ADN que mejoran an ms la sensibilidad y especificidad de estos procedimientos estndar. Ejemplos de tales desarrollo fueron el uso de oligonucletidos 5'-marcadas por fluorescencia, el desarrollo de las balizas moleculares, el desarrollo de Colecciones de sets de ADN y chips de ADN, entre muchos otros.