Practica de Laboratorio n4 PREPARACIN Y DILUCIN DE LOS ALIMENTOS HOMOGENIZADO OBJETIVOS Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo

o estudio, as como las diluciones que les permitan investigar su contenido microbiolgico. Determinar el nmero de diluciones adecuado, con base en las caractersticas y datos de la muestra y de los microorganismos que sern investigados. GENERALIDADES Los microorganismos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algn modo su sobrevivencia o desarrollo. Los alimentos por su produccin primaria, generalmente tienen una importante microbiota normal, segn la regin y condiciones en que se producen; adems, su composicin tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos. Adems de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminacin durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminacin cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patgenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparicin de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). Dado el tamao de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de clulas por gramo, su determinacin cuantitativa requiere la preparacin de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los clculos. En esta prctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus caractersticas, algunos pueden requerir modificaciones o mtodos especficos pero, en todos los casos donde sea posible, se recomienda apegarse a estas guas y modificarlas nicamente cuando sea necesario. FUNDAMENTO Posteriormente a la toma de muestra y como parte del anlisis, se hace una dilucin primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y as lograr una distribucin lo ms uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al anlisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperacin de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperacin y actividad de las clulas microbianas presentes, as como para favorecer aquellas que se buscan entre una poblacin mixta. Se pretende encontrar el nmero de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que despus de la incubacin se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra despus de realizar tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observacin de resultados proporcionales al tamao de la poblacin, en el caso de tubos o matraces. MATERIALES stomaquer :equipo que golpea ala muestra pipetas de 1 a 10ml vaso presipitado de 500ml hallar el peso del vaso

 10 tubos de ensayo Muetras :solucin salina(alimento) Solucin acuosa :leche PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sacar con la pipeta 10ml de la solucin acuosa (leche) y 9ml de solucin acuosa (agua). Luego hacer la mezcla de ambos, el vaso precipitado de 500ml. Llevar dicha mezcla en un rotador a 8prm durante 20 minutos. Mientras tanto tener listo los 10 tubos de ensayo para realizar el vaseado a cada tubo. Despus pasados los 20 minutos sacar con la pipeta la solucin salina (agua) de 4,5 ml y 0,5 ml de la homogenizacin y vaciar al primer tubo. Luego sacar con pipeta de solucin salina 4,5 ml y 0,5 del primer tubo y luego vaciar para el segundo tubo. Seguidamente para el tercer tubo el mismo procedimiento hasta terminar todos los tubos.

PRACTICA DE LABORATORIO N5 INTRODUCCIN Este presente trabajo es para poder identificar diferentes tipos de microorganismos a travs del reactivo de Mueller Hinton Broth que es un medio de uso general que puede utilizarse en el cultivo de una amplia variedad de microorganismos Es un medio para realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana mediante el mtodo de difusin en disco. La composicin del medio Mueller Hinton 2 permite el crecimiento de las bacterias no exigentes (Enterobacterias, bacilos Gram-negativos no fermentadores, estafilococos y enterococos) encontrados en patologa humana. Este medio garantiza mnimas interferencias entre los componentes del medio y el resultado de la prueba de sensibilidad antimicrobiana. La concentracin de iones divalentes en el medio est ajustada para asegurar una determinacin ms exacta de la sensibilidad de Pseudomonas frente a los aminoglicsidos y a las tetraciclinas. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO DE MUELLER HINTON OBJETIVO: Saber en que consta la preparacin del cultivo del Agar Mueller Hinton Identificar los diferentes microorganismos en una muestra de cebiche FUNDAMENTO TERICO: Mueller-Hinton Agar Fue desarrollada originalmente como un medio de Agar sencillo y transparente para el cultivo de la Neisseria patgena. Se desarrollaron otros medios que remplazaron el uso del Agar Mueller Hinton para el cultivo de la Neisseria patgena, pero se utiliz ampliamente en la determinacin de la resistencia a la sulfonamida por parte de los gonococos y otros organismos. Ahora se recomienda como medio de prueba para uso en pruebas de sensibilidad antimicrobiana. Mueller Hinton Broth, sin ajustar, presenta una frmula similar a la del medio slido, pero sin Agar, para uso cuando se prefiera un medio lquido. Se puede utilizar para el cultivo general de bacterias. Especfico para la realizacin de antibiogramas, existen dos variantes, Agar Mueller - Hinton/Sangre y Agar Mueller - Hinton/Chocolate, estas variaciones se realizan para obtener la sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganismos, St. Pneumoniae y Haemophilus spp. Respectivamente

MATERIALES Balanza Matraz erlenmeyer Vaso precipitado Pipetas Algodn Agua destilada Mechero de bunsen Autoclave Placas petry (3) Muestra (pan y ceviche) Reactivos: Mueller-Hinton Agar En la balanza, pesar 1.70 gr de Agar Mueller Hinton para saber cuntos gramos se utilizara. Esterilizar el vaso precipitado en el mechero de Bunsen. Para elaborarlo primero disolvemos en el matraz erlen-meyer, 1.70 g. de Agar Mueller Hinton en 50ml de agua destilada y al homogeneizarlo obtendr un color amarillento. Luego sellar el matraz erlen-meyer con algodn, envolverlo con papel y amarrarlo con una pita; para llevar a la autoclave y esterilizarlo. Llevar al autoclave el matraz erlen-meyer junto a las placas petry, para esterilizarlos. Luego al cabo de 15 minutos retirar las placas petry junto al matraz erlen-meyer; Seguidamente encender el mechero de bunsen para poder realizar el plaqueo a las tres placas petry con la sustancia que se encuentra en el interior del matraz erlen-meyer. Esperar unos minutos hasta se seque la disolucin en las placas. Luego en forma de estras aadir a cada placa la muestra del ceviche y el pan.

RESULTADOS Podemos observar colonias de diferentes microorganismos formados en en el agar mullerr hinton a travs de la muestra del cebiche PRCTICA DE LABORATORIO N6 EFECTO DE ANTIBIOTICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS INTRODUCCIN La resistencia de las bacterias es el principal obstculo para la eficacia teraputica de los antibiticos, pues no slo puede anular la accin curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todava ms graves para el conjunto de la poblacin, ya que provoca la desaparicin de las cepas susceptibles y la propagacin de las resistentes. Ese es el motivo por el cual la determinacin de la sensibilidad de las bacterias a los antibiticos haya adquirido tanta importancia y sea indispensable para hacer de los antibiticos un uso racional y para preservar la eficacia de este grupo tan valioso de agentes teraputicos. Los antibiogramas son mtodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio especfica y estandarizada. La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clnico algunas recomendaciones sobre la terapia que puede ser ms apropiada en pacientes con una infeccin especfica. No obstante, la correlacin exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clnica es muchas veces difcil de predecir, ya que existen numerosos factores que influencian la interaccin de los agentes antimicrobianos y los microorganismos en un determinado paciente. Entre los factores podemos resaltar:

La metodologa usada para realizar el antibiograma toma en consideracin algunos de estos factores para determinar ms eficientemente cmo un microorganismo podra responder in vivo a un determinado antibitico. OBJETIVO PRINCIPAL: Conocer conozca el efecto que tienen las bacterias ante los antibiticos.

FUNDAMENTO TERICO: El antibiograma es la prueba microbiolgica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibiticos. Las tcnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiologa para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones. Se considera como antimicrobiana cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilizacin como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintticos o semisintticos (modificacin qumica de un compuesto natural). La historia moderna de los antibiticos comienza con el descubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos. La utilizacin de antibiticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que padecan procesos infecciosos, aunque desgraciadamente tambin supuso un aumento en los niveles de resistencia antibitica. El antibiograma tiene cuatro utilidades principales: La utilidad bsica del antibiograma es la instauracin de un tratamiento antibitico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infeccin posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algn antibitico para no incluirlo como terapia. En cuanto al tratamiento el antibiograma no slo es necesario en la instauracin, tambin resulta til en el seguimiento e incluso en la confirmacin de tratamientos empricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confirmar, o en su caso corregir el tratamiento. Otra aplicacin de las tcnicas de estudio de resistencia es la epidemiologa. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clnicos para tomar medidas correctoras. Por otro lado tambin puede tener utilidad diagnstica porque el perfil de resistencia puede en algn caso orientar en la identificacin bacteriana. Existen multitud de antimicrobianos en el mercado y el nmero sigue creciendo porque el desarrollo de ms mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se traduce en un esfuerzo mayor por fabricar ms y mejores antibiticos. No es necesario contrastar la eficacia de todos los antibiticos para cada aislamiento bacteriano. Los criterios que se siguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan respondes a factores de diversa ndole: Factores microbiolgicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia descritos previamente en su especie. Factores farmacolgicos: Tipo de antimicrobiano y parmetros de absorcin, distribucin y eliminacin. Factores del paciente: Tipo de infeccin. Factores de riesgo y estado general de salud. Situacin inmunolgica e hipersensibilidad. Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia antibitica ms habituales para cada especie.

Un antibiograma mostrando la resistencia de la bacteria ante varios I. MATERIALES: 3 placas petry Matraz erlen-meyer 1 tubo de ensayo Esptula de grigalski Probeta Autoclave Agua destilada Agar mueller Hinton Solucin salina fisiolgica Antibiticos ( ampicilina, penicilina, amiacina, bacitracina, amoxicilina, clindamicina, ciprofloxacina, azitromicina, norfloxacina, vancomicina, estreptomicina, cloranfenicol, gentamicina). Pinza Balanza Mechero de bunsen

PROCEDIMIENTO: Para elaborarlo primero disolvemos en el matraz erlen-meyer, 1.70 g. de Agar Mueller Hinton en 50ml de agua destilada y al homogeneizarlo obtendr un color amarillento. Luego sellar el matraz erlen-meyer con algodn, envolverlo con papel y amarrarlo con una pita, junto a las 3 placas petry envueltas en papel, para llevar a la autoclave y esterilizarlo. Luego al cabo de 15 minutos retirar las placas petry junto al matraz erlen-meyer; Seguidamente encender el mechero de bunsen para poder realizar el plaqueo a las tres placas petry con la sustancia que se encuentra en el interior del matraz erlen-meyer (Agar Mueller Hinton). Esperar unos minutos hasta se seque la disolucin en las placas. En un tubo de ensayo aadir 1 ml de solucin salina fisiolgica junto con una mnima cantidad de agua destilada. Luego, con la pipeta extraer una gota del tubo de ensayo y aadir a la placa petry (de Agar mueller Hinton) y con la ayuda de la esptula de grigalski diseminar en toda la superficie de la placa. Luego esperar unos minutos a que se que la disolucin en las placas. Luego, al lado del mechero, usaremos una pinza (pero antes flameamos la pinza en el mechero d bunsen) para extraer los discos de los diversos antibiticos y aadir 6 discos a cada placa petry. Luego incubar las tres placas petry a 37C. RESULTADOS

Si hubo efecto en las tres placas petry, porque se observa el tamao de halo de inivicin alrededor de los discos. Pudimos observar que hubo reaccin con la ciprofloxacina porque ella tiene una mxima reaccin con los microorganismos Primera placa C=CLORANFENO LDP= CEFACLOR NX=NORTFLOXACINA 8mm-11mm 13mm-14mm 12mm-11mm

CC=CLINDOMISINA S=STREPTOMISINA AM=AMPICILINA Segunda placa AMX=AMOXICILINA ACTM=ACITROMICINA CZ=CEFASOLINA CFL=CEFALEXINA CIP=CIPROFLOXACINA GCM=GENTAMICINA Tercera placa MQ=AMICACINA B=BASITRACINA P=PENICILINA CXT=TRIMETOPRIM SULFAMETAXOSOL VA=BANCOMICINA TE=TETRAXIFINA CUESTIONARIO

14mm-11mm 13mm-14mm 12mm-10mm

11mm-2mm 14mm-15mm 0 - 0

4mm-5mm 20mm-23mm 16mm-13mm

10mm-11mm 9mm-10mm 9mm-8mm 17mm-15mm 10mm-15mm 8mm-7mm

1.-a que se debe el halo de inhibicin representativo que muestra en el ciprofloxacina en la coli? Debido a la creciente resistencia en las bacterias causada por la aparicin y resistencia a la ciprofloxacina en bacterias como Escherichia coli usada para combatir las bacterias en el cuerpo y es recetado para varios tipos de infecciones como prostatitis, neumona, infecciones del tracto urinario, cistitis, fiebre tifoidea, tuberculosis, diarrea del viajero, sinusitis,

PRCTICA DE LABORATORIO EFECTO DE TEMPERATURA EN LOS MICROORGANISMOS INTRODUCCIN Los microorganismos como grupo demuestran una capacidad extraordinaria para vivir y reproducirse a lo largo de un amplio rango de temperaturas (desde temperaturas bajo 0C, hasta temperaturas que alcanzan los 113C). Los microorganismos se han agrupado en cuatro categoras, a base de su rango de temperatura ptimo para el crecimiento. Las categoras son: psicroflicos, mesoflicos, termoflicos e hipertermoflicos. El rango de temperatura ptimo y el lmite mnimo y mximo de temperatura que distinguen a cada grupo no se deben tomar como valores absolutos que establecen la frontera entre una y otra categora y s como un reflejo del hbitat natural donde se desarrolla cada grupo. De hecho, el rango de temperatura que define a cada categora vara de un grupo de microorganismos a otro.

El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reaccin qumica individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin OBJETIVO GENERAL: Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos.

FUNDAMENTO TEORICO El crecimiento de los microorganismos se encuentra influenciado por varios factores. Entre ellos los ms importantes son la aireacin y la temperatura. En cuanto a este ltimo, la Temperatura, los microorganismos tienen un margen de temperaturas en el cual pueden crecer. Este margen viene delimitado por la temperatura mxima de crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso mueren; la temperatura mnima por debajo de la cual no pueden crecer aunque generalmente no mueren; y la temperatura ptima a la cual ofrecen el mejor crecimiento. Los microorganismos se clasifican en: o o o Hipertermfilos: Su temperatura ptima se encuentra por encima de los 80C. Muchos de ellos son arqueas. Termfilos: Su temperatura ptima se encuentra entre 45-70C. Suelen ser microorganismos de vida libre Mesfilos: Su temperatura ptima se encuentra entre los 25-45C. Incluye microorganismos patgenos y comensales del hombre y animales de sangre caliente y algunos de vida libre. Psictrofos: La temperatura ptima de los microorganismos de este grupo est por debajo de los 25 30C incluye microorganismos de vida libre. Psicrfilos: Su temperatura ptima de desarrollo se encuentra entre los 12 15C

o o

MATERIALES: Mueller Hinton Agar Agua destilada Matraz erlen-meyer Autoclave Estufa Asa de kolle 3 Placas petry Probeta Termmetro Vaso precipitado Mechero de bunsen Placa de scherichiacolli Estufa Incubadora

PROCEDIMIENTO: Para elaborarlo primero disolvemos en el matraz erlen-meyer, 1.70 g. de Agar Mueller Hinton en 50ml de agua destilada e instantneamente homogeneizarlo Luego sellar el matraz erlen-meyer con algodn, envolverlo con papel y amarrarlo con una pita, junto a las 3 placas petry envueltas en papel, para llevar a la autoclave y esterilizarlo. Luego al cabo de 15 minutos retirar las placas petry junto al matraz erlen-meyer; Seguidamente encender el mechero de bunsen para poder realizar el plaqueo a las tres placas petry con la sustancia que se encuentra en el interior del matraz erlen-meyer (Agar Mueller Hinton). Esperar unos minutos hasta se seque la disolucin en las placas

Primera temperatura (37c): Aadir una cierta cantidad de agua destilada al vaso precipitado y sumergir el termmetro para as poder controlar la temperatura (37C); seguidamente poner a la estufa para que alcance la temperatura requerida durante 5 minutos aproximadamente. (Alcanzada la temperatura retirar el vaso precipitado de la estufa). Luego, flameamos el asa de kolle en el mechero de bunsen. Una vez flameada el asa de kolle, abrir cuidadosamente la placa scherichiacolli y rozar con el asa de kolle e instantneamente sumergir en el vaso precipitado durante 10 min. Para la siembra: Transcurrido los 10 min; realizar el plaqueo en una placa petry (de Agar Mueller Hinton) haciendo uso del asa de kolle (que se encuentra sumergida en el vaso precipitado) en forma de estras, luego rotular.

Segunda temperatura (45C) Aadir una cierta cantidad de agua destilada al vaso precipitado y sumergir el termmetro para as poder controlar la temperatura (45C); seguidamente poner a la estufa para que alcance la temperatura requerida durante 5 minutos aproximadamente. (Alcanzada la temperatura retirar el vaso precipitado de la estufa). Luego, flameamos el asa de kolle en el mechero de bunsen. Una vez flameada el asa de kolle, abrir cuidadosamente la placa scherichia colli y rozar con el asa de kolle e instantneamente sumergir en el vaso precipitado durante 10 min. Para la siembra: Transcurrido los 10 min; realizar el plaqueo en una placa petry (de Agar Mueller Hinton) haciendo uso del asa de kolle (que se encuentra sumergida en el vaso precipitado) en forma de estras, luego rotular.

Tercera temperatura (98C) Aadir una cierta cantidad de agua destilada al vaso precipitado y sumergir el termmetro para as poder controlar la temperatura (98C); seguidamente poner a la estufa para que alcance la temperatura requerida durante 5 minutos aproximadamente. (Alcanzada la temperatura retirar el vaso precipitado de la estufa). Luego, flameamos el asa de kolle en el mechero de bunsen. Una vez flameada el asa de kolle, abrir cuidadosamente la placa scherichiacolli y rozar con el asa de kolle e instantneamente sumergir en el vaso precipitado durante 10 min. Para la siembra: Transcurrido los 10 min; realizar el plaqueo en una placa petry (de Agar Mueller Hinton) haciendo uso del asa de kolle (que se encuentra sumergida en el vaso precipitado) en forma de estras, luego rotular.

Luego de la siembra en las tres placas rotuladas con su temperatura correspondiente (37C, 45C y 98C) llevar a la incubadora (a temperatura de37c) para realizar la lectura al cabo de un tiempo.

RESULTADOS: 98C

37C

45C

PRACTICA DE LABORATORIO N2 COLORACION GRAM INTRODUCCION Los colorantes son colorantes orgnicos, complejos constituidos fundamentalmente por radicales cromforos y auxcromos. Los primeros son los que imparten color y los segundos de las interacciones con los sustratos por teir. Los mecanismos de captacin de los colorantes son una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos, como adsorcin, absorcin, capilaridad, smosis, afinidad qumica e intercambio inico. Las tcnicas de unciones microbiolgicas se clasifican en simples y diferenciales, en las primeras se aplica un solo colorante que tie todas las estructuras celulares y por lo tanto todas la clulas sin distincin. Una de las tinciones diferenciales mas utilizadas para la identificacin bacteriana es la de Gram, se basa en la aplicacin de cristal violeta como colorante primario, aplicacin de una solucin decolorante y un segundo colorante, la safranina como colorante secundario. La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Las bacterias que resisten la decoloracin permanecern de color azul-violeta, interpretndose como Gram positivas. Por otro lado las bacterias que no resisten la coloracin aceptaran el colorante de contraste, observndose de color rojo, se interpretan como Gram negativas. II OBJETIVOS: Identificar bacterias gran positivas y gran negativas Observacin de la coloracin en el microscopio

III FUNDAMENTO TERICO pared celular de una bacteria gram negativa y gram positiva? LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS: Est formada en un 90% por peptidoglicano, siendo ste el principal componente que permite diferenciarlas con la pared de las Gram negativas, pues al teirlas, es gracias a l, al grosor que ste le proporciona, que se logra mantener la coloracin del cristal violeta en el interior de la clula al teirla con la tincin Gram. Adems del peptidoglicano, sta se encuentra compuesta de cidos teicoicos, que estn presentes en pequeas cantidades; stos se presentan embebidos en la pared de la bacteria como polisacridos cidos. El trmino de cidos teicoicos se refiere a los polmeros de la pared que contienen unidades de glicerolfosfato o de ribitolfosfato. Estos polialcoholes estn unidos por steres fosfato y a menudo presentan unidos otros azcares y D-alanina. Debido a su carga negativa, los cidos teicoicos son en gran parte responsables de la carga negativa neta de la superficie de las clulas y puede intervenir en el paso de iones a travs de la pared celular. Algunos de estos cidos que contienen glicerol estn unidos a lpidos de la membrana de las Bacterias Gram positivas y debido a esta ntima asociacin con lpidos, estos cidos teicoicos se denominan tambin cidos lipoteicoicos. LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS: Representa una segunda bicapa lipdica contiene diversas protenas, siendo una de ellas las porinas o canales protecos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas estructuras llamadas lipopolisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacrido O (antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A (endotoxina).Las bacterias Gram-negativas pueden presentar una Capa S que se apoya directamente sobre la membrana externa. Si presenta flagelos, estos tienen cuatro anillos de apoyo. Sus lipoproteinas se unen al ncleo de polisacaridos. CUl es la finalidad del aceite de inmersin? El aceite tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X. Se usa generalmente aceite de cedro. No pods usar el objetivo de 100X en seco, a diferencia del de 40X, 10X y menores. IV MATERIALES Y METODOS: Azul de lactofenol (Col de hongos) Cristal violeta Violeta de genciana Lugol Alcohol cetona Safranina

V PROCEDIMIENTO: A. COLORACIN : Realizar la toma de muestra utilizando hisopo (muestra d secrecin otica) y dejar secar a temperatura ambiente. Adicionar unas gotas cristal violeta sobre la muestra. Dejar actuar entre 1 o 2 minutos y luego lavar a chorro lento. Adicione unas gotas de lugol sobre la muestra. Dejar actuar entre 1 o 2 minutos y luego lavar a chorro lento. Adicione alcohol cetona entre 3 a 4 gotas, dejando actuar por un minuto. Lavar con agua de cao a chorro lento.

 Finalmente adicionar unas gotas de safranina sobre la muestra y deje actuar 1 o 2 minutos. Lavar con agua de cao a chorro lento y dejar secar a temperatura ambiente colocando la lmina de forma vertical Observar sus coloraciones en el microscopio compuesto, utilizando aceite de inmersin y el objetivo 100X. PRACTICA N 01 ESTERILIZACIN DEL MATERIAL Y PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVOS

INTRODUCCIN Por su minsculo tamao , los microorganismo no pueden estudiarse como individuos , si no que es necesario manejarlos como poblaciones .para ello es necesario cultivarlos , es decir ,favorecer su multiplicacin en vitro, en ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sushbitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfierene n el estudio del mic roorga nismo de i nte rs, a l que a dem s de propo rciona r l os nutrie ntes nec esa rios para su crecimiento multiplicacin Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la destruccin completa de todas las unidades del lote de producto terminado, se define la esterilidad en trminos probabilsticos, en donde la probabilidad de que una unidad de producto est contaminada es aceptablemente remota. Se considera que un producto crtico es estril cuando la probabilidad de que un microorganismo est presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de esterilidad 10^-6). Los agentes que matan microbios son denominados microbiocidas (cida= matar) o ms comnmente denominados germicidas. Si el agente especficamente destruye bacterias, es llamado bacteriocida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea despus de exponer el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, ste otra vez se habr contaminado con microorganismos. Los mtodos trmicos de esterilizacin son comnmente los ms utilizados para eliminar los microorganismos, incluyendo las formas ms resistentes como lo son las endoesporas. OBJETIVOS

Comprobar la efectividad del proceso de esterilizacin. Elaborar adecuadamente los medios de cultivo deshidratados y por componentes. Lavar, preparar y envolver correctamente el material que se someter a esterilizacin MATERIALES

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Agar selectivo para estreptococos Matraz de 100ml Algodn Pipeta 10ml Placas petri Balanza Autoclave(canal gua,barmetro,canastilla,olla) Agua destilada.

ESTERILIZACIN: Es la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va. Es un procedimiento que engloba un trmino absoluto que significa la total destruccin o remocin de toda forma de vida. Para medios de cultivo se usan altas temperaturas, vapor saturado a presin, algunos agentes qumicos ( muy pocos ) y ciertos filtros y radiaciones U.V.

Se dividen en mtodos: 1) Fsicos 2) Qumicos.

Existen varios mtodos de esterilizacin, detallados a continuacin. Mtodos fsicos Calor hmedo (en autoclave de vapor) Calor seco (en horno de esterilizacin) Flama directa Incineracin Aire caliente Pasteurizacin Ebullicin Vapor Tyndalizacin Radiacin Radiacin ionizante Radiacin no ionizante: (p. ej:Radiacin infrarroja y Radiacin ultravioleta) Mtodos qumicos Alcoholes Etanol Alcohol isoproplico Aldehdos Formol Glutaraldehdo Fenoles Fenol (cido carblico) Xilenol xido de etileno Perxido de hidrgeno

Calor: la muerte trmica de un microorganismo es el resultado de la inactivacin de protenas celulares esenciales o enzimas y hay alta correlacin entre altas temperaturas y la inactivacin celular o proteica.

 Calor Hmedo: - Ebullicin. - Vapor fluente Tyndalizacin 80-100C 3 das. - Vapor a presin autoclave ( la totalidad del material a esterilizar debe estar en contacto con el vapor ). Calor seco: - Llama directa ( mechero ) - Incineracin ( residuos ) - Aire caliente ( hornos ) MEDIO DE CULTIVO Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condicionesfsic a s ptima s, permite n el crecimient o de l os microorga nismos. Estos medios so n esenc ia l es en el L a bora torio d e Mi crobiol oga po r l o que un cont rol e n s u fa brica cin, pre pa ra c in, c onserva cin y uso,asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Clasificacin de los medios de cultivo En l os la bora torios de mic robiol oga s e util iza n dife re ntes tipos d e m edios de cul tivo que pu ed en se r preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se parte de unmedio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel PROCEDIMIENTO Primero empesamos pesando el agar selectivo para estreptococos de 20ml convirtindolo en gramos da en 0.86 g dek agar . Luego cojemos un matraz de 100ml , introducimos el agua destilada en 20ml con la pipeta. Hacemos la dicha mezcla del agua destilada y el agar de estreptococos,hacemos ligeros movimientos antes de autoclavar. Luego de algunos minutos poner en el autoclave juntamente con las placas petri. Seguidamente sacamos la mezcla conjuntamente con las placas petri y luego vaciamos la mezcla en las placas petri . Dejamos durante una hora para que se solidifique la mezcla . CONCLUSIONES

Se pudo realizar la practicas del medio se cultivo y la esterilizacin: Por medio de esta prctica al investigar la teora y realizar la preparacin de un medio de cultivo, se logrl a el a bor a c in a decua da de l os mismos, a s como la sel eccin a propia da pa ra el uso que s e l es da r poste rio rme nte a l os medios de l mtodo de est eril iza c in que el imina ra l os restos microbia nos quepudi es en ha b er queda do en el medio d e cul tivo ya que s i exis te a l guno de estos, ya no sera a dec ua do para el uso que se le pudiera llegar a dar. Tambin se observ (con la teora) que de acuerdo al tipo de bacteria que se requiera sembrar, ser el tipo de m edio d e c ul tivo, esto, ya qu e ca da ba cteria r equi er e ci erto tipo de nutri en tes pa ra sub sistir yformar sus colonias, adems de que cierto tipo de medios de cultivo, nos pueden mostrar de acuerdo a sucomposicin ciertas caractersticas que presentan determinado tipo de bacterias, ya sea por su pH y queeste sea indica d o por l os

indic a dores d e l os m edios o por qu e r ea ccione con cier tos com pone nt es del medio creando colores o formas PRACTICA DE LABORATORIO N3 SIEMBRA EN MICROBIOLOGIA INTRODUCCION La poblacin microbiana en nuestro entorno es grande y compleja, cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo incluidas en la boca , el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, as como casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran ms frecuentemente en la oscuridad , en objetos hmedos que a menudo entran en contacto con la comida la suciedad y vegetacin. Las superficies de nuestro entorno tienen a menudo microbios. SIEMBRA MICROBIANA

OBJETIVOS Aprender los principales mtodos de siembra de microbiologa Aprender los principales mtodos de cultivo existentes Aplicar la tcnica adecuada para preparar el area de trabajo y evitar.

FUNDAMENTO TEORICO Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza para Prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y esterilizacin para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilizacin es un mtodo de Eliminacin total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un proceso que elimina nicamente formas vegetativas de los microorganismos. La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de mayor Utilizacin en microbiologa. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los Microorganismos por oxidacin, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un Mechero o en horno a 150-180 C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principalmente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de material de vidrio y quirrgico. Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El ms recomendable es la autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin para alcanzar temperaturas de 121 C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruccin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor. Para el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma.

METODOS DE CULTIVO DE USO RUTINARIO: Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.),o , e n e l ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente de aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras partculas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminacin del medio de cultivo. El asa debe ser flameada adecuadamente y enfriada antes de tocar el inculo, o el medio de cultivo. QUE ES SIEMBRA? En biologa, y especficamente en microbiologa, un cultivo es un mtodo para la multiplicacin de microorganismos, tales como bacterias, hongos y parsitos, en el que se prepara un medio ptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado como un mtodo fundamental para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades en medicina humana y veterinaria. Un microorganismo se puede sembrar en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Tipos de siembras: a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisladas del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los siguientes procedimientos: * En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por el otro extremo de la misma . Este tipo de siembra tambin se puede hacer en tubo con medio slido en pico de flauta. * En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lneas tangenciales en un borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimiento se repite hasta que se completa la superficie de la placa . b) Siembra en masa: Primero se aade un volumen conocido de suspensin de microorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar. c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una Cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un asa de Drigalski . d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma vertical en un tubo con medio slido . e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una

Suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos 15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guardando condiciones de esterilidad. MATERIALES Asa bacteriolgica Tubo de ensayo Vaso precipitado Mechero de bunsen Torunas de alcohol Placas petricas Agar infusin cerebro corazn Muestra de orine

Obtencin de 4 muestras Se considera una etapa crucial en el procesamiento del uro cultivos ya que la posibilidad de contaminacin con bacterias de la flora comensal de piel, perin y uretra distal, es muy alta e induce a la generacin de resultados falsamente positivos. PROCEDIMIENTO

1. 2. 3. 4.

Teniendo con las pacas petri con medio de cultivo de la practica anterior empezaremos con la siembra en microbiologa. Ahora con el AGAR MC(maconke) marcar en cuatro partes para distribuir la muestra(orina) sobre ella con la esptula drigalsky . Luego seguidamente hacemos la distribucin de la muestra (orina) para el siguiente AGAR XLD y AGAR ESTREPTOCOS ,AGAR Para todo los medios de cultivo elaborado

METODO DE SIEMBRa Dividimos la placa en 4 partes para poder hacer la siembra de diferentes maneras INCUBACIN Una vez sembradas las placas deben incubarse durante 16 a 18 horas a 35 - 37 C. Incube 48 horas aquellos uro cultivos negativos con sedimento urinario alterado. SIEMBRA DE UROCULTIVO INTRODUCCION

Este presente trabajo es realizado con el fin de determinar medios de cultivo a travs de la siembra de urocultivo que se basa en la identificacin del nmero y de los tipos de bacterias presentes en la orina, encontramos microorganismos individualmente que son colocados en las placas petri y crecern en colonias individuales, cada replica del microorganismo es genticamente idntico a su antecesor. Tambin se puede usar para generar cultivos genticamente puros a partir de un cultivo mixto, con diferentes especies de microorganismos, usando una tcnica llamada estriado. En esta tcnica, una gota de del cultivo es tomada de la muestra, mediante un instrumento llamado asa bacteriolgica, estril; despus se distribuye la muestra sobre la superficie del medio de cultivo dibujando estras, dejando de esta forma un gran nmero de microorganismos al principio y una baja cantidad al final de

colonias aisladas, para estimar la concentracin de microorganismos en un cultivo o una solucin de ese cultivo, usando un contador de colonias, que crecieron pueden removerse individualmente con otra asa estril, y as determinar a qu especie corresponde cada colonia individual. OBJETIVOS Realizaremos un urocultivo para la determinacin de los diferentes tipos de microorganismos presentes en muestras de orina, realizando las diferentes pruebas para el diagnostico de las posibles enfermedades o infecciones urinarias. Realizar cultivos para biorremediacin FUNDAMENTO El urocultivo se basa en la identificacin del nmero y de los tipos de bacterias presentes en la orina. Es necesario que el mtodo de recogida sea el adecuado siguiendo unos protocolos de higiene evitando as posibles contaminaciones de la muestra. Para la identificacin del nmero de bacterias, realizaremos un recuento bacteriano para la identificacin de los tipos de bacterias presentes en la orina y sus patologas, se realizara una siembra en medios de cultivo diferentes con la tcnica de siembra comnmente utilizado en el urocultivo, segn el tipo de microorganismo comnmente encontrado en la muestra. MEDIOS DE CULTIVO MICROBIANO Condiciones generales par un medio de cultivo de los microorganismos El desarrollo adecuado de microorganismo en un medio de cultivo se afectado por una seri de factores de gran importancia y que algunos casos son ajenos por completo al propio medio: 1 Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica de contener como mnimo C,H,O,N,P,S y sales. En muchos casos ser necesario ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras de crecimiento (factores de crecimiento).todas esta sustancias se subministraban originalmente en forma de infusiones de carne ,extractos de carne ,o extractos de levadura sin embargo la preparacin de estas sustancias provocan la perdida de los factores nutritivos lebiles, Actualmente en forma mas extendida de aportar estas sustancias o los medios es utilizando la peptona que adems representa una fuente fcilmente digerible de N y C. Si estas bacterias tienen necesidades nutritivas especificas por lo que se aaden suero de leche, suero sanguneo, sangre ,yema de huevo ,etc igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos como glucosa ,galactosa y ciertos sales como carbonatos, sulfatos , cloruro.

2 Consistencia adecuada del medio. Los medios de cultivo en medios generales se les conoce como caldos o agares. Medio cultivo Caldos : medio liquidos Agares : medio solido Partiendo de un medio liquido este puede ser modificado e n su consistencia aadiendo productos solidificantes: Caldo + solidificante=medio solido

3 Presencia o ausencia de oxigeno y otros gases. Gran cantidad de microorganismos pueden crecer en una atmosfera con tensin de oxigeno normal. Algunas pueden obtener el oxigeno directamente de los sustratos del medio .pero los microorganismos anaerobios estrictos se desarrollan en ausencia de oxigeno atmosfrico . los microaerofilos , microorganismo que para desarrollarse necesita atmsfera con baja tensin de oxgeno y los anaerobios facultativos crecen en cualquier condicin (con o sin oxigeno). 4 Condiciones adecuadas de humedad. Un nivel mnimo de humedad tanto es el medio como en la atmosfera es imprescindible para el crecimiento de los microorganismos; en las estufas con temperatura de incubacin alta (74,40,44) una fuente provea humedad y evite que se reseque. 5 Potencial de hidrogeno(PH) La mayora de los microorganismos crecen en medios de PH neutro. El termino generales las bacterias crecen mejor en medios ligeramente alcalinos y los hongos ligeramente acidos . 6 Luz . La mayora de los microorganismos crecen mejor en ausencia de luz por esa razn las estufas con la ecepcion son los organismos fotosintetizadores .ejemplo : alagas 7Temperatura: La mayora de los microorganismos son meso filos (temperatura templada). Ejemplo: hongos 20C y 30C,bacterias 35C-37C. 8 Esterilidad. Todos los medios deben ser estriles antes de su uso para evitar interferencias con otros medios de cultivo.

UROCULTIVO O CULTIVO DE ORINA El urocultivo es la prueba definitiva para comprobar si existe o no infeccin de orina, y en caso de existir, que microorganismo es el causante y que antibiticos pueden eliminarlo. Consiste en poner una pequea muestra de orina en una serie de medios que permiten el crecimiento bacteriano, aportando informacin sobre el tipo y cantidad de bacteria existente en la muestra. El resultado de un urocultivo se puede expresar de muchas maneras, y va a depender del laboratorio, pero bsicamente esta informacin va a ser comn a todos. 1. UROCULTIVO NEGATIVO

No hay infeccin de orina. Se puede expresar como: Cultivo negativo, crecimiento negativo o no se aslan bacterias patgenas. Todas estas son las distintas maneras de expresar lo mismo, que no existe infeccin, que todo est bien. 2. CONTAMINACIN, O MUESTRA CONTAMINADA. La contaminacin se produce cuando ha habido algn fallo en el proceso de recogida de la muestra. En las muestras contaminadas suele haber crecimiento bacteriano, pero, o bien es una cantidad demasiado pequea para pensar que existe infeccin y es necesario comprobarlo con una nueva muestra, o hay una mezcla de bacterias que hacen pensar en errores en el proceso

3.

de recogida de la orina. Las causas de un cultivo contaminado puede ser porque no se ha lavado bien la zona o por que no se ha desechado la porcin inicial de la miccin. UROCULTIVO POSITIVO.

Este resultado se da cuando realmente hay una infeccin de orina. En el informe se debe indicar el numero de UFC/cc (Unidades Formadoras de Colonias por centmetro cubico), el tipo de bacteria que est produciendo la infeccin (las ms comunes son Escherichia coli o Proteusspp). En caso de cultivo positivo se recomienda repetir el cultivo a los 5 das posteriores al tratamiento con antibiticos. MEDIOS DE CULTIVO: Agar Mac Conkey Aislamiento selectivo de Enterobacterias y Escherichia coli El agar MacConkey con cristal violeta es un medio selectivo y diferencial para la deteccin de Enterobacterias en muestras de origen diverso. Este medio ha sido especialmente diseado para detectar la fermentacin de la lactosa mediante un cambio de color al rojo neutro. Colonias lactosas (+): rosa a rojas, a veces rodeadas por un halo de sales biliares precipitadas. Colonias lactosa (-): incoloras o ligeramente beige. Las sales biliares y el cristal violeta hacen el medio selectivo para las bacterias Gram-positivas. Agar Nutritivo . El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy til porque permanece slido incluso a relativas altas temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente 0,5 % de peptona; 0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura; 1,5 % de agar; 0,5 % de cloruro de sodio; agua destilada; pH casi neutro (6,8) a 25 C. Sangre carnero

Contiene sangre de mamferos (generalmente oveja, conejo, humanos) a una concentracin de 5 a 10%. es un medio enriquecido, diferencial, usado para aislar microorganismos fastidiosos y detectar actividad hemoltica. La -hemolisis, se manifiesta como una lisis y digestin completa de los eritrocitos que rodean la colonia, por ejemplo algunas bacterias del genero Streptococcus. La -hemolisis , aparece solo como lisis parcial (los eritrocitos, no son lisados completamente o la digestin no fue completa), por tanto la hemoglobina aparece como una halo verdoso alrededor de la colonia. BIORREMEDIACIN MICROBIANA

En este tipo de remediacin se usan microorganismos directamente en el foco de la contaminacin. Los microorganismos utilizados en biorremediacin pueden ser los ya existentes (autctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros ecosistemas, en cuyo caso deben ser agregados o inoculados (ver Cuaderno N46) La descontaminacin se produce debido a la capacidad natural que tienen ciertos organismos de transformar molculas orgnicas en sustancias ms pequeas, que resultan menos txicas. El hombre ha aprendido a aprovechar estos procesos metablicos de los microorganismos. De esta forma, los microorganismos que pueden degradar compuestos txicos para el ambiente y convertirlos en compuestos inocuos o menos txicos, se aprovechan en el proceso de biorremediacin. De esta forma, reducen la polucin de los sistemas acuticos y terrestres. La gran diversidad de microorganismos existente ofrece muchos recursos para limpiar el medio ambiente y, en la actualidad, esta rea est siendo objeto de intensa investigacin. Existen, por ejemplo, bacterias y hongos que pueden degradar con relativa facilidad petrleo y sus derivados, benceno, tolueno, acetona, pesticidas, herbicidas, teres, alcoholes simples, entre otros. Los metales pesados como uranio, cadmio y mercurio no son biodegradables, pero las bacterias pueden concentrarlos de tal manera de aislarlos para que sean eliminados ms fcilmente. Las actividades microbianas en el proceso de biorremediacin se pueden resumir en el siguiente esquema: METABOLISMO MICROBIANO. Los microorganismos ingieren contaminantes como fuente de carbono y algunos nutrientes como fsforo y nitrgeno. La digestin de este compuesto en sustancias ms simples como parte del metabolismo del microorganismo, puede resultar en la degradacin del compuesto en forma parcial (transformacin) o total a dixido de carbono (CO2) y agua (H2O).

AGENTES ETIOLGICOS A INVESTIGAR

- Escherichia coli - Klebsiella spp. - Enterobacter spp. - Serratia spp. - Enterococus spp. - Proteus spp. - Pseudomonas spp. - Acinetobacter spp. - Candida spp. - Staphylococus spp. - Estreptococo grupo B (imprescindible en embarazada MATERIALES

Asas de siembra desechables Portaobjetos

Placas de Petri Mechero Pinzas agua destilada Papel para cubrir mesas de laboratorio Vasos de muestra Pipeta Microscopio Tubos de ensayo Baln, perlas de vidriO Violeta de genciana Lugol Alcohol cetona Safranina Agar MacConkey Agar nutritivo Sangre de carnero PROCEDIMIENTO Recogida de sangre Para poder obtener la sangre de carnero nos dirigimos hacia el camal de Ayacucho, el baln no tena que chocar con el pelaje del carnero y tenamos que darle unas vueltas al baln con las perlas de cristal durante 10 minutos para que no se coagule la sangre. Recogida de muestra: Se utilizar un recipiente de muestra desechable. La orina que se recoger ser la primera orina de la maana, por ser una orina ms concentrada. Esterilizacin de materiales: Esterilizamos todos nuestros materiales para que no quede ningn tipo de microorganismo para poder realizar nuestro cultivo. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO Y EL AGAR MACCONKEY:

1. 2.

Empezamos primero pesando el agar nutritivo en 14g y el agar MacConkey en 12,5g. Despus de pesar diluimos el agar nutritivo con agua destilada(500ml) en un matraz de 1000ml ,al igual que el agar MacConkey con agua destilada (250ml) en un matraz de 500ml.

3. Empezamos a auto clavar ambas soluciones del agar MacConkey y el agar nutritivo conjuntamente. 4. Seguidamente sacar y hacer enfriar amabas soluciones (dejamos reposar las soluciones durante 50 minutos). 5. Ahora la sangre de carnero mesclar con el agar nutritivo.

6. despus de que este frio el Agar sangre empezamos a plaquear con las placas petri esterilizadas adelante del mechero de bunzen para que no se pueda contaminar la muestra, tambin con el mechero tenemos que desaparecer las burbujas de la muestRA

7.

despus de que este frio el AGAR MacConkey empezamos a plaquear con las placas petri esterilizadas adelante del mechero de bunzen para que no se pueda contaminar la muestra, tambin con el mechero tenemos que desaparecer las burbujas de la muestra

8.. Usar el asa calibrada, flamear, dejar enfriar, mantener en posicin vertical introducir solo el aro debajo del nivel de la orina previa mezcla de la orina sin centrifugar INCUBACIN Una vez sembradas las placas deben incubarse durante 16 a 18 horas a 35 - 37 C. Incube 48 horas aquellos uro cultivos OBTENCION DE MEDIOS DE CULTIVOS: Agar macconkey (NEGATIVO) (POSITIVO)

Agar Sangre B. COLORACIN AGAR SANGRE

Realizar la toma de muestra utilizando hisopo y dejar secar a temperatura ambiente. Adicionar unas gotas cristal violeta sobre la muestra. Dejar actuar entre 1 o 2 minutos y luego lavar a chorro lento. Adicione unas gotas de lugol sobre la muestra. Dejar actuar entre 1 o 2 minutos y luego lavar a chorro lento Adicione alcohol cetona entre 3 a 4 gotas, dejando actuar por un minuto. Lavar con agua de cao a chorro lento. Finalmente adicionar unas gotas de safranina sobre la muestra y deje actuar 1 o 2 minutos. Lavar con agua de cao a chorro lento y dejar secar a temperatura ambiente colocando la lmina de forma verticAL Observar sus coloraciones en el microscopio compuesto, utilizando aceite de inmersin y el objetivo 100X. C. COLORACION AGAR MACCONKEY

Realizar la toma de muestra utilizando hisopo y dejar secar a temperatura ambiente. Adicionar unas gotas de safranina sobre la muestra y deje actuar 1 o 2 minutos. Lavar con agua de cao a chorro lento y dejar secar a temperatura ambiente colocando la lmina de forma vertical. Observar sus coloraciones en el microscopio compuesto, utilizando aceite de inmersin y el objetivo 100X.

Examen microscpico de los medios de cultivo MUESTRA 1: agar sangre observacin por colonias y medios.

Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados. Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa. Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas esporas, hifas. Streptococcus: de color azul. MUESTRA 2: Agar MacConkey observacin por colonias y medios Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosacon blanco. Colonias con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis. GRAM POSITIVAS SCHERICHIA COLY GRAM NEGATIVAS Este trabajo ha sido realizado con un propsito y para corroborar que nuestras sospechas tras la observacin del cultivo son ciertas. Para ello tras la observacin de la siembra y el cultivo, al observar las colonias, decidimos realizas las observaciones microscpicas con la elaboracin de la tincin de gram, para verificar que, cada una de esas colonias se corresponde con la forma que debe de presentar cada bacteria de estas. Tras la realizacin de cada una de las pruebas nombradas con anterioridad durante todo el desarrollo hemos podido llegar a la conclusin que, ambas muestra presentan E.coli , Enterococcus, Streptococcus. Ambas muestras poseen un alto nmero de bacterias, presentan una alta bacteriuria.