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ANTIBIOGRAMA 1.

OBJETIVOS - Determinar a sensibilidade de um microrganismo a determinados agentes antimicrobianos pelo mtodo de difuso; - Identificar a rea que corresponde ao halo de inibio do agente antimicrobiano na prtica; - Determinar as condies necessrias para a realizao do antibiograma de bactrias aerbicas e anaerbicas facultativas. 2- FUNDAMENTOS TERICOS Como antibiticos combatem as bactrias? Os antibiticos com aplicaes teraputicas devem ter toxidade seletiva. Devem ser txicos para o agente causador da doena mas no para o ser humano por atuarem em etapas do metabolismo e no d indivduo infectado. Vejamos os principais mecanismos de ao de antibiticos sobre bactrias. 1- Inibio da duplicao do cromossomo bacteriano (o impede a reproduo do microrganismo) ou da transcrio do DNA em RNA mensageiro (fonte de informao para a sntese protica). Ex.: quinolonas (norfloxacino,ciprofloxacino). 2- H antibiticos que imitam substncias usadas pela clula bacteriana ( metablitos) e se ligam a enzimas, inibindo-as. Ex.: trimetoprima e sulfas (inibem a produo de cido flico, essencial ao crescimento bacteriano; o ser humano no produz cido flico, o obtm da alimentao). 3- H antibiticos que modificam a permeabilidade da men=mbrana plasmtica da bactria, fazendo com que metablitos importantes sejam perdidos atravs dela. Ex.: polimixina B, daptomicina. 4- H antibiticos que atuam inibindo a sntese de protenas bacterianas. Como existe usam diferena estrutural entre os ribossomos de bacria e os de humanos, esses medicamentos no afetam a produo protica humana. Ex.: Cloranfenicol,eritromicina, azitromicina, neomicina, tetraciclinas,gentamicina. 5- A parede celular uma estrutura relativamente rgida, formada pela substncia peptidoglicano, que envolve a membrana plasmtica de bactrias. H antibiticos que impedem a formao completa do peptidoglicano. Isso acarreta a lise da clula bacteriana. Ex.: penicilina, amoxilina, amplicilina, cefalosporinas, vancomicina, bacitracina. Em funo das reaes adversas e da possibilidade de selecionar bactrias resistentes, antibiticos jamais devem ser tomados por conta prpria.

Mecanismos de resistncia das bactrias aos antibiticos A resistncia antibitica ocorre quando a bactria adquire genes que permitem a interferncia no mecanismo de ao do antibitico por mutao espontnea de DNA ou por transformao e transferncia de plasmdeos. Os antibiticos BETA-lactam inibem as protenas que unem a penicilina (PBP) na parede celular bacteriana. Bactrias como estafilococos desenvolveram resistncia a antibiticos BETA-lactam, adquirindo a habilidade de produzir BETA-lactamase, que destri o antibitico, e adquirindo a nova PBP, que no suscetvel inibio antibitica. Espcies de estreptococos na verdade alteram seus ribossomos para prevenir a adeso de eritromicina, tetraciclina, estreptomicina e gentamicina (BOZDOGAN, 1999). Fluoroquinolonas agem inibindo DNA-girase e topoisomerase IV, ambas enzimas envolvidas na sntese do DNA bacteriano. A resistncia a fluoroquinolona, entretanto, pode se desenvolver por meio de alteraes no acesso ou nas prprias enzimas-alvo. Alteraes nessas enzimas incluem mutaes desenvolvidas com DNA-girase, que tendem a ocorrer em bactrias gram-negativas resistentes a fluoroquinolonas ou mutaes em topoisomerase IV, que ocorrem mais em bactrias gram-positivas resistentes a fluoroquinolonas. Alteraes no acesso a enzimas-alvo evitam que as fluoroquinolonas atravessem a parede celular bacteriana. Esse mecanismo de resistncia bacteriana envolve a expresso de bombas de fluxo associadas a membranas e resistentes a mltiplas drogas, que bombeiam ativamente o antibitico para fora da clula bacteriana (ENDTZ, 1999) . Alm do DNA cromossmico, as clulas bacterianas podem conter pequenas molculas circulares de DNA denominadas plasmdios. Certos plasmdios possuem genes responsveis pela sntese de enzimas que destroem um antibitico antes que ele destrua a bactria. So os chamados plasmdios R (de resistncia aos antibiticos). Eles tambm possuem genes que permitem sua passagem de uma bactria para outra (fator F). Quando dois ou mais tipos de plasmdios R esto presentes em uma mesma bactria, os genes de um deles podem passar para outro por recombinao gnica: conjugao, transformao e transduo. Esse mecanismo faz com que surjam plasmdios R portadores de diversos genes para resistncia a diferentes antibiticos. Os plasmdios podem estar integrados no cromossomo, sendo capazes de transferir genes cromossmicos. Muitos so promscuos, isto , passam o gene de resistncia para espcies no aparentadas geneticamente (LODDER, 1996). Como a resistncia cromossmica depende de mutao espontnea, evento raro, ela dirigida quase sempre a uma s droga e os genes so transferidos com freqncia relativamente baixa. Por isso, seu impacto clnico menor que o da resistncia plasmidial. No se pode esquecer que bactrias sensveis

podem receber genes cromossmicos mutantes de bactrias j resistentes, atravs da recombinao gnica (LUNA, 1999). Descobriu-se em 1974 que grande parte dos genes de resistncia considerados plasmidiais ou cromossmicos esto localizados sobre transposons e apresentam as propriedades destes: disseminao rpida dentro da clula ou entre clula. Os transposons so segmentos de DNA com grande mobilidade, eles codificam a enzima transposase - responsvel por sua transferncia para outros segmentos de DNA. Eles so promscuos: criam as variaes invadindo diversos stios do DNA hospedeiro, mas s vezes exageram, produzindo mutaes letais (LODDER, 1996). 3- MATERIAS, VIDRARIAS E UTENSLIOS 12 placas de Petri; 1 rack com 10 ponteiras para micropipeta de 0,1mL; 2 pipetas graduadas de 10 mL; 2 macropipetadores; 4 estantes para tubos de ensaio; 10 tubos de ensaio, 10 x 150 mm,com tampa rosqueada; Papel de po; Barbante; 1 tesoura; 3 Becker de 250 mL; 2 provetas de 250 mL; 6 esptulas tipo canaleta de 15 cm; 1 Becker de alumnio; Papel de filtro; 2 trip; 2 tela de amianto; 4 alas de Drigalsky; 2 Becker de 500 mL; 3 bastes de vidro; 1 frasco para meio de cultivo de 250 mL; Furador de papel; 3 Swab; 2 ala de Nichrome; 1 estante para lminas; 2 lminas; 1 caixa para lminas; 1 pina metlica; 2 micropipetas de 0,1mL; 1 bero para lminas;

8 cubas; Caixa de fsforos; 1 dispensador 0 a 10 mL; 2 frascos para meio de cultivo de 500 mL;

4- EQUIPAMENTOS Encubadora shake; Microscpio ptico, objetiva de 100x; Estufa bacteriolgica a 37 C; Autoclave, temperatura 121C, 1,1 atm, por 15 minutos; Forno Pasteur, temperatura 170C por 90 minutos. Balana Metller PC 200, 220 v; Balana Bel,220 v;

5- REAGENTES USADOS Soluo salina de cloreto de sdio (NaCl) de 0,5% m/v; Soluo aquosa de corante cristal violeta (C24H28N3C) de 1% m/v; Soluo aquosa de lcool acenonato (1:1), C3H6O; Soluo aquosa de lugol,1% m/v; gua da torneira; gua deionizada,H2O; leo de cedro; Cefaclor; Amoxicilina; Cefalexina; Azitromicina;

6-MEIO DE CULTIVO - Agar manitol Peptona Proteose: 10.0 g/L ( fonte de nitrognio e aminocidos); Extrato de Bife: 1.0 g/L ( enriquecimento do meio); Cloreto de Sdio: 75.0 g/L ( agente seletivo); D-Manitol: 10.0 g/L ( fonte de carbono e enrgia); Vermelho Fenol: 0.025 g/L (indicador de pH); Agar: 15.0 g/L ( solidificao do meio); pH final: 7,4 0,2;

- Agar eosina azul de metileno Peptona de carne: 10 g/L ( fonte de nitrognio e aminocidos);

Fosfato de potssio: 2 g/L Lactose: 5 g/L ( fonte de carbono e energia); Sacarose: 5 g/L( fonte de carbono e energia); Agar: 13,5 g/L ( solidificao do meio); Azul de metilino: 0,065 g/L ( agente seletivo); Eosina amarela: 0,4 g/L ( indicador de pH); pH final: 7,2 0,2;

- Caldo glicosado Peptona bacteriolgica: 10 g/L (fonte de nitrognio e aminocidos); Extrato de levedura: 10 g/L (fonte de nitrognio); Cloreto de sdio: 5 g/L(aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio); Glicose: 5 g/L (fonte de carbono e energia);

- Agar motilidade Peptona de carne : 10 g/L(fonte de nitrognio); Extrato de bife: 3,0 g/L(aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio); Cloreto de sdio: 5g/L; Agar : 4,0 g /L (solidificao do meio); pH 7,4 2;

- Agar para contagem de microrganismos (APC) Peptona de casena: 5,0 g/L (fonte de nitrognio e aminocidos); Extrato de levedura: 2,5 g/L (enriquecimento do meio); Dextrose: 1,0 g/L ( fonte de carbono e energia); Agar; 15,0 g/L (solidificao do meio);

7- AMOSTRAS Mucosa nasal; Coliformes;

8- Procedimentos A) Preparao de meios de cultivos a) Montagem e esterilizao das placas de Petri. b) Preparo de meio de cultivo solidificado semi-solidificado. c) Preparo de meio de cultivo lquido. B) Plaqueamento

C)Inoculao da amostra bacteriana Transferir, em condies asspticas, uma colnia de Staphylococcus para tubo de ensaio contendo caldo glicosado com auxlio de uma ala de Nichrome. Repetir o procedimento para a amostra contendo bactrias dos grupo coliforme. O tubo de caldo glicosado contendo a amostra de coliformes ( Escherichia coli) dever ser posto em mesa agitadora, por 24 horas a 37C e o tubo contendo coliforme em estufa a 37C. D) Antibiograma a) Preparo dos discos dos agentes antimicrobianos Preparar discos de papel de filtro com dimetro de 0,5mm (furador). Numerar as substncias cujo poder antimicrobiano ser testado. Segurando os discos (um a um) com auxlio de uma pina metlica, mergulhe-os em cada uma das substncias. Aguarde alguns segundos para eliminar o excesso do produto no disco de papel. b) Inoculao da amostra no meio Agar Plate Count (A.P.C.) acrescido de 2% de extrato de levedura. Dividir a placa em quatro quadrantes e numer-los. Transferir 1 mL da cultura a ser testada para placa de Petri. Espalhar com auxlio de uma ala de Drigalsky, a amostra do microrganismo-teste sobre a superfcie do meio estril contido na placa; repita o procedimento para mais uma placa. c) Adio dos antibiticos. Colocar no centro de cada quadrante, os discos com agentes antimicrobianos utilizando uma pina metlica (antibiticos 1 a 4).Incubar em estufa regulada a 35/ 37C por no mximo 48h. Observao das placas de Petri para verificar ao de cada antibitico sobre o microrganismo pesquisado. Nas placas onde houver inibio, mea o halo formado com auxlio de uma rgua. O dimetro do halo tem que ser expresso em milmetros. Consulte a tabela em anexo para comprovar a sensibilidade do microrganismo testado aos antibiticos. E) Colorao de Gram. 9- REAES No houve.

10- CLULOS E/OU RESULTADOS Massa pesado do Agar para contagem de microrganismos (A.P.C.) 23,5g ---- 1L m -------0,5 L m =11,75 g Massa para preparar o caldo glicosado Peptona bacteriologia: 10 g --------- 1L M ----------- 0,08 L M = 0,8g Extrato de levedura: 10 g --------- 1L M ----------- 0,08 L M = 0,8g Cloreto de sdio: 5 g --------- 1L M ----------- 0,08 L M = 0,4g Glicose: 5 g --------- 1L M ----------- 0,08 L M = 0,4g Meio motilidade

Agar eosina azul de metileno 36 g---------1000 mL m------------ 200 mL

m= 7,2g Agar manitol 111,025g-----------1000 mL M -----------------200 mL M = 22,205g Resultado das colnias plaqueadas:

Agar manitol Tamanho Cor Forma Elevao Brilho Cor do meio 4 mm Amarelo Redondo No Sim Amarelo

Agar eosina azul de metileno 1 mm Roxo Redondo Sim Sim (verde) No houve mudana de cor

Agar manitol: Colnia amarela a colnia de Staphylococcus aureus,cocos Gram +, so halfilas e por digerir manitol libera substncia cida que muda a cor do meio para amarelo. Agar eosina azul de metileno: A colnia de coliformes a Escherichia,bastes Gram -, teve colorao roxa que nos indica que o pH foi 5,0,ou seja, as bactrias digeriram a lactose e a sacarose presente no meio. Caldo Glicosado: Amostra do Agar manitol Houve turvao e no produziu gs. Como houve a inoculao da picada nica no meio motilidade, notou-se que as bactrias so imveis e aerbicas. Amostra do Agar eosina azul de metileno Houve turvao e no houve produo de gs. Pela inoculo no meio motilidade,foi observado que as bactrias so imveis e anaerbicas facultativas.

Observao microscpica:

Lmina do Agar manitol: Cocos: Estafilococos Gram +

Lmina do Agar eosina azul de metileno: Bacilos: Estreptobacilos Gram

Quadrantes com antibiticos:

1234-

Cefaclor Amoxicilina Cefalexina Azitromicina

Placas: Escheria: 1- O antibitico Cefaclor no inibiu o crescimento das bactrias, que cresceu, at no disco do antibitico. 2- A amoxilina exibiu um halo de inibio de 6mm; 3- O antibitico Cefalexina no inibiu o crescimento das bactrias, que cresceu, at no disco do antibitico. 4- A Azitromicina exibiu um halo de inibio de 4mm; Staphylococcus aureus: As bactrias so sensveis a todos os antibiticos,ou seja, no houve crescimento. dos

Obs: A nica maneira de diferenciar Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermis,em laboratrio atravs do Agar manitol.

11-Conluses O antibiograma ensaio capaz de medir a susceptibilidade ou resistncia de uma bactria aos antibiticos por meio do espectro de sensibilidade observados na placa de cultura. , por definio, um teste de sensibilidade in vitro. " um ensaio que mede a susceptibilidade/resistncia de uma bactria a um ou mais agentes antimicrobianos. Seu objetivo tanto a anlise do espectro de sensibilidade/resistncia a drogas de uma bactria quanto a determinao da concentrao mnima inibitria". O Staphylococcus aureus uma bactria esfrica, aerbia ou anaerbia facultativa, gram positiva que cresce na forma de cachos de uva. Essa bactria considerada pelos mdicos um problema, j que, alm de provocar infeces, costumam ser encontradas na pele de at 15% dos seres humanos. comum termos em nosso organismo, como pele, boca, nariz, intestino, colnias de bactrias que no nos causam doenas, mas importante frisar que essas bactrias no causam doenas somente enquanto permanecem restritas a esses locais, pois as colnias so verdadeiros reservatrios de bactrias prontas para invadir o corpo todas as vezes que o sistema imunolgico estiver fragilizado. As bactrias encontradas na pele ficam esperando apenas uma leso para poderem entrar no corpo, e por isso extremamente importante lavar bem as feridas, pois vrios tipos de infeces no organismo so causados pelo Staphylococcus aureus, e o tipo mais comum a infeco da pele, cuja porta de entrada pode ser at uma pequena mordida de inseto. O Staphylococcus aureus tambm responsvel por infeces como impetigo, terol, furnculo, foliculite, mastite puerperal entre outras. O Staphylococcus aureus tambm pode invadir o nosso corpo atravs de alimentos contaminados com as toxinas da bactria, provocando intensa infeco intestinal, vmitos e diarreia. Esses alimentos podem ser contaminados na hora de sua manipulao (por pessoas que estejam contaminadas com a bactria em secrees nasofarngeas, ou com ferimentos nas mos, abcessos ou acnes). Produtos que no foram cozidos ou refrigerados adequadamente permitem a multiplicao da bactria e a produo da toxina. Uma vez em nosso organismo, o Staphylococcus aureuspode no ficar restrito apenas nossa pele. Se invadir a circulao sangunea,

poder atingir qualquer rgo, desencadeando infeces graves, sepse e choque sptico. Uma das infees mais temidas, provocadas pelo Staphylococcus aureus, a endocardite, no corao, mas outras infeces possveis so a pneumonia, a pielonefrite e osteomielite. A Escherichia coli uma bactria na forma de bastonete, e anaerbia facultativa. Seu habitat primrio o trato gastrintestinal de humanos e outros animais endotrmicos (de sangue quente). considerada um indicador de qualidade de gua e alimentos atravs da anlise de coliformes fecais: nome dado a um grupo de bactrias que habita o intestino dos referidos animais. Geralmente a bactria em questo habita o intestino sem causar problemas de sade. No entanto, ao se direcionar para a circulao sangunea ou outras regies do corpo, capaz de provocar infeces . 12- ESQUEMA A) a) Montagem e esterilizao das placas de Petri

Autoclave

b)

c)

B)

C)

D) a)

b)

13- ATIVIDADES DE VERIFICAO a) Explique por que se deve realizar a semeadura a amostra utilizando a ala de Drigalsky? R: Para espalhar de maneira uniforme microrganismos uni- ou multicelulares sobre placas de Agar. b) Como podemos determinar se um microrganismo sensvel ou no a um determinado antibitico? R: Verificando se houve crescimento de bactria ao fazer o antibiograma. c) Mencione algumas limitaes desta prtica.

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