UNIVERSIDAD DE LA SERENA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

LABORATORIO DE BIOQUMICA KINESIOLOGA

Actividad enzimtica de la B-fructofuranosidasa Y los factores que influyen en ella

Nombre Integrante 1, Javiera Castro, Nelly Rivera, Paulina Kyonen, Abraham Daz e-mail contacto: jcastro6@alumnosuls.cl; nelly_r.o@hotmail.com; paauignacia@hotmail.com; sheto_18@hotmail.com.
RESUMEN

Las reacciones qumicas requieren de catalizadores para acelerar las reacciones, ya que estos disminuyen la energa de activacin. Las Enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica, poseen la propiedad de un alto grado de especificidad, esto quiere decir, que una enzima cataliza una reaccin donde participa un sustrato determinado o sustratos semejantes. La actividad enzimtica estar determinada por distintos factores, por lo que veremos algunos de ellos. El experimento N1 consiste en la deteccin de la actividad de la B-fructofuranosidasa en un extracto de levadura, para determinar esto, se utilizaron diferentes materiales y procedimientos que ayudaron a realizar el experimento de forma correcta. Esta enzima es hidrolitica frente a la sacarosa por lo que su actividad se puede evidenciar con la aparicin de glcidos reductores mediante el reactivo DNS, dando productos coloridos que facilitan su observacin. En el experimento N2 observaremos la influencia que tiene la temperatura sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa, Para esto, colocamos las muestras a diferentes temperaturas y as logramos observar que las mas coloridas fueron las de mayor temperatura, esto quiere decir que fueron las ms rpidas en reaccionar, siendo el mximo punto de reaccin a una temperatura de 50C. En el experimento N3 comprobamos la influencia que tiene el pH sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa preparando distintas soluciones con pH desde 2,4 hasta 7,4 pudiendo evidenciar la influencia en la actividad de la enzima, identificando como pH optimo 6, 4( donde la velocidad de reaccin es mxima)para la enzima B-fructofuranosidasa .
PALABRAS CLAVE: Enzimas Catalizadores Energa de activacin Velocidad de reaccin fructofuranosidasa 3,5Dinitrosalicilato (DNS) solucin amortiguadora pH temperatura Tiempo de incubacin. INTRODUCCIN En el presente informe detallaremos la funcin de la B-fructofuranosidasa, la cual es una enzima que tiene accin hidrolitica frente a la sacarosa. Determinaremos esta actividad por medio del reactivo 3,5-dinitrolsalicilato (DNS), el cual nos permitir medir los productos directamente sin necesidad de clculos analticos muy complicados, sin embargo para lograr estas mediciones debemos aislar y purificar, parcialmente, a la enzima para as poder analizar las variables individuales que influyen en su actividad. Es as como en esta sesin de laboratorio reconocemos estas variables (pH, temperatura, tiempo) para determinar la velocidad de reaccin de la enzima involucrada procurando que la solucin amortiguadora de pH garantice la mantencin del pH elegido durante el periodo de observacin y que la concentracin de sustrato sea lo suficientemente alta para mantener la saturacin de la enzima mientras dure el experimento. Adems profundizaremos aun ms en los factores de pH y temperatura con dos experimentos, este ltimo factor influye directamente ya que al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de reaccin, sin embargo solo puede elevarse hasta cierto punto ya que pasado ese punto la enzima se inactiva, este punto depende de la t normal de las clulas en las cuales reside la enzima. Por su parte el primer factor influye en la cintica enzimtica debido a cambios en el estado de ionizacin de los componentes del sistema enzimtico. Si se vara esta ionizacin de los grupos que posee la enzima a nivel del sitio activo o en algn punto lejano, pero que de algn modo altere el sitio activo se afecta el tipo de unin y estabilidad del complejo enzima-sustrato o de la actividad cataltica misma. Las enzimas son activas en un rango limitado de pH y la mayora de los casos, se puede encontrar un pH o una zona de pH en la cual la actividad enzimtica es mayor, lo que se denomina pH ptimo (por lo general un pH entre 5 y 9). Hay que considerar adems, que la enzima puede inactivarse por desnaturalizacin a pH extremos y que la estabilidad de la enzima o los sustratos frente a diversos agentes desnaturalizantes puede variar en funcin del pH. La naturaleza de la solucin amortiguadora tambin puede interferir. Los objetivos para este laboratorio son: Determinar los factores que influyen en la eficiencia de la actividad enzimtica experimental. Detectar la actividad enzimtica de la -fructofuranosidasa. Estudiar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reaccin enzimtica.

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EXPERIMENTO 1. DETECCION DE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA EN UN EXTRACTO DE LEVADURA.

Materiales: Tubos de ensayo, pipetas, agua destilada, parafilm. REACTIVOS: muestra solucin de sacarosa (sustrato) 0,45 M; solucin glucosa-fructosa 0,01 M; reactivo 3,5dinitrosalicilato; Buffer acetato pH = 4,7; 0,05 M; solucin de extracto -fructofuranosidasa. Fraccin A Solucin de extracto -fructofuranosidasa. Fraccin B pH= 4,7 T = 27 Stock de enzimas tubo1 tubo 2 tubo 3 tubo 4 + 1ml de enzimas + 6ml agua destilada + 6ml agua destilada +6ml agua destilada + 24 ml agua destilada

1/10 Tubos a: 1ml buffer acetato + 1ml sacarosa Tubos b: 1,5ml buffer acetato + 1ml sacarosa Se llevan a 27 por 3 min. Patrn: 1ml enzimas 1/2000 + 1ml fructosa sacarosa 0,01m (27 por 3min.) Se agrega a los tubos 1ml de sacarosa cada 30 sg. Menos al patrn. Luego de 5min se agregan 2 ml de DNS a todos los tubos y se llevan a bao hirviendo durante otros 5min. Por ltimo enfriar.

1/250

1/500

1/1000

1/2000

a1

b1

a2

b2

a3

b3

a4

b4

PROCEDIMIENTO

1) Confeccionar una curva de calibracin para la determinacin de la concentracin de glucosa- fructosa por espectrofotometra a partir de un patrn. 2) Preparar por duplicado varias diluciones del extracto enzimtico tanto de la fraccin A, como de la fraccin B. Colocar la solucin amortiguadora, la solucin enzimtica y el agua necesaria para completar el volumen de 12 mL, Mezclar. 3) Equilibrar los tubos a temperatura de incubacin 27 C durante 2 a 3 minutos. 4) Iniciar la reaccin agregando el sustrato (sacarosa). Registrar el tiempo. 5) Incubar simultneamente un blanco y un patrn. 6) Al completarse exactamente el tiempo para la incubacin, detener la reaccin agregando 2,0 mL de reactivo 3,5-dinitrosalicilato. 7) Desarrolle el color de todos los tubos llevndolos a un bao de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfre.8) Completar con agua hasta un volumen de 20 mL. Resultados
Tabla1.- tabla que relaciona la concentracin de enzima con la absorbancia

Tubo [ ] A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 Patrn

[Solucin enzimtica] 1/750 1/1500 1/3000 1/6000 1/1500 1/3000 1/6000 1/12000

Absorbancia 1,220 0,676 0,602 0,968 0,557 0,416 0,807 0,483 1,789

[Glucosa] (mM) 1,342E-08 7,480E-09 6,672E-09 1,067E-08 6,180E-09 4,638E-09 8,912E-09 5,370E-09 1,964E-08

Velocidad de reaccin (mM de Glucosa/5min)

2,68E-09 1,50E-09 1,33E-09 2,13E-09 1,24E-09 9,28E-10 1,78E-09 1,07E-09 3,93E-09 2

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1.60E-08 1.40E-08 1.20E-08 Absorbancia 1.00E-08 8.00E-09 6.00E-09 4.00E-09 2.00E-09 0.00E+00 0.00E+00 5.00E-10 1.00E-09 1.50E-09 2.00E-09 2.50E-09 y = 5.0085x - 8E-12 R = 0.9999

y = 5.0133x - 1E-11 R = 1

Fraccion A Fraccion b

3.00E-09

Velocidad de reaccion (mM glucosa/5min)

Grafico 1.- Grfico velocidad de reaccin (mM de Glucosa/5min) en funcin de la concentracin de enzima.

EXPERIMENTO 2. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA.

MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Agua destilada REACTIVOS Glucosa-Fructosa 0,01 M Sacarosa 0,45 M Preparacin enzimtica Buffer Citrato 0,2 M Reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS)

Abs = absorbancia de la solucin problema. [Glucosa]= concentracin de glucosa de la solucin problema.

[Glucosa]= concentracin de glucosa de la solucin problema. Tiempo = tiempo de reaccin PROCEDIMIENTO

A) Se Preparo baos de incubacin a 10C, 30C, 40C, 50C, 60C y 70C B) Se dispuso una serie de 12 tubos de ensayo, en el que tres tubos estarn en cada temperatura, uno con muestra el otro patrn y un ltimo control. Al primer tubo se le agrego los componentes del sistema enzimtico, excepto el sustrato. C) Se equilibro cada tubo con sus respectivos controles a las diferentes temperaturas de incubacin elegidos a iniciar la reaccin con el sustrato. D) Se Incubo exactamente durante 40 minutos. Se detuvo la reaccin con 3,5-dinitrosalicilato. Se completo volumen a 20 mL con agua. E) Se midi la absorbancia en espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm.
(Fbrega, Maturana, Plaza, 2013)

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RESULTADOS
Tabla 2. Resultados de la temperatura sobre la actividad enzimtica en absorbancia, concentracin de glucosa y velocidad de reaccin.

Tubo 1 2 3 4 5 Blanco Patrn

Temperatura (C) 10 27 40 50 60 27 27

Absorbancia 1.296 0.766 4.604 6.82 2.87 0 0.001

[Glucosa] (mM) 7,12 4,23 25 37 15

v (mM de Glucosa/min) 1.424 0.846 5 7.4 3

Grfico: velocidad de reaccin (mM de Glucosa/min) en funcin de la temperatura.

EXPERIMENTO 3. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA -FRUCTOFURANOSIDASA

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Agua destilada Cubetas espectrofotmetro

REACTIVOS Glucosa-Fructosa 0,01 M Sacarosa 0,45 M Preparacin enzimtica Buffer Citrato 0,2 M Reactivo 3,5 dinitrosalicilato (DNS)

Abs = absorbancia de la solucin problema. [Glucosa]= concentracin de glucosa de la solucin problema.

[Glucosa]= concentracin de glucosa de la solucin problema. Tiempo = tiempo de reaccin

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PROCEDIMIENTO A)Se prepararon soluciones con 0,5 ml de solucin enzimtica ms 1 ml de sacarosa (0,45M) con pH 2,4; 3,4; 4,4; 5,4; 6,4 y 7,4 B) Se dispuso de una serie de seis tubos de ensayo, uno para cada pH ms un tubo patrn y uno control. Se Agrego a cada tubo la solucin amortiguadora de acuerdo a la escala preparada. Se incluy en la serie los controles adecuados y el patrn, se mezclo. Luego se equilibro los tubos a temperatura de incubacin obtenida a partir del experimento anterior y se inicio la reaccin con el sustrato. C)Se Incubo exactamente durante 40 minutos y a la temperatura previamente establecida. D) Se detuvo la reaccin agregando 2,0 mL de solucin 3,5-dinitrosalicilato. E) Para desarrollar el color Desarrollar se incubo todos los tubos en bao hirviente durante 5 minutos. y luego se dejo enfriar. F) Se Completo con agua destilada a volumen de 15 mL. G)Se Ley la Absorbancia en el espectrofotmetro con la longitud de onda de 540 nm.(Fbrega ,Maturana ,Plaza, 2013) RESULTADOS
Tabla 3. Resultados de la temperatura sobre la actividad enzimtica en absorbancia, concentracin de glucosa y velocidad de reaccin

Tubo 1 2 3 4 5 6 Blanco Patrn

pH 2,4 3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 4,4 4,4

Absorbancia 1,487 1,788 1,061 1,367 1,536 1,174 0 0

[Glucosa] mM
8,17 9,81 2,33 1,5 33 25

v (mM de Glucosa/min) 1,634 1,962 0,466 0,300 6,600 5,000

Figura 3. Velocidad de reaccin (mM de Glucosa/min) en funcin del pH.

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Fotografa 2.Soluciones con 1,5 ml de buffer acetato , 0,5ml de disolucin enzimtica y 1ml de sacarosa0,45M.

Fotografa 1.Tubo de ensayo numero 1 a 10 C.

Fotografa 3.Soluciones despus de aplicar distintas temperaturas.

DISCUCIONES
En este primer experimento logramos determinar la velocidad de reaccin de una concentracin enzimtica determinada, pero qu pasa con las cubetas que se encontraban ms concentradas (color ms rojizo)?, bueno como los resultados indicaron estas cubetas mas concentradas arrojaron absorbencias muy altas lo que a su vez entregaron concentraciones de glucosa tambin ms altas, por lo que tuvieron que diluirse aquellas cubetas cuyas absorbancias fueran elevadas, es por eso que cada vez que se diluyera una de estas concentraciones al momento de calcular la concentracin de glucosa haba que multiplicar por 2. Una ciertas cantidad de procedimientos propicios a pequeos errores es la respuesta a la falta de precisin de los datos ya que los factores tiempo y temperatura controlados por nosotros nunca sern 100% precisos. En el experimento sobre la influencia de la temperatura sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa, logramos darnos cuenta que la temperatura es un factor muy importante que puede causar grandes cambios en la velocidad de una reaccin , en este caso al realizar el procedimiento , todo estaba resultando de manera adecuada a lo que tena que ser, hasta el momento en que calculamos la absorbancia de cada muestra en la que tuvimos complicaciones con los 3 ,4 y 5 donde tuvimos que diluirlos La enzima posee numerosos grupos ionizables que se ven afectados por el pH al que se encuentren sometidas, esto se comprob con la realizacin del experimento llevando la enzima a distintos pH comparando entre ellos la diferencia que exista en la velocidad de reaccin, en este caso la hidrolisis de sacarosa, y la correspondencia con la concentracin del producto en la solucin (glucosa). Lo anterior se ve relacionado con la variacin de la ionizacin de estos grupos a nivel del sitio activo afectando el tipo de unin y estabilidad del complejo enzima-sustrato o la actividad cataltica misma. La grafica se explica teniendo en cuenta lo anterior explicado, donde el pH modifica el estado de disociacin de los grupos qumicos presentes en la enzima, en el sustrato, el complejo enzima sustrato y con ello puede modificarse la unin. La grafica tiene una forma acampanada ya que la mayor velocidad se encuentra en el pH optimo , generalmente entre 5,0 y 9,0 y el decrecimiento se debe a que a valores extremos de pH puede producirse desnaturalizacin de la protena enzimtica lo que contribuye a la poca actividad que se observa en esta zona. (Cardell, 2007) CONCLUSIONES DETECCION DE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA EN UN EXTRACTO DE LEVADURA. Podemos concluir que la actividad de esta enzima (B-fructofuranosidasa) ms la accin del DNS nos permitieron obtener los productos adecuados para el anlisis de la actividad enzimtica experimental por lo cual se cumplieron los objetivos planteados. A su vez pudimos notar que tanto ms aislada y pura dejemos la muestra como ms resistente sea la solucin amortiguadora de pH los resultados sern ptimos teniendo en cuenta tambin el resto de los factores que influyen en estas actividades. Finalmente hay que destacar la relacin directa entre estos factores y la velocidad de reaccin con la que acta la enzima, es decir

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la capacidad para catalizar los sustratos que se encuentren en la muestra ya sea por accin directa en el sitio activo o algn punto lejano, pero que tambin influya en este sitio. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA. La temperatura es fundamental, ya que puede aumentar o disminuir la velocidad de una reaccin, entonces dependiendo a que temperatura tengamos una muestra esta adquirir diferentes caractersticas, si aumentamos la temperatura la energa cintica de las partculas aumenta por lo que se producen ms choques y los reactantes formaran en un menor tiempo los productos ya que la energa de activacin se disminuyo considerablemente, en nuestro experimento a las temperaturas de 40 a 50C son las que presentan mayor velocidad siendo 50C el punto de mayor velocidad donde la enzima mantiene una conformacin estable ,desde el punto de vista cataltico, luego la enzima disminuye su velocidad de reaccin a una temperatura ms elevada en nuestro caso a 60C por lo que queda demostrado que la temperatura puede ser favorable como perjudicial. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA -FRUCTOFURANOSIDASA El ndice de casi todas las reacciones catalizadas por encima muestra una dependencia importante de la concentracin de ion hidrgeno. Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad ptima a valores de pH entre 5 y 9, como comprobamos en el caso de la enzima -fructofuranosidasa donde su punto de mayor actividad enzimtica se encontraba al pH 6,4 y tambin es el punto donde se encuentra mayor concentracin de glucosa. La relacin entre actividad y concentracin de ion hidrgeno refleja el equilibrio entre la desnaturalizacin de enzima a pH alto o bajo, y los efectos sobre el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas cuyo mecanismo comprende catlisis acidobsica, los residuos comprendidos deben estar en el estado de protonacin apropiado para que la reaccin proceda.( Murray, Bender, Botham , Kennelly ,Roowell , Weil ,2010). REFERENCIAS Debe indicar las fuentes utilizadas en la elaboracin de su trabajo, las cuales deben ser fidedignas. La forma de referenciar libros se entrega a continuacin: [1] Apellido autor, Inicial nombre mayscula. & Apellido autor, Inicial nombre mauscula. (Ao publicacin). Ttulo cursiva (N ed). Ciudad de impresin: Editorial. Si se utilizo alguna publicacin de revista cientfica (paper), la forma de referenciarlo ser as: [2] Apellido autor, Inicial nombre mayscula. & Apellido autor, Inicial nombre mauscula. (Ao publicacin). Ttulo publicacin. Nombre Revista de publicacin cursiva. N Revista: N pgina inicial trabajo-N pgina final trabajo En el caso que se citen pginas web, estas deben ser de autor conocido pertinente, que le permita confiar e la informacin entregada. La forma de referenciar pgnas web es la siguiente: [3] Apellido autor, Inicial nombre mayscula. <Fecha de visita>. Nombre pgina. [En lnea]. Disponible en: http://themedicalbiochemistrypage.org/

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