Anlisis Instrumental

Prof. Dr. Eliel R. Romero Garca

Unidad II.I Mtodos pticos de Anlisis Instrumental

2.1 Mtodos pticos de anlisis instrumental

a. Espectroscopia Atmica: Espectroscopia atmica de absorcin Espectroscopia atmica de emisin b. Espectroscopia Molecular: Colorimetra Turbidimetra Nefelometra Polarimetra Espectroscopia UV-Vis Espectroscopia IR

1. Mtodos pticos basados en la medicin de la dispersin de la luz: Turbidimetra y Nefelometra

Cuando la luz pasa a travs de un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas de mayor longitud que la del haz incidente, parte de la radiacin se dispersa en todas las direcciones dando un aspecto turbio a la muestra.

La medida de la disminucin de la intensidad del haz colimado, como consecuencia de la dispersin es la base de la Turbidimetra

Fotodetector

Fuente de luz visible

Haz incidente (Po)

Haz colimado (P)

Los mtodos nefelomtricos se basan en la medida de la radiacin dispersada a un ngulo de 90 con respecto al haz incidente que pasa a travs de un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas.

Fotodetector de alta sensibilidad de haces dispersados a 90

Haz dispersado (P)

90

Haz colimado Fuente de luz visible Haz incidente (Po)

Teora de la nefelometra y turbidimetra

La dispersin asociada con estos mtodos (a diferencia de la espectroscopa de Raman) no supone prdida neta de potencia radiante, solo supone cambio en la direccin de la propagacin. Donde la intensidad de la radiacin que aparece en cualquier ngulo depende del nmero de partculas, de su tamao y forma, de los ndices de refraccin relativos de las partculas y del medio, y de la . Por la complejidad de las variables involucradas, raras veces se aplica a problemas analticos especficos. En general la aplicacin de los mtodos turbidimtricos y nefelomtricos es emprica.

Efecto de la concentracin sobre la dispersin En una suspensin diluida la atenuacin de un haz de radiacin paralela por dispersin est dada por la ecuacin:

Donde: P0 y P son la potencia del haz incidente y del haz atenuado a travs de la longitud b de un medio turbio; la es el coeficiente de turbidez (o solo turbidez) y su valor se relaciona linealmente con la concentracin c de partculas dispersas. Por tanto de manera anloga a la ley de Beer:

Donde k = 2.3 /c El tratamiento analtico con esta ecuacin es muy similar para las curvas de calibracin del anlisis fotomtrico con la ley de Beer para las mediciones turbidimtricas donde se grafica la relacin lineal log10 P0/P vs. c establecida con muestras patrn y usando como blanco el disolvente para determinar P0. Para las mediciones nefelomtricas se representa grficamente la potencia del haz dispersado perpendicularmente (90) al haz incidente contra la concentracin, para la cual se obtiene frecuentemente una relacin lineal.

Efecto por el tamao de las partculas El efecto sobre la fraccin del haz dispersado depende fuertemente del tamao y forma de las partculas. Se requiere de una suspensin coloidal (homogeneidad de partculas). Factores como la concentracin de reactivos, velocidad y orden de la mezcla, duracin del estado de reposo, temperatura, pH y fuerza onica son importantes variables experimentales.

Efecto de la en la dispersin El coeficiente de turbidez vara con la :

Donde s es una constante para cada sistema, y t depende del tamao de la partcula y es de 4 cuando el tamao de la partcula es considerablemente inferior a la del haz incidente (Dispersin Rayleigh) y para partculas de similar tamao a la la t = 2. Para fines de anlisis se emplea luz blanca, y para suspensiones coloridas se requiere de filtros, monocromadores o redes de difraccin para seleccionar una donde no exista absorcin de la radiacin.

Instrumentacin analtica e industrial

Aplicaciones Anlisis de agua para pretratamiento y tratamiento Control y anlisis de procesos Determinacin de sulfatos que al reaccionar con BaCl2 generan una suspensin coloidal Titulacin por precipitacin Densidad ptica microbiana

Cytofast SA nephelometer is a semi-automatic instrument for the preparation of slides using the Cytofast method. It performs the nephelometric reading of the cellular density of samples, in order to determinate the quantity to be added onto the slide for each of them. Automatically, it aspirates the proper quantity of sample from the vial, and, at the same time, it adds the Stickeur solution, balances samples if needed, mixes samples. After centrifugation, the operator has to discharge the supernatant from the slides, disassemble slides for their supports, let slides to drain on air and proceed with the standard staining process.

An easy transition from manual to Kirby Bauer systems and other disk diffusion methodologies to the advantages of microbroth dilution testing, the Sensititre manual system includes a manual viewer, pipettor, and susceptibility plates for visual reading. Adding the optional nephelometer provides an inexpensive solution to standardize inoculum density. Easy-to-ready endpoints eliminate inaccuracies associated with disk diffusion. Stand-alone nephelometer improves consistency by measuring organism suspension and alerting the technologist if inoculum adjustments are needed

Nefelmetros

Las mediciones de turbidez proporcionan datos sobre la concentracin de partculas que no se han disuelto y que quedan suspendidas en la fase lquida. La concentracin de partculas determinada se utiliza para el control y la optimizacin del proceso, por ejemplo, para controlar el crecimiento de la biomasa, la cristalizacin y los procesos de filtracin o la medicin de concentracin de slidos en las aguas residuales.

Turbidmetro para el control de calidad del agua

 Se dispone de dos soluciones de medicin ptima de la turbidez: una se basa en la tecnologa de dispersin de retorno de la luz y la otra en la tecnologa de la dispersin de la luz en un ngulo de 90. La primera se beneficia de la tecnologa de la fibra ptica para la plena compatibilidad con los portaelectrodos de proceso. La segunda en una gran variedad de flow-through portaelectrodos para instalaciones de tubo directo.

Para la deteccin de partculas grandes ( 0,3 m). La medicin simultnea de luz de difusin recta y directa permite compensar cambios de color. Aplicaciones tpicas: deteccin de perforacin de filtro, deteccin de aceite emulsionado en agua, claridad de cerveza/bebidas. Construido en acero inoxidable, zafiro, juntas de polmero (FDA)

El sensor InPro8600 combina tecnologa de precisin ptica junto con una medida electrnica en un cabezal de sensor compacto, y provee de mediciones altamente fiables y reduce los costes de instalacin. Las reas de aplicacin tpicas es el control a tiempo real de la realizacin de filtros en la industria de alimentacin y bebidas, y aplicaciones de separacin de producto en general. El InPro8600/W/3 combina la medida de turbidez y color (grado de amarillo) medida para la aplicacin bebidas. La herramienta de configuracin wireless facilita la instalacin y puesta en marcha del sistema. El diseo compacto de los sensores permite la instalacin en el mnimo espacio. Turbidez nica (25 y 90 dispersin) y color (grado de amarillo) combinaciones vlidas para instalaciones optimizadas. Medidas de turbidez precisas gracias a la captura de deteccin de luz dispersa partculas no deseadas as como lquidos aparentemente claros: la calidad de producto despus de filtraciones se mejora significativamente. ngulo de medida dual para controlar la tendencia del tamao de partcula

2. Mtodos de pticos basados en la Absorcin de radiacin UV-Vis

La regin del espectro de absorcin UV-Vis engloba las radiaciones perceptibles por el ojo humano y han sido muy tiles especialmente en el campo del anlisis cuantitativo, est constituida por tres zonas del espectro EM: 1. UV-Cercano 185-400 nm 2. Visible 400-700 nm 3. IR-Cercano 700-1100 nm

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La mayora de los espectrmetros comerciales cubren en el rango 185-900 nm El rango inferior depender de la naturaleza de los materiales pticos y la presencia de gases (v.g. O2, vapor de agua) Algunos equipos alcanzan hasta 150 nm con muestras en estado gaseoso en la regin UV-vaco

Matices absorbidos y transmitidos

Matz observado (Transmitido) Verde azul Azul verdoso Azul Prpura Rojo Amarillo Verde amarillo Matz Absorbida Rojo Anaranjado Amarillo Verde Verde azul Azul Violeta Absorbida (nm) 650-700 600-650 570-600 490-570 475-490 440-475 400-440

Verde azul

Azul verdoso

Azul

Naranja

Amarillo

Verde

From left to right: cobalt(II) nitrate, Co(NO3)2 (red); potassium dichromate, K2Cr2O7 (orange); potassium chromate, K2CrO4 (yellow); nickel(II) chloride, NiCl2 (green); copper(II) sulfate, CuSO4 (blue); potassium permanganate, KMnO4 (violet).

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La absorcin luminosa se da por interaccin de los fotones incidentes con las especies de la muestra, as que cuando una molcula aislada absorbe un fotn de la regin UV-Vis, la energa de uno o varios electrones de valencia aumenta, perturbacin que causa una serie de transiciones resultado de la suma de la energas rotacional ERot, vibracional EVib, y electrnica EElec:

E tot = E Rot + E Vib + E Elec

En donde: EElec>EVib>ERot

Espectrometra de absorcin UV-Vis

Nunca se registra el espectro de una molcula aislada sino el de un nmero elevado, cuyos estados de energa son ligeramente diferentes. El resultado es un espectro de bandas correspondiente a la suma de todas las transiciones individuales de numerosos estados de energa de las molculas presentes. La energa captada en el transcurso de la absorcin de un fotn puede restituirse por diversos procesos llevados a cabo con o sin emisin de fotones. La fosforescencia y la fluorescencia son transformaciones de este tipo.

Espectrometra de absorcin UV-Vis

El proceso de absorcin ocurre en dos etapas: 1 M + h M* (t aprox. 10-8-10-9 s) 2 M* M + calordespreciable La absorcin UV o visible resulta, generalmente, de la excitacin de los electrones de enlace (revisar la TRPECV, TEV y la TOM) En consecuencia los picos de absorcin correlacionan con los tipos de enlaces en las especies en cuestin, por lo que la absorcin puede ser til para identificar los grupos funcionales presentes en una molcula, pero de mayor aplicacin es la determinacin cuantitativa de las especies que contienen los grupos absorbentes

Espectrometra de absorcin UV-Vis

Es comn que los compuestos orgnicos muestren dos o ms picos mximos de absorcin en la regin UV. Los datos se registran anotando la longitud de onda y el solvente utilizando, adems se indica el logaritmo del coeficiente de extincin molar en la en la que se encuentra el mximo de UV, v.g.

etanol mx

232nm(log = 4.18)

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La energa transmitida a compuestos orgnicos como el -caroteno, es suficiente para permitir la ocurrencia de un gran nmero de diferentes transiciones electrnicas entre los mltiples niveles de energa vibratorios y rotacionales An con el cuantizado de las transiciones, los valores de E son tan cercanos que la resolucin completa en una solucin es imposible, obtenindose una banda amplia de absorcin, conteniendo todas las transiciones superpuestas Las molculas gaseosas, son relativamente simples y si permiten resolver estas bandas

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La absorcin de la energa radiante en las regiones espectrales del visible y de UV, depende principalmente del nmero de arreglos de los electrones de las molculas o iones absorbentes Existen tres tipos de transiciones electrnicas: 1. Electrones , y n 2. Electrones d y f 3. Electrones de transferencia de carga

1. Transiciones , y n
Se dan en iones y molculas orgnicas Las molculas orgnicas son absorbentes de la radiacin EM debido a la capacidad de elevar los niveles de energa de los electrones de valencia Los enlaces sencillos absorben en el rango del UV vaco ( < 185 nm), debido a la interferencia atmosfrica las determinaciones se limitan a superiores La absorcin UV-Vis esta limitada a los grupos cromforos, que son grupos funcionales que contienen electrones de valencia con energas de excitacin relativamente bajas Los espectros de los cromforos orgnicos son complejos debida a la superposicin de las transiciones vibracionales y las electrnicas, dando una banda de absorcin ancha y en ocasiones contnua

1. Transiciones , y n (Cont)
Tipos de electrones absorbentes en las molculas orgnicas: 1. Los electrones de enlace entre los tomos y que se asocian con ms de un tomo 2. Los electrones antienlazantes (* *) y los pares no enlazados (n) de la ltima capa de valencia, como en el O, N, S y halgenos
Los tipos de enlaces moleculares en el formaldehdo:

Comparacin de las transiciones ms frecuentes encontradas en compuestos orgnicos simples

Transicin *
Un e- del orbital enlazante de la molcula se excita al correspondiente * por absorcin de la radiacin, por lo que la molcula se encuentra en estado excitado ,* Para la transicin se requiere un alto nivel de energa, por lo que se lo que se localiza en el rango del UV-vaco El metano, por ejemplo, que slo contiene enlaces sencillos CH y que slo puede sufrir transiciones * presenta un mximo de absorcin a 125 nm Como la fuerza del enlace CC es menor que la del enlace CH, se requiere menos energa para la excitacin; por ello, el pico de absorcin aparece a mayor longitud de onda

Algunos ejemplos de absorcin para transiciones n *

3. Transiciones n* y *: La mayora de los mtodos de espectroscopia de absorcin de los compuestos orgnicos se basan en estas transiciones puesto que los picos de absorcin se encuentran en una regin experimentalmente accesible (200-700 nm) Se requieren de grupos funcionales no saturados (electrones ) y dichos centros absorbentes son denominados cromforos; las molculas de esqueleto carbonado conteniendo uno ms grupos cromforos se denominan cromgenos Para el estado n,* la y los picos de absorcin son bajos y se encuentran entre 10 y 100 L mol-1 cm-1 y para la * normalmente son de 1 000 y 10 000 El solvente ejerce efecto sobre la de los picos

Absorcin de algunos cromforos *

 Cromforos aislados: Para una serie de molculas con un mismo cromforo, la posicin e intensidad de las bandas de absorcin sern constantes. Cuando hay cromforos separados por al menos dos enlaces simples, se observa la superposicin de los efectos individuales Cromforos conjugados: Cuando los cromforos se encuentran muy cercanos entre s, el espectro de absorcin se desplaza hacia mayores longitudes de onda (efecto batocrmico) y con un aumento en la intensidad de la absorcin (efecto hipercrmico).

Efecto de los dobles enlaces conjugados sobre la posicin del mximo de absorcin de la transicin ,* para algunos polienos conjugados

Auxcromos Es un sustituyente (generalmente saturado) que altera la y el coeficiente de extincin molar del mximo de absorcin cuando se une a un cromforo Causa el efecto batocrmico y/o el efecto hipercrmico

Efecto de multicromforos en la absorcin

Desplazamiento hipsocrmico
Para las n,* las son cortas y tienden al azul (efecto hipsocrmico) conforme aumenta la polaridad del solvente debido al incremento de la solvatacin del par de e- no enlazantes que disminuye la energa del orbital n (que es mayor con los prticos como el etanol o agua con la formacin de puentes de hidrgeno) O sea, es el desplazamiento a longitudes de onda ms cortas como resultado de una sustitucin o cambio del solvente

Absorption spectra of 2-(4'-hydroxystyryl)-N-methylquinolinium-betaine in chloroform (1), water (2)

Desplazamiento hipsocrmico

Absorption spectra of 4-(4'-hydroxystyryl)-N-methyl-pyridinium-iodide in n-butanol (1), n-propanol (2), methanol (3), water (4)

Desplazamiento batocrmico

El desplazamiento del mximo de absorcin a longitudes de onda ms largas causado por cualquier sustitucin en el cromforo (por auxcromo) o un cambio en un disolvente Para las ,* la tendencia es hacia el rojo (batocrmico), en donde las fuerzas de polarizacin atractivas entre el disolvente y el absorbente tienden a disminuir los niveles de energa de los estados excitado o no excitado, efecto que tambin se presenta en las transiciones n,*

Desplazamiento batocrmico e hipsocrmico

hipsochromic shift

batochromic shift

Efecto hipercrmico Aumento en el coeficiente de extincin molar ; se observa como un incremento de la intensidad de la banda espectral debida a las interacciones con los componentes de la matrz molecular; disminuye la transmitancia e incrementa la absorbencia Efecto hipocrmico Reduccin en el coeficiente de extincin molar

Espectros UV de algunos compuestos orgnicos representativos

Espectros UV de la 1,2,4-tetrazina

Caractersticas de absorcin de algunos compuestos aromticos

Transiciones de Electrones d y f
Observada en la mayora de los metales en transicin absorben en el UV o visible Para los lantnidos y actnidos (v.g. Holmio, Erbio, Protactinio, Samario, etc.) son el resultado de transiciones electrnicas de los e- de 4f y 5f Para los elementos de la primera y segunda serie de los metales en transicin son los e- de 3d y 4d (v.g. Cu, Ti, Cr, V, Mn, Fe, Hg, Co, etc.)

Espectros de absorbancia UV-Vis de algunos iones de metales de transicin

3. Electrones de transferencia de carga

Son de max muy alta (>10 000) Muchos complejos inorgnicos presentan este fenmeno (complejos de transferencia de carga) Son de elevada sensibilidad para la deteccin y determinacin de especies absorbentes Ejemplos: complejos fenlicos, tiocianato con Fe(III), ofenantrolina con Fe(II), el complejo de yoduro de yoduro de molecular, el complejo ferro/ferrocianuro del azul de prusia Uno de los componentes debe ser dador y otro donador de e-, por lo que la absorcin implica la transferencia de e- del dador hasta un orbital del aceptor El estado excitado es resultado de un proceso de oxidoreduccin interno

Algunos ejemplos de espectros de transferencia de carga de tres especies

Ejemplo. En el complejo Fe (III)/tiocianato, la absorcin de un fotn da lugar a la transferencia de un e- del in tiocianato (SCN1-) a un orbital asociado con el Fe(III), y el producto es una especie excitada formulada principalmente por el Fe(II) y el radical neutro tiocianato (SCN) En ocasiones el e- regresa a su estado original y puede disociarse del complejo por un proceso de redox fotoqumico

Aplicaciones de la espectrometra UV-Vis 1.Anlisis cuantitativo 2.Titulaciones Fotomtricas 3.Anlisis cualitativo

1. Anlisis Cuantitativo
i. ii. iii. iv. v. vi. vii. Aplicaciones amplias para compuestos orgnicos e inorgnicos Sensibilidades de 10-4 a 10-5 M (en ciertos casos de 10-6 a 10-7 M) De amplia selectividad Incertidumbres de 1-3 % a dcimas porcentuales Sencilla adquisicin de datos Anlisis de iones orgnicos e inorgnicos, compuestos, Los hidrocarburos saturados no muestran absorcin selectiva en la regin visible y en las accesibles del UV lejano (195nm), el DNA (280nm), Protenas globulares (260nm), viii. Determinacin de azcares reductores y totales (reaccin de DNS, prueba del fenolsulfrico), determinacin de protenas (prueba del c. Bicincnico BCA, Bradford, Biuret), ix. Turbidimetra y densidad ptica (cinticas de crecimiento celular, biomasa) x. Monitores de control de procesos, detectores y sensores.

Anlisis de un analito individual Experimentalmente se inicia con una CURVA DE CALIBRACIN [A = f(c)], partiendo de disoluciones de concentraciones conocidas del analito y sometidas al mismo tratamiento que la muestra La curva ajustada a una lnea recta para diluciones diludas, permite deducir la concentracin cx de la muestra problema
Absorbancia Ax AR

y = mx + b

cR

Concentracin c x

Anlisis de un analito individual En ocasiones es posible preparar una disolucin patrn cuya concentracin CR se elige de modo que su absorbancia AR sea prxima o ligeramente superior a la Ax de la muestra problema, y por medio de la siguiente expresin se puede calcular la cx:

Ax c x = cR AR
Si la muestra tiene ms de un componente no presente en el estndar de referencia (impurezas) y que absorbe a la misma de la medida, esta ecuacin no ser vlida y conduce a un resultado errneo

2. Titulaciones Fotomtricas
Se basa en dirigir el cambio en la absorbancia de cuando menos una sustancia involucrada en una titulacin (v.g. cido-base), ya sea reactivo, producto o indicador Los datos que proporciona, como funcin del volumen agregado, pueden representarse grficamente o seguirse electrnicamente, a fin de localizar el rompimiento del punto final

Absorbancia

Absorbancia

Punto de equivalencia

Punto de equivalencia

Reactivo en volumen

Reactivo en volumen

a) Absorbancia de los tituladores

b) Absorbancia de los productos

Titulaciones Fotomtricas
Son mejores que las titulaciones por potenciometra o conductimetra, pero se requieren tituladores automticos programables Ventajas: 1. Se mide directamente la absorbencia de la concentracin 2. Alto grado de sensibilidad 3. No hay contacto directo con la muestra (v.g. ausencia de sondas o electrodos) 4. No hay diferencia de trabajo con sustancias de fuerza inica alta o baja Como resultado de la dependencia lineal y la sensibilidad es til en titulaciones exactas en sistemas acuosos diludos y los que contienen electrolitos dbiles as como en sistemas no acuosos

Titulaciones Fotomtricas
Br -OH + NaOH H2O Br -ONa + H2O

p-bromofenol (Amarillo)

p-bromofenolato de sodio (Azul)

Absorbe el azul (440-475 nm), molcula menos soluble

Absorbancia ( 325 nm)

0.32

Efecto batocrmico

Absorbe el amarillo (570-600 nm), molcula ms soluble

1.2

2.4

3.6

Volumen de NaOH 0.12 N (mL)

3. Anlisis cualitativo
La espectrometra proporciona suficientes datos para: 1. La identificacin de sustancias puras y ayudar en la caracterizacin estructural, ya que la curva de absorcin completa de una sustancia pura es nica y permite ser distinguida de todas las dems 2. Puede establecerse el tipo general y, en algunos casos, la identidad de los constituyentes de mezclas simples Para mejorar el anlisis se requiere de un buen monocromador y un detector lo suficientemente sensible para poderle usar en bandas de muy angostas

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN MOLECULAR UV/VIS

Los espectrmetros estn conformados por tres partes bsicas: 1. Fuente de luz 2. El sistema dispersivo (monocromador), y 3. El detector
Muestra

Fuente

Monocromador

Detector

Diseo de un espectrmetro de tipo secuencial de ptica normal Muestra Detector de Detector fila de diodos

Fuente

Sistema disperso

Espectrmetros de tipo simultneo de ptica inversa

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN MOLECULAR UV/VIS

1) Fuente de luz: (Continua y de potencia constante) a) Lmpara de Deuterio e Hidrgeno (regin UV 160-375 nm) b) Lmpara de filamento de Wolframio (regin 350-2500 nm) c) Lmpara de arco de Xenn (regin de 200-1000 nm) 2) Celdas: (1 cm) a) b) c) d) Cuarzo (Vis/IR, con un mx. de 3 mm de espesor de pared) Slice (Vis/IR, con un mx. de 3 mm de espesor de pared) Cristal silicatado (regin de 350-2000 nm) Plstico (Vis)

3) Equipos a) b) c) d) Haz sencillo Doble haz espacial Doble haz temporal Multicanal

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN MOLECULAR UV/VIS

Representacin grfica de un espectrofotmetro de ptica dispersiva convencional

Diseos para fotmetros y espectrofotmetros

a) De haz sencillo b) De doble haz con haces separados en el espacio c) De doble haz con haces separados en el tiempo

La disposicin instrumental para medir las propiedades de transmisin de la luz de soluciones del Spectronic 20

Colormetro Spectronic 20

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

UV/Visible Life Science Spectrophotometer

Representacin grfica de un Espectrofotmetro de arreglo en serie de diodos

Diagrama de un Espectrofotmetro de arreglo en serie de diodos