Gnero Leptospira: El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) perteneciente a la familia Leptospiraceae, Orden Spirochaetales, comprende dos especies: Leptospira

interrogans con aproximadamente 100 variantes serolgicas (serovars) patgenos y Leptospira biflexa que son saprofitas, ambas diferenciadas sobre la base de sus propiedades antignicas, el anlisis por la endonucleasa de restriccin o la composicin del DNA. La leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los resorvorios naturales son los roedores y una gran variedad de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la orina el agente etiolgico, contaminando el agua, suelo, alimentos, etc. El mecanismo de transmisin puede ser directo (orina u rganos de animales infectados) o indirecto (a travs de las aguas o suelos contaminados). La puerta de entrada es a travs de lesiones de la piel y mucosas incluyendo conjuntivas. Las leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, usualmente con una longitud de 6 a 20um. y 0,1 um. de dimetro, sus extremos semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente son rectos), son muy mviles. Se colorean por mtodos especiales como: Morosov, Vago, Kiktenko, ya que toman dbilmente los colorantes de anilina; debido a su dimetro tambin se visualizan con el microscopio de campo oscuro. Desarrollan en medios especiales lquidos, semislidos y slidos, enriquecidos con suero de conejo o de carnero al 8-10% a temperatura de 28-30C, en un perodo de 5-10 das, en condiciones de aerobiosis. El diagnstico definitivo de leptospirosis requiere de: 1.-Aislamiento de Leptospira interrogans a partir de muestras clnicas (sangre, lquido cfalo-raqudeo u orina), en medios de cultivo o por inoculacin de Hamster o cobayos. 2.-Evidencia de conversin serolgica en sueros pareados con un incremento cudruple del ttulo de diagnstico inicial de 1/100. Otras alternativas para la tipificacin son el uso de anticuerpos monoclonales, anlisis de factor y los mtodos moleculares (PCR, RFLP, PFGE y DNA fingerprinting).

Aislamiento Primera semana de enfermedad: Perodo agudo espiroquetmico, antes del tratamiento con antibiticos, las leptospiras se aislan de sangre y LCR. Durante y despus de la segunda semana de iniciada la enfermedad: Perodo de inmuno-espiroquetrico, la orina puede contener leptospiras. La presencia de anticuerpos puede ser detectada en muestras pareadas: 1ra muestra, en la primera semana de enfermedad. 2da muestra, en la tercera semana de enfermedad. Otras pruebas serolgicas utilizadas son: Fijacin del complemento, Hemoaglutinacin indirecta, Aglutinacin-lisis, ELISA e Inmunofluorescencia.

MATERIAL Cultivo de leptospira en medio lquido de Korthof modificado. Cultivo de leptospira en medio semislido de Korthof modificado. Frotises coloreados, a partir de cultivo. Lminas portaobjetos. Set de colorantes de Kiktenko. Mechero de alcohol.

Asas de siembra en aro. Microscopio de luz y campo oscuro. Aceite de inmersin.

PROCEDIMIENTO 1. Observar en el tubo con medio lquido de Korthof modificado el desarrollo particular de las leptospiras, caracterizado por la opalescencia en el medio al ser agitado suavemente y observarlo a travs de la luz o de una lmpara. 2. En el medio semislido de Korthof modificado, observar el desarrollo de las leptospiras. En forma de anillos a unos milmetros de la superficie del medio. No agitar el medio.

COLORACIN: 1.2.Realizar un frotis en la lmina portaobjeto desengrasada y limpia a partir del cultivo de Leptospira en medio lquido. Cubrir el frotis con una solucin mordiente y calentar con el mechero de alcohol, hasta la aparicin del vapor, durante un minuto, evitando la evaporacin del mordiente. Eliminar el mordiente y sin lavar, aadir el colorante de violeta de genciana al 1%, calentar el mechero con alcohol hasta la aparicin del vapor por 45 segundos. Lavar con agua corriente, secar al medio ambiente. Observar al microscopio con objetivo de inmersin. Las leptospiras se tien de un color rosado-violeta en fondo incoloro. Se presentan clulas solas o entrelazadas, semejando la letra C o S generalmente con ambos extremos en forma de gancho.

3.4.5.-

PROTOCOLO

Microorganismo

Medio Lquido

Medio Semislido

Microscopia con Coloracin Kiktenko

Leptospira sp.

PREGUNTAS

1.2.3.-

Mencionar dos caractersticas que diferencian a las leptospiras de las otras bacterias (cocos, bacilos). Para el diagnstico de leptospirosis es necesario conocer el serovar infectante? En qu casos est indicada la prueba de FTA-ABS?