CINTICA DE BIODEGRADACIN

INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA
Autores: lvaro Opazo Jaime Molina Fecha entrega: 22 de Noviembre, 2013

RESUMEN La presencia de colorantes en las aguas residuales representa un problema ambiental, ya que este tipo de compuestos no puede eliminarse con mtodos de tratamiento convencionales. Debido a que la mayora de los sistemas de tratamiento basados en mtodos qumicos o fsicos son costosos. Mediante la experiencia realizada se pretende demostrar un mecanismo de decoloracin eficiente y con menor costo de operacin que tiene como propsito, el estudio de la cintica de biodegradacin. Para ello, se dispone de una mezcla colorante, que actuar como el sustrato para el cultivo bacteriano. Se trabaja con 3 matraces, cuya mezcla se realiza con RB5, BB41 y NBB. Luego, de medir las absorbancias en un tiempo definido y haciendo uso de las curvas de calibracin para la mezcla colorante. Se obtiene el comportamiento de la concentracin en el tiempo, arrojando las siguientes curvas de cintica biodegradativas para RB5, NBB [ ] y BB41 respectivamente: [ ] . ; [ ] ;

Finalmente se procede a calcular el % de remocin para cada medio presente en la mezcla colorante. Resultando que el RB5, BB41 y NBB presentan respectivamente: 88,96%; 89,17% y 88,92%. Demostrando que, la mezcla completa se muestra favorable a la biodegradacin en el tiempo. Y ms an, el medio BB41 es aqul que presenta el mejor sustrato para el microorganismo. Es decir, permite una mayor remocin del color caracterstico presente en la mezcla colorante.

1. INTRODUCCIN O TEORA Durante el estudio del crecimiento microbiano, se pueden identificar claramente 4 fases distintas, cuyas velocidades de crecimiento o inactivacin varan.

Figura 1. Fases de crecimiento e inactivacin microbiana en funcin del tiempo. Fase de adaptacin, en la cual la bacteria se adapta al medio al cual fue inoculado. No existe divisin de las bacterias, solo un crecimiento de ellas. Fase exponencial. Principalmente se realiza la duplicacin y reproduccin de las bacterias, donde la cantidad de bacterias y colonias aumenta considerablemente. Fase estacionaria. Dado el agotamiento de nutrientes y recursos por el consumo de las bacterias, el crecimiento disminuye. Por ello, la tasa de crecimiento microbiano y la de muerte, son iguales y el nmero de bacterias permanece aproximadamente constante. Fase de muerte. No existen nutrientes para las bacterias en el medio, por lo que de a poco van muriendo.

2. OBJETIVOS

Verificar la existencia de una fase de muerte o inactivacin durante el desarrollo del crecimiento microbiano. A partir del espectrofotmetro y la medicin de absorbancias, caracterizar el desarrollo de la fase de muerte. Aplicar el uso de la centrfuga, los tubos Eppendorf y el espectrofotmetro. Dominar el manejo de mtodos de esterilizacin para evitar la contaminacin de muestras.

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El desarrollo de la experiencia contempla dos partes. Primero, preparar la solucin colorante. Para ello, utilizando papel aluminio, se debe pesar la cantidad de colorante en funcin de la concentracin que se desea obtener. Luego, depositar los papeles con la cantidad de colorante en tubos con tapa y llevar a esterilizacin por autoclave, durante 15 [min] a 121 [C] y 2 [bar]. Luego, aadir directamente el colorante al medio de cultivo, en este caso, medio LB. En la segunda etapa de la experiencia, corresponde analizar la cintica de biodegradacin. Primero, se prepara un blanco. Para ello, se inoculan 100 [L] del cultivo en tres matraces con medio lquido sin colorante. Por otra parte, se prepara la solucin de mezclas de colorante, en este caso, la muestra 4, cuya composicin es de 60 [ppm] de BB41, 20 [ppm] de NBB y 60 [ppm] de RB5. Esta solucin se realiza en triplicado. Se debe medir entonces, en el espectrofotmetro la absorbancia cada da, observando una disminucin, utilizando el blanco antes preparado. Para realizar la curva de absorbancia v/s concentracin molar se toma 1 [mL] de medio con colorante (de cada uno de los matraces) y se mide su absorbancia a 597 [nm], 617 [nm] y 618 [nm]. En caso de que la absorbancia sea mayor y no pueda medirse, se debe realizar una dilucin de 1 [mL] en 9 [mL] de medio. Finalmente, con las absorbancias de 3 das distintas (toma de datos cada 24 [h]), se obtiene la curva de calibracin para esa muestra especfica.

4. RESULTADOS Y DISCUSIN La experiencia se basa en el estudio de la cintica de biodegradacin de colorantes a partir un registro de datos de absorbancia. El propsito es encontrar una relacin entre las absorbancias medidas y la concentracin de colorante en la muestra. Es por ello que, se dispone de una curva de calibracin de concentracin en funcin de la absorbancia. Los datos y curvas de calibracin de la mezcla de colorante se encuentran en Apndice A. Las mediciones registradas de absorbancia para los 3 matraces se desprenden a continuacin: Tabla 1. Absorbancias de 3 matraces medidas en el tiempo
Da 0 [nm] 1 2 3 597 0,343 0,437 0,432 618 0,322 0,406 0,401 617 0,323 0,407 0,404 597 0,067 0,081 0,08 Da 1 618 0,064 0,077 0,076 617 0,064 0,077 0,077 597 0,04 0,039 0,036 Da 2 618 0,038 0,036 0,033 617 0,038 0,036 0,033 597 0,014 0,026 0,019 Da 3 618 0,009 0,02 0,014 617 0,012 0,023 0,017

Utilizando las curvas de calibracin dadas por: [ ] [ ] [ ] Se procede a construir la siguiente tabla que da cuenta de las concentraciones medidas, segn las absorbancias registradas en la Tabla 1: Tabla 2. Concentraciones de matraces para cada absorbancia medida.
Da 0
[nm] 1 2 3 Prom

Da 1 6,2E+02 9,7E-04 1,2E-03 1,2E-03 1,1E-03 6,0E+02 2,3E-04 2,8E-04 2,7E-04 2,6E-04 6,2E+02 1,1E-04 1,3E-04 1,3E-04 1,2E-04 6,2E+02 1,9E-04 2,3E-04 2,3E-04 2,2E-04 6,0E+02 1,4E-04 1,3E-04 1,2E-04 1,3E-04

Da 2 6,2E+02 6,5E-05 6,1E-05 5,6E-05 6,1E-05 6,2E+02 1,1E-04 1,1E-04 9,9E-05 1,1E-04 6,0E+02 4,8E-05 8,8E-05 6,5E-05 6,7E-05

Da 3 6,2E+02 1,5E-05 3,4E-05 2,4E-05 2,4E-05 6,2E+02 3,6E-05 6,9E-05 5,1E-05 5,2E-05

6,0E+02 1,2E-03 1,5E-03 1,5E-03 1,4E-03

6,2E+02 5,5E-04 6,9E-04 6,8E-04 6,4E-04

En base a las concentraciones promedio para cada componente de la mezcla colorante, es decir, para cada longitud de onda. Se grafica la concentracin respecto al tiempo, segn:

RB5
0,0016 0,0014 0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0
0 0,5 1 Concentracin [g/L] C = 0,001e-0,975*t R = 0,9403

1,5

2,5

3,5

Tiempo [da]

Grfico 1. Muestra el decaimiento exponencial de la concentracin de RB5 en el tiempo.

BB41
0,0007 Concentracin [g/L] 0,0006 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Tiempo [da]

C = 0,0005e-1,055*t R = 0,9657

Grfico 2. Muestra el decaimiento exponencial de la concentracin de BB41 en el tiempo

NBB
0,0012 Concentracin [g/L] 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Tiempo [da] C = 0,0009e-0,996t R = 0,9502

Grfico 3. Muestra el decaimiento exponencial de la concentracin de NBB en el tiempo

De esta forma, se obtienen las siguientes curvas experimentales de cintica de biodegradacin: [ ] [ ] [ ] Se observa que las tres curvas presentan un decaimiento significativo desde el da 0 al 1. Ello significa que en dicho rango se alcanza la mayor tasa de biodegradacin. No obstante, el medio BB41 es el ms favorable al consumo del colorante por el microorganismo. Pues, presenta la mayor magnitud de las tres curvas respecto a la constante cintica. Por lo tanto, es de esperar que genere el mayor decaimiento. En caso contrario, de los tres medios; la tasa de decaimiento menor est dada por el medio RB5, pues presenta la menor constante cintica de reaccin. Finalmente se calcula el % de Remocin dado por: ( Donde, )

De esta forma, se tiene que: Tabla 3. % de Remocin para los 3 medios existentes en la mezcla colorante
Medio RB5 BB41 NBB Cf 1,52E-04 6,93E-05 1,26E-04 Co 1,37E-03 6,40E-04 1,13E-03 % Remocin 88,96 89,17 88,92

Segn los porcentajes de remocin hallados, se desprende que el sistema slo corresponde a un proceso de biodegradacin. Descartando la presencia de absorcin en el medio. Ello, se explica porque la absorcin de un microorganismo genera restriccin en el consumo de sustrato para el resto de los microorganismos reduciendo la tasa de biodegradacin. Lo cual no es el caso en estudio. Pues, muy por el contrario; se remueve considerablemente el sustrato en el tiempo alcanzado porcentajes de remociones muy altas. Lo cual, en ningn caso inhibe el crecimiento microbiano y por lo dems no genera saturacin del microorganismo si es que fuese nutriente limitante. Es de considerar que la velocidad de biodegradacin depende de numerosos factores, tales
como; el pH, la temperatura, los nutrientes, as como de la especificidad de la enzima por el sustrato.

5. CONCLUSIONES Segn lo observado, la bacteria presenta propiedades biodegradativas. Pues la concentracin del colorante decrece considerablemente en el tiempo. Alcanzando tasas de decaimiento que guardan estrecha relacin con la fase exponencial de crecimiento microbiano. Es decir, que el crecimiento se favorece por la presencia del sustrato. Descartando algn proceso de absorcin, pues en ningn momento se establece inhibicin de los microorganismos tras limitar la disponibilidad del sustrato. Por lo tanto, slo se distingue biodegradabilidad. Los porcentajes de remocin para los medios RB5, BB41 y NBB son respectivamente 88,96%; 89,17% y 88,92%. Siendo la mayor remocin alcanzada por la BB41, debido a que presenta la mayor constante cintica. En cambio, la menor remocin est dada por la NBB. Pese a que la menor constante cintica corresponde al medio RB5, el error de medicin es muy bajo. Pues, los % de remocin son muy similares. No obstante, el error se atribuye a contaminacin del medio tras las mediciones y por supuesto el error asociado al equipo de absorbancia.

Sin embargo, en los tres medios se observa que la mayor remocin se da al medir en el da 1 (se alcanza la mayor tasa de decaimiento en la concentracin de colorante). Lo que implica que el perodo de latencia del microorganismo es muy rpido. El microorganismo se adapta con facilidad, lo que se traduce en alcanzar en un rango muy acotado el perodo de crecimiento exponencial microbiano.

6. REFERENCIAS 6.1) 6.2) 6.3) http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S018629792012000200009&script=sci_arttext Brock, Biologa de Los Microorganismos 10 Edicin

7. APNDICE. Apndice A Tabla 4. Datos de Concentracin respecto a absorbancia para RB5

RB5 X ABSORBANCIA [nm] 0,628 0,321 0,155 0,057 597 [nm] Y CONCENTRACIN [g/L] 0,00215625 0,00107813 0,00053906 0,00026953

RB5
0,0025 CONCENTRACIN 0,002 0,0015 0,001 0,0005 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 ABSORBANCIA C= 0,0034*ABS R = 0,9971

Grfico 4. Curva de calibracin para RB5 Tabla 5. Datos de Concentracin respecto a absorbancia para NBB
NBB 617 [nm] X Y ABSORBANCIA CONCENTRACIN [nm] [g/L] 0,613 0,001875 0,321 0,0009375 0,159 0,00046875 0,06 0,00023438

NBB
0,002
CONCENTRACIN 0,0015 0,001 0,0005 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 ABSORBANCIA C = 0,003*ABS R = 0,9972

Grfico 5. Curva de calibracin para NBB.

Tabla 6. Datos de Concentracin respecto a absorbancia para BB41

BB41 618 [nm] X Y ABSORBANCIA CONCENTRACIN [nm] [g/L] 0,609 0,0010625 0,319 0,00053125 0,157 0,00026563 0,058 0,00013281

BB41
0,0012 CONCENTRACIN 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 ABSORBANCIA C = 0,0017*ABS R = 0,9969

Grfico 6. Curva de calibracin para BB41

Apndice B