INFORME DE PRCTICAS DE LABORATORIOS Y TALLERES.

ASIGNATURA CARRERA: NIVEL Y PARALELO : Fecha realizacin : Fecha presentacin informe: Prctica N

Laboratorio de Microbiologa Ingeniera Ambiental Segundo 2M 07-11-2013 14-11-2013 4

Grupo N 19

Mesa N 2

Integrantes Machado Vernica

MICROSCOPIA: TINCIN DE MICROORGANISMOS 1. OBJETIVOS. Dar a conocer aspectos bsicos para el uso apropiado del microscopio, mediante la realizacin de tcnicas de observacin de microorganismos. Realizar tcnicas de preparacin de frotis y fijacin de coloracin, ms empleados en el estudio de microscopio de cultivos bacterianos, provenientes de medios slidos y lquidos.

2. INTRODUCCIN. El microscopio es un instrumento de gran importancia en el laboratorio microbiolgico, ste se utiliza para aumentar el tamao de la muestra, lo cual hace posible ver los detalles estructurales de los microorganismos empleando previamente las tcnicas de tincin. El estudio microscpico de los organismos proporciona datos fundamentales para su identificacin como lo son: su forma, tamao, estructura, entre otras. 1. Gerard. E. El microscopio de uso microbiolgico. Para la distincin de microorganismos y constituyentes celulares se requiere el uso de colorantes biolgicos. Examen de organismos vivos.- Se suspende a los organismos en agua u otro lquido, se coloca una gota de esta muestra sobre el portaobjetos, se cubre y se observa. Examen de bacterias teidas.- Las estructuras de las bacterias se distinguen mejor con la utilizacin de colorantes; se pueden destacar varias tcnicas: Tincin simple.- Permite clasificar a los microrganismos segn su morfologa; usa un solo colorante. Tincin diferencial.- Determina diferencias entre clulas bacterianas; usa ms de un colorante. Tincin Gram.- Clasifica a las clulas segn su pared celular; en Gram + (positivas) y Gram (negativas). Tincin negativa.- Se tie solamente el medio que rodea a la clula y se observa el perfil de la misma, se emplea tinta china.

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Antes de la tincin es necesario preparar un frotis que consiste en lo siguiente: Extensin.- Se lo realiza sobre el portaobjetos de una muestra, con el objeto de separar lo los microorganismos para una mejor visualizacin. Secado.- Permite la eliminacin del agua que proviene el cultivo. Fijado.- Hace posible que las bacterias queden inactivas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa de las clulas a observar.

2. Dr. Enrquez. S. Tcnicas de tincin y barrido

3. MATERIALES Y MTODOS 3.1 Materiales: Microscopio compuesto. Asas de cultivo. Portaobjetos. Cubreobjetos. Asa de inoculacin. Agua destilada. Reactivos: Azul de metileno. Nigrosina (tinta china). Cristal Violeta. Lugol Alcohol Safranina

3.2 Mtodo TINCIN SIMPLE Se realiz un frotis en la muestra de Escherichia Coli, a continuacin se agreg azul de metileno, dej reposar por un minuto; inmediatamente elimin el exceso de colorante con agua destilada, dej secar, posteriormente observ en el microscopio utilizando los objetivos de 4x a 40x, para el lente de 100x coloque una gota de aceite de inversin para no distorsionar la visualizacin y finalmente anot las observaciones. TINCIN GRAM Se realiz un frotis de Escherichia Coli, a continuacin se agreg cristal violeta, durante un minuto, lav con agua corriente la muestra, inmediatamente cubr el preparado con yodo, durante un minuto y nuevamente lav con agua corriente, posteriormente lav el frotis con alcohol hasta no observar el colorante violeta, luego cubr el frotis con Safranina durante 30 segundos, lav con agua corriente y dej secar al ambiente, finalmente anot las observaciones. TINCIN DE CPSULA Tincin Negativa con tinta china: Se coloc sobre el portaobjetos una asada de Klebsiellasp, a continuacin mezcl con una cantidad igual de tinta china, cubr con el cubreobjetos, de inmediato observ en el microscopio a 40x y empleando el aceite de inmersin en el lente de 100x y finalmente anot las observaciones.

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Tincin Negativa de Maneval modificado: Se coloc una gota de rojo congo sobre un portaobjetos, a continuacin tom una muestra de Klebsiellasp con el asa y mezcl haciendo movimientos giratorios, inmediatamente extend la suspensin con un portaobjetos, realizando un frotis, posteriormente dej secar al ambiente, cubr la preparacin con fucsina cida y deje reposar por un minuto, lav con agua corriente posteriormente dej secar y finalmente anot las observaciones. TINCIN DE ENDOSPORAS Se realiz un frotis de Bacillus Sp, a continuacin coloqu en el frotis abundante verde malaquita, inmediatamente cubr la nuestra con papel filtro, posteriormente pas por la llama varias veces hasta observar vapores, lav con agua corriente; cubr el frotis con safranina durante 30 segundos, nuevamente lav y dej secar al ambiente, finalmente anot las observaciones con el lente de 100x, empleando aceite de inmersin. INCLUSIONES LIPDICAS Tom una asada de Saccharomyceo Cerevisioe (levadura), despus cubr con Sudan III, dej reposar por 3 minutos, posteriormente enjuagu con agua destilada y finalmente anot las observaciones.

4.

RESULTADOS - DATOS

Tincin

Reactivos

Microorganismos

Observaciones

Grfico (100X)

Simple

Azul de metileno

Escherichia-Coli

Se observ cocos ligeramente ovoides y bacilos alargados en forma de bastn, gracias al reactivo empleado se puede distinguir estas bacterias al colorearse de azul.

Gram (+/-)

Cristal Violeta Lugol Alcohol cetona Safranina

Escherichia-Coli

Se observ bacterias Gram (negativas), debido a su coloracin rojo/ rosada, al momento de su ltima tincin.

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Cpsula
(negativa tinta china)

Tinta china

Klebsiellasp Pneumoniae

Se observ la cpsula de las clulas que se perfila en la placa sin colorear a la clula, tan solo da color negro el contorno.

Cpsula
(negativa Madeval modificada)

Rojo Conga Fucsina cida

Klebsiellasp Pneumoniae

Se observ la cpsula como halos incoloros, las clulas de tonalidad roja, y por ltimo el espacio intermolecular de un color oscuro.

Endosporas

Verde malaquita Safranina

Bacillus Sp.

Se observ que las clulas se presentan de color rojo, mientras que las esporas se notan de color verde.

Lipdica

Sudan III

Saccharomyceo Cerevisioe (levadura)

Se observ la membrana roja al contorno, son rodondas, grandes y se encuentran agrupadas similar a una colmena.

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5. CONCLUSIONES. 1. Mediante las tcnicas para observar microorganismos que se emplean en el laboratorio, se puede destacar la utilizacin del microscopio ya que es la herramienta necesaria e indispensable para visualizar estructuras muy pequeas y que no son visibles para el ojo humano, su adecuado y cuidadoso uso nos permite obtener resultados favorables en las prcticas. 2. A momento de culminar esta prctica se constato que los colorantes biolgicos nos permite obtener una mejor visualizacin de la muestra, empleando las distintas tcnicas de tincin, de esta manera se puede identificar estructuras y presencia de materiales de almacenamientos de los microorganismos analizados en las diferentes procedimientos de frotis y fijacin de colorantes.

6. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN 1. Investigue cules son las molculas o estructuras celulares responsables de la tincin simple? Las estructuras responsables de la tincin simple son: - Cloroplastos. - Carotenos. - Xantofilas. - Ficobilinas. Tcnicas: Se tie con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.
2. Graficar que pasa con la capa de pptido-glicano de las bacterias en la tincin GRAM.

GRAM POSITIVAS

GRAM NEGATIVAS

EXPLICACIN:

Su pared celular es gruesa con abundante pptidoglicano, esto hace que retenga su coloracin especfica en este caso violeta, durante el proceso de tincin Gram.

EXPLICACIN: Contiene una capa fina de peptidoglicano adyacente a la membrana citoplsmica, responsable de la incapacidad de la pared celular para conservar el color violeta en la decoloracin con etanol durante la tincin Gram, debido a la safranina empleada al final del proceso, su coloracin es roja.

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3. Qu colorantes se utilizan para la realizacin de tinciones y proponga otros tipos de tinciones? Los colorantes ms empleados en tinciones son: azul de metileno, cristal violeta, lugol, safranina, tinta china, rojo conga, verde malaquita, sudam III, alcohol cetona, fucsina cida, entre otros. Tincin de Van Gieson.- La Tincin de Van Gieson corresponde a la mezcla de cido pcrico fucsina cida y hematoxilina frrica de Weigert. Es el mtodo ms simple mediante tincin para diferenciar colgeno de otros tejidos conectivos. Identifica: Ncleos celulares color marrn a negro. Colgeno (tejido conectivo fibroso): Color rosa o rojo. Msculo y Citoplasma: Color amarillo. Tincin de Weigert .- Una tcnica de tincin de fibras elsticas a base de una mezcla de cloruro frrico y hematoxilina. Las fibras elsticas tien de azul o negro. En combinacin con la floxina o la tincin de van Gieson. Tie fibras elsticas en tonos de azul y violeta. Tincin de Romanowsky.- De utilizacin en extendidos sanguneos.

4. Cules son las principales precauciones de manejo de microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias? A momento de finalizar el trabajo y cuando no se est utilizando el microscopio, se debe poner el objetivo de menor aumento. No forzar los tornillos giratorios. Se evitar manejarlo con las manos hmedas o mojadas. El sistema ptico y de iluminacin nunca deber ser tocado con los dedos. No se debern colocar los portaobjetos mojados sobre la platina. Despus de usar el lente de inmersin se deber limpiar con un pauelo suave o con un papel higinico y alcohol. En las preparaciones en fresco siempre deber cubrirse con cubreobjetos. Revisar y limpiar el microscopio antes y despus de cada prctica. El aceite tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio, los rayos emergentes ya no se apartan de la normal, sino que continan su camino sin desviacin, consiguiendo as que una mayor cantidad de luz llegue al objetivo, mejorando notablemente la visin y se utiliza para el objetivo de 100x. Se usa generalmente aceite de cedro. No se puede usar el objetivo de 100x en seco, a diferencia del de 40x, 10x y menores.

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6. BIBLIOGRAFA:

1. Gerard. E. El microscopio de uso microbiolgico. Editorial Panamericana S.A. 4ta Edicin. 2. Dr. Enrquez. S. Tcnicas de tincin y barrido. Recuperado el 13 de noviembre de 2013. De: http://www.tecnicastincionybarrido.qb.fcen.uba.ar. 3. Dra. Izurrieta N. Tincin microbiolgica. Recuperado el 13 de noviembre de 2013. De: http://www.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-4-tincin de microorganismos. 4. Microbiloga General, tema 4.- MICROSCOPIA: Tincin de microorganismos. Recuperado el 13 de noviembre de 2013. De: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMicroscopia.htm 5. Araceli Quilis Benaige. Microscopio: mantenimiento y precausiones. Recuperado el 13 de noviembre de 2013. De: http://www.mailxmail.com/curso-microscopio/mantenimiento-precauciones