Un novedoso ligando cianobacterial para la L-selectina humana extrada de Aphanizomenon flos aquae Su potencial papel en la biologa de las clulas

s madre in vitro y in vivo

Jensen GS, Hart AN, Zaske LAM, Drapeau C, Gupta N, Schaeffer DJ, Cruickshank JA

Introduccin
El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos in vitro y en vivo de StemEnhance, un extracto de Aphanizomenos flos-aque (AFA) enriquecido con un novedoso ligando para L-selectina humana, en la

fisiologa de la clula madre. La L-selectina es una molcula de adhesin involucrada en la migracin celular, la adhesin celular, y la retencin versus la liberacin de clulas madre de la mdula sea dentro de la circulacin de la sangre. La estimulacin de la L-selectina conduce a los receptores de quimiocina preformados CXCR4, los cuales son especficos para la externalizacin de la quimiocina SDF-1

(por sus siglas en ingls: Stromal Derived Factor-1). (Figura 1). La vinculacin de SDF-1 a CXCR4 lleva a la externalizacin de las molculas de adhesin que se sujetan a la clulas madre en la mdula por eso ayuda en la

sea. SDF-1 acta como un poderoso atrayente de las clulas madre y retencin de las clulas madre dentro del entorno de la mdula sea.

Se demostr que cualquier interferencia con el eje CXCR4/SDF-1 es uno de los varios mecanismos contribuyentes clulas madre involucrados en la liberacin de las de la mdula sea. Por que interfiera con eso, el

cualquier componente

CXCR4 o el SDF-1 tiene el potencial de actuar como un movilizador de la clula madre.

Hay muchas formas de apoyar la movilizacin de las clulas madre. Por ejemplo el G-CSF (por sus Colony-Stimulating

Figura 1

siglas en ingls: Granulocyte

Factor), el componente natural en el cuerpo que estimula la movilidad de las clulas madre, funciona al menos en parte al incrementar el nivel de encimas proteolticas especficas que degradan el SDF-1, consiguiente promueve desestabilizando el eje al CXCR4/SDF-1. Otros componentes una vez ms por

tal como el AMD-3100 desestabilizando el eje

la movilizacin

celular

bloquear CXCR4,

CXCR4/SDF-1. Finalmente los bloqueadores de la L-selectina reducen la densidad del CXCR4 en la superficie de la membrana de las clulas madre, y por esa razn cae la regulacin del eje CXCR4/SDF-1. Debido al proceso fisiolgico involucrado en cada uno de estos mecanismos de accin, las

movilizaciones provocadas por cada uno de estos mecanismos muestran diferente magnitud, tiempo de inicio y duracin. La movilizacin producida por el G-CSF y el AMD-3100 comienza en unos pocos das, dura unos das y puede conducir a un incremento en el nmero de las clulas madre en la

circulacin, por arriba de las 100 veces. Por el contrario, la movilizacin provocada por los bloqueadores de L-selectina es ms transitoria y de mucha menos magnitud. La movilizacin fue rpida, pasajera y moderada, por esa razn

observada despus del consumo de StemEnhance

nosotros hipotetizamos que AFA contiene un bloqueador de la L-selectina.

Mtodos y Resultados
AFA contiene un ligando para la L-selectina humana. Para determinar si AFA contiene un ligando de la L-selectina (molcula de

vinculacin). Dynabeads paramagnticas (cuentas desarrolladas tecnologicamente para la separacin inmunomagntica) revestido con L-selectina

humana fue incubadas con un extracto de agua de AFA (AFA-W) (Figura 2). las Dynabeads Despus de lavados la y Figura 2

incubacin

fueron

cualquier material ligado del extracto de AFA fue desprendido de las molculas de la L-selectina y a continuacin pasado por el gel para electroforesis.

Este proceso revel que AFA contiene un ligando de L-selectina que aparece ser un dmero hecho de dos protenas que poseen un peso molecular de 57 y 54 kDa respectivamente (Figura 3). Al usar el con la Espirulina, se determin

mismo protocolo

que la Espirulina no contiene un ligando de la Lselectina. Figura 3

AFA-W especficamente reduce el TQ1 immunostaining de L-selectina en las clulas humanas PMN

La L-selectina

posee

un

especfico emplazamiento

vinculante

cuya

activacin da

lugar

la

externalizacin de CXCR4. Para determinar si el ligando de la L-selectina presente en AFA vincula al emplazamiento de vinculacin activa de la L-selectina, examinamos el efecto de AFA-W en las propiedades vinculantes del anticuerpo monoclonal de la L-selectina anti-humana TQ1. TQ1 es un anticuerpo que especficamente liga el emplazamiento de vinculacin fisiolgica activa de la L-

selectina. La incubacin de linfocitos con AFA-W redujo la vinculacin de TQ1 en aproximadamente

50 veces, indicando que el ligando de la L-selectina de AFA efectivamente se liga al emplazamiento de vinculacin activa de la L-selectina. AFA-W inhibe la expresin de CXCR4 inducida por fucoidina en las clulas CD34+ de la mdula sea. Era importante determinar si el ligando de la L-selectina encontrado en AFA era un estimulante o un inhibidor de la L-selectina. Sabemos que la estimulacin de la L-selectina conduce a un incremento en la externalizacin del CXCR4, la cual puede ser cuantificada al medir la densidad de los

receptores de CXCR4 en la superficie de las clulas madre. La incubacin de las clulas madre de la mdula sea con AFA-W no tuvo ningn efecto en la densidad de CXCR4, indicando que el ligando de L-selectina de AFA no era un estimulante de la L-selectina (Figura 4; lnea verde).

Figura 4

Con el objetivo de investigar si el ligando era un bloqueador de la L-selectina se examin el efecto de AFA-W en el incremento de la densidad de CXCR4 inducida por la fucoidina. (Figura 4). La inhibida (50%) al

fucoidina es un polisacrido de sulfato conocido por estimular la L-selectina. La fucoidina provoc un incremento de 8 veces ms de la densidad de CXCR4 (lnea azul), la cual fue

incubarse con AFA-W (lnea roja). Por esa razn, AFA contiene un bloqueador de la L-selectina.

El consumo de StemEnhance result en un incremento momentneo de la circulacin de las clulas CD34+ Como previamente se describi en la literatura

cientfica, los bloqueadores de la L-seletina tienen el potencial para ser efectivos movilizadores de las clulas madre, al modular el eje Por esa razn probamos la CXCR4/SDF-1. habilidad de

movilizacin del inhibidor de la L-selectina contenido en AFA en humanos. Usando un paradigma dobleciego cruzado, el nivel de circulacin las clulas madre CD34+ fue comparado en 15 individuos

antes y despus de la ingestin de 1 gramo de StemEnhance o placebo. StemEnhance (StemTech Figura 5

Health Sciences, Inc., CA) es una frmula patentada del citoplasma y una fraccin de la pared clular de la biomasa de toda la planta, enriquecida aproximadamente 5 veces ms por el contenido del ligando de la L-selectina comparado con la biomasa cruda de AFA.

El consumo de StemEnhance result en 60 minutos en un incremento de 25 1% en el nmero de clulas madre circulando en la sangre (p< 0.0001) (Figura 5). El nmero de clulas madre CD34+ en la circulacin regres a su punto de inicio alrededor de 3 o 4 horas despus de su consumo. Esto se dio en contraste con el placebo, el cual result con solamente unas menores fluctuaciones de los niveles de las clulas CD34+ en la circulacin de la sangre 2 horas despus del consumo.

Para probar la repetibilidad del efecto por el consumo de StemEnhance en los niveles de las clulas CD34+ en la sangre perifrica, 16 experimentos separados se realizaron en un voluntario. El promedio del incremento en el nmero de circulacin de clulas madre fue de 53 16%, media proporcional de 36 % y con una y

un aumento mximo

mnimo de 233% y -4% respectivamente (Figura 6).

Figura 6

Argumentos
Las estrategias para un rgimen alimenticio que apoye la biologa de las clulas madre representa un campo emergente en la investigacin medica y nutricional. La cianobacteria AFA ha sido estudiada por sus propiedades antioxidantes y efectos inmuno-modificadores, ambos efectos en humanos e in vitro. AFA contiene un nmero de compuestos que han sido sometidos a mucha investigacin, incluyendo el poderoso antioxidante de la ficociamina, un complejo polisacrido con poderosas propiedades

inmuno-modificadoras y el neuromodulador feniletilamina responsable de la experiencia de energa mental reportada por los consumidores. Se ha reportado aqu que AFA tambin contiene un novedoso componente que especficamente vincula el rea activo de la L-selectina humana. Se compone de dos subunidades con un peso aparente de 5457 kDa. Este ligando de la L-selectina humana, obtenido de la extracto de agua de AFA, fue capaz de

modular le respuesta funcional de los linfocitos humanos in vitro. La expresin del receptor CXCR4, la cual es causada por el efecto bien conocido de la fucoidina sobre la L-selectina, fue disminuyada cuando la fucoidina y el extracto de agua de AFA fueron agregados simultneamente, indicando que el ligando de la L-selectina de AFA estaba compitiendo con la fucoidina por la vinculacin a el

emplazamiento activo de la L-selectina. Un estudio doble-ciego cruzado controlado con un placebo mostr que el consumo de StemEnhance result en un pequeo pero significativo aumento en el nmero de clulas madre CD34+ circulando en la sangre, llegando al mximo punto una hora despus del consumo. El efecto fue estadsticamente significativo (p<0.0001). Hay sin embargo una fluctuacin significativa de un da a otro en el efecto de StemEnhance o en la habilidad para cuantificar con precisin el efecto. Por eso, para evaluar la naturaleza de esta fluctuacin, hicimos una prueba en un individuo durante 16 das experimentales. El incremento en el nmero de clulas madre en la sangre despus del consumo de StemEnhance

promedi 52 + 16% y vari en gran medida entre el 96% y el 333% del valor inicia. De manera interesante, el promedio de respuesta en el individuo examinado repetidamente y el promedio de

respuesta de StemEnhance en el estudio doble-ciego cruzado que incluy a 12 personas, fue similar, indicando la relativa consistencia de la respuesta y que el ensayo de doble-ciego cruzado puede de hecho haberle restado importancia al efecto de StemEnhance. Recientes estudios han puesto en evidencia el potencial papel de los movilizadores de las clulas madre en el mantenimiento ptimo de la salud. Recientemente, numerosos estudios concluyeron que el nivel de las clulas madre CD34+ circulando en la sangre era un buen indicador de salud.