MTODO CROMOGNICO PARA LA IDENTIFICACIN Y/O RECUENTO DE

Enterococcus POR LA TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA CON EL

EMPLEO DEL MEDIO m-CROMOCEN ENT

1. INTRODUCCIN
La enumeracin de bacterias o grupos de bacterias indicadoras de contaminacin
fecal es utilizada para valorar la calidad sanitaria de las aguas destinadas al
consumo humano, la agricultura, la industria y la recreacin. No existe un indicador
universal por lo que se debe seleccionar el apropiado para cada situacin particular
en estudio.
Algunos investigadores recomiendan los enterococos como el indicador ms
apropiado en aguas marinas porque sobreviven en ellas ms que los coliformes
fecales (Vergaray et al., 2007). La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) plantea
que el valor principal de los estreptococos fecales en el examen de la calidad del
agua potable es como indicadores adicionales de la eficiencia del tratamiento,
adems de ser valiosos para detectar contaminacin de las aguas subterrneas o de
superficie (OMS, 1998).
En lo que respecta al anlisis de las aguas, los enterococos pueden considerarse
como indicadores de contaminacin fecal. Ellos son usualmente ms resistentes que
Escherichia coli a la cloracin y al estrs del medio ambiente y como resultado
sobreviven ms tiempo, por lo que pueden ser utilizados como buenos indicadores
de la calidad microbiolgica del agua para consumo humano y el monitoreo de la
eficacia de los tratamientos de desinfeccin utilizados para garantizar la potabilidad.
Sin embargo, es conveniente sealar que algunos enterococos que se encuentran
en las aguas pueden proceder ocasionalmente de otros hbitats. El examen de
Enterococcus es conveniente para la interpretacin de resultados dudosos de otras
pruebas como la presencia de grandes nmeros de coliformes en ausencia de
Escherichia coli. Debido a su resistencia ante condiciones ambientales adversas, se
les considera como los principales microorganismos indicadores en aguas
recreacionales dulces y marinas.

Este mtodo describe el anlisis de varios tipos de aguas, para la deteccin y/o
enumeracin de Enterococcus, en el medio cultivo m-CromoCen ENT, el cual
contiene el sustrato cromognico 6-cloro-3-indoxil--D-glucsido (rosa-glu) para la
deteccin de actividad glucosidasa presente en las especies de Enterococcus,
permitiendo un procedimiento ms sencillo.

La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los
microorganismos Gram-negativos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin
de los microorganismos de inters.
En el presente mtodo, se definen Enterococcus como bacterias que presentan
una coloracin de rosada clara a oscura en toda la colonia. Enterococcus incluye
Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium, y sus
variantes.

2. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de
Seguridad Biolgica. Estos microorganismos se encuentran en el grupo de
riesgo 2.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados,
bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada
solucin desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la
superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la
zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes,
lave rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
Use bata de laboratorio.


3. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD

1. Determinacin de pH.
2. Evaluacin microbiolgica.
Ver anexo A

4. CULTIVO EN PLACAS E IDENTIFICACIN

Coloque la membrana filtrante sobre la superficie del medio cromognico
m-CromoCen ENT.

Incube el medio a 35 2 C durante 18-24 horas.

En este mtodo los Enterococcus se definen como aquellas bacterias que producen
colonias de rosado claro a oscuro en toda la superficie.


5. CONFIRMACIN DE IDENTIDAD

Algunos rganos regulatorios pueden exigir la confirmacin de Enterococcus spp.
por algunas pruebas adicionales a la deteccin de actividad glucosidasa respuesta
caracterstica en el medio m-CromoCen ENT. En este caso, la confirmacin de las
colonias sospechosas de Enterococcus se puede ejecutar con la prueba rpida de
PYR (Pirrolidonil arilamidasa) y/o la prueba de bilis-esculina (Ver anexo B).


2
6. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Ver Anexo B

Medio m-CromoCen ENT
Agua para diluciones tamponada
Reactivo para la prueba PYR
Agar bilis-esculina
Solucin salina
KH
2
PO
4

MgCl
2

Caldo Todd-Hewit
L-pirrolidonil--naftilamida
Reactivo p-dimetilaminocinaldehdo


7. EQUIPAMIENTO, UTENSILIOS Y SUSTANCIAS ADICIONALES
7.1 Equipamiento y materiales

Horno o autoclave.
Incubadora (capaz de operar a las temperaturas 35 2 C )
Bao termostatado (capaz de operar a la temperatura de 35 2 C)
pH-metro con una exactitud en la calibracin de 0.1 unidades de pH a 20 C
a 25 C.
Frascos de capacidad apropiada, de borosilicato, con tapas de rosca con
liners de neopreno.
Pipetas graduadas o automticas, de capacidades de 1 y 10 mL, graduadas
en divisiones de 0.5 y 0.1 mL.
Placas de Petri plsticas estriles de 9 x 50 mm, com tapas ajustadas, o de 10
x 55 mm o de 15 x 60 mm con tapas holgadas.
Unidad de filtracin para membranas de 50 mm de dimetro, envuelta en
papel kraft y estril.
Bomba de vaco elctrica.
Frasco para filtracin (kitasato), usualmente de 1 L, con dos mangueras
correspondientes.
Frasco trampa que se conecta entre el Kitasato y la bomba.
Pinza con puntas planas y lisas.
Alcohol etlico al 95 % en un frasco pequeo de boca ancha para la
esterilizacin de la pinza.
Mechero de gas o cabina de seguridad.
Membranas filtrantes cuadriculadas, de color blanco con un tamao de poros
de 0,45 0,02 m y con dimetro de 47 50 mm de dimetro, estriles.
Agua para diluciones: agua para diluciones tamponada estril, preparada en
grandes volmenes para enjuague de filtro entre las muestras.
Rotuladores de placas.
3
Frascos de vidrio graduados con tapa de rosca de volumen 1 L estriles para
la medicin de las muestras.

8. MICROORGANISMOS INTERFERENTES Y REACCIONES ATPICAS

En el caso de la deteccin de la actividad de la enzima - glucosidasa (GLU) con el
sustrato 6-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiransido (ROSA-GLU) incluido en el medio
se debe tener en cuenta que esta enzima est presente en el grupo KES (Klebsiella-
Enterobacter-Serratia) (Palacios, 2002). Estos microorganismos resultan totalmente
inhibidos en el medio por la presencia de inhibidores de la microbiota gram-negativa.
Si crecieran colonias sospechosas de estos microorganismos, se deben ejecutar
pruebas confirmatorias (tincin de Gram o prueba rpida de PYR).

Las reacciones tpicas de los microorganismos diana se mantienen estables ms all
de las 18-24 horas de incubacin recomendadas.

Las muestras de agua que contienen materiales coloidales o partculas en
suspensin pueden obstruir la membrana e impedir la filtracin, o causar
diseminacin de las colonias bacterianas las cuales podran interferir en la
enumeracin e identificacin de las colonias diana.

9. PROCEDIMIENTO

9.1 Muestras

Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o
cambios en su composicin y estado.

En el momento de la colecta, trate las muestras que contienen cloro residual con 1
mL de solucin al 10 % de tiosulfato de sodio por litro de muestra.

Transporte las muestras en refrigeracin o en contenedores con hielo para mantener
la temperatura de 1 a 4 C.

Analice las muestras en el laboratorio lo antes posible. Ensaye el agua potable
antes de las 30 h posteriores a su recoleccin y el agua bruta antes de las 6 h.

9.1.1 Seleccin del tamao de la muestra:

Determine el tamao de la muestra teniendo en cuenta la densidad microbiana
esperada. Para analizar aguas potables, limite el tamao de la muestra slo por el
contenido de slidos en suspensin (turbiedad) o por el crecimiento de los
microorganismos en su conjunto en el medio. Para propsitos regulatorios, el tamao
oficial de la muestra es 100 mL.

Un volumen ptimo de muestras debe proporcionar entre 20 y 80 colonias de
Enterococcus por placa, aunque se logran mejores resultados al obtener de 20 a 60
colonias por placa y no ms de 200 UFC/placa en la superficie de la membrana
filtrante.

4
Analice el agua potable filtrando entre 1 y 100 mL, filtre volmenes ms pequeos
tales como duplicados de 50 mL o porciones de cuatro rplicas de 25 mL. Analice
otros tipos de aguas con mayor densidad microbiana esperada o de mayor turbiedad
filtrando hasta tres volmenes diferentes (diluidos o no diluidos).

Si el volumen de muestra a filtrar, es menor de 10 mL (diluida o no diluida), previo a
la filtracin, aada aproximadamente 10 mL de agua para dilucin estril al embudo,
o tome con una pipeta el volumen de muestra y traspselo a un frasco para
diluciones estril y filtre posteriormente la dilucin completa.

El objetivo de aumentar los volmenes de agua para dilucin estril aadidos a la
muestra es lograr una distribucin ms uniforme de la suspensin bacteriana sobre
la superficie de la membrana filtrante.

9.1.2 Dilucin de la muestra

En caso de analizar una muestra en que se sospeche un alto nivel de contaminacin,
prepare el agua para diluciones tamponada segn se indica en el anexo B.
Seleccione la dilucin a preparar de forma tal que el nmero total de UFC de
microorganismos diana a obtener en la placa se encuentre entre 20 y 60.

No mantenga las diluciones preparadas por un perodo mayor de 30 minutos a
temperatura ambiente, para evitar la multiplicacin o muerte de los microorganismos.


Volmenes de muestras recomendados a filtrar en dependencia de la fuente de
agua.

Para consumo humano directo o indirecto:
Agua para consumo humano: 100 mL
Agua de pozos, manantiales, lagos, presas y reservorios: 10-100 mL
Puntos de entrada al procesamiento de agua: 0,1-10 mL
Agua de ro: 0,001-1 mL

Aguas recreacionales:
Piscinas: 100 mL
Playas: 0,1-10 mL

Aguas residuales:
Cloradas: 0,01-1 mL
Sin clorar:0,0001-0,1 mL


10. FILTRACIN POR MEMBRANA CON EL EMPLEO DEL MEDIO
m-CROMOCEN ENT
El esquema general del mtodo se presenta en el Anexo C.

10.1 Procedimiento de cultivo en placas.
Prepare el medio m-CromoCen ENT de ser necesario. Si las placas estn
preparadas con antelacin y refrigeradas, permita que stas alcancen la temperatura
5
ambiente. Si la superficie del medio est hmeda seque las placas en la incubadora
durante 30 min a 40 C. Rotule las placas adecuadamente.
Utilizando la pinza flameada, coloque la membrana filtrante con la superficie
cuadriculada hacia arriba sobre la base porosa del filtro. Una el filtro con la base con
la ayuda del cierre, teniendo en cuenta no daar la membrana. Coloque
aproximadamente un volumen de 20 mL de agua para diluciones estril y fltrela
previamente. Agite vigorosamente la muestra unas 25 veces y tome posteriormente
en un contenedor estril el volumen de la muestra de agua (segn 9.1.1 y 9.1.2) y
fltrela conectando la bomba de vaco. Realice otro enjuague de aproximadamente
20 mL de agua para diluciones. Al terminar estos pasos, abra la unidad de filtracin y
retire la membrana filtrante con ayuda de la pinza flameada. Coloque esta membrana
sobre la superficie del medio m-CromoCen ENT teniendo especial cuidado en que no
queden burbujas de aire entre la membrana y el medio.
Realice los enjuagues del filtro con agua para diluciones tamponada estril, antes y
despus de procesar cada una de las muestras.
Coloque las placas en la incubadora a temperatura de 35 2 C en posicin
horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Incube por
un perodo de 18 a 24 h. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar
la presencia de colonias tpicas de Enterococcus o para su enumeracin.


11. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL MEDIO m-CROMOCEN ENT
(Ver Anexo D)

En el medio m-CromoCen ENT, el crecimiento tpico de Enterococcus, son colonias
de rosado claro a oscuro.

Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias
Gram-positivas.

Los microorganismos Gram-negativos resultan inhibidos en el medio.

Nota: Tenga en cuenta la respuesta de los microorganismos interferentes o
reacciones atpicas para el anlisis de los resultados. (Ver acpite 8).

12. RECOMENDACIONES PARA EL RECUENTO DE COLONIAS EN EL MEDIO
m-CROMOCEN ENT
Las placas deben mostrar recuentos en el intervalo de 20 a 80 UFC. Calcule la
cuenta por 100 mililitros de la muestra y reporte.

Cuando la muestra de 100 mL se separa en 2, 3 4 porciones de 50 y/o 25 mL,
determine la cuenta dada por cada placa y smelas. Reporte el recuento en
UFC/100 mL.
6
Si emplea diluciones de la muestra, tanto en 1, como en 2, 3 4 placas diferentes,
correspondientes a las porciones de la misma muestra, multiplique el nmero de
colonias diana por placa por el recproco de la dilucin empleada para cada placa. Si
emplea ms de una placa, sume los recuentos despus de haber multiplicado cada
una en la que se ensay una porcin diluida por el recproco de la dilucin.
Si emplea volmenes de muestra menores de 100 mL pero en una sola placa, divida
el recuento resultante en la placa entre el volumen de muestra filtrado y multiplique el
valor por 100 mL, para determinar el recuento en UFC/ 100 mL.
Si emplea volmenes de muestra menores de 100 mL de una muestra diluida, pero
en una sola placa, divida el recuento resultante en la placa entre el volumen de
muestra filtrado y multiplique el valor por 100 mL, y finalmente multiplique este valor
por el inverso de la dilucin empleada, todo esto para determinar el recuento en
UFC/ 100 mL.
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde
las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes orientaciones:

Placas con menos de 20 colonias diana- Cuando las placas muestran cuentas de
menos de 20 colonias, cuente el nmero de colonias presentes en dicha placa y si
ha filtrado una dilucin, multiplquelo por el factor de dilucin para obtener el valor
estimado de cuenta en placa. Aclare en su informe esta situacin agregando al valor
encontrado la leyenda "valor <20".

Placas con ms de 80 colonias.- Cuando el nmero de colonias diana por placa
exceda de 80, cuente las colonias en aquellas porciones de la placa que sean
representativas de la distribucin de colonias. Cuente, por ejemplo, una cuarta parte
o una mitad del rea de la placa y multiplique el valor obtenido por 4 2,
respectivamente. Aclare en el informe esta situacin agregando al valor encontrado
la leyenda "valor >80".

Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes
formas (tipos):

Cadenas de colonias no separadas claramente entre s, que parecen ser
causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias.
Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la placa sobre la
superficie de la membrana.
Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de
inhibicin del crecimiento, que en conjunto exceden el 50 % de la placa o
represin del crecimiento que por s mismo excede el 25 % de la superficie de
la placa.

Cuando es necesario contar en placas que contienen colonias extendidas que no
estn incluidas en alguno de los grupos anteriores, cuente cualquiera de los tipos
mencionados, como provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del
primer tipo, si la placa contiene una sola cadena, cuente como una sola colonia, si la
placa contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, cuente
7
cada cadena como colonia individual. No cuente cada colonia de la cadena
individualmente. Las colonias del segundo tipo generalmente se observan como
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los
crecimientos del tercer tipo, reprtelos como crecimiento extendido. En caso de que
una dilucin se encuentre dentro del rango y otra dilucin presente colonias de
crecimiento extendido, reporte la dilucin en la que se pueden contar las colonias.

Placas sin colonias.- Cuando las placas no muestran colonias, reporte la ausencia.

Placas corridas por duplicado provenientes de una misma muestra, una con
crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms de 80 colonias.- Cuando
una placa tiene entre 20 y 80 colonias y su duplicado ms de 80 colonias, cuente
ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta en
placa.
El recuento de Enterococcus se realiza como sigue: proceda como en los prrafos
anteriores. Ejecute el recuento de todas las colonias de color rosado claro a oscuro
con diferente intensidad de color. Las colonias incoloras o con coloracin propia,
diferente a la descrita, no sern tomadas en cuenta.
13. CONFIRMACIN
Si se exigiera por algn rgano regulatorio la confirmacin adicional de
Enterococcus, seleccione las colonias sospechosas de Enterococcus para la
confirmacin con la prueba rpida PYR como describe el procedimiento (Anexo B),
y/o de Bilis-esculina (Anexo B).
Las colonias seleccionadas debern ser de un nmero de al menos 5 por placa.
Utilice cultivos puros para ejecutar la prueba.

14. BIBLIOGRAFA
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Wastewater 1998. 20th Edition.
2. Cowan and Steels. Manual for the identification of medical bacteria 1993. 3th
Edition.
3. Daz Prez, M. et al. Evaluacin del Desempeo de un nuevo medio de cultivo
en la Bsqueda de Enterococcus en muestras clnicas. Revista CENIC
Ciencias Biolgicas 2005, Vol. 36, No. Especial.
4. Ewing, W.H. Edwards and Ewings Identification of Enterobactericeae 1986.
4
th
Edition. Elsevier Science Publiching Co. Inc., New York.
5. Holt, J . et al. Bergeys Manual

of Determinative Bacteriology. Williams

&Wilkins 1994. 9
th
Edition, pg 528.
6. ISO 16140: Microbiology of food and animal feeding stuffs- Protocol for the
validation of alternative methods 2003. First edition 2003-05-01.
7. Kreig, N.R., and J .G. Holt. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology 1984,
Vol 1. Williams & Wilkins, Baltimore.
8. Manafi, M. New medium for the simultaneous detection of total coliformes and
E. coli in water. Abstracts of the 95
th
Meeting of the American Society for
Microbiology 1995. Washington, DC, Abstr p-43, p. 389.
8
9. Manual BioCen de Medios de Cultivo 2004. Medios de cultivos, peptonas,
extractos y agares. Centro Nacional de Biopreparados.
10. NC 93-01-130. Determinacin de estreptococos fecales. 1991.
11. Norma Espaola UNE-EN ISO 7899-2. Calidad del agua. Deteccin y recuento
de enterococos intestinales. Parte 2: Mtodo de filtracin por membrana (ISO
7899-2: 2000) Mayo 2001.
12. OMS. Guas para la calidad del agua potable. Segunda edicin. Vigilancia y
control de los abastecimientos de agua de la comunidad. 1998;3:65-66
13. Palacios, E. et al. Utilidad del medio cromognico MPOen el procesamiento
habitual del urocultivo. Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.
2002; 20(08): pg. 388-390.
14. Revista CENIC Ciencias Biolgicas 2005, Vol. 36, No. Especial.
15. Tejedor MT. et al. Identification and Antibiotic Resistance of Faecal Enterococci
Isolated from Water Samples. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria:
Facultad de Veterinaria. 2001. Islas Canarias, Espaa.
16. Tendencia actual del estreptococo como indicador de contaminacin fecal.
Revista Cubana Higiene Epidemiologa 2002; On-line ISSN 1561-3003; 40(1):
0-0.
17. United States Office of Water EPA-821-R-97-004. Environmental Protection
Agency. 4305. May 1997.
18. Vergaray et al., 2007. Federal-Provincial Working Group on Recreational Water
Quality. Guidelines for Canadian Recreational Water Quality. Minister of
National Health and Welfare. Canada, 1992:22-5;.
19. Water quality. Detection and enumeration of intestinal enterococci. Part 2:
Membrane filtration method. (ISO 7899-2:2000).

9
ANEXO A: Control de la calidad del medio m-CromoCen ENT
Determinacin del pH
Condiciones de Seguridad:
Use la bata de laboratorio.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza de precisin de 0,01 g
pH-metro
Licuadora elctrica

Materiales:
Frasco cnico de 250 mL
Embudo de cristal de 120 mm de dimetro
Esptula de acero inoxidable
Papel de filtro neutro
Cilindro graduado de 100 mL
Pinzas con punta amiantada para vasos
Termmetro de 0-100 C (valor de divisin 1)

Materias Primas:
Agua destilada o desionizada

Procedimiento:
a) Corte con una esptula el medio contenido de una o ms placas y adicinelo en el
vaso de la licuadora elctrica.
b) Aada un volumen de agua destilada o desionizada, medidos con el cilindro
graduado, igual al volumen de medio contenido en la placa o en las placas tomadas
para el ensayo, en varias porciones para arrastrar en cada una de ellas los restos de
medio que queden adheridos a las paredes de la placa.
c) Adicione todas estas porciones en la licuadora.
d) Homogeneice totalmente la mezcla en la licuadora durante 1 minuto, operando el
equipo segn la instructiva del mismo, y filtre todo el contenido a travs de un papel
de filtro neutro para filtracin rpida colocado en un embudo.
e) Recoja el filtrado en un frasco cnico.
f) Enfre el filtrado a una temperatura de 25 2 C y proceda a medir el pH en el pH-
metro. Opere el pH-metro segn la instructiva del mismo.
g) Realice el procedimiento por triplicado para cada muestra.
h) Anote los resultados.
Clculo e Interpretacin de los Resultados:
Calcule la media entre los tres valores obtenidos.
Aproxime los resultados hasta la dcima.

Criterios de aceptacin
El valor del pH debe ser 7,0 0,2.


10
ANEXO A (cont). Control de calidad del medio m-CromoCen ENT.

Evaluacin microbiolgica del m-CromoCen ENT

Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee
la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza tcnica (precisin 0,01 g)
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Bao termostatado de laboratorio
Bomba de vaco
Espectrofotmetro (opcional)

Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Frascos cnicos de vidrio sin tapa de 250 , 500 y 1 000 mL
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
Hisopo de algodn estril
Asa calibrada de 1 L
Placas de Petri de (100 x 13) mm y (150 x 25) mm
Cilindros graduados de cristal de 100 mL
Lmina portaobjetos
Lmina cubreobjetos
Esptula de Drigalsky
Pipeta Pasteur
Lpiz cristalogrfico
Tubo 0,5 de la escala MacFarland (opcional)
Pinza de acero inoxidable
Filtro de acero inoxidable para filtracin por membrana
Pinzas plsticas o de acero inoxidable para manipular las membranas filtrantes
Membranas filtrantes de acetato o nitrato de celulosa para filtracin por membrana



11
Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Medio de cultivo Agar Triptona Soya en tubos, con agar en plano inclinado
Medio de cultivo, de referencia o control, semejante al que se evaluar
Cepas ATCC de referencia o control Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Enterococcus faecalis ATCC 19433 y Escherichia coli ATCC 25922.
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con Caldo Triptona Soya
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
Gorro
Agua destilada o desionizada
Operaciones Preliminares:
a) Compruebe que se ha realizado la limpieza de la meseta y el cuarto segn lo
establecido, observando el registro correspondiente.
b) Prepare el inculo segn los siguientes pasos.
c) Partiendo de cuas de los cultivos microbianos en conservacin (refrigeracin de 4 - 8
C), siembre por estras cada uno de los microorganismos de referencia en dos tubos de
Agar Triptona Soya con agar inclinado o en Caldo Triptona Soya, de las bacterias a
ensayar.
d) Incube a 35 2 C de 18-24 h para las bacterias.
e) Realice la Tincin de Gram, para comprobar la pureza del cultivo a sembrar.
f) La evaluacin del medio se realizar a partir de inculos estandarizados, ya sea a
partir del cultivo con 50 % de transmitancia en el espectrofotmetro, o del tubo
correspondiente a la escala 0,5 de MacFarland, para lo cual, estandarice el inculo y
prepare diluciones seriadas del mismo.
g) Rotule las placas que contienen el medio a evaluar.

Procedimiento:
Agrupe las placas rotuladas por microorganismo dentro del cuarto de siembra.

Mtodo de siembra por la tcnica de filtracin por membrana
Inoculacin del medio de cultivo.
a) Esterilice el equipamiento de filtracin antes de utilizarlo.
b) Con ayuda de una pinza estril, remueva la membrana de su embalaje individual y
colquela sobre la base del filtro.
c) Filtre la muestra (0,1 mL del cultivo en 20 mL de agua desionizada o destilada
estril) y enjuague el filtro con otros 10 mL del agua.
d) Remueva la membrana filtrante con ayuda de una pinza estril y colquela sobre
la superficie del medio agarizado.
e) Incube las placas invertidas a 35 2 C de 18-24 h.

Criterios de aceptacin (tabla 1)




12
Tabla 1. Criterios de aceptacin para el mtodo de siembra por filtracin por
membrana despus de incubacin por 18-24 h a 35 2 C

Microorganismo Caractersticas de
las colonias
aisladas
Crecimiento en la dilucin
10
-5
Enterococcus .
faecalis
ATCC 29212
Colonias de 0,5-1
mm de , de color
rosado claro a
oscuro
Bueno
Enterococcus faecalis
ATCC 19433
Colonias de 0,5-1
mm de , de color
rosado claro a
oscuro
Bueno
Escherichia coli
ATCC 29212
Incoloras, si las hay De inhibido a escaso
(recuperacin 0,01 % para
el inculo 10
5
UFC/mL)*

* siembra en paralelo con el Agar Triptona Soya.

Preparacin de patrones de la escala MacFarland
1 Condiciones de Seguridad:
Use bata de laboratorio.
Manipule con cuidado el cido sulfrico concentrado ya que puede causar
quemaduras severas en los ojos y la piel.

2 Equipos, Materiales y Materias primas:
Equipos:
Estufa con circulacin forzada de aire de 50 a 200 C
Agitador magntico
Balanza de 0,01 g de precisin

Materiales:
Bulbos de vidrio 2R
Tapones de clorobutilo 13 mm
Sellos de aluminio de 13 mm
Matraz de un solo trazo de 100 mL
Frasco cnico de 250 mL
Esptula
Vaso para precipitado de 25 mL
Pipeta automtica de 1 a 5 mL
Puntas para pipeta automtica de 1 a 5 mL
Bandeja de acero inoxidable (160 x 270) mm
Barra magntica (40 x 8) mm
Selladora manual para bulbos 2R
Pipetas de vidrio graduadas de 1 mL y 10 mL


13
Materias primas:
Agua potable
Detergente industrial
Agua desionizada
Acido sulfrico 98 % (p.a) (=1,84 g/cm
3
)
Cloruro de bario dihidratado (p.a.)

Operaciones Preliminares:
Fregado de los bulbos y tapones.
a) Sumerja los bulbos y tapones en una solucin de detergente.
b) Mantngalos en esta solucin durante 15 min.
c) Saque los bulbos y tapones del detergente y enjuguelos con suficiente agua
potable, hasta eliminar todo el detergente.
d) Enjuague los bulbos y tapones dos veces con agua desionizada.
e) Escrralos y colquelos en una bandeja de acero inoxidable.
f) Coloque la bandeja en una estufa con circulacin forzada de aire y seque los
bulbos y tapones a 70 C durante 2 h.
g) Una vez transcurrido el tiempo de secado, saque la bandeja de la estufa y deje
enfriar los bulbos y tapones hasta temperatura ambiente.

Preparacin de la solucin de cido sulfrico al 1 % .
a) Tome con una pipeta graduada 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98 %, (=1,84
g/cm
3
) y depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL .
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Preparacin de la solucin de cloruro de bario al 1 %.
a) Pese en una balanza de 0,01 g de precisin, con una esptula en un frasco cnico
de 250 mL,
1,17 g de cloruro de bario di-hidratado. Opere el equipo segn instructiva del mismo.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 g .
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Procedimiento:
Preparacin de la suspensin.
a) Endulce una pipeta graduada de 10 mL con la solucin de cido sulfrico al 1 %.
b) Endulce una pipeta graduada de 1 mL con la solucin de cloruro de bario al 1 %.
c) Mezcle en un frasco cnico de 250 mL los volmenes deseados de soluciones
segn las proporciones indicadas en la tabla 1. Segn el patrn que se desea
preparar.
d) Agite durante 5 min.






14
Tabla 1. Proporciones de los reactivos para la preparacin de la escala MacFarland

Escala de MacFarland
Tubo H
2
SO
4
1 % (mL) BaCl
2
1 % (mL)
0,5 9,95 0,05
1 9,9 0,1
2 9,8 0,2
3 9,7 0,3
4 9,6 0,4
5 9,5 0,5
6 9,4 0,6
7 9,3 0,7
8 9,2 0,8
9 9,1 0,9
10 9,0 1,0

Llenado de los bulbos.
a) Coloque el frasco cnico con la suspensin en el agitador magntico e introduzca
una barra magntica.
b) Comience a agitar a 500 r/min.
c) Grade la pipeta automtica para 3 mL.
d) Coloque la punta en la pipeta automtica.
e) Manteniendo en agitacin la suspensin dispense en cada bulbo 3 mL de la
misma con ayuda de la pipeta automtica.

Tapado y sellado de los bulbos.
a) Coloque los tapones y los sellos de aluminio sobre los bulbos.
b) Tome los bulbos uno a uno, colquelos fuera de la bandeja y vaya sellndolos con
la selladora manual para bulbos 2R.

Revisin.
a) Observe los bulbos individualmente a travs de la luz y elimine los que tengan
partculas extraas.

Rotulado.
a) Rotule los frascos con la etiqueta correspondiente.

Almacenamiento.
a) Almacnese en la oscuridad.

Preparacin de las cepas de trabajo

Operaciones preliminares.
Preparacin de la solucin de formaldehdo al 12 %
a) Vierta en un matraz de un solo trazo de 100 mL, 32,4 mL de formol al 37 %.
b) Complete el volumen con agua destilada o desionizada.
c) Homogeneice la preparacin invirtiendo el frasco de 4 a 5 veces el matraz.
15
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin de una solucin de cido sulfrico al 1 %. (m/v)
a) Tome con una pipeta graduada de 1 mL, 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98
%^, ( =1,84 g/cm
3
) y depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL.
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice la solucin agitndola manualmente.
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin de la solucin de cloruro de Bario al 1 % (m/v)
a) Pese en una balanza tcnica de precisin 0,1 g, en un frasco cnico de vidrio de
250 mL, 1 g de cloruro de bario di-hidratado.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 mL.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.
d) Trasvase el contenido a un frasco.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin del cultivo para su posterior estandarizacin
Preparacin del cultivo puro (18-24 horas)
a) Tome con un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama del quemador
parte de la biomasa del microorganismo procedente de una cua de conservacin
(cepa certificada) e inocule en un tubo de vidrio que contenga un medio slido de
uso general en plano inclinado (Ej: Agar triptona soya). Rotule el tubo con el nombre
del microorganismo en cuestin. En caso de contar con una cepa salvaje proveniente
de una muestra, tomar una colonia aislada y proceder de igual forma.
b) Incube el tubo inoculado en condiciones de tiempo y temperatura segn los
requisitos del microorganismo. (Bacterias generalmente a 35 2 C).
c) Si desea comprobar la pureza del cultivo despus de pasado el tiempo de
incubacin realice una tincin de Gram.

Preparacin de la suspensin
a) Tome el tubo de cultivo fresco y aada 5 mL de solucin salina estril.
b) Arrastre el cultivo del agar rotando el tubo con movimientos manuales,
manteniendo el tubo en posicin horizontal.
c) Vierta la suspensin final a un tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca, estril.
Rotule el nombre de la cepa y la fecha. (Tubo A).
d) Si desea compruebe la pureza del cultivo del tubo A realizando una Tincin de
Gram.

Estandarizacin de la cepa al 50 2 % de transmitancia utilizando un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 580 nm
a) Encienda el espectrofotmetro 30 min. antes de ser utilizado.
b) Ajuste el equipo a 0 y 100 de transmitancia.
c) Extraiga con una pipeta estril de 1 mL en condiciones aspticas 1mL del
contenido del tubo A y transfiralo a un tubo de (150 x 20) mL con tapa de rosca, no
necesariamente estril en este caso, indicando el nombre de la cepa y rotulndolo
como tubo B.
d) Aada 1 mL de formaldehdo al 12 % al tubo B.
16
e) Mantenga en contacto la suspensin de la cepa y el formaldehdo de 15-30 min.
f) Agite el tubo B, aada de su contenido aproximadamente 8 mL al tubo de lectura
del equipo, colquelo en el espectrofotmetro y observe el porcentaje de
transmitancia que mide el equipo.
g) Si el porcentaje de transmitancia est por debajo del 50 %, adale con cuidado
aproximadamente 1 mL menos de solucin salina al 0,85 %. Anote en su libreta de
trabajo los volmenes de solucin salina que va aadiendo.
h) Repita la operacin descrita en el apartado f.
i) Repita las operaciones descritas en los apartados g y h hasta alcanzar el 50 2 %
de transmitancia.
j) En caso de que el valor de la transmitancia exceda el 50 %, extraiga con una
pipeta estril de 1 mL en condiciones aspticas 1 mL del contenido del tubo A y
transfiralo al tubo B, aada 1 mL de formaldehdo al 12 % y contine la lectura
despus de haber transcurrido los 15 minutos.
k) Sume los volmenes de solucin salina al 0,85 % y de formaldehdo incorporados
al mL de suspensin microbiana.
Ejemplo:
1 mL de formaldehdo + mL de solucin salina =X mL de solvente
Entonces:
1 mL de suspensin microbiana +X mL de solvente (Formaldehdo y solucin
salina) ~50%

Estandarizacin por turbiedad similar al tubo # 5 de MacFarland
a) Tome un tubo de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca que contenga
en su interior 9 mL solucin salina, colquelo en una gradilla para tubos y rotlelo
con el nombre del microorganismo, la fecha y las iniciales M.F#5 que significa
MacFarland #5 lo que corresponde aproximadamente a 3,0 10
8
clulas/mL.
b) Coloque el tubo A (suspensin microbiana) en la gradilla referida en el apartado
anterior 2.2.c.
c) Tome el tubo #5 de la escala de MacFarland y colquelo en la gradilla.
d) Extraiga con una pipeta de 1 mL estril en condiciones aspticas 0,5 mL del
contenido del tubo A y transfiralo al tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca
rotulado con M.F. #5 hasta alcanzar una turbiedad al tubo #5 de la escala de
MacFarland.
Cuenta de viables de la suspensin estandarizada (Para determinar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
a) Prepare la suspensin microbiana estandarizada (Tubo A).
b) Coloque en una gradilla 10 tubos de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de
rosca, estril. Rotule los tubos indicando el nombre del microorganismo y diluciones
desde 10
-1
hasta 10
10
.
c) Adicione aspticamente 9 mL de solucin salina estril a cada tubo con una pipeta
de 10 mL estril y portapipetas automticos si posee.
d) Agite el tubo A con un agitador magntico si posee o con la mano durante 5
segundos.
e) Tome 1 mL aspticamente con una pipeta de 1 mL estril y portapipetas
automtico, del tubo A y adalo al tubo 10
-1
. Agite durante 2 3 segundos.
17
f) Transfiera de igual forma, 1 mL del tubo 10
-1
al tubo 10
-2
. Agite. Repita esta
operacin hasta el tubo marcado con 10
-10
.
g) Rotule 2 placas de Petri con el medio de cultivo especfico segn corresponda por
microorganismo y por dilucin e identifquelas con el nombre de la cepa, dilucin y
fecha de inoculacin.
Inoculacin
a) Agite la dilucin 10
-5
durante 2 3 segundos y tome 0,2 mL de la misma con una
pipeta de 1 mL estril e inocule esta cantidad en cada una de las 2 placas que
contienen el medio de cultivo.
b) Aplique rotacin manual en forma de 8 a las placas.
c) Deje reposar las placas con las tapas hacia arriba durante 15 minutos.
d) Incube las placas a la temperatura y el tiempo que se describe para el
microorganismo del ensayo.
e) Si desea comprobar la pureza del inculo a las placas incubadas realice Tincin
de Gram despus del tiempo de incubacin.

Lectura de las placas
Cuente las Unidades Formadoras de Colonias en cada una de las 2 placas
sembradas. Haga un promedio y tome el valor promedio (de no obtenerse
crecimiento en una de ellas, desechar el resultado de esa placa y solo tomar en
cuenta el de la placa restante) y antelo en el registro de cuentas de viables.
Nota: Si en lugar de partir de la cepa estandarizada con el espectrofotmetro
parte de la cepa estandarizada por MacFarland, realice los mismos pasos para
hacer las diluciones pero partiendo del tubo que contiene la suspensin
estandarizada al 0,5 de MacFarland. El resto de los pasos se realiza de la misma
forma.

Se considerar vlido el ensayo si:
a- En las diluciones de trabajo se encuentran las Unidades Formadoras de Colonias
necesarias para realizar nuestro ensayo en al menos 1 placa (de 10 a 100 UFC).
b- No existe contaminacin en las inoculaciones realizadas.

18
ANEXO B. Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos.

1. Agua para diluciones tamponada

Solucin stock de buffer de fosfato

Composicin.

Dihidrgenofosfato de potasio
(KH
2
PO
4
)
34,0 g
Agua destilada 500 mL

Preparacin.
Ajuste el pH de la solucin a 7,2 con el NaOH 1 N y complete el volumen a 1000
mL con agua destilada. Esterilice en autoclave a 121 C durante 15 min.

Solucin stock de MgCl
2
: Disuelva 38 g de MgCl
2
anhidro ( 81,1 g del
hexahidratado) en un litro de agua destilada.

Preparacin.
Esterilice en autoclave a 121 C durante 15 min.

Almacene en refrigeracin ambas soluciones stock despus de la esterilizacin y
maniplelas aspticamente.

Solucin de trabajo final (pH 7,0 0,2): Aada 1,25 mL de la solucin stock
de buffer fosfato y 5 mL de la solucin stock de MgCl
2
para cada litro de
agua destilada preparada. Mezcle bien, dispense en contenedores
apropiados (frascos graduados o frascos de Erlenmeyer para el enjuague
del filtro) y esterilice en autoclave.


2. m-CromoCen ENT

Formulacin g/L
Bases nutritivas 8,0
Mezcla cromognica 0,075
Acetato de talio 0,476
Xilosa 10,0
Fosfato dipotsico 5,0
Dihidrgeno fosfato de potasio 1,5
Prpura de bromocresol 0,01
Agar 13

pH 7.0 0.2

Preparacin

De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporcin de 38,06 g/L de agua
destilada o desionizada. Para preparar 500 mL del medio, suspenda 19,03 g del polvo en
19
500 mL de agua destilada o desionizada. Hierva hasta disolucin y esterilice en
autoclave a 115 C durante 10 minutos. Enfriar hasta 45 C. Distribuir 7,5 mL de medio
en placas de Petri estriles de 5,5 cm, agitando suavemente para homogeneizar.
Almacenar las placas protegidas de la luz. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE A
TEMPERATURAS MAYORES DE 115 C.


3. Prueba Rpida PYR para la identificacin de Enterococcus.

Fundamento: La Prueba PYR es altamente sensible y especfica para los
estreptococos del grupo A y mucho ms para las especies de Enterococcus. Esta
prueba reemplaza la prueba de bacitracina y la de tolerancia a la sal para ambos
grupos. La enzima que se detecta es la llamada pirrolidonil arilamidasa. El
microorganismo que posee esta enzima hidroliza el PYR y se libera -naftilamida que
es detectado por la adicin de p-dimetilaminocinaldehdo, desarrollndose un color
rojo si la prueba es positiva.

Otros organismos (ej: muchos lactococos, Aerococcus viridans, G. hemolysans,
algunos estreptococos y algunos estafilococos) son tambin PYR-positivos.

La prueba PYR se realiza utilizando el Caldo Todd-Hewit con 0,01 % de
L-pirrolidonil--naftilamida. El Caldo Todd Hewit puede prepararse a partir del medio
en polvo o por ingredientes. Cuando se dispone del medio en polvo se prepara de la
siguiente forma:
Suspender 37 g en 900 mL de agua destilada o desionizada. Mezclar bien y
esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar hasta temperatura
ambiente y aadir 100 mL de una solucin de L-pirrolidonil--naftilamida al 0,01 %
por filtracin. Dispensar 0,2 mL de medio en tubos estriles.

Si no se dispone del medio en polvo se prepara a partir de los ingredientes de la
siguiente forma:

Caldo PYR (Caldo Todd-Hewit con 0,01 % de L-pirrolidonil--naftilamida)
Formulacin g/L
Infusin cerebro corazn 10,0
Peptona 20,0
Dextrosa 2,0
Cloruro de sodio 2,0
Fosfato de sodio 0,4
Carbonato de sodio 2,5
Total 37,0
pH 7,8 0,2

Disolver todos los ingredientes en 900 mL de agua desionizada. Esterilizar en
autoclave a 121 C por 15 minutos. Enfriar hasta temperatura ambiente y aadir 100
mL de una solucin de L-pirrolidonil--naftilamida al 0,01 % por filtracin. Dispensar
0,2 mL de medio en tubos estriles.

El medio debe tener el pH 7,8 0,2, debe ser de color amarillo y estar transparente.

20

Preparacin de la solucin de L-pirrolidonil--naftilamida al 0,01 %
Aadir 0,01 g de L-pirrolidonil--naftilamida en 100 mL de agua desionizada.

Preparacin de la Solucin del Reactivo p-dimetilaminocinaldehdo para revelar la
prueba PYR
Aadir 0,01 g de p-dimetilaminocinaldehdo en 100 mL de agua desionizada.

Mtodo de empleo:

Con un asa estril pique una colonia de inters e inocule el Caldo PYR, incube a
35 C durante 4 horas. Posteriormente adicione una gota del reactivo p-
dimetilaminocincaldehdo al 0,01 % y observe el cambio de color. La reaccin debe
leerse despus de transcurrir 1 minuto de la adicin del reactivo. Si se observa un
color rojo intenso tras la adicin del reactivo revelador, la prueba ser positiva. Si
aparece un color amarillo o anaranjado, la prueba se considera negativa.


4. Prueba de Bilis-esculina para la identificacin de Enterococcus.

Fundamento: La prueba de bilis-esculina se basa en la habilidad que tienen ciertas
bacterias de hidrolizar la esculina en presencia de un 40 % de bilis. Esta prueba se
utiliza en la identificacin presuntiva de las especies pertenecientes al gnero
Enterococcus as como tambin para Streptococcus pertenecientes al grupo D,
especficamente S. bovis.
La hidrlisis de la esculina puede demostrarse de dos maneras. El mtodo usual se
desarrolla en placas o en tubos de plano inclinado que contienen el Medio Bilis-
Esculina. El glicsido de esculina presente en el medio contiene molculas de
aglicona 6,7 dihidroxicumarina y glucosa. Esta molcula es fluorescente bajo luz
ultravioleta. Producto de la hidrlisis se libera la molcula de aglicona que reacciona
con el in frrico presente en las sales de hierro contenidas en el medio y se produce
una coloracin carmelitosa, indicando una prueba positiva. Generalmente el
resultado est a las 24 horas de incubacin pero algunas cepas pueden requerir 48
horas para mostrar un resultado positivo (Barrow and Feltham, 1993; Koneman et al.,
1994). Adems, se puede confirmar la prdida de fluorescencia de la molcula de
esculina o la posible confusin de la fluorescencia por los pigmentos producidos por
los microorganismos.
De manera alternativa tambin se puede comprobar la utilizacin de la porcin de
glucosa liberada de la molcula de esculina por la produccin de cido o cido y gas
de los organismos (Barrow and Feltham, 1993).

21

Procedimiento
Estriar una colonia aislada del organismo en estudio sobre placas o tubos en pico de
flauta del medio Agar Bilis-Esculina. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Interpretacin
La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo
marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa.

Observaciones:
- La colonias a ensayar pueden ser analizadas nicamente si estn separadas
por lo menos en 5 mm a su alrededor de otras colonias o si se toman de
cultivo puro.


22

Anexo C. Diagrama de flujo para la determinacin de Enterococcus en muestras de aguas.

Muestra de agua
Tome en un contenedor estril muestras con el volumen a filtrar
Realice enjuague del filtro con el agua para diluciones tamponada estril (20 mL)
Filtre el volumen de la muestra (tenga en cuenta el acpite 9.1.1 y 9.1.2)
Realice el enjuague posterior (20 mL)
Coloque la membrana filtrante en el medio m-CromoCen ENT.
Incube las placas a 35 2 C durante 18-24 horas
Identifique las colonias de Enterococcus (colonias de pequeo tamao (0,5-1 mm de ), de color
rosado claro a oscuro)
Ejecute, de ser necesaria la confirmacin de las colonias sospechosas de Enterococcus con la prueba
PYR y/o la prueba de Bilis-esculina.
Reporte los resultados.

































23
Anexo D. Ejemplos de reacciones tpicas de micororganismos diana





Enterococcus faecalis. Colonias rosadas


24