Вы находитесь на странице: 1из 0

MÉTODO CROMOGÉNICO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Salmonella spp. CON EL EMPLEO DEL MEDIO CROMOCEN SC EN MUESTRAS CLÍNICAS

1. INTRODUCCIÓN

CromoCen SC es un medio cromogénico para la detección, aislamiento, diferenciación y/o recuento de Salmonella (excepto S. Typhi) y coliformes totales de otras bacterias Gram-negativas.

El medio basa su funcionamiento en la combinación de una reacción cromogénica para detectar la actividad β-galactosidasa de los coliformes y una reacción bioquímica de degradación de fuentes de carbono por las Salmonella no pertenecientes al grupo typhi que produce una disminución del pH, con el consiguiente cambio de color del indicador incluido en la formulación. La combinación de bases nutritivas utilizadas permite el crecimiento adecuado de los microorganismos de interés, en presencia de inhibidores para los microorganismos Gram-positivos.

La utilización de un agente que proporciona opacidad, posibilita un mejor contraste de colores y mejor observación de las respuestas.

El método que se describe en este documento prevé el empleo del medio CromoCen SC para la identificación de Salmonella no Typhi, ni Paratyphi, en paralelo con otro medio selectivo complementario para la identificación de S. Typhi y S. Paratyphi (Agar S.S.).

2. INDICADORES DE DESEMPEÑO DEL MEDIO CROMOCEN SC

Sensibilidad para Salmonella no Typhi: 100% Especificidad para Salmonella no Typhi: 96,9% Exactitud para Salmonella no Typhi: 97,6%

Con el medio CromoCen SC, se logra una sensibilidad analítica de 10 -6 UFC/mL a partir de un inóculo estandarizado a 0,5 de la escala MacFarland.

*El número de tubo utilizado de la escala Mac Farland, será el equivalente a 3x10 8 UFC/mL, equivalente además al 50 % de transmitancia determinada mediante el espectrofotómetro.

3. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Manipule los microorganismos con extremo cuidado según los requisitos de Seguridad Biológica. Estos microorganismos se encuentran en el grupo de riesgo 2. En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente añada solución desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y manténgala sobre la superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la zona.

En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave rápidamente la zona con agua fresca y acuda al médico si es necesario. Use bata de laboratorio.

4. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD

1. Determinación de pH.

2. Evaluación microbiológica.

Ver anexo A

5. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Salmonella: Es un género de la familia Enterobacteriaceae (Brenner, 1984). Los miembros de esta familia son caracterizados como bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas. Presentan flagelos perítricos. Producen ácido y algunas veces gas a partir de glucosa, son usualmente catalasa positivos, oxidasa negativos y reducen nitratos a nitritos.

En este método Salmonella no perteneciente a las especies de S. Typhi y S. Paratyphi se definen como colonias de color rosado con diferentes intensidaes a rojo.

Detección de Salmonella: Determinación de la presencia o ausencia de Salmonella, en un volumen o masa determinado de producto.

6. ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO

Inocule en el Caldo Selenito (CS), u en otro caldo apropiado para enriquecimiento de Salmonella (Caldo Rappaport-Vassiliadis, o el medio modificado con la incorporación de peptona de soja, a partir de la muestra de coprocultivo o de otro origen.

Incube el Caldo Selenito a 35 ± 2 ºC durante 18 - 24h. (El Caldo Rappapot Vasiliadis

a

41,5 ± 1 ºC durante 18-24 horas).

7.

SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIÓN

A

partir de los cultivos anteriores, inocule los medios selectivos:

- CromoCen SC

- Agar S.S.

Incube el medio CromoCen SC a 35 ± 2 ºC durante 18-24 horas.

Incube el Agar S.S. a 35 ± 2 ºC durante 11-18 horas.

Identificación en el medio CromoCen SC.

El crecimiento típico de Salmonella (S. Typhimurium, S. cholerae-suis, S. Enteritidis, excepto S. Typhi) en el medio CromoCen SC son colonias de rosadas con diferentes intensidades a rojo.

Identificación en el medio Agar S.S.

El crecimiento típico de Salmonella en Agar S.S. modificado son colonias incoloras con o sin centro negro, mientras que Shigella se observa como colonias incoloras.

8.

REACCIONES ATÍPICAS

MICROORGANISMOS

INTERFERENTES,

OTROS

MICROORGANISMOS

Y

CromoCen SC Algunas cepas de Citrobacter sp. pueden dar colonias con coloración violeta rosáceo, de diferentes intensidades y una persona no entrenada o poco familiarizada con el desempeño del medio puede confundirlas con Salmonella.

Los coliformes, a excepción de Klebsiella y Citrobacter, se identifican como colonias verde azules de diferentes intensidades.

Klebsiella y Citrobacter se observan como colonias de color violeta de diferentes tonalidades.

Otros microorganismos Gram-negativos crecen como colonias incoloras o con coloración propia. Tal es el caso de algunas cepas de Shigella, que aparecen con coloración azul con bordes regulares o de color verde azul y bordes irregulares; algunas cepas de Pseudomonas y de Proteus crecen como colonias de color naranja, entre otros.

Agar SS

Las bacterias fermentadoras tardías desarrollarán colonias con centro rosa después de 48 h.

Cepas de Proteus y Citrobacter muestran también colonias transparentes con centros de color negro grisáceo

9. CONFIRMACIÓN DE IDENTIDAD

Confirme las colonias sospechosas de Salmonella, identificándolas con las pruebas bioquímicas y serológicas adecuadas.

10.

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Ver Anexo B

Base de Caldo Selenito (BCS) Selenito de sodio Caldo Rappaport-Vassiliadis con soya (CRVS) (Opcional) Base de Medio CromoCen SC Suplemento PLG Agar S.S. Caldo triptona soya Agar nutriente Agar tres azúcares y hierro (TSI) Agar urea (Christensen) Medio de descarboxilación de la L-lisina Medio SIM Reactivo para la detección de β- galactosidasa Reactivos para la reacción Voges-Proskauer Reactivo para la reacción de indol Agar nutriente semisólido Solución salina

11. SUEROS

Realice la identificación serológica con los antisueros disponibles a escala comercial. Estos sueros aglutinantes contienen anticuerpos mono o polivalentes anti-O, anti Vi, y otros contienen anticuerpos para uno o más factores H (sueros anti-H mono o polivalentes).

12. EQUIPAMIENTO, UTENSILIOS Y SUSTANCIAS ADICIONALES

Equipamiento y materiales

Autoclave Incubadora (capaz de operar a las temperaturas 35 ± 2 ºC ) Baño termostatado (capaz de operar a la temperatura de 41,5 ± 1 ºC o incubadora capaz de operar a la temperatura de 41,5 ± 1 ºC) Baño termostatado (capaz de operar a la temperatura de 44 a 47 ºC ) Agitador magnético Agitador de tubos Asa calibrada de 10 μL pHmetro con una exactitud en la calibración de ± 0,1 unidades de pH a 20 ºC – 25 ºC Pipetas graduadas o automáticas, de capacidades de 1 y 10 mL, graduadas en divisiones de 0,5 y 0,1 mL Placas Petri (90 x 10 mm Balanza técnica con presición de 0,1 g Refrigerador capaz de operar a 4 ± 1 °C

Portaobjetos de cristal estériles Lámpara para observar las reacciones serológicas Mechero de gas. Papel de pH (rango 6-8 pH) con graduaciones máximas de 0,4 unidades por cambio de color

13. MUESTRAS

Ver Anexo C.

La toma de muestras es uno de los pasos más importantes en el Laboratorio de Microbiología pues de ello depende el éxito de la identificación. Es responsabilidad del especialista asegurar la adecuada toma de muestras aunque en general se delega esta tarea al personal técnico. Las muestras recogidas incorrectamente pueden producir resultados dudosos y conllevan al empleo de agentes antimicrobianos innecesarios o erróneos.

El tamaño de la muestra debe ser el adecuado para realizar el examen microscópico y el cultivo. De ser posible, debe tomarse antes de iniciar la terapia antimicrobiana. Si no va a ser procesada de inmediato debe almacenarse en refrigeración a 4 °C y trasladarse al laboratorio en un medio de transporte adecuado (Medio Transporte de Stuart) que proporcione condiciones de pH y humedad.

Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daños o cambios en su composición y estado.

Tipos de muestras que se pueden analizar por este método: Coprocultivos, hemocultivos, o cualquier otro tipo donde se sospeche la presencia de Salmonella

Recoger heces por defecación espontánea o isopado rectal.

14. SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIÓN.

Ver el esquema del método en el Anexo D.

Siembre directamente con un asa la muestra sobre la superficie del medio CromoCen SC y en el medio Agar S.S. para obtener una respuesta más rápida.

Utilizando los cultivos procedentes del Caldo Selenito, inocule con la ayuda del asa la superficie de la placa de medio CromoCen SC y del Agar S.S., sembrando por estriado (agotamiento del inóculo) en las placas.

Realice tantas réplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo.

Incube las placas en posición invertida a 35 ± 2 ºC (CromoCen SC y Agar S.S.), agrúpelas en no más de 4 placas por columnas.

Con posterioridad a la incubación, examine las placas para determinar la presencia de colonias típicas de Salmonella y las atípicas (sospechosas) que pudieran considerarse Salmonella. (Ver Anexo E)

Identificación en el medio CROMOCEN SC

El crecimiento típico de Salmonella (typhimurium, cholerae-suis, enteritidis, excepto S. typhi), se expresa en colonias de rosadas con diferentes intensidades a rojas. En el caso de los coliformes, excepto Klebsiella y Citrobacter, son colonias de coloración azul-verdosa. Las colonias de Klebsiella y Citrobacter se observan de color violeta. Las colonias incoloras o con pigmentación propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio.

NOTA: Algunas cepas de Salmonella pueden mostrar una respuesta más tardía si provienen de la siembra directa, para lo cual las placas provenientes de la misma, que contengan colonias de color rosa claro, pueden ser incubadas hasta la confirmación de la aparición de la coloración característica de Salmonella que puede ser un período de hasta 48 horas.

Identificación en el medio Agar S.S.

El crecimiento típico de Salmonella en el medio Agar S.S. son colonias transparentes con centro de color negro.

Cepas de Proteus y Citrobacter muestran también colonias transparentes con centros de color negro grisáceo

15 CONFIRMACIÓN

Para la confirmación, tome una colonia considerada como típica o sospechosa de cada placa de cada medio selectivo. De resultar el aislamiento negativo, seleccione otras 4 colonias sospechosas.

Si una placa muestra menos de 5 colonias sospechosas, seleccione todas las típicas para la confirmación.

Estríe las colonias seleccionadas en la superficie del medio agar nutriente con la superficie previamente secada, de forma tal que permita el desarrollo de colonias bien aisladas.

Incube las placas por espacio de 24 ± 3 h a 37 ± 1 ºC .

Utilice cultivos puros tanto para las pruebas bioquímicas como para la serología.

15.1 Confirmación bioquímica Agar TSI (o agar hierro de Kligler) Agar urea Medio para descarboxilación de la lisina Voges-Proskauer Indol

15.1.1

Agar TSI

Estríe la superficie del agar inclinado y puncione el fondo. Incube durante 24 ± 3 h a 37 ± 1 ºC.

Interprete los cambios en el medio como sigue:

a) Fondo del tubo.

- amarillo

- rojo sin cambio

- negro

- burbujas o ruptura

glucosa positiva (utilización de glucosa)

glucosa negativa ( no utilización de glucosa)

formación de sulfuro de hidrógeno (H 2 S)

formación de gas de glucosa

b) Superficie de la pendiente del tubo.

- amarillo

- rojo sin cambio

lactosa y/o sacarosa positiva (utilización de lactosa y/o sacarosa)

lactosa y/o sacarosa negativa (no utilización de lactosa ni sacarosa)

Los cultivos puros de Salmonella muestran pendientes alcalinas (rojas) y fondos ácidos (amarillos), con formación de gas (burbujas) y (en cerca del 90 % de los casos) formación de sulfuro de hidrógeno (Ennegrecimiento del agar).

Cuando una Salmonella lactosa positiva es aislada, la pendiente del agar TSI es amarilla. La confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no se debe basar solo en los resultados del ensayo en el agar TSI.

15.1.2 Agar urea

Estríe la superficie del agar inclinado. Incube durante 24 ± 3 h a 37 ± 1 ºC y examine

a intervalos.

Si la reacción es positiva, la escisión de la urea, libera amonio que provoca un cambio de color del indicador rojo fenol hacia rosado – rosa y después a cereza. La reacción es frecuentemente apreciada después de 2 a 4 h.

15.1.3 Medio para descarboxilación de la lisina

Inocule justamente debajo de la superficie del medio líquido. Incube durante 24 ± 3 h

a 37 ± 1 ºC.

La turbiedad y el color púrpura después de la incubación indica una reacción positiva. El color amarillo indica una reacción negativa.

15.1.5 Voges-Proskauer

Suspenda una azada de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contiene 3 mL del medio VP. Incube durante 24 ± 3 h a 37 ± 1 ºC.

Después de la incubación, adicione 2 gotas de solución de creatina, 3 gotas de solución etanólica de 1 naftol y con posterioridad dos gotas de solución de hidróxido de potasio, agite después de adicionar cada reactivo.

La formación de un color rosa brillante en un intervalo de hasta 15 minutos indica una reacción positiva.

15.1.6 Indol

Inocule un tubo que contenga 5 mL de medio con triptona/ triptófano con la colonia sospechosa. Incube durante 24 ± 3 h a 37 ± 1 ºC.

Después de la incubación adicione 1 mL del reactivo Kovac.

La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. Un anillo amarillo - marrón indica una reacción negativa.

16.1.7 Interpretación de los resultados de las pruebas bioquímicas

La interpretación de los resultados de las pruebas bioquímicas aparece en la tabla 1.

Tabla 1 — Interpretación de las pruebas bioquímicas

   

Cepas de Salmonella

 

Ensayo a

S. Typhi

S. Paratyphi A

S. Paratyphi B

S. Paratyphi C

Otras cepas

Reacción

% b

Reacción

% b

Reacción

%

c

Reacción

% c

Reacción

% b

TSI ácido de glucosa TSI gas de glucosa

+

100

+ +

100

   

+

 

+

100

d

0

+ +

100

+

+

92

TSI ácido de lactosa TSI ácido de sacarosa TSI producción de H 2 S

-

2

100

- -

-

-

1

-

0

0

- -

-

-

1

+

97

10

- +

+

+

92

Hidrólisis de urea Descarboxilación de lisina Reacción de β-Galactosidasa

-

0

0

- -

-

-

1

+

98

0

- +

+

+

95

-

0

0

- -

-

-

Reacción de Voges-Proskauer

-

0

0

- -

-

-

2 e

0

Produción de indol

-

0

0

- -

-

-

1

3

From reference [4].

b

Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de los serotipos de Salmonella muestran reacciones marcadamente + o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de los serotipos de los serotipos que contaminan los alimentos de diferentes

orígenes.

c Estos porcentajes se desconocen en la bibliografía disponible.

 

d Salmonella Typhi es anaerogénica.

 

e

La subespecie arizonæ de Salmonella enterica muestra reacciones positiva o negativa a la lactosa pero es siempre β galactosidasa positiva. Para el estudio de estas cepas puede ser de utilidad ejecutar pruebas complementarias.

15.2 Confirmación serológica y serotipaje

Realice la detección de la presencia de antígenos O, Vi y H en Salmonella con los sueros apropiados, a partir de cultivos puros y después de haber eliminado las cepas autoaglutinantes. Utilice el antisuero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

15.2.1 Eliminación de las cepas autoaglutinantes

Coloque una gota de solución salina en un portaobjetos limpio. Disperse en la gota, con la ayuda del asa, parte de la colonia a analizar, hasta que obtenga una suspensión homogénea y turbia. Balancee el portaobjetos suavemente por un período de 30 a 60 segundos. Observe el resultado tomando un fondo oscuro y preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las bacterias se han agrupado en una o más unidades, entonces considere la cepa autoaglutinante, y no la someta a las pruebas de detección de antígenos.

15.2.2 Prueba para antígenos O

Utilice una colonia pura, no aglutinante, y proceda de igual manera que en el acápite anterior, utilizando una gota del antisuero O en lugar de solución salina. Si ocurre aglutinación, considere la reacción como positiva.

15.2.3 Prueba para antígenos Vi

Utilice una colonia pura, no aglutinante, y proceda de igual manera que en el acápite 15.2.1, utilizando una gota del antisuero Vi en lugar de solución salina. Si ocurre aglutinación, considere la reacción como positiva.

15.2.4 Prueba para antígenos H

Inocule el agar nutriente semisólido con una colonia pura no autoaglutinante. Incube el medio a 35±1 °C durante 18-24 horas. Utilice este cultivo para realizar la prueba para antígenos H. Proceda de igual manera que en el acápite 16.2.1, utilizando una gota del antisuero H en lugar de solución salina. Si ocurre aglutinación, considere la reacción como positiva.

16. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

De acuerdo con la interpretación de los resultados, indique la presencia o ausencia de Salmonella en la muestra.

18. BIBLIOGRAFÍA

1. Albarado Luzmila, Samper Ivonne y Guzmán Militza. Aeromonas sp. como agente causal de síndrome diarréico agudo en niños menores de 6 años de edad. 2005. ISSN 0075-5222 versión impresa.

2. Anuario estadístico de Salud, 2007. MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA DIRECCIÓN NACIONAL DE REGISTROS MÉDICOS Y ESTADÍSTICAS DE SALUD. Ciudad de la Habana. 2008. Acceso al sitio:

.pdf, en la fecha 2008.08.15.

3. Cabrera R, Ramírez M, Bravo L, García B, Fernández A, 1998. Serotipaje de los microorganismos pertenecientes al género Salmonella. Enf Infec Microbiol 18: 150–152.

4. Estevez Touzard M, Díaz González M, Monte Boada RJ, Toledo Rodríguez I, Ramón Bravo J, 1993. The infectious etiology of acute diarrheal diseases in the Republic of Cuba, 1991. Rev Cub Med Trop 45: 139–145.

5. Díaz Pérez, M., Durán Vila, A., Zhurbenko, R., Rodríguez Iglesias, I., Viera, D.R., Rodríguez Martínez, C. (2002). Utilidad de los medios cromogénicos y/o fluorogénicos CromoCen CC y CromoCen SC en el análisis de aguas residuales. Revista Latinoamericana de microbiología, Vol. 44, No. 4, Oct-Dic,

p. 425. Suplemento.

6. Dossier Salmonella. Coltura, identificazione, serotipificazione. Biolife. 2005.

Características clínicas de pacientes ingresados en UCIP con Enfermedad diarreica aguda por Salmonella "no tifoídica" (1990-1999). Instituto Superior de Medicina Militar: Dr. Luis Díaz Soto. Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos. Ciudad de La Habana. Revista Cubana de Medicina Intensiva y Emergencias 2005;4(4)

8. Dr. Pablo Aguiar Prieto, Dr. Arnaldo Castro Domínguez, Dr. Enrique Pérez, Dra. Gisele Coutin Marie, Dra. Telma Triana rodríguez, Dr. Rubén Hernández Ermus, Dra Elayne Rodríguez Dávila y Dra. Katiuska Fernández Jerez. Carga de la shigellosis en tres sitios centinelas de Cuba. Reporte Técnico de Vigilancia. Vol. 10, No 4 Julio-Agosto, 2005 ISSN 1028-4338.

9. Dra. Erenia Gámez Frómeta, Dra Alexis Sanchén Casas, Dr. Ubaldo del Risco Barrios, Lic. Raquel Idania Hernández Cisneros. Aislamiento de Plesiomonas shigelloide en pacientes con enfermedad diarréica aguda. Centro provincial de Higiene y Epidemiología Camagüey. Archivo Médico de Camagüey 2005; 9 (3) ISSN 1025-0255.

10. Dra. Margarita Ramírez, Dra. Neysi Vaaldés, Lic. Laura Bravo, Téc. Anabel Fernández y Téc. Nelsydeismi Castañeda. Perfíl plasmídico y resistencia antimicrobiana en cepas de Shigella aisladas en Cuba. Rev. Cubana de Medicina Tropical v.56 n.3 Ciudad de La Habana sep.-dic. 2004.

11. Dra. Nilda E. Herrera Valdés, Téc. María Elena Fuerte Calvo, My. María Elena Díaz García, Téc. Day Larrinaga, Téc Martha Sandoval Acosta y Dr. Mario Santiago Puga Torres. Meningoencefalitis letal por Salmonella B. Rev. Cub. Med. Mil. V.30 n.2 Ciudad de La Habana abr.-jun. 2001.

12. G. Prats Pastor, B. Mirelis Otero, C. Muñoz Batet y N. Rabella García. 1998. Indicaciones del coprocultivo. Aspectos prácticos. Servicio de Microbiología.

Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Universidad autónoma. Barcelona. Medicine 1998; 7(74) : 3456-3457. 13. Health Protection Agency (2008). Detection of Salmonella species. National Standard Method F-13 issue 3.1. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf sops.asp 14. I. Poilane, A. Collignon, 2006. Biodiagnóstico de las diarreas agudas bacterianas y virales. Acta Bioquím. Clín. Latinoam. v.40 n.3 La Plata jul./sep. 2006. Publicado por la Asociación Española de Farmacéuticos Analistas (AEFA) con autorización de la revista francesa Biologiste et Practicien. ISSN 0325-2957 versión impresa. 15. Informe anual. Unidad Nacional de Salud ambiental. Ministerio de Salud Pública. Cuba. 2003. 16. Kosek M, Bern C, Guerrant RL. The magnitude of the global problem of diarrheal disease from studies published 1992-2000. Bulletin of the World Health Organization 2003;81(3):197-204 17. My. Rigoberto Bravo Pérez, Dr. Mario Santiago Puga Torres, Cap. Dionys Barreiro Viera y Dr. Rafael Nodarse Hernández. Presentación de un caso atípico de fiebre tifoidea. 2002. Revista Cubana de Medicina Militar ISSN 0138-6557 v.7 n.1 Ciudad de La Habana ene.-mar. 2002. 18. Quesada Muñiz, V. de J., Rodríguez Martínez, C. (2001). Composition and method for detecting and early and differentiated counting of Gram-negative microorganisms. PCT. WO 01/81615 A1. 19. Quesada Muñiz, V. de J., Rodríguez Martínez, C. (2002). Composición y método para la detección y recuento diferenciado y temprano de organismos microscópicos Gram-negativos. Certificado de Autor No. 22808. Cuba. 20. Quesada Muñiz, V. de J., Rodríguez Martínez, C. (2002). Composición y método para la detección y el recuento temprano y diferenciado de organismos microscópicos Gram-negativos. Patente. No. Expediente PI- 20010060, No. Registro 4816, Guatemala. 21. Quesada Muñiz, V., Rodríguez Martínez, C., Tsoraeva, A. (2000). Medios de cultivo cromogénicos y fluorogénicos para el análisis de muestras de agua y alimentos. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 31, No. 1:25-28. 22. Roberto Cabrera, Joaquim Ruiz, Margarita Ramírez, Laura Bravo, Anabel Fernández, Ana Aladueña, Aurora Echeíta, Joaquim Gascón, Pedro L. Alonso, And Jordi Vila. Dissemination Of Salmonella Enterica Serotype Agona And Multidrug-Resistant Salmonella Enterica Serotype Typhimurium In Cuba. Am. J. Trop. Med. Hyg., 74(6), 2006, Pp. 1049-1053 23. Rodríguez Martínez, C., Quesada Muñiz, V. de J., Tsoraeva, A., Zhurbenko, R., Rodríguez Iglesias, I. (2002). Empleo de nuevos medios cromogénicos y fluorogénicos para el recuento y la identificación de microorganismos indicadores y detección de patógenos en alimentos. Revista Latinoamericana de microbiología, Vol. 44, No. 4, Oct-Dic, p. 471. Suplemento. 24. Rodríguez Martínez, C., Zhurbenko, R., Quesada Muñiz, V. de J. (2002). Resultados y perspectivas del desarrollo de medios de cultivo para el diagnóstico microbiológico. Revista Latinoamericana de microbiología, Vol. 44, No. 4, Oct-Dic, p. 470. Suplemento.

ANEXO A: Control de la calidad. Medio CromoCen SC.

Determinación del pH Condiciones de Seguridad:

Use la bata de laboratorio.

Equipos, Materiales y Materias Primas:

Equipos:

Balanza de precisión de 0,01 g

pH-metro

Licuadora eléctrica

Materiales:

Frasco cónico de 250 mL

Embudo de cristal de 120 mm de diámetro

Espátula de acero inoxidable

Papel de filtro neutro

Cilindro graduado de 100 mL

Pinzas con punta amiantada para vasos

Termómetro de 0-100°C (valor de división 1°)

Materias Primas:

Agua destilada o desionizada

Procedimiento:

a) Corte con una espátula el medio contenido de una o más placas y adiciónelo en el

vaso de la licuadora eléctrica. b) Añada un volumen de agua destilada o desionizada, medidos con el cilindro graduado, igual al volumen de medio contenido en la placa o en las placas tomadas

para el ensayo, en varias porciones para arrastrar en cada una de ellas los restos de medio que queden adheridos a las paredes de la placa.

c) Adicione todas estas porciones en la licuadora.

d) Homogeneice totalmente la mezcla en la licuadora durante 1 minuto, operando el

equipo según la instructiva del mismo, y filtre todo el contenido a través de un papel

de filtro neutro para filtración rápida colocado en un embudo.

e) Recoja el filtrado en un frasco cónico.

f) Enfríe el filtrado a una temperatura de 25 ± 2 °C y proceda a medir el pH en el

pHmetro. Opere el pHmetro según la instructiva del mismo.

g) Realice el procedimiento por triplicado para cada muestra.

h) Anote los resultados.

Cálculo e Interpretación de los Resultados:

Calcule la media entre los tres valores obtenidos.

Aproxime los resultados hasta la décima.

Criterios de aceptación El valor del pH debe ser 7,0 ± 0,2.

Anexo A (cont.). Control de la calidad del Medio CromoCen SC Evaluación microbiológica del Medio CromoCen SC

Condiciones de Seguridad:

Manipule los microorganismos con extremo cuidado según los requisitos de Seguridad Biológica.

En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente añada solución desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y manténgala sobre la superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la zona.

En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave rápidamente la zona con agua fresca y acuda al médico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:

Equipos:

Balanza técnica (precisión 0,01 g)

Incubadora de laboratorio

Microscopio óptico

Baño termostatado de laboratorio

Espectrofotómetro (opcional)

Materiales:

Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm

Asa y aguja de nicrom

Gradillas para tubos

Frascos cónicos de vidrio sin tapa de 250, 500 y 1 000 mL

Quemador de gas

Pipetas de 1 y 2 mL estériles

Portapipetas

Placas de Petri de (100 x 13) mm

Cilindros graduados de cristal de 100 mL

Lámina portaobjetos

Lámina cubreobjetos

Lápiz cristalográfico

Tubo 0,5 de la escala MacFarland (opcional)

Pinza de acero inoxidable

Materias Primas:

Alcohol al 70 % o fenol al 3 %

Medio de cultivo agar triptona soya en tubos, con agar en plano inclinado

Medio de cultivo, de referencia o control, semejante al que se evaluará

Cepas ATCC de referencia o control Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Citrobacter freundii ATCC 8090 y Enterococcus faecalis ATCC 29212

Algodón

Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado

Tubo con caldo triptona soya

Bata sanitaria

Botas cubrecalzado

Gorro

Agua destilada o desionizada

Reactivos para la tinción de Gram

Operaciones Preliminares:

a) Compruebe que se ha realizado la limpieza de la meseta y el cuarto según lo establecido, observando el registro correspondiente.

b) Prepare el inóculo según los siguientes pasos.

c) Partiendo de cuñas de los cultivos microbianos en conservación (refrigeración de 4 – 8

°C), siembre por estrías cada uno de los microorganismos de referencia en dos tubos de agar triptona soya con agar inclinado o en caldo triptona soya, de las bacterias a

ensayar.

d) Incube a 35 ± 2°C de 18 a 24 h para las bacterias.

e) Realice la Tinción de Gram, para comprobar la pureza del cultivo a sembrar.

f) La evaluación del medio se realizará a partir de inóculos estandarizados, ya sea a

partir del cultivo con 50 % de transmitancia en el espectrofotómetro, o del tubo

correspondiente a la escala 0,5 de MacFarland, para lo cual, estandarice el inóculo y prepare diluciones seriadas del mismo.

g) Rotule las placas que contienen el medio a evaluar.

Procedimiento:

Agrupe las placas rotuladas por microorganismo dentro del cuarto de siembra.

Inoculación del medio de cultivo Método de siembra por estriado en la superficie hasta obtener colonias aisladas.

Inoculación del medio de cultivo.

a) Utilice un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama. Con el dedo meñique y la

palma de la mano, quite el tapón o desenrosque la tapa del tubo que contiene el microorganismo a sembrar y manténgala sujeta con el dedo meñique, enfríe en las paredes del tubo el asa que tiene en esa misma mano y que contiene un cultivo puro o

una suspensión madre del microorganismo de prueba. Arrastre con el asa parte de la biomasa o una gota de la suspensión prueba, flamee la boca del tubo y enrosque la tapa que mantuvo sujeta con el dedo meñique. Deposite el tubo en una gradilla, manteniendo

el asa cargada en la mano y en la zona cercana al mechero. Este procedimiento puede

hacerse partiendo de una placa con un cultivo del microorganismo de prueba y tocando el

centro de una colonia aislada.

b) Tome la placa a ser inoculada al lado del mechero y comience a trazar líneas rectas en

zig-zag bien apretado a partir de un borde a otro de la placa, avanzando hacia el centro. Gire la placa en un ángulo de aproximadamente 70 a 90 grados y realice estriado entrecruzando los cuadrantes. En el último cuadrante realice un zig-zag menos frecuente,

o sea, con líneas más separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este

método puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el inóculo de partida está muy concentrado (colonia aislada o suspensión madre del microorganismo de prueba).

c) Realice la misma operación con el medio control utilizado.

Criterios de aceptación (tabla 1)

Tabla 1. Criterios de aceptación para el método de siembra por estriado en la superficie hasta obtener colonias aisladas

Microorganismo

Color y morfología de las colonias aisladas

Crecimiento a partir de la suspensión al 50 % de transmitancia

Salmonella Typhimurium ATCC

De rosada a roja, centro más oscuro y bordes más claros

Bueno

14028

Preparación de patrones de la escala MacFarland Condiciones de Seguridad:

Use bata de laboratorio.

Manipule con cuidado el ácido sulfúrico concentrado ya que puede causar quemaduras severas en los ojos y la piel.

Equipos, Materiales y Materias primas:

Equipos:

Estufa con circulación forzada de aire de 50 a 200 °C

Agitador magnético

Balanza de 0,01 g de precisión

Materiales:

Bulbos de vidrio 2R

Tapones de clorobutilo 13 mm

Sellos de aluminio de 13 mm

Matraz de un solo trazo de 100 mL

Frasco cónico de 250 mL

Espátula

Vaso para precipitado de 25 mL

Pipeta automática de 1 a 5 mL

Puntas para pipeta automática de 1 a 5 mL

Bandeja de acero inoxidable (160 x 270) mm

Barra magnética (40 x 8) mm

Selladora manual para bulbos 2R

Pipetas de vidrio graduadas de 1 mL y 10 mL

Materias primas:

Agua potable

Detergente industrial

Agua desionizada

Acido sulfúrico 98 % (p.a) (ρ=1,84 g/cm 3 )

Cloruro de bario dihidratado (p.a.)

Operaciones Preliminares:

Fregado de los bulbos y tapones.

a) Sumerja los bulbos y tapones en una solución de detergente.

b) Manténgalos en esta solución durante 15 min.

c) Saque los bulbos y tapones del detergente y enjuáguelos con suficiente agua

potable, hasta eliminar todo el detergente.

d) Enjuague los bulbos y tapones dos veces con agua desionizada.

e) Escúrralos y colóquelos en una bandeja de acero inoxidable.

f) Coloque la bandeja en una estufa con circulación forzada de aire y seque los

bulbos y tapones a 70 °C durante 2 h.

g) Una vez transcurrido el tiempo de secado, saque la bandeja de la estufa y deje

enfriar los bulbos y tapones hasta temperatura ambiente.

Preparación de la solución de ácido sulfúrico al 1 %.

a)

g/cm 3 ) y deposítelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL.

b) Complete el volumen con agua desionizada.

c) Homogeneice bien la solución, agitándola manualmente.

Tome con una pipeta graduada 0,55 mL de ácido sulfúrico (p.a.) al 98 %, (ρ=1,84

Preparación de la solución de cloruro de bario al 1 %.

a) Pese en una balanza de 0,01 g de precisión, con una espátula en un frasco cónico

de 250 mL, 1,17 g de cloruro de bario dihidratado. Opere el equipo según instructiva del mismo.

b) Añada agua desionizada hasta completar 100 g.

c) Homogeneice bien la solución, agitándola manualmente.

Procedimiento:

Preparación de la suspensión.

a) Endulce una pipeta graduada de 10 mL con la solución preparada en el apartado

3.2.

b) Endulce una pipeta graduada de 1 mL con la solución preparada en el apartado

3.3.

c) Mezcle en un frasco cónico de 250 mL los volúmenes deseados de soluciones

según las proporciones indicadas en la tabla 5. Según el patrón que se desea

preparar.

d) Agite durante 5 min.

Tabla 2. Proporciones de los reactivos para la preparación de la escala MacFarland

 

Escala de MacFarland

Tubo

H 2 SO 4 1 % (mL)

BaCl 2 1 % (mL)

0,5

9,95

0,05

1

9,9

0,1

2

9,8

0,2

3

9,7

0,3

4

9,6

0,4

5

9,5

0,5

6

9,4

0,6

7

9,3

0,7

8

9,2

0,8

9

9,1

0,9

10

9,0

1,0

Llenado de los bulbos.

a) Coloque el frasco cónico con la suspensión en el agitador magnético e introduzca

una barra magnética.

b) Comience a agitar a 500 r/min.

c) Gradúe la pipeta automática para 3 mL.

d) Coloque la punta en la pipeta automática.

e) Manteniendo en agitación la suspensión dispense en cada bulbo 3 mL de la misma con ayuda de la pipeta automática.

Tapado y sellado de los bulbos.

a) Coloque los tapones y los sellos de aluminio sobre los bulbos.

b) Tome los bulbos uno a uno, colóquelos fuera de la bandeja y vaya sellándolos con

la selladora manual para bulbos 2R.

Revisión.

a) Observe los bulbos individualmente a través de la luz y elimine los que tengan

partículas extrañas.

Rotulado.

a) Rotule los frascos con la etiqueta correspondiente.

Almacenamiento.

a) Almacénese en la oscuridad.

Preparación de las cepas de trabajo Condiciones de Seguridad:

Manipule los microorganismos con extremo cuidado según los requisitos de Seguridad Biológica.

En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente añada solución desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y manténgala sobre la superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la zona.

En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave rápidamente la zona con agua fresca y acuda al médico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:

Equipos:

Incubadora de laboratorio

Microscopio óptico

Espectrofotómetro

Agitador de tubos

Materiales:

Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm

Asa y aguja de nicrom

Gradillas para tubos

Quemador de gas

Pipetas de 1 y 2 mL estériles

Portapipetas

Lámina portaobjetos

Lápiz cristalográfico

Pinza de acero inoxidable

Materias Primas:

Alcohol al 70 % o fenol al 3 %

Algodón

Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado

Tubo con caldo triptona soya

Bata sanitaria

Botas cubrecalzado

Gorro

Agua destilada o desionizada

Reactivos para la tinción de Gram

Formaldehído al 37 %

Solución salina estéril

Agar para conteo en placas

Operaciones preliminares.

Preparación de la solución de formaldehído al 12 %

a) Vierta en un matraz de un solo trazo de 100 mL, 32,4 mL de formol al 37 %.

b) Complete el volumen con agua destilada o desionizada.

c) Homogeneice la preparación invirtiendo el frasco de 4 a 5 veces el matraz.

d) Trasvase el contenido a un frasco ámbar.

e) Rotule el frasco para identificar la solución.

Preparación del cultivo para su posterior estandarización Preparación del cultivo puro (18-24 horas)

a) Tome con un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama del quemador

parte de la biomasa del microorganismo procedente de una cuña de conservación

(Cepa certificada) e inocule en un tubo de vidrio que contenga un medio sólido de uso general en plano inclinado (Ej: agar triptona soya). Rotule el tubo con el nombre del microorganismo en cuestión. En caso de contar con una cepa salvaje proveniente de una muestra, tomar una colonia aislada y proceder de igual forma.

b) Incube el tubo inoculado en condiciones de tiempo y temperatura según los

requisitos del microorganismo. (Bacterias generalmente a 35 ± 2 °C).

c) Si desea comprobar la pureza del cultivo después de pasado el tiempo de

incubación realice una tinción de Gram.

Preparación de la suspensión

a) Tome el tubo de cultivo fresco y añada 5 mL de solución salina estéril.

b) Arrastre el cultivo del agar rotando el tubo con movimientos manuales,

manteniendo el tubo en posición horizontal.

c) Vierta la suspensión final a un tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca, estéril.

Rotule el nombre de la cepa y la fecha. (Tubo A).

d) Si desea compruebe la pureza del cultivo del tubo A realizando una Tinción de

Gram.

Preparación de la solución salina Pese 8,5 g de NaCl y adicione a 1 litro de agua destilada o desionizada.

Estandarización de la cepa al 50 ± 2 % de transmitancia utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm

a) Encienda el espectrofotómetro 30 min. antes de ser utilizado.

b) Ajuste el equipo a 0 y 100 de transmitancia.

c) Extraiga con una pipeta estéril de 1mL en condiciones asépticas 1mL del

contenido del tubo A y transfiéralo a un tubo de (150x20) mL con tapa de rosca, no necesariamente estéril en este caso, indicando el nombre de la cepa y rotulándolo

como tubo B.

d) Añada 1 mL de formaldehído al 12 % al tubo B.

e) Mantenga en contacto la suspensión de la cepa y el formaldehído de 15-30 min.

f) Agite el tubo B, añada de su contenido aproximadamente 8 mL al tubo de lectura

del equipo, colóquelo en el espectrofotómetro y observe el porcentaje de transmitancia que mide el equipo.

g) Si el porcentaje de transmitancia está por debajo del 50 %, añádale con cuidado

aproximadamente 1 mL ó menos de solución salina al 0,85 %. Anote en su libreta de

trabajo los volúmenes de solución salina que va añadiendo.

h) Repita la operación descrita en el apartado f.

i) Repita las operaciones descritas en los apartados g y h hasta alcanzar el 50 ± 2 % de transmitancia.

j) En caso de que el valor de la transmitancia exceda el 50 %, extraiga con una

pipeta estéril de 1 mL en condiciones asépticas 1 mL del contenido del tubo A y

transfiéralo al tubo B, añada 1 mL de formaldehído al 12 % y continúe la lectura después de haber transcurrido los 15 minutos.

k) Sume los volúmenes de solución salina al 0,85 % y de formaldehído incorporados

al mL de suspensión microbiana. Ejemplo:

1 mL de formaldehído + Σ mL de solución salina = X mL de solvente Entonces:

1 mL de suspensión microbiana + X mL de solvente (Formaldehído y solución salina) ~ 50%

Estandarización por turbiedad similar al tubo # 5 de MacFarland

a) Tome un tubo de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca que contenga

en su interior 9 mL solución salina, colóquelo en una gradilla para tubos y rotúlelo con el nombre del microorganismo, la fecha y las iniciales M.F# 5 que significa

MacFarland # 5 lo que corresponde aproximadamente a 3,0 × 10 8 células/mL.

b) Coloque el tubo A en la gradilla referida en el apartado anterior.

c) Tome el tubo # 5 de la escala de MacFarland y colóquelo en la gradilla.

d) Extraiga con una pipeta de 1 mL estéril en condiciones asépticas 0,5 mL del

contenido del tubo A y transfiéralo al tubo de (150x20) mm con tapa de rosca rotulado con M.F. # 5 hasta alcanzar una turbiedad al tubo # 5 de la escala de MacFarland.

Cuenta de viables de la suspensión estandarizada (Para determinar las Unidades Formadoras de Colonias (UFC)).

a) Prepare la suspensión microbiana estandarizada (Tubo A).

b) Coloque en una gradilla 10 tubos de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de

rosca, estéril. Rotule los tubos indicando el nombre del microorganismo y diluciones desde 10 -1 hasta 10 10 .

c) Adicione asépticamente 9 mL de solución salina estéril a cada tubo con una pipeta de 10 mL estéril y portapipetas automáticos si posee.

d) Agite el tubo A con un agitador vortex de tubos, si lo posee, o con la mano durante

5 segundos.

e) Tome 1 mL asépticamente con una pipeta de 1 mL estéril y portapipetas

automático, del tubo A y añádalo al tubo 10 -1 . Agite durante 2 ó 3 segundos.

f) Transfiera de igual forma, 1 mL del tubo 10 -1 al tubo 10 -2 . Agite. Repita esta

operación hasta el tubo marcado con 10 -10 .

g) Rotule 2 placas de Petri con el medio agar para conteo en placas según

corresponda por microorganismo y por dilución e identifíquelas con el nombre de la cepa, dilución y fecha de inoculación.

Inoculación

a) Agite la dilución 10 -5 durante 2 ó 3 segundos y tome 0,2 mL de la misma con una

pipeta de 1 mL estéril e inocule esta cantidad en cada una de las 2 placas que contienen el medio de cultivo.

b) Aplique rotación manual en forma de 8 a las placas.

c) Repita las operaciones a y b para todas las diluciones restantes hasta 10 -10 .

d) Deje reposar las placas con las tapas hacia arriba durante 15 minutos.

e) Incube las placas a la temperatura y el tiempo que se describe para el

microorganismo del ensayo. f) Si desea comprobar la pureza del inóculo a las placas incubadas realice Tinción de Gram después del tiempo de incubación.

Lectura de las placas

Cuente las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de las 2 placas sembradas. Haga un promedio y tome el valor promedio (de no obtenerse crecimiento en una de ellas, desechar el resultado de esa placa y solo tomar en cuenta el de la placa restante) y anótelo en el registro de cuentas de viables. Nota: Si en lugar de partir de la cepa estandarizada con el espectrofotómetro parte de la cepa estandarizada por MacFarland, realice los mismos pasos para hacer las diluciones pero partiendo del tubo que contiene la suspensión estandarizada al 0,5 de MacFarland. El resto de los pasos se realiza de la misma forma.

Se considerará válido el ensayo si:

a- En las diluciones de trabajo se encuentran las Unidades Formadoras de Colonias necesarias para realizar nuestro ensayo en al menos 1 placa (de 10 a 100 UFC).

b- No existe contaminación en las inoculaciones realizadas.

ANEXO B. Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos.

1. Caldo Selenito Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de materiales clínicos, especialmente heces.

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubación.

Composición.

Peptona de carne

5,0 g

Lactosa

4,0 g

Selenito de sodio

4,0 g

Fosfato hirógeno dipotásico

3,5 g

Fosfato dihidrógeno potásico

6,5 g

Agua

1000 mL

pH : 7.0 ± 0.2

Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta su disolución completa. Evite el calentamiento excesivo. No esterilizar en autoclave. Distribuir en tubos estériles un volumen no menor a 5 mL. Se recomienda guardar en refrigeración si no se usa de inmediato. Siembra -Materia fecal: a un tubo con 10-15 mL de caldo selenito, agregar 1-2 mL de una suspensión de materia fecal. -Tejido infectado: macerar 1-2 g de tejido en 10-15 mL de caldo selenito, usando una varilla estéril. -Orina: a un tubo con unos 5 mL de caldo selenito doble concentración, agregar igual volumen de orina.

Incubación A 35-37 °C, durante 16-24 horas, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos

Crecimiento

Salmonella Enteritidis ATCC 13076

Bueno

Salmonella Typhimurium ATCC 14028

Bueno

Otras recomendaciones:

-Se aconseja usar el medio el mismo día de la preparación. -No incubar el medio de cultivo sembrado por más de 24 horas, debido a que el efecto inhibitorio del selenito disminuye luego de las primeras 6-12 horas de incubación, y además porque no es favorable para la mayoría de las cepas de Salmonella, que pueden no recuperarse.

-La única ventaja de incubar durante 48 horas es el incremento de la recuperación de Salmonella Pullorum.

2. Medio Caldo Rappaport-Vassiliadis con soya (CRVS) (Opcional)

Solución A

Composición.

Digerido enzimático de soya

5,0 g

Cloruro de sodio (NaCl)

8,0 g

Dihidrógenofosfato de potasio (KH 2 PO 4 )

1,4 g

Dipotasiohidrógenofosfato (K 2 HPO 4 )

0,2 g

Agua

1000 mL

Preparación. Disuelva los componentes calentando cerca de los 70 ºC de ser necesario. Prepare esta solución el día de la elaboración del medio CRVS completo.

Solución B

Composición

Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 2 . 6H 2 O)

400 g

Agua

1000 mL

Preparación.

Disuelva el cloruro de magnesio en agua.

Al ser esta sal muy higroscópica, es recomendable que disuelva el contenido completo de un frasco de MgCl 2 . 6H 2 O de un frasco nuevo, de acuerdo con la fórmula. Por ejemplo, 250 g de MgCl 2 . 6H 2 O, añádalos a 625 mL de agua, dando una solución de volumen total de 788 mL con concentración de 31,7 g por 100 mL de MgCl 2 . 6H 2 O.

Conserve la solución en frasco ámbar bien cerrado a temperatura ambiente y con tiempo límite de vencimiento de 2 años.

Solución C

Composición

Oxalato de verde malaquita

0,4 g

Agua

100 mL

Preparación.

Disuelva el oxalato de verde malaquita en el agua. Conserve la solución en frasco ámbar a temperatura ambiente hasta 8 meses.

Medio completo.

Composición.

Solución A

1000 mL

Solución B

100 mL

Solución C

10 mL

Preparación.

Añada a los 1000 mL de solución A, 100 mL de solución B y 10 mL de solución C.

Ajuste pH de ser necesario, el cual debe encontrarse después de la esterilización en 5,2 ± 0,2. Antes de su uso, dispense en los tubos un volumen de 10 mL. Esterilice durante 15 min a una temperatura de 115 ºC. Almacene el medio preparado a 3 ± 2 ºC. Use el medio el día de su preparación.

La composición final del medio es:

Digerido enzimático de soya

 

4,5 g/L

Cloruro de sodio

7,2 g/L

Mezcla de fosfatos (KH 2 PO 4 + K 2 HPO 4 )

 

1,44 g/L

Cloruro

de

magnesio

anhidro

(MgCl 2 )

ó

Cloruro

de

13,4 g/L

magnesio hexahidratado (MgCl 2 . 6 H 2 O)

 

28,6 g/L

Oxalato de verde malaquita

 

0,036 g/L

3. Medio CromoCen SC

Medio base.

Composición.

Mezcla cromogénica Bases nutritivas Agar

pH 7,0 ± 0,2

Preparación.

5,4 g 11, 0 g 15, 0 g

Adicione el suplemento líquido PLG (cód. 4261) a 1 L de agua destilada o desionizada. Mezcle bien. Suspenda 31,4 g del medio base y agite suavemente. Caliente hasta ebullición repetidas veces, si fuera necesario, hasta la total fusión del agar. No caliente a temperaturas mayores de 100 ºC. Enfríe hasta 45 ºC. Dispense en placas Petri estériles, agite suavemente para homogeneizar.

Ajuste pH de ser necesario, para que después de la esterilización este se encuentre alrededor de 7,0 ± 0,2 a 25 ºC. Caliente con agitación frecuente hasta que el medio hierva y el agar se disuelva. No sobrecaliente.

4. Suplemento PLG

Reactivo: propilenglicol

Determinación de las características organolépticas Se ejecuta por simple evaluación visual.

Criterios de aceptación El reactivo debe ser incoloro, transparente, sin presencia de partículas.

5. Agar S.S. Modificado

Medio diferencial y selectivo idóneo para el aislamiento de Shigella y Salmonella.

El Agar S.S. Modificado. como lo indica su nombre, responde a una variante del medio original, en el cual se disminuye el contenido de las sales biliares, se varía la composición de las bases nutritivas y se aumenta el pH del medio, todo esto para lograra un crecimiento más abundante de Shigella.

Composición.

Proteosa Peptona

5,0 g

Extracto nutritivo

2,0 g

Extracto de levadura

3,5 g

Lactosa

10,0 g

Sales biliares

5,5 g

Citrato de sodio

2,5 g

Tiosulfato de sodio

10,0 g

Citrato férrico amónico

1,5 g

Verde brillante

0,00033 g

Rojo neutro

0,025 g

Agar

12,0 g

pH l: 7,3

± 0,2

Suspender 52 g en 1 L de agua destilada o desionizada, hervir hasta disolución completa, mezclar bien y distribuir. Evitar cualquier sobrecalentamiento. No esterilizar en autoclave. Preparación de las placas de agar S.S. modificado

Transfiera alrededor de 8 mL del medio fundido a placas Petri estériles pequeñas. Inmediatamente antes de su uso, proceda a secar las placas en el horno con temperatura entre 37-55 ºC, por aproximadamente 30 minutos, hasta que la superficie del medio esté seca.

Almacene las placas por un período de 5 días a 3 ± 2 ºC protegidas de la luz.

Incubación A 35-37 °C, durante 18-24 horas, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri ATCC 12022 Enterococcus faecalis ATCC 29212

6. Agar nutriente.

Composición.

Crecimiento bueno bueno Inhibidoa escaso

Producción de H 2 S + - -

Peptona bacteriológica

5,0 g

Extracto nutritivo

1,0 g

Extracto de levadura

2.0 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Agar

15,0 g

Preparación.

Suspenda 28 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada o desionizada, hervir hasta disolución completa, esterilice a 121 ºC por 15 min y distribuya. Ajuste pH para que después de la esterilización este se encuentre entre 7,4 ± 0,2 a 25 ºC.

Preparación de las placas de agar nutriente.

Transfiera alrededor de 8 mL del medio fundido a placas Petri estériles pequeñas. Inmediatamente antes de su uso, proceda a secar las placas en el horno con temperatura entre 37-55 ºC, por aproximadamente 30 minutos, hasta que la superficie del medio esté seca.

Almacene las placas por un período de 5 días a 3 ± 2 ºC protegidas de la luz.

Prepare el medio en tubos, si lo desea, dispensándolo a una altura de aproximadamente 4 cm. Inclínelo y deje solidificar.

7.

Agar tres azúcares y hierro (TSI)

Composición

Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro de sodio (NaCl) Lactosa Sucrosa Glucosa Citrato de hierro (III) Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua

3,0 g 3,0 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 1,0 g 0,3 g 0,3 g 0,024 g 9 g a 18 g 1 ) 1 000 ml

Preparación

Disolver los componentes o el medio deshidratado completo en agua, calentando de ser necesario.

Ajuste pH de ser necesario, de modo que después de la esterilización tenga un valor

de 7,4 ± 0,2 a 25 °C.

Dispense el medio en tubos una cantidad de aproximadamente 5 mL.

Esterilice durante 15 min. en autoclave a 121 °C.

Deje solidificar inclinados los tubos de manera tal que la base del medio tenga una

profundidad entre 2,5 cm a 5 cm.

8. Base de caldo urea

Composición.

Peptona bacteriológica

1,0 g

Dextrosa

1,0 g

Fosfato mopotásico

0,8 g

Fosfato disódico

1,2 g

Cloruro de sodio

15,0 g

Rojo fenol

0,004 g

Preparación.

Suspender 0,9 g en 95 mL de agua destilada o desionizada, mezclar bien, esterilizar 115 ºC por 20 min, enfriar a 50 ºC y adicionar asépticamente 5 mL de una solución de urea estéril al 40 %. Mezclar bien y distribuir un volumen de 5 mL en tubos estériles.

9. Medio para descarboxilación de L-lisina

Composición

L-Lisina monohidrocloruro Extracto de levadura Glucosa Púrpura de bromocresol Agua

5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1 000 ml

Preparación

Disolver los componentes en agua, calentando de ser necesario.

Ajuste pH, de ser necesario, de modo que después de la esterilización se encuentre

en un valor de 6,8 ± 0,2 a 25 °C.

Transfiera el medio en cantidades de 2 mL a 5 mL.

Esterilice durante 15 min en autoclave a 121 °C.

10. Medio SIM

Composición.

Hidrolizado enzimático de casína

20,0 g

Peptona bacteriológica

6,1 g

Tiosulfato de sodio

0,2 g

Sulfato amónico ferroso

0,2 g

Agar

3,5 g

Preparación.

Suspender 30 g en 1 L de agua destilada o desionizada, hervir hasta disolución completa, distribuir en tubos y esterilizar a 121 ºC por 15 min.

11. Reactivo de Kovac

Composición.

Alcohol amílico, isoamílico o butílico

5,0 mL

p - dimetilbenzaldehído

5 mg

HCL concentrado

25 mL

12.

Solución salina fisiológica

Composición.

Cloruro de sodio

8,5 g

Agua

1 000 mL

Preparación.

Disolver el cloruro de sodio en agua. Ajustar pH, de ser necesario, de modo que después de la esterilización se encuentre en un valor de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Dispense de 90 mL a 100 mL de la solución en tubos ante de esterilizar. Esterilizar a 121 ºC por 15 min.

ANEXO C: Procesamiento de muestras clínicas

Los procedimientos que se describen a continuación son tomados de: Lic. Eric Caballero J. MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGIA CLINICA. Consultado en: www.monografias.com.

1. HEMOCULTIVOS:

Desinfecte el tapón de caucho del frasco de hemocultivos con alcohol etílico al 70%. No utilice solución de yodo para limpiar el caucho.

Asépticamente desinfecte el sitio de la venopunción con alcohol etílico al 70% y luego con una preparación de yodo en círculos concéntricos hacia fuera del sitio elegido. Espere que el yodo seque y realice la punción sin palpar de nuevo.

Coleccione la muestra de sangre a razón de 0.5 – 2 ml para niños y 5-10 ml para adultos en cada frasco. El volumen de sangre a cultivar es el factor más importante en la recuperación del microorganismo.

Cada frasco debe ser servido con una punción diferente en diferentes tiempos, a menos que utilice a la vez frascos para organismos aeróbicos y anaeróbicos. Nunca llenar todos los frascos con sangre provenientes de una sola punción.

No tomar sangre del catéter, a menos que se esté realizando un estudio epidemiológico.

Siembre la muestra de sangre en caldo triptona soya (u otro medio líquido de propósito general). En paralelo, inocule una placa de agar chocolate y CromoCen SC.

Incube el ATS inoculado por 6-18 h a una temperatura de 35 ± 2 ºC y las placas de

agar chocolate y CromoCen SC a 35 respectivamente.

durante 12-24 h y 18-24 h

±

2

ºC

2. HECES :

Coloque la muestra dentro de un envase limpio, con cierre hermético y no necesariamente estéril. No solicite frotis por Gram.

No cultive si la muestra es dura o bien formada.

No se recomienda el uso de Culturette, salvo para infantes y pacientes con diarrea activa. Si lo utiliza, recolecte más de 2 g de muestra.

ANEXO D. Diagrama del método para la determinación de Salmonella en coprocultivos

Muestra de heces fecales

de Salmonella en coprocultivos Muestra de heces fecales CromoCen SC A gar S.S mod. Incubar (18

CromoCen SC

Agar S.S mod.

Incubar

(18 - 24 h a 35 ± 2 ºC)

Kliger, LIA

24

– 48 h

24 – 48 h
 

Urea

 

3 h

  3 h

Sist. ident.

18

– 24 h

18 – 24 h

Serología

  3 h Sist. ident. 18 – 24 h Serología Caldo Selenito Incubar (8 - 12

Caldo Selenito

Incubar (8 - 12 h a 35 ± 2 ºC) 24 h Agar S.S mod.
Incubar
(8 - 12 h a 35 ± 2 ºC)
24 h
Agar S.S mod.
CromoCen SC
ident. 18 – 24 h Serología Caldo Selenito Incubar (8 - 12 h a 35 ±

Anexo E. Algunos ejemplos de respuestas típicas y atípicas de los microorganismos diana y otros microorganismos

de los microorganismos diana y otros microorganismos Fig. 1. Salmonella Typhimurium en el medio CromoCen SC.
de los microorganismos diana y otros microorganismos Fig. 1. Salmonella Typhimurium en el medio CromoCen SC.
de los microorganismos diana y otros microorganismos Fig. 1. Salmonella Typhimurium en el medio CromoCen SC.

Fig. 1. Salmonella Typhimurium en el medio CromoCen SC.

el

medio CromoCen SC.

Fig.

2.

E. coli

en

Fig. freundii en el medio CromoCen SC. 3. Citrobacter Fig. 4. Klebsiella pneumoniae en el
Fig. freundii en el medio CromoCen SC. 3. Citrobacter Fig. 4. Klebsiella pneumoniae en el
Fig. freundii en el medio CromoCen SC. 3. Citrobacter Fig. 4. Klebsiella pneumoniae en el

Fig.

freundii en el medio CromoCen SC.

3.

Citrobacter

Fig.

4.

Klebsiella

pneumoniae

en el

medio CromoCen SC.

Fig. 5. Shigella sonnei en el medio CromoCen SC (violetas bordes muy irregulares) Shigella
Fig. 5. Shigella sonnei en el medio CromoCen SC (violetas bordes muy irregulares) Shigella

Fig.

5.

Shigella

sonnei en

el

medio

CromoCen

SC

(violetas bordes muy irregulares)

Shigella

flexneri en el medio

CromoCen SC (violetas bordes muy irregulares)

Fig.

6.

Fig. 7. Salmonella Typhi en el medio CromoCen SC Fig. 8. Pseudomonas aeruginosa en el
Fig. 7. Salmonella Typhi en el medio CromoCen SC Fig. 8. Pseudomonas aeruginosa en el
Fig. 7. Salmonella Typhi en el medio CromoCen SC Fig. 8. Pseudomonas aeruginosa en el

Fig.

7.

Salmonella

Typhi

en

el

medio

CromoCen SC

Fig. 8. Pseudomonas aeruginosa en el medio CromoCen SC

Enterobacter
Enterobacter

de

microorganismos en

Fig.

9.

Mezcla

Citrobacter
Citrobacter

el

medio CromoCen

SC.

Salmonella

Typhimurium

Fig. 10. Mezcla de microorganismos en el medio CromoCen SC. E. coli Citrobacter
Fig.
10.
Mezcla
de
microorganismos en
el
medio
CromoCen
SC.
E. coli
Citrobacter
de microorganismos en Fig. 11. Mezcla el medio CromoCen SC. Salmonella Typhimurium Pseudomonas
de microorganismos en Fig. 11. Mezcla el medio CromoCen SC. Salmonella Typhimurium Pseudomonas
de microorganismos en Fig. 11. Mezcla el medio CromoCen SC. Salmonella Typhimurium Pseudomonas

de

microorganismos en

Fig.

11.

Mezcla

el

medio

CromoCen

SC.

Salmonella

Typhimurium

Salmonella Typhimurium Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas

aeruginosa

Salmonella Typhimurium Pseudomonas aeruginosa Fig. 12. Mezcla de microorganismos en el medio
Salmonella Typhimurium Pseudomonas aeruginosa Fig. 12. Mezcla de microorganismos en el medio
Fig. 12. Mezcla de microorganismos en el medio CromoCen SC. Salmonella Typhimurium Citrobacter
Fig.
12.
Mezcla
de
microorganismos en
el
medio
CromoCen
SC.
Salmonella
Typhimurium
Citrobacter