ZOOLOG IA

LA SEDA COMO BIOMATERIAL EN MEDICINA REGENERATIVA

Jos e Luis Cenis
Instituto Murciano de Investigaci on y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA) E-mail: josel.cenis@carm.es

Los grandes avances producidos en la ultima d ecada mediante la aplicaci on de las herramientas de la biolog a molecular y celular han hecho posible el desarrollo de nuevos conceptos terap euticos en biomedicina, que han abierto nuevos campos como son la Medicina Regenerativa y la Ingenier a de Tejidos. Estos conceptos se basan en la posibilidad real de aislar c elulas troncales (stem cells) indiferenciadas, desarrollarlas en soportes (scaffolds) adecuados y favorecer su diferenciaci on a diversos tejidos mediante la acci on de factores de crecimiento celular espec cos. Ello abre la posibilidad de producir tejidos humanos nuevos capaces de reemplazar a tejidos lesionados, evitando el riesgo de rechazo del sistema inmune. El componente principal de la Medicina Regenerativa es sin duda el conocimiento detallado de la biolog a y manejo de las c elulas troncales. Estas investigaciones han captado la atenci on del publico y tienen un gran perl mediatico. Sin embargo, hay otro componente de la ingenier a de tejidos mucho menos conocido como son los biomateriales en los que esas c elulas han de crecer, diferenciarse e integrarse en los lugares adecuados del organismo receptor. Las caracter sticas de estos materiales tienen una in xito del proceso. uencia decisiva en el e Afortunadamente se dispone de una gran variedad de biomateriales adecuados para estas aplicaciones. Gran parte de ellos son sint eticos (biopol meros, ceramicas, biovidrio, etc.) en tanto que otros son de origen natural (colageno, alginatos, etc). Curiosamen te, desde hace unos anos, uno de los materiales mas mosantiguos producidos por la humanidad se esta trando como uno de los biomateriales de mayor calidad y potencial para ingenier a de tejidos. Se trata de la seda. La aplicaci on de la seda como biomaterial, a trav es de su uso en suturas quirurgicas, fue temprana, y data del siglo XIII. Sin embargo, los nuevos conocimientos adquiridos sobre las propiedades y estructura de este producto, han abierto su uso a nuevas aplicaciones que vamos a tratar brevemente en este trabajo.

minios amorfos y otros de lamina beta. Constituye el 70 % del peso del capullo. La otra prote na es la sericina, hidrosoluble y de estructura globular, que mantiene unidos los lamentos de bro na. La sericina es normalmente desechada en el proceso textil, aunque tiene diversas aplicaciones en medicina y cosm etica. La bro na en cambio, presenta caracter sticas que la hacen muy interesante como biomaterial: a) Es un material de naturaleza proteica, altamente biocompatible. No se verica rechazo ni respuesta inamatoria en los tejidos donde se injerta. El rechazo ocasional que se ha reportado con algunas suturas, se atribuye a la contaminaci on de la bro na con sericina (11). b) Presenta una gran resistencia mecanica a tracci on, junto a una gran exiblilidad. lento que c) Es biodegradable, pero a un ritmo mas en otros biomateriales organicos, lo que permite una mejor consolidaci on de los tejidos. En dos anos se reabsorbe totalmente y no se encuentran rastros de la misma en los tejidos (1). d) Puede elaborarse en diferentes conguraciones, las necesidades: geles, lms, matrices posegun rosas 3D, microbras y microesferas. e) Su producci on es sencilla, y sostenible. La cr a del gusano de seda es sencilla y de bajo coste, si se dispone de moreras, y la elaboraci on de los materiales se hace predominantemente en medio acuoso con t ecnicas relativamente simples. f) Presenta la interesante propiedad de tener una supercie altamente reactiva. Su supercie presenta grupos carboxilo terminal a los que se pueden unir de forma covalente p eptidos tales como el motivo RGD (8), hormonas, tales como la PTH (8), y factores de crecimiento, tales como la BMP-2 (bone morphogenetic protein-2) (4, 5, 7). Estas prote nas favorecen de forma muy signicativa tanto la adhesi on como el desarrollo de los cultivos celulares implantados sobre la matriz.

Estructura y cualidades de la seda como biomaterial

La seda, es segregada por las glandulas seric genas del gusano de seda (Bombyx mori L.), que la utiliza para elaborar el capullo, una estructura cerrada de protecci on en la que realiza la metamorfosis de larva a adulto. Tal como es segregado el hilo de seda, que es cont nuo y puede medir hasta 1.500 metros, consta de dos prote nas. Una de ellas es la bro na, que es una prote na polim erica y lineal, que alterna do-

de la Presentaciones y elaboracion seda como biomaterial

Una de las ventajas de la bro na de la seda como biomaterial es la gran versatilidad de sus presentaciones junto con su facilidad de fabricaci on. El punto de partida para la utilizaci on de la seda como biomaterial, al igual que se hace para su utilizaci on en la

EUBACTERIA 19

ZOOLOG IA
industria textil, es la eliminaci on de la sericina. Ello se hace mediante ebullici on en una soluci on jabonosa, o en carbonato s odico. Tras un ltrado, se obtiene una madeja de textura similar al algod on, constituida en su totalidad por bro na. La bro na es insoluble en agua y los disolventes habituales, y se solubiliza unicamente en bromuro de litio concentrado o en una mezcla de cloruro calcico y etanol. Una vez solubilizada, la soluci on se dializa y se obtiene as una soluci on acuosa de bo na regenerada a partir de la cual se fabrican las diversas presentaciones. sencilla de la bro La presentaci on mas na es en forma de lm y recubrimientos de otros materiales. Para ello, se parte de una soluci on acuosa de bro na al 10 %, que se vierte en un molde o supercie adecuada y se deja evaporar. Posteriormente, se trata con una soluci on de metanol, que induce la transici on de una estructura proteica parcialmente amorfa a una estructura totalmente cristalina e insoluble. Este lm puede actuar tambi en como recubrimiento de otros biomateriales (poliuretanos, policaprolactonas, etc.) o actuar combinado en diversas mezclas con dichos biomateriales (celulosa, polietileno, colageno, etc.). El efecto obtenido es una mejora de las cualidades de los materiales por separado. Por ejemplo, el recubrimiento con bro na de una matriz de policarbonatouretano favorece la adhesi on y el crecimiento de broblastos en el mismo por un factor de 2.5 veces, respecto al material no recubiertos (2). Por otra parte, el lm de bro na ha demostrado un efecto positivo muy signicativo en la regeneraci on de piel. Usado como vendaje en dermatotom as, el lm de bro na produ ce una mayor regeneraci on del colageno y menor reacci on inamatoria, que se traduce en tiempos de cica cortos con respecto a los materiales hatrizaci on mas bitualmente empleados (9). Una propiedad muy importante de los lms de bro na es que su supercie presenta una gran variedad de residuos aminoac dicos que permiten la posibilidad de decorar su supercie con distintos tipos de ligandos y factores de crecimiento. A traves de una modicaci on qu mica con carbodiimidas, es posible obtener un aclopamiento covalente del motivo pept dico RGD, lo que favorece la adhesi on, proliferaci on y diferenciaci on de osteoblastos, broblastos y celulas estromales (8). Tambi en se ha demostrado que es posible decorar lm de bro na con BMP-2 unida al mismo mediante enlace covalente (4). En estas condiciones, la prote na se retiene en la supercie del lm durante un tiempo superior, en relaci on a la prote na que es simplemente adsorbida a la supercie. Ello se traduce en una mejora signicativa en la adhesi on y diferenciaci on de osteoblastos seo (4,5). en la formaci on de tejido o

Figura 1. Cilindro solido de matriz porosa tridimensional de bro na

Un segundo tipo de presentaci on de la bro na es en forma de matrices o armazones porosos tridimensionales (3D scaffolds, Figura 1). Estas matrices porosas se forman anadiendo granos de ClNa de una granulometr a conocida a una soluci on de bro na, de concentraci on entre el 4 y el 10 %. El efecto de la sal es el de captar el agua de la soluci on y crear huecos. Tras la evaporaci on del agua, tratamiento con metanol y el lavado de la sal el resultado es una estructura altamente porosa y esponjosa, con espacios del orden de 100 micras, muy adecuada para el crecimiento celular. Este tipo de matriz porosa se ha ensayado ampliamente, en combinaci on con la adici on de BMP-2, para seo y cart la regeneraci on de tejido o lago a partir de sea (5). En conc elulas mesenquimales de la m edula o junto, la conclusi on que se desprende de los trabajos realizados es que la matriz porosa de bro na constituye un medio muy adecuado para el crecimiento de c elulas mesenquimales, y la posibilidad adicional de decorar el material con factores de crecimiento se traduce en un crecimiento y diferenciaci on de dichas rapido c elulas signicativamente mas y eciente que el obtenido con materiales convencionales, tales como el colageno. Por otra parte, la bro na se biodegrada lenta que el colageno a una tasa mas (1), lo que supone que el nuevo tejido regenerado sobre la misma tiene un mejor soporte estructural en su proceso de formaci on.

20 EUBACTERIA

ZOOLOG IA
Por ultimo, la bro na tambi en puede presentarse en forma de microesferas (Figura 4) para la liberaci on controlada de farmacos. Este es un campo de un enorme inter es para la industria farmac eutica. A trav es del tratamiento de la bro na con metanol, es posible modular el grado de cristalinidad de la estructura proteica en lamina beta de la supercie, congurando la capacidad del material para retener y liberar de forma controlada enzimas y prote nas terap euticas. Normalmente se observa una pauta de liberaci on de las mismas caracterizada por una liberaci on inicial raoida seguida por una liberaci on lineal y progresiva a lo largo de un per odo prolongado (3).

Figura 2. Vista al microscopio de barrido del material anterior, donde se aprecia su estructura supercial. (Cortes a S. Hofman y L. Meinel, ETH, Zurich)

Un tercer tipo de presentaci on de la bro na son las esponjas de nanobras (Non-woven mats, Figura 3). En este caso, a trav es de un proceso conocido como electrohilado que consiste en pulverizar a presi on una soluci on de bro na sometida a un campo electri co (30 Kv) sobre un tambor metalico conectado a tie rra, se obtienen nanobras de bro na de un diametro comprendido entre 100 y 300 nan ometros. Estas nanobras, entrelazadas entre s , tienen una dimensi on y conguraci on muy similar a la de la matriz extracelular de los tejidos, y por tanto, constituyen un sustrato muy adecuado para el crecimiento de c elu se ha comprobado que el las humanas (6). Ademas, proceso de electrohilado no es tan agresivo como para degradar prote nas, por lo que incorporando BMP-2 y granulos de hidroxiapatito a la soluci on acuosa de bro na se produce un armaz on electrohilado activo y ptimo para el crecimiento y diferenciaci o on de c elulas seo (7). mesenquimales a tejido o

Figura 4. Vista al microscopio de barrido de una microesfera de bro na de seda. (Cortes a S. Hofman y L. Meinel, ETH, Zurich)

Aplicaciones de los biomateriales de seda

La versatilidad de la bro na como biomaterial la hace apta para cualquier tipo de aplicaci on en Ingenier a Tisular. Sin embargo, las aplicaciones que mas maduras y cercanas a su aplicaci estan on nal lo son en el campo de la regeneraci on de hueso, cart lago y ligamentos. En este sentido, una aplicaci on muy interesante es la reconstrucci on de ligamento cruzado de la rodilla mediante la elaboraci on de un cord on de bras de seda que posteriormente, se siembran con sea que se dic elulas mesenquimales de la m edula o ferencian a tejido de ligamento, ofreciendo una resis tencia mecanica muy superior a la de otros materia les organicos y una gran biocompatibilidad (1). Esta ya en fase comercial en Estados Uniaplicaci on esta a especializada en el dos, por parte de una compan desarrollo de biomateriales basados en bro na de se a tambi da (Serica, ). A trav es de esta compan en se dispone de hidrogeles y armazones de bro na utilizables en cirug a est etica y reconstructiva. Otras aplicaciones relacionadas con regeneraci on de t ejido seo y cart disponibles todav o lago no estan a, pero los buenos resultados descritos en la literatura cient ca (1, 4-9) invitan a pensar que su aplicaci on cl nica lejana. Otra de las areas no esta en las que se trabaja activamente es en regeneraci on axonal en tejido

Figura 3. Vista al microscopio de barrido de una red de microbras de bro na de seda obtenida mediante electrohilado. (Cortes a S. Hofman y L. Meinel, ETH, Zurich)

EUBACTERIA 21

ZOOLOG IA
nervioso. Ya se ha demostrado que la bro na es altamente biocompatible con tejido nervioso, y se han desarrollado construcciones de conguraci on tubular destinadas a guiar el crecimiento axonal de nervio perif erico, que a la vez liberan factores de crecimiento de nervio (NGF) para estimular dicho desarrollo (10). Aparte de las aplicaciones mencionadas, hay otras muchas en desarrollo en este momento, y otras muchas posibles que todav a no se han comenzado a explorar. La entrada de la bro na en el repertorio de armazones para crecimiento y diferenciaci on celular es relativamente reciente, alrededor de una d ecada, no se ha aprovechado todo su potenpor lo que aun cial. El desarrollo de este material ha sido liderado por el Departamento de Ingenier a Qu mica y Centro de Biotecnolog a, de la Tufts University (Medford, Massachussets, EE.UU), liderado por David Kaplan. Hay tambi en grupos de investigaci on muy productivos en este campo en Jap on, China y Corea. Por lo que respecta a Europa, destaca el grupo de Lorenz Meinel, en la Escuela Polit ecnica de Zurich (Suiza), y tambien hay grupos muy activos en diversas universidades de Alemania e Italia. Por lo que respecta a nuestro pa s, los estudios sobre la seda, en cualquiera de sus aspectos, son muy escasos, a pesar de la gran importancia que tuvo su producci on en siglos pasados. Que sepamos, unicamente el Departamento de Ciencia de Materiales de la ETSI de Caminos, Canales y Puertos de la UPM una l ha mantenido durante bastantes anos nea activa y competitiva de investigaci on sobre seda, en su revertiente de material estructural y resistente. Mas cientemente, desde hace tres anos, el Instituto Murciano de Investigaci on y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA) se ha incorporado al campo de la investigaci on sobre aprovechamientos biotecnol ogicos de la seda en el campo espec co de los biomateriales. Este inter es es l ogico y obligado, si se considera que las instalaciones del IMIDA constituyeron la Estaci on Seric cola de Murcia, fundada en 1892, y que fue el cen en todas las actividades retro de referencia espanol lacionadas con la producci on y elaboraci on de la seda. Esta actividad seric cola naliz o en 1976, cuando la competencia de la seda asiatica y las bras sint eticas expulsaron la seda espanola del mercado textil. El hacer una revisi on completa de este tema superar a el espacio permitido, por lo que puede obtenerse informaci on adicional consultando la revisi on reciente, de Wang et al. (11), que revisa 271 refemas rencias. En cualquier caso, la conclusi on que se extrae tras consultar la abundante bibliograf a sobre el tema es que la bro na de la seda ofrece una gran versatili dad en su presentaci on, resistencia mecanica, biocompatibilidad, y reactividad qu mica en la supercie que permite la adhesi on de todo tipo de mol eculas bioactivas. Todo ello lo convierte en un sustrato casi ideal para el crecimento y diferenciaci on de c elulas humanas. Por tanto, una vez realizados los ensayos cl nicos y los procesos de validaci on correspondientes, los biomateriales de bro na van a ser de gran utilidad en el campo de la Ingenier a Tisular.

Bibliograf a
1. Altman, G.H., D az, F., Jakuba, C., et al. (2003). Silk based biomaterials. Biomaterials 24: 401-416. 2. Chiarini, A., Petrini, P., Bozzini, D., et al. (2003). Silk broin/poly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth:in vitro interactions with human cells. Biomaterials 24: 789-799. 3. Hofmann, S., Wong Po Foo, CT., Rossetti, F., Textor, M., Meinel, L. (2006). Silk broin as an organic polymer for controlled drug delivery. Journal of Controlled Release 111: 219227. 4. Karageorgiu, V., Meinel, L., Hofmann, S., et al. (2004). Bone morphogenetic protein-2 decorated silk boin lms induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Matter. Res. 71: 528-537. 5. Karageorgiu, V., Tomkins, M., Fajardo, R., et al. (2006). Porous silk broin 3-D scaffolds for delivery of bone morphogenetic protein-2 in vitro and in vivo. J. Biomed. Mater. Res. 78: 324-334. 6. Kim, KH., Jeong, L., Park, HN., et al. (2005). Biological efcacy of silk broin nanober membranes for guided bone regeneration. J. Biotechnology 120: 327-339. 7. Li, C., Vepari, C., Jin, H-J., Kim, HJ., Kaplan, D. (2006). Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 27: 3115-3124. 8. Soa, S., McCarthy, MB., Gronowicz, G., Kaplan D. (2001). Functionalized silk-based biomaterials for bone formation. J. Biomed. Mater.Res. 54:139-148. 9. Sugihara, A., Sugiura, K., Morita, H., et al. (2000). Promotive effects of a silk lm on epidermal recovery from fullthickness skin wounds. Proc.Soc.Exp. Biol. Med. 225: 58-64. 10. Uebersax, L., Mattotti, M., Papaloizos, M., et al. (2007) Silk broin matrices for the controlled release of nerve growth factor (NGF). Biomaterials 28: 44494460. 11. Wang, Y., Kim, H-J., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. (2006). Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials 27: 6064-6082.

22 EUBACTERIA