SDS-PAGE Western Blot

INGENIERA GENTICA 2010
SDS-PAGE
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(SDS polyacrilamide-gel electrophoresis)
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Qu es electroforesis?
ANIONES (-) CATIONES (+)
+ NODO
CTODO
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La poliacrilamida posee ciertas caractersticas que la hacen til para ser usada en electroforesis: i) termo-estabilidad, ii) transparencia, iii) resistencia, iv) qumicamente inerte, v) se pueden preparar varios tamaos de poro, vi) resiste grandes gradientes de voltaje, vii) permite realizar varias tinciones de protenas, viii) se pueden extraer las protenas, ix) se puede secar
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Acrilamida. Autopolimeriza espontnea pero muy lentamente. En presencia de radicales libres, el proceso se ve acelerado. stos provienen del APS en presencia de TEMED. Los polmeros que se forman, sin embargo, slo forman una solucin viscosa porque las cadenas se deslizan una sobre otra. La bisacrilamida es capaz de unir cadenas de acrilamida entre s (crosslinker), llevando a la formacin de un gel.
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%T (densidad del gel) = (g acrilamida + g bisacrilamida) x 100 100 ml %C (entrecruzamiento) = g bisacrilamida x 100 (g acrilamida + g bisacrilamida)
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Sistema de geles verticales para SDS-PAGE
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El SDS (detergente inico) permite independizarse de la forma y la carga de las protenas. Al quedar desnaturalizadas, las protenas adquieren cargas negativas de una manera proporcional a su peso molecular.
Grupos cargados
+ -
H
+
+ H +
Regiones hidrofbicas
- -
- - - - - -
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Muestra
A esta se le aade un buffer que contiene SDS, b-Mercaptoetanol o DTT
Ambos son agentes reductores y se usan para i) terminar de desnaturalizar protenas con puentes disulfuro intracatenarios y ii) desarmar estructuras cuaternarias mantenidas por las mismas uniones
El buffer adems posee: glicerol y azul de bromofenol
La muestra se calienta a 95-100C por 3-5 min y est lista para ser sembrada en el gel
SDS-PAGE
Una vez que la muestra y el gel estn listos, se siembra en las calles y
se aplica voltaje para que las muestras migren

El sistema que usaremos es un gel discontinuo (el ms comnmente usado) que consiste en dos porciones de gel diferentes: Stacking gel y Resolving gel
Stacking gel
Resolving gel
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Tris-HCl pH 6,8
Tris-Glicina pH 8,3
Tris-HCl pH 8,8
+
El buffer de corrida (pH8,3) posee Tris-Glicina, mientras que el Stacking y el Resolving gel poseen buffer Tris-HCl pH 6,8 y pH 8,8 respectivamente. Al aplicar voltaje, los iones Cl- al igual que las protenas (cargadas negativamente), comienzan a migrar hacia el polo +
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+
En el stacking, los iones Cl- marcan el frente de corrida por su alta relacin q/m. El pH del stacking -6,8- desplaza levemente el
equilibrio de la glicina (pI6,1) hacia la forma cargada negativamente, haciendo que sta migre lentamente. De este modo se genera una zona de alta resistencia, localizada entre los iones Cl- y la glicina. Dado que las protenas no pueden migrar ms rpido que los iones Cl-, sumado a que se utiliza un porcentaje bajo de acrilamida (3-5%), las protenas tienden a apilarse en esta zona de baja conductancia.
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+
Una vez que llegan al gel resolvedor (pH 8,8), la glicina gana cargas negativas y el voltaje se hace homogneo a lo largo del gel. Desde aqu, el factor clave en la migracin de las protenas es el % de acrilamida y las protenas migran de acuerdo a su peso molecular
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O: Origen de siembra A: Stacking gel B: Resolving gel C: Interfase
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HOJA DE RUTA.
Gel discontinuo:
Stacking gel (concentracin de la muestra) Running gel (separacin)
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La resolucin va a depender del %T: 15%: 12 45 kDa
10%: 15 70 kDa
5%: 55 200 kDa
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Geles con gradiente de acrilamida
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Migracin de protenas en geles de SDS a distintas concentraciones de acrilamida (%T). Se muestra la migracin de nueve protenas que van desde 94 kDa 14,4 kDa.
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Visualizacin: tincin de protenas totales

Coomassie brillant blue
Nitrato de plata
Mtodo Coomassie R-250 Coomassie G-250 Plata Lmite de deteccin 50 - 100 ng 10 - 50 ng 1 - 10 ng
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Determinacin del peso molecular
- Se realiza un SDS-PAGE corriendo en paralelo protenas de PM conocido con la protena de tamao desconocido. - Se grafica la movilidad de los fragmentos conocidos en funcin del logaritmo de su PM (relacin lineal inversa). - Se interpola la movilidad del fragmento desconocido y as podemos determinar su PM.
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Algunas aplicaciones del SDS-PAGE

Evaluar los componentes de una muestra compleja (ej. lisado bacteriano) Determinacin del peso molecular Evaluacin de la eficiencia de un paso de purificacin
Evaluar la induccin de protenas recombinantes en un cultivo bacteriano

Primer paso de un Western Blot Segundo paso de una electroforesis en gel en 2D (el primer paso es un Isoelectroenfoque)
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En nuestro TP
Purificacin Armado de geles
GST
15 % (x 2)
GST-hnRNP K
8% (x 2)
GST-MDM2
6% (x 2)
SDS-PAGE Tincin con Coomassie brillant blue
Cuantificacin de las protenas
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GST
BSA: 100 ng/l
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GST-hnRNP K
BSA: 100 ng/l
SDS-PAGE
GST-MDM2
BSA: 100 ng/l
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Western Blot
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Western Blot (Immunoblotting)

Provee informacin acerca de la presencia, peso molecular y abundancia de un antgeno especfico por combinar la separacin de protenas por SDS-PAGE con el reconocimiento especfico de antgenos por anticuerpos. Ya que la electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, slo pueden utilizarse para WB anticuerpos que reconozcan la forma desnaturalizada del antgeno.
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Comparacin de protenas observadas por SDS-PAGE y WB sobre una misma muestra

SDS-PAGE Western Blot
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PASOS DE UN WESTERN BLOT:

1) SDS-PAGE
2) Transferencia a membrana
3) Bloqueo
4) Incubacin con anticuerpo primario 5) Incubacin con anticuerpo secundario 6) Deteccin
http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf
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HOJA DE RUTA
SDS-PAGE
1) SDS-PAGE
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HOJA DE RUTA.
Gel discontinuo:
Stacking gel (concentracin de la muestra) Running gel (separacin)
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%T (densidad del gel) = (g acrilamida + g bisacrilamida) x 100 100 ml %C (entrecruzamiento) = g bisacrilamida x 100 (g acrilamida + g bisacrilamida)
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2) Transferencia a membrana
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TRANSFERENCIA Una vez finalizada la corrida, las protenas son (electro)transferidas a una membrana (nitrocelulosa o PVDF)
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Electrotransferencia (blotting)
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La transferencia puede hacerse en 2 condiciones: 1)Hmeda

Buffer de transferencia: Tris-Glicina 1X + metanol 20%
Semi-seca
Ms rpida. No recomendada para protenas mayores a 100 KDa
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Visualizacin de las protenas en el gel pre-transferencia:
NO Coomassie brillant blue ya que produce una tincin

irreversible. Tincin con cobre (CuCl2), luego los geles pueden ser desteidos completamente por varios lavados en 0,1-0,25 M Tris/0,25 M EDTA pH 8.
Visualizacin de las protenas en la membrana:

Ponceau Red
Visualizacin de las protenas en el gel post-transferencia:
Coomassie brillant blue para chequear la eficiencia de la

transferencia.
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3) Bloqueo
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Evita pegado inespecfico de los anticuerpos a la membrana

Soluciones de bloqueo: Fuente de protenas: BSA o leche en polvo descremada
Detergente: Tween-20 o Tritn X-100 (entre 0,05 y 0,2%)
Receta solucin de bloqueo del TP: TBS 1X Tween-20 0,1% Leche en polvo descremada 5% (Svelty 0% grasa)
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4) Incubacin con anticuerpo primario
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3 clases de anticuerpos:
Anticuerpos que reconocen al independientemente de su conformacin. antgeno
Anticuerpos que reconocen slo epitopes especficos de la forma nativa del antgeno.
Anticuerpos que reconocen desnaturalizadas de la protena. slo formas
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Puntos clave en la incubacin de la membrana con la solucin de anticuerpo primario:

Dilucin del anticuerpo primario: (1:100-1:3000), sn. de bloqueo o
TTBS sin agente bloqueante.
Tiempo de incubacin:
vara de pocas horas a ON, depende de la afinidad del anticuerpo por el antgeno y de la abundancia del antgeno.
Temperatura de la incubacin: T amb o 4C. Si se incuba ON poner a

4C. Con agitacin.
Cantidad y duracin de los lavados.
Parmetros que dependen de cada complejo antgeno-anticuerpo
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En nuestro TP
Anticuerpo primario
Recuperar los anticuerpos (son muy caros y peden reutilizarse)!!!!!!
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5) Incubacin con anticuerpo secundario
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Puntos clave en la incubacin de la membrana con la solucin de anticuerpo secundario:

Dilucin del anticuerpo secundario:
bloqueo o TTBS sin agente bloqueante. (1:1000-1:20.000), sn. de
Tiempo de incubacin: 1-2 horas.
Temperatura de la incubacin: T amb. Con agitacin.

Cantidad y duracin de los lavados.
Parmetros que dependen de cada complejo antgeno-anticuerpo
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En nuestro TP
Anticuerpo secundario
anti-IgG de ratn o anti-IgG de conejo dependiendo de la especie del anticuerpo primario, conjugado a peroxidasa de rabanito (HRP). Dilucin 1:10.000 en solucin de bloqueo.
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6) Deteccin
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DETECCIN Existen diferentes mtodos para la deteccin de la protena de inters
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Western blot: sistemas de deteccin colorimtrica
Ac 2ario conjugado a Ez
Ac 2ario conjugado a Biotina + Avidina-Ez
Ez: Peroxidasa de rabanito (HRP) Fosfatasa alcalina (AP)
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Western blot: sistemas de deteccin quimioluminiscente
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Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents

High sensitivity: broad dynamic range on film and imager, which allows a quantitative detection. Chemiluminescent and chemifluorescent detection. Extended signal duration - up to 24 h - enables multiple exposures to be made. Compatibility with Hybond ECL and Hybond-P membranes.
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent

High signal intensity and sensitivity allows the use of highly diluted primary and secondary antibodies with no reduction in sensitivity. Stable signal allows multiple exposures and makes the reagent suitable for large experimental series, allowing convenient handling time between the end of the experiment and detection. Optimized for imaging with ImageQuant LAS 4000 (CCD-based imaging) and compatible with Amersham Hyperfilm. Compatible with Rainbow Molecular Weight Markers and Amersham ECL DualVue Western Blotting Markers. Optimized for use with Amersham Hybond P (PVDF) membranes and compatible with Amersham Hybond- ECL (nitrocellulose) membranes.
Ge Healthcare: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?OpenDocument&ParentId=800633
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Quimioluminiscencia
Revelado con pelculas autorradiogrficas
Imgenes digitales. Los aparatos de ltima generacin no slo detectan quimioluminiscencia (Ac 2ario-HRP) sino fluorescencia (Ac 2ario-fluorocromo)
Odyssey Infrared Imaging System
STORM Analysers
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Detection kits For HRP-conjugated antibodies: ECL and ECL+ (home made or commercially available) are the traditional kits used and we recommend ECL+. For the new generation detection machines such as Genegnome, use the detection kit recommended by the manufacturer of the machine. We do not recommend ECL or BCIP/NBT detection kits as they are not as sensitive. X-ray films Manual film development is traditionally used and enables the scientist to control the incubation time of the x-ray film in the developing agent and fixation agent. Automated x-ray film developers are also widely used and easy to use. Remember that an over-exposed film is not suitable for analysis as determination of the relative amount of protein is not possible. Overexposed films show totally black bands with no contrast, and/or numerous non-specific bands. Digital images: The new generation of film developers are units with a camera inside an enclosure, removing the need for a darkroom. The camera detects the chemiluminescence emanating from the membrane, transforming the signal into a digital image for rapid analysis with software provided with the detection machine. A range of machines are now commercially available. At the front of the next generation are systems which do not use HRP-conjugated antibodies (i.e chemiluminescence): for example, STORM Analysers detect fluorescence from fluorochrome-conjugated secondary antibodies. The Odyssey Infrared Imaging System detects infrared fluorescence.
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The LI-COR Odyssey Infrared Imaging System is useful for detecting infrared dyes. It is a two channel laser-based infrared detection system made by LI-COR Biosciences. It provides high sensitivity, multiplexing capabilities and accurate quantitation. The instrument can be used to identify fluorescent molecules that excite at 680 nm and emit at 700 nm in one channel, and molecules that excite at 780 nm and emit at 800 nm in the second channel.
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The Odyssey Fc System can acquire images in both fluorescent and chemiluminescent modes. IR Fluorescence: Lasers are used to excite 700 nm and 800 nm IRDye fluorophores for 2 channel detection. Fluorescent emission is then detected to generate an image of the sample. At these IR wavelengths, membrane autofluorescence is very low. This method directly detects the fluorescently labeled conjugates. Because the fluorescent signal is very stable, samples can be archived and re-imaged. Chemiluminescence: Luminol substrate is applied to the sample, and is oxidized by horseradish peroxidase (HRP) enzyme in a light-generating reaction. This method is indirect, because it relies on the enzymatic reaction to report the location of the HRP conjugate. Chemiluminescent signals are dynamic and time-dependent. Light emission is initially strong, but diminishes over time.
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Revelado: fluorescencia vs. Quimioluminiscencia
LI-COR ODYSSEY
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Thermo Scientific: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=C19B1756-03B2-41A0-8ED5-2C22A0B1DDEB
DyLight Fluorescent Western Blotting Kits Complete kits for dual-fluorescent (549/649) and dual-infrared (680/800) Western blot detection, complete with corresponding fluorescent MW markers.
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Revelado: fluorescencia vs. Quimioluminiscencia
LI-COR ODYSSEY: Rango lineal
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INGENIERA GENTICA 2010 Clean-Blot IP Detection Reagent and Kit Specially formulated AP and HRP conjugates for clear, specific Western Blot detection with immunoprecipitation (IP) experiments.
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Figure 2: Easily distinguish your target protein on Western blot with Clean-Blot IP Detection Reagent (HRP). Mouse liver extract (50 g) total protein was separated on a Bio-Rad Criterion gel, transferred to PVDF membrane and blocked with 1% milk in TBST. The membrane was probed with mouse monoclonal anti-Cdk1 (LabVision) (0.2 g/ml) and goat anti-mouse HRP (0.16 g/ml) or Clean-Blot IP Detection Reagent (HRP) (0.2 g/ml).

Far-Western Blot Kit for Biotinylated Proteins
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Far-Western blotting is the method of probing a membrane containing transferred protein with another protein to detect specific protein-protein interactions.
ProFound Far-Western Biotinylated-Protein:Protein Interaction Kit This kit utilizes biotin modification of a purified "bait" protein probe. Prey proteins separated in-gel or transferred to a membrane can be probed with this biotinylated bait. Detection of an interaction with "prey" protein(s) is achieved with a streptavidin-horseradish peroxidase conjugate and a chemiluminescent substrate.
Pelisch et al. J Biol Chem. 2005. 280: 25461-9.
Barrionuevo et al. J Immunol. 2007. 178: 436-445
Barrionuevo et al. Clin Exp Immunol. 2003. 133: 200-207
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Applications
Immunological detection (with known Ab) Identification of antigens recognized by unknown Abs (serum)
Evalutaion of cross reactivity

Can be used after either 1D-electrophoresis or 2D-electrophoresis

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Sistema de geles verticales para SDS-PAGE

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A esta se le aade un buffer que contiene SDS, b-Mercaptoetanol o DTT

El buffer adems posee: glicerol y azul de bromofenol

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se aplica voltaje para que las muestras migren

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O: Origen de siembra A: Stacking gel B: Resolving gel C: Interfase

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La resolucin va a depender del %T: 15%: 12 45 kDa

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Geles con gradiente de acrilamida

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Visualizacin: tincin de protenas totales

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Determinacin del peso molecular

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Algunas aplicaciones del SDS-PAGE

Evaluar la induccin de protenas recombinantes en un cultivo bacteriano

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SDS-PAGE Tincin con Coomassie brillant blue

Cuantificacin de las protenas

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BSA: 100 ng/l

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BSA: 100 ng/l

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Western Blot (Immunoblotting)

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Comparacin de protenas observadas por SDS-PAGE y WB sobre una misma muestra

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PASOS DE UN WESTERN BLOT:

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La transferencia puede hacerse en 2 condiciones: 1)Hmeda

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