Cellules dendritiques et immunothrapies des cancers

Marc GREGOIRE INSERM U601, Nantes.

Bilan essais cliniques: Immunothrapies par cellules dendritiques

Mlanome Prostate
Rein
Pancras, colon, sein, poumon, gliome

Mthodes de chargement
Tumor lysate Peptides RNA transfection Recombinant protein Tumor in situ a-galactosylceramide Idiotype DC/tumor fusion Apoptotic bodies Exosomes + peptides 24 24 4 2 2 2 2 1 1 1

Efficacit thrapeutique : Rmission complte (CR) <10% Rmission partielle (PR) <20% Stabilise (SD) ~30% Progression (PD) Efficacit biologique : Immunisation (>65%) Rponse Hypersensibilit retarde (DTH) Rponse T (prolif. / IFN / IL2) ELISPOT ttramres - ELISA Activit cytotoxique

30 25 20 15 10 5 0 1996 1998 2000 2002 2004 Essais Revues

Banchereau J et al., Cell, 106, 271, 2001 Bender J., Clin. Appl. Immunol. Reviews, 1, 37-44, 2000 Bhardwaj, N, Trends in Mol. Med., 7 (9), 388, 2001 G. Schuller et al, Curr Op Immun., 15, 138-147, 2003 C.F. Figdor, et al., Nat Med., 10 (5), 475-480, 2004 SA Rosenberg et al, Nat Med, 10 (9), 909-915, 2004 F Nestl et al, Curr. Op. Immun., 17, 163-169, 2005

Cellules dendritiques et thrapie antitumorale

Quelles indications ?

Quelles DC ?

Origine Sous-population Maturation Chargement dantignes

Quelles analyses de la rponse immunitaire ?

DTH ELISPOT Ttramres T/Cytokines

Quelles stratgies ?

Combien Frquence Site Adjuvant

C.G. Figdor, et al., Dendritic cell immunotherapy : Mapping the way. Nat Med., 10 (5), 475-480, 2004

Culture method / DC maturation

Cellules dendritiques :
Immatures ou matures ? Modes de maturation ? Quelles populations de DC ?

Immature moDC 21 IL-1,IL-6,TNFa,PGE2 moDC 14 MCM,TNFa,PGE2 moDC 5 TNFa moDC 3 TNFa,PGE2 moDC 2 TNFa,CD40L moDC 2 GM-CSF/IL-13 DC from bulk PBMC 2 Sequential density centrifugation 2 Seq. density centrifugation after Flt3-L 1 CD34+ derived Langerhans cells 1 Poly-I:C moDC 1 IL-1,IL-6,TNFa,PGE2, + CD40L moDC 1 IL-1,IL-6,TNFa,PGE2 ,+ IFNa/g + Poly-I:C moDC 1 MCM moDC 1 1 Flt3-L expanded DC in vivo DC from leukemic cell line 1 GM-CSF/IL-13 DC : bulk PBMC + bacterial extract + IFNg 1 TNFa + Poly-I:C moDC 1 IL-1, IL-6,PGE2 moDC 1 Allogeneic IL-1,IL-6,TNFa,PGE2 maturated DC 1 Allogeneic TNFa moDC 1 moDC derived exosomes 1 CD34+ cells +TNFa,GM-CSF,Flt3-L 1 Flt3-L expanded DC + CD40L 1 DC autolog. Leuk. cells + IL-1, IL-6,TNFa, PGE2 Maturation 1

Standardisation ?

Histoire dune sentinelle CPA

1. Agression externe Tumeur Greffe
Dbris cellulaires

1. Mort physiologique

6. Phase effectrice

Dbris cell.

2. Sentinelles : Endocytose Phagocytose

Signal de Danger
3. Maturation I 5. Rponse cellulaire Rponse humorale

Cytotoxicit cellulaire

3. Migration

Th Tc - Tr
4. Prsentation Cross-prsentation 4. Synapse immunologique

Priphrie
Premier signal danger
IL-10 IL-12

Maturation I et migration

CMH II

B7.2

B7.1

recCD40

APC
CD91 HSP TL-Rec recTNF Pathogne TL-Rec CpG TNF

Stress Infection

CCR7

CMH I

Signal 1
Danger Signals

Inflammation

Lyse cellulaire

Gallucci S and Matzinger P, Cur. Opinion Immunol., 13, 114-119, 2001

Ganglion
Th1
RecT
(CD4)

IL-2

IL-10

IL-12 CD40L CD28 CMH II B7.2 B7.1 CD40

IFN

Signal 2

APC
Second signal
ILIL -15 RecT
(CD8)

CMH I

CTL

TNF

Maturation II et Cross-prsentation

Mthodes de Gnration des Cellules Dendritiques

Poches de cytaphrse Rsidus danneau
GM-CSF + IL-4 ou IL-13 GM-CSF + IL-4 Lymphocytes

monocytes

Diffrenciation
CDs immatures Elutriation
Phagocytose
Lymphocytes

CDs immatures

CDs immatures

CDs immatures

Activit phagocytaire des CD immatures

4C 37C

CA PKH-26

DC (CD54-FITC)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 Time (h) 30 40

DC + CA 1:1
64%

DC + CA 1:2

% phagocyting DC

37C Control 4C

35%

DC + CA 1:3
97%

DC + CA 1:5
96%

2%

3%

Cellules dendritiques :
Chargement Prsentation dantignes
Loading method
Tumor lysate Peptides RNA transfection Recombinant protein Tumor in situ a-galactosylceramide Idiotype DC/tumor fusion Apoptotic bodies Exosomes + peptides 24 24 4 2 2 2 2 1 1 1

Chargement de cellules dendritiques pour la prsentation d antignes tumoraux

Thurner, B. et al. J. Exp. Med, 190 (11), 1669-1678,1999 Condon C. et al. Nature Medicine, 2 (10), 1122-1128, 1996

Peptides

DNA

Maturation ?
Cell. T Cell. T

Nair SK et al. Annal Surg., 235, 540-549, 2002

RNA

Prsentation ?
Cell. T

Exosomes
Wolfers J.. et al., Nature Medicine, 7 (3),297-303, 2001

Cell. T

Activation T ?
Cell. T

Fusions cellulaires
Kugler, A. et al., Nature Medicine, 6 (3), 332-336, 2000

Cellules mortes

Ncrose / apoptose : Activation ou tolrance ?

HSP

Danger !

Apoptose

IL1

Activation

HSP IL1

Tolrance

HSP Ncrose

?
?
Danger !

+
HSP

Activation

Cellules dendritiques :
Immunothrapie antitumorale

Etudes pr-cliniques
Titre : Utilisation des cellules prsentatrices dantignes (cellules dendritiques) dans limmunothrapie antitumorale des cancers. Promoteur : CHU Nantes, 5 alle de lIle Gloriette, 44093 Nantes, Cedex 01 Investigateur principal : Marc GREGOIRE, Unit 419 INSERM Co-investigateurs : Pr. B. DRENO, Unit de Thrapie Cellulaire et Gnique 2000 Titre : Evaluation des protocoles de production et de maturation/activation de cellules dendritiques issues de monocytes de patients atteints de tumeurs cancreuses traites par chimiothrapie -SBID Promoteur : CHU Nantes, 5 alle de lIle Gloriette, 44093 Nantes, Cedex 01 Investigateur principal : Pr. N. MILPIED, service dHmatologie, CHU Nantes Co-investigateur scientifique : Dr M. GREGOIRE Titre : Etude de faisabilit de production de cellules dendritiques et d'induction d'une rponse anti alphaftoprotine chez les patients atteints de carcinome hpatocellulaire pour une immunothrapie spcifique. Promoteur : CHU de Nantes, 5 alle de lIle Gloriette 44093 Nantes cedex Investigateur principal : Dr. Jrme GOURNAY, Service d'Hpato-gastroentrologie, CH G et R Lannec Co-investigateurs scientifiques : Dr. N. FERRY, Pr. F. JOTEREAU, Dr M. GREGOIRE Titre : Etudes biologiques et immunologiques des liquides pleuraux pour applications thrapeutiques-SBID Promoteur : CHU de Nantes, 5 alle de lIle Gloriette 44093 Nantes cedex Investigateur principal : Pr. G. Dabouis, Service d'oncologie thoracique mdicale et digestive Co-investigateur scientifique : Dr. M. GREGOIRE

2001

2004

2004

DC patients LAM
36 30
5

CD83
10

1200 1000
8

CD40
9

IL12p70
1000
6

IL10
4

1000
* * 5

24 18 12
8 11

800 600 400

11

750
pg/ml

1 2

750
8

6 0

200 0
iDCs mDCs CD86
14 5

500

500

iDCs

mDCs CD80

250

250
4 7

12

240 200 160 120 80

14 5

90 75

0
5

12 iDCs

8 mDCs

12 iDCs

MF I

60
8

mDCs

45 30
4 5 5

40 0

15 0
iDCs mDCs HLA-DR
4
7 7

140000
mDCs HLA-ABC
9 7

iDCs

120000 100000 80000

cpm

MLR
iDCs 8h matured DCs mDCs

420 350 280 210 140 70 0

iDCs
7

900 750

600 450 300 150 0

mDCs iDCs mDCs
7

60000 40000 20000 0

Pat #9 Pat #11

11

donneurs sains Avant chimiothrapie Aprs chimiothrapie

Essais cliniques
Titre : Etude de phase I/II dimmunisation de patients atteints de mlanome de stade III/IV par injections de cellules dendritiques autologues charges en peptides de mlanome . Promoteur : CHU de Nantes Investigateur principal : B. DRENO Responsables scientifiques : F. JOTEREAU, N. LABARRIERE, M. GREGOIRE Titre : Etude multicentrique, de phase I/II dimmunothrapie cellulaire par injection de cellules dendritiques autologues charges en cellules apoptotiques leucmiques chez des patients atteints de leucmie aigu myloblastique en 2 me rmission complte Promoteur : CHU de Nantes, 5 alle de lIle Gloriette 44093 Nantes cedex Investigateur principal : Dr. Patrice CHEVALLIER, Service d'Hmatologie Co-investigateurs : Dr. T. LAMY (Rennes), Dr. N. IFRAH (Angers) et Dr. M. GREGOIRE (INSERM U601) Titre : tude de phase I/II d'immunothrapie des carcinomes hpatocellulaires par induction d'une rponse anti alpha ftoprotine Promoteur : CHU de Nantes, 5 alle de lIle Gloriette 44093 Nantes cedex Investigateur principal : Dr. Jrme GOURNAY, Service d'Hpato-gastroentrologie, CH G et R Lannec Co-investigateurs scientifiques : Dr. N. FERRY (CIC Nantes), Dr M. GREGOIRE (INSERM U601) (Angers) & (Rennes)

2002

2005

2005

Titre : Etude de Phase I/II dimmunothrapie cellulaire pour des patients atteints de msothliomes pleuraux malins par injections de cellules dendritiques autologues charges en cellules tumorales apoptotiques Promoteur : CHU de Nantes, 5 alle de lIle Gloriette 44093 Nantes cedex Investigateur principal : Pr. G. DABOUIS, Service d'oncologie thoracique mdicale et digestive Co-investigateurs : Dr. L. CELLERIN (Service de Chirurgie thoracique) et Dr. M. GREGOIRE (INSERM U601) (Angers) & (Rennes)

Protocole pour Immunothrapies LAM & msothliome

Cell. tumorales avant chimio

Cytapheresis

Meso ou blastes

Lymphocytes T
GM-CSF IL-4

Conglation Stockage Test maturation Maturation 6h. (TNF / Ampligen)

Chargement
KLH

Caractrisation Phnotypage HLA Scurisation Traitements Conglation

ImmunoMonitorage

Diffrenciation Cellules dendritiques

Production Cell apoptotiques-ncrotiques

Protocole pour mlanome & CHC

Cytapheresis

GM-CSF IL-4

5 Jours

Lymphocytes
Conglation Stockage tests KLH

16h

ImmunoMonitorage

TNF Poly I:C

Chargements peptides AFP

Cellules dendritiques matures

Essai clinique - Validation :

Formalits administratives Productions cellulaires

Autorisation de lessai clinique : AFSSaPS Qualit du produit

Qualit du matriel de dpart
adapt l obtention dun produit cellulaire de qualit

Procd de production
Description prcise validation et reproductibilit

Contrles
matriel de dpart, sur le produit intermdiaire, sur le produit fini

Autorisation de lessai clinique : CCPPRB Ethique de lessai

Conditions exprimentales
Qualit de vie, Qualit de traitement Suivi du patient

Informations au patient
Lettre dinformation Lettre de consentement

Couvertures juridiques
Assurance CNIL

Structure dInterface Recherche-Clinique

Productions des produits de thrapie cellulaire et gnique

TRANSFERT

U.T.C.G.

Recherche

Interface Qualit des produits thrapeutiques

Clinique

Transfert Contraintes de production en clinique

Tests de production en grand volume Evaluation de leffet des produits thrapeutiques annexes GMP Prparation selon les recommandations pour CCPPRB, AFSSaPS Prparations standardises pour essais multicentriques Evaluation du produit fini Prparation du cahier de labo et de suivi de protocole

Production cellulaire Unit de Thrapie Cellulaire et Gnique

Production DC pour thrapie

J0

Prlvements aphrse ou rsidus danneau

Gradient de Ficoll (pour rsidus)

Vitesse : 2500 rpm Chambre 40ml Dbit >130ml/mn

Plaquettes / Erythrocytes

Purification par lutriation

Lymphocytes

+J3

Milieu RPMI Alb Hum 2% Glutamine GM-CSF (800 U/ml) + IL-4 (200 U/ml)

Monocytes

Analyse : phnotype

Dendritiques immatures

Analyse : Phnotype viabilit KLH ?

CD1a CD11c CD14, CD3 CD19, CD56 CD83

J5

Phagocytose

J6

(durant la nuit = 16 h.) Milieu RPMI Alb Hum 2% GM-CSF (800 U/ml) Maturation IL-4 (200 U/ml) (6 heures ou TNF (40ng/ml) 24 heures ) Poly I:C ou Ampligen (150g/ml) ou Ribomunil ?
CD1a CD11c CD14 CD54 CD80, CD86 CD83 DC-LAMP DC-SIGN CCR7 HLA-DR HLA-ABC NFkB (nuclaire)

Cellules lyses

J 7/8+
IL-12p40 IL-12p70 TNF IL-10 IL15

Dconglation / Maturation 18h 36h si 6h

Stockage
Conglation 90% Alb Hum 4% 10% DMSO

Analyses : Viabilit phnotype cytokines

Laboratoire de Recherche

Ya plus qu
Service clinique

AFSSaPS CCPPRB

Equipe recherche

EFS

CNIL Cahier dobservation

DRC-Promoteur

UTCG

Inclure les patients

Contrle Qualit Laboratoire dImmunologie

Service dhmatologie M. GREGOIRE M. PADIEU A. GAUVRIT I. BARBIEUX PJ. ROYER C. SAPEDE S. TANGUY-ROYER T. SIMON Pr. JL HAROUSSEAU Dr. P. CHEVALLIER Dr N. MORINEAU

Service dOncologie mdicale Pr. G. DABOUIS Dr L. CELLERIN Dr. Ch. SAGAN Unit de thrapie Cellulaire Pr. B. DRENO Dr. I. ARNAUD Dr. S. SAYAGH

Service de Gastrologie Pr. JP GALMICHE Dr. J. GOURNAY Dr N. FERRY