INGENIERA DE TEJIDOS

Dra Alicia Lorenti

Ingeniera de Tejidos
Es la aplicacin de principios y mtodos de la ingeniera y de las ciencias biolgicas, para el entendimiento de la relacin estructura funcin en tejidos, y el desarrollo de sustitutos biolgicos que restauren, mantengan o mejoren la funcin de dichos tejidos

BIOLOGA MEDICINA

INGENIERA

MATERIALES FSICA

QUMICA

CLULAS

Microambiente

BIOMATERIALES

Medicina Regenerativa
Desarrollo de terapias basadas en clulas, capaces de inducir la regeneracin del rgano/tejido, estimuladas por el microambiente que las recibe

Qu es lo que estimula la regeneracin

Las clulas implantadas por s mismas Las clulas implantadas estimulan a las residentes a reparar el dao Las clulas implantadas secretan o estimulan la secrecin de factores de crecimiento

Ingeniera de tejidos

Construcciones implantables Dispositivos extracorpreos Matrices de soporte

CLULAS Cmo elegir la mejor clula

Capaces de realizar funciones diferenciadas

Potenciales efectos adversos Disponibilidad

CMO ELEGIR LAS CLULAS Segn el tipo celular

Clulas stem Lneas celulares Clulas primarias

Segn su origen
Clulas autlogas Clulas homlogas

Clulas xenogeneicas

Clulas Stem

Origen

Embrionarias Embrionarias germinales Adultas o somticas Totipotenciales Pluripotenciales Multipotenciales Potencialidad restringida

Potencialidad

Lneas Celulares Son clulas inmortalizadas

(humanas o animales)

Transformadas por incorporacin en su genoma de parte del genoma del virus SV-40 Transformacin espontnea

Lneas Celulares
Obtenidas a partir de: Tumores Tejidos normales Se desarrollan fcilmente Su potencial tumorignico nunca puede ser descartado

Clulas primarias diferenciadas

Obtenidas a partir de tejidos funcionales
AISLAMIENTO Digestin enzimtica Disgregacin mecnica Centrifugacin Gradientes Pasajes por columnas Cell sorting

Clulas primarias diferenciadas Aisladas y cultivadas

Objetivo fundamental del cultivo: estabilizar o mejorar la funcionalidad de las clulas diferenciadas

Origen de las clulas primarias diferenciadas

Clulas humanas
Opcin de eleccin Procuracin limitada

Riesgo de zoonosis

Clulas animales

Rechazo hiperagudo
(Inmunoaislamiento)

El cerdo es el animal de eleccin

Clulas frescas vs clulas cultivadas

<tiempo de preparacin

Clulas frescas

<gasto >prdida
(apoptosis y anoikis)

Clulas cultivadas

>recuperacin y reorganizacin celular

is s e t n S

Clulas

Remode

lacin

Matriz extracelular

Regulacin

Factores de crecimiento
(locales y sistmicos)

Estructura tisular

Ingeniera de tejidos

Scaffolds p/ cultivo 3D

La Ingeniera de Tejidos es slo cultivo de clulas? Clulas aisladas Cultivo in vitro (ambiente no fisiolgico) Formacin de colonias o monocapa Desorganizacin, ausencia de funcin, muerte

Tejidos

Cul es la respuesta???

Ausencia de organizacin tisular (3D)

Implante

Estmulos mecnicos, elctricos, estructurales, seales

Ingeniera de Tejidos
Naturales

BIOMATERIALES
Hbridos

Sintticos

BIOMATERIALES
Dispositivos permanentes Dispositivos temporarios (extra
o intracorpreos)

Algunas caractersticas
Fatiga Fracturas Toxicidad Inflamacin No adaptacin a cambios Biocompatibilidad Biodegradabilidad Porosidad Inmunogenicidad Adhesin celular

SOPORTES IDEALES
Scaffolds (andamios): Estructuras tridimensionales
Scaffolds prefabricados que permiten la migracin y adhesin celular, la difusin de nutrientes, de factores de crecimiento y de factores expresados Vascularizacin del scaffold sembrado. Las clulas pueden morir antes de que se produzca la angiognesis Estructuras capaces de desarrollar distintas funciones simultneamente. Ejercer/soportar funciones mecnicas necesarias para el funcionamiento celular

Tipos de biomateriales
Componentes de la matriz extracelular
Colgeno Elastina Vitronectina Glicosaminoglicanos: c.hialurnico, condroitn sulfato, dermatan sulfato, heparan sulfato, keratan sulfato

Polmeros sintticos
Polihidroxicidos: polilctico (PLA), poligliclico (PGA) y copolmeros Poliacrilatos: poli-HEMA, poli-MMA

Polisacridos
Quitosan (citoesqueleto de crustceos)

Ingeniera de tejidos

Medicina regenerativa

APLICACIONES
Heridas Tejido osteoarticular

Msculo cardaco, vasos, vlvulas

rganos bioartificiales

Sistema nervioso

Aparato urinario

INGENIERA DE TEJIDOS APLICADA A REPARACIN DE HERIDAS

Coagulacin Inflamacin

Tejido de granulacin

Remodelacin

CUAL ES EL PROBLEMA? Grandes superficies lceras crnicas CUAL FUE EL PRIMER PLANTEO?

CULTIVO DE EPIDERMIS

CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA

1950 Parshley y col. Cultivo por explantos

1967 Flaxman y col. Clulas disgregadas enzimticamente

CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA

1968 Karasek y col. Primer implante en conejos

1975 Rheinwald y Green. Introducen EGF y feeder-layer. Perspectivas teraputicas: logran amplificar el cultivo y crecer keratinocitos sin sobrecrecimiento de fibroblastos

Funcin de EGF y feeder-layer

EGF

Feeder-Layer

Se une a receptores de membrana > capacidad formadora de colonias

No proliferativos Metablicamente activos

CULTIVO DE PIEL UN POCO DE HISTORIA

1987 Pittelkow y col. Cultivo sin feeder-layer ni suero. 1990s Distintos sustratos: dermis/epidermis

2000s Clulas stem epidrmicas

CULTIVO IN VITRO CON FEEDER-LAYER

OBJETIVOS 1- Inhibir la proliferacin de fibroblastos drmicos 2- Aumentar la capacidad formadora de colonias de queratinocitos 3- Subcultivar para amplificar

POR QU FEEDER-LAYER Los fibroblastos aportan

Colgeno Fibronectina Laminina

Factores de crecimiento Proteoglicanos

Por qu si y por qu no feeder-layer SI: Aporta factores de crecimiento NO: Son clulas transformadas

Se puede cultivar sin feederlayer y sin suero (vaca loca) ? Se han desarrollado medios de cultivo especficos para queratinocitos

Mtodo de Pittelkow Cultivo sin feeder-layer y sin suero Dos etapas Proliferacin
Aumento del nmero de clulas

Diferenciacin
Estratificacin

CULTIVO DE QUERATINOCITOS SIN SUSTRATOS DRMICOS Logros

Obtencin de cultivos de queratinocitos con posibilidades teraputicas Fragilidad de las lminas de queratinocitos por ausencia de soporte drmico Mayor sensibilidad a infecciones y prdida por roces

Problemas

Cul es la tendencia actual Dermis + Epidermis

SOLUCIONES Ingeniera de tejidos

Cultivo de queratinocitos Cultivo de fibroblastos Matrices tridimensionales

Estructuras compuestas Dermis cadavrica

Lminas para cultivo in vitro de queratinocitos

Membrana de cido hialurnico

Lminas para cultivo in vitro de fibroblastos

Membrana de cido hialurnico

Piel artificial (Burke y Yannas, 1980) INTEGRA

Epidermis temporaria de siliconas (Silastic) sobre esponja de colgeno (Tipo I)glicosaminoglicano (condroitn-6-sulfato, dermatan-sulfato, c.hialurnico). El Silastic se reemplaza por cultivo de epidermis autloga

Membrana de cido poligliclico sobre malla tridimensional de nylon DERMAGRAFT Sembrado con fibroblastos de neonatos humanos (alogeneicos)

Estructura bicapa con clulas alogeneicas APLIGRAF

Fibroblastos humanos Colgeno tipo I Keratinocitos humanos

Da 0

Da 6

Empaquetamiento y envo

Estrato crneo Da 20

Dermis humana liofilizada ALLODERM

Procedente de donantes (AATB) Eliminacin de epidermis y clulas drmicas (Procedimiento AlloDerm) Sus componentes son colgeno, elastina, proteoglicanos, canales vasculares y matriz bioactiva intacta. Se eliminan los antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad I y II. Se liofiliza y criopreserva

DERMIS CADAVRICA Y EPIDERMIS CULTIVADA (Cuono, 1987)

Reseccin tangencial Cobertura con homoinjerto Epidermis Dermis

Reseccin de homoepidermis y colocacin de cultivo de piel

Cultivo

OTRAS ALTERNATIVAS
Lminas de colgeno Hidrogeles: gelatina, poli-HEMA Sustratos basados en quitina Geles de fibrina

MEDICINA REGENERATIVA E INGENIERA DE TEJIDOS EN ENFERMEDADES CARDACAS

El corazn adulto es un rgano posmittico. Sus clulas son terminalmente diferenciadas No tiene capacidad regenerativa, ni en condiciones fisiolgicas ni despus de una injuria

EXISTE UN NUEVO DOGMA?

Indicios de mitosis de miocitos en zonas peri-infarto y remotas (ndice mittico 0,08% y 0,03% respectivamente)
Beltrami A y col.NEJM 2003

El corazn tendra capacidad de regeneracin

REGENERACIN CARDACA Terapias basadas en clulas Qu clulas? WANTED! The best cell for cardiac regeneration
J Am Coll Cardiol 2004

TIPOS DE CLULAS DEL MIOCARDIO ADULTO

Cardiomiocitos
(componente contrctil)

Fibroblastos
(protenas de matriz)

Musculares lisas
(pared de vasos)

Endoteliales
(revestimiento)

ISQUEMIA

Patologas isqumicas
Prdida de

cardiomiocitos, endoteliales, msculo liso, fibroblastos

Necrosis coagulativa

funcin

Infiltracin de clulas inflamatorias

Activacin de metaloproteinasas y mRNAs

(TGF1,FGF2)

REMODELACIN FIBROSIS

QU CLULAS SE ESTN USANDO Mioblastos esquelticos Clulas stem cardacas Clulas stem extracardacas

USO DE CLULAS STEM DE MDULA SEA Poblacin de clulas Lin- ckit+ de mdula sea implantadas en zonas periinfarto Transdiferenciacin a cardiomiocitos, clulas endoteliales y msculo liso Miocardio de novo, funcin contrctil, arterias, arteriolas y venas
Orlic y col. Nature 2001

CELULAS STEM EXTRACARDIACAS Los trabajos de Orlic no pudieron ser reproducidos

Heterogeneidad de clulas usadas Protocolos de aislamiento e identificacin no estandarizados ni reproducibles fcilmente Los tejidos musculares estriados tienen autofluorescencia Los tejidos necrticos tienen aumentada esa autofluorescencia (acumulacin de lipofuscina, pigmentos derivados de la sangre, flavinas) Leucocitos derivados de MO pueden ser confundidos con clulas stem
Bel y col.Circulation 2003, Balsam y col.Nature 2004, Murry y col.Nature 2004

Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature, 2003 Haematopoietic stem cells do not transdifferentiated into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature, 2004 Haematopoietic stem cells adopt mature haemopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature, 2004

MEDICINA REGENERATIVA EN CORAZN

Resultados no contundentes No siempre son reproducibles Clulas stem cardacas: difciles de aislar y cultivar Clulas cardacas adultas no se reproducen in vitro Implante de clulas de msculo esqueltico asociado a arritmias Clulas stem extracardacas no siempre retenidas en el lugar de implante

DESARROLLO DE VLVULAS CARDACAS

Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, and challenges. Siembra de clulas sobre una estructura sinttica biodegradable Siembra de clulas sobre tejido humano procesado Repoblacin in-vivo de sustratos implantados, por clulas endgenas circulantes Resultados modestos
Mendelson K y col.Ann Biomed Eng. 2006

The cardiovascular tissue-reactor: a novel device for the engineering of heart valves Desarrollo de un biorreactor por transformacin in vitro de vlvulas porcinas en humanas. Remocin total de las clulas porcinas por tripsinizacin, y siembra con clulas vasculares humanas
Karim N y col.Artificial Organs 2006

DESARROLLO DE UN CORAZN ARTIFICIAL

Perfusion-decellularized matrix: using natures platform to engineer a bioartificial heart
Ott H. Nature Medicine 2008

Requisitos Arquitectura del corazn Constituyentes celulares apropiados Funcin de bomba

PEG

Triton X-100

SDS

Resultados de este desarrollo

Estructura acelular con geometra intacta Contenido normal de colgeno I y III, laminina y fibronectina Resembrado con clulas cardacas y endoteliales Colocado en un biorreactor, bajo ambiente cardaco fisiolgico, con estimulacin elctrica: funcin de bomba

Ingeniera de Tejidos aplicado a otros rganos/tejidos

Desarrollo de estructuras del aparato gnitourinario Vejiga Urter Uretra Desarrollo de estructuras del sistema msculo esqueltico Cartlago Hueso Tendones y ligamentos