Manual de Laboratorio

Gua de pruebas de laboratorio para Inmunohematologa y Banco de Sangre
Seccin de Inmunohematologa y Banco de Sangre Facultad de Microbiologa Universidad de Costa Rica Dr. Carlos Cordero Gmez Dr. Miguel Rodrguez Pineda 2009
Universidad de Costa Rica Facultad de Microbiologa Seccin de Inmunohematologa y Banco de Sangre Gua de pruebas de laboratorio para Inmunohematologa y Banco de Sangre
Indice
Prefacio ................................................................................................................................. 4 Introduccin .......................................................................................................................... 5 La flebotoma o recoleccin de sangre................................................................................... 9 Suspensin de trabajo en el laboratorio de Inmunohematologa, glbulos rojos al 3-5%, .... 12 Lavado de muestras en Inmunohematologa. ...................................................................... 14 Lectura, interpretacin y escore de las reacciones de aglutinacin. ..................................... 16 Determinacin en tubo del grupo sanguneo ABO en adultos. ............................................. 19 Determinacin en tubo del grupo sanguneo ABO en recin nacidos ................................... 22 Determinacin en tubo de subgrupos sanguneos ABO. ...................................................... 25 Determinacin en tubo del antgeno Rh/ D. ........................................................................ 29 Deteccin del antgeno D dbil ............................................................................................ 32 Clulas Control de Antiglobulina Humana. ........................................................................... 34 Conservacin de Glbulos Rojos. .......................................................................................... 37 Determinacin del fenotipo Rh ............................................................................................. 39 Determinacin de la sustancia H en saliva ........................................................................... 44 Determinacin fenotpica del sistema MNSs........................................................................ 49 Determinacin fenotpica de los sistemas de grupo sanguneo Kell, Duffy y Kidd. ............... 55 Clulas Rastreadoras o clulas pantalla ............................................................................... 60 Prueba de inmunoglobulina indirecta. ................................................................................. 64 Prueba de antiglobulina directa ........................................................................................... 70 Estudio de Anticuerpos Irregulares ...................................................................................... 74 Prueba de compatibilidad sangunea ................................................................................... 81 Identificacin de Anticuerpos .............................................................................................. 94 Tcnica de adsorcin de anticuerpos ................................................................................... 98 Tcnica de Elucin de Anticuerpos .................................................................................... 100 Incompatibilidad materno- fetal ........................................................................................ 107 Anemia Hemoltica Autoinmune ........................................................................................ 112 Anexo 1 ............................................................................................................................. 116
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Reactivos anti-A y anti-B .................................................................................................... 116 Anexo 2 ............................................................................................................................. 119 Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes. .................................................. 119
2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinacin ..............................................................119 2.2 Autoadsorcin en fro ................................................................................................................120 2.3 Tcnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas fras .............................121 2.4 Adsorcin de autoanticuerpos fros utilizando estroma de eritrocitos de conejo. ..................122 2.5 Disociacin de IgG utilizando cloroquina ..................................................................................123 2.6 Adsorcin autloga de autoanticuerpos con reactividad caliente............................................125 2.7 Tcnica utilizando ZZAP .............................................................................................................126
Anexo 3 ............................................................................................................................. 128 Tcnicas de elucin de anticuerpos ................................................................................... 128

3.1 Elucin cida con digitonina ......................................................................................................128 3.2 Tcnica de Rubin modificada ....................................................................................................129 3.3 Tcnica de eludo de Lui ............................................................................................................130
Anexo 4 ............................................................................................................................. 131 Procedimientos para estudio de anemias hemolticas inducidas por medicamentos ......... 131
4.1 Demostracin de la formacin de complejos inmunes inducidos por droga ...........................131 4.2 Deteccin de anticuerpos contra penicilina o cefalotina ..........................................................132
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Prefacio
La presente gua de laboratorio pretende orientar al estudiante en el aprendizaje de las principales tcnicas de Laboratorio de Inmunohematologa y Banco de Sangre. Est constituida por los procedimientos que el estudiante debe realizar en las sesiones prcticas de los cursos de Laboratorio de Inmunohematologa y Banco de Sangre de la carrera de Licenciatura en Microbiologa y Qumica Clnica de la Universidad de Costa Rica. El propsito principal es que el estudiante logre a travs del desarrollo de los procedimientos que se presentan obtener su propia vivencia en cada prctica realizada, hacer las anotaciones pertinentes y desarrollar las destrezas y habilidades propuestas. Tambin que el estudiante cuente con un material propio de consulta rpido para su futuro ejercicio profesional.
Los autores
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Introduccin
Las secciones de Inmunohematologa y Banco de Sangre tienen bajo su responsabilidad el preparar los hemocomponentes y seleccionar el ms indicado para el paciente a quien el mdico se lo prescribe. Para cumplir con esta labor se debe interaccionar con los donantes de sangre, realizar pruebas inmunohematolgicas como la determinacin de grupos sanguneos, fenotipos y pruebas de compatibilidad dentro de otras. El buen desenvolvimiento dentro del Laboratorio y la utilizacin de medidas preventivas es un aspecto bsico y fundamental para los cursos de Laboratorio de Inmunohematologa y Banco de Sangre. Aqu le brindamos algunas de las recomendaciones importantes para la seguridad en el Laboratorio y Banco de Sangre. En 1987 el CDC introduce el concepto que la sangre de todo paciente debe ser tratada como potencialmente infecciosa para el Virus de la Hepatitis B (HBV), Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y otros patgenos transmitidos por va parenteral. Toda persona que labore en un laboratorio de Banco de Sangre debe saber que el SIDA y la hepatitis se trasmiten por medio de fluidos corporales y que, por lo tanto, se deben guardar todas las normas de seguridad necesarias para evitar el contagio. La exposicin ocupacional al HIV es menos frecuente que la del HBV, debido a que las concentraciones en que se puede encontrar el HBV son mucho ms altas, adems de que este virus puede permanecer estable a 25C por ms de siete das, lo que explica su mayor frecuencia e infeccin. La transmisin ocupacional de HBV y del HIV se relaciona con: inoculacin percutnea de sangre, plasma, suero u otros fluidos corporales, debido a accidentes con agujas. Contaminacin de la piel con sangre o fluidos corporales sin que medien punciones, debido al contacto directo de una lesin y el fluido contaminante.
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Exposicin de mucosas ( oral, nasal o conjuntiva) a sangre o fluidos corporales, como resultado de pipetear con la boca, salpicaduras al momento de quitar un tapn de un tubo y/o centrifugacin inadecuada que genere aerosoles con material infeccioso y que entren en contacto con lesiones en piel. Los estudiantes debern cumplir con los siguientes puntos dentro del Laboratorio: 1- No correr. 2- Siempre que va a manipular o trasladar muestras dentro del Laboratorio estas debern de estar en una gradilla, no las cargue en las manos, adems utilice guantes para dicho transporte. 3- Utilice zapatos cerrados, no utilice zapatillas abiertas o sandalias. Con el objetivo de proteger los pies de salpicaduras de sangre o lesiones por vidrios quebrados. 4- Si se tiene el pelo largo amrrelo con una cola, para evitar que este se vaya a contaminar con el material que se utiliza. 5- Es importante utilizar antejos para evitar salpicaduras en los ojos, en especial en aquellas maniobras donde se puedan generar aerosoles. 6- Si se ve afectado por alguna salpicadura lave con abundante agua y en casos de alguna lesin con algn vidrio debe acudir donde un mdico que lo asista. 7- Siempre utilice gabacha dentro del Laboratorio. 8- Antes de empezar la prctica y hasta el final de la misma utilice guantes. Los guantes pueden estar hechos de ltex o vinil. En ambos casos demuestran una buena barrera protectora; sin embargo, los de ltex permiten conservar mayor sensibilidad tctil.
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Se debe tener como norma general el uso de guantes cuando se realiza cualquier procedimiento dentro del laboratorio. 9- Queda prohibido el uso de telfonos celulares durante el Laboratorio. 10- Lavado de manos. El frecuente lavado de manos es una de las medidas de precaucin ms tiles e importantes, ste se debe realizar posterior al contacto con pacientes y muestras de laboratorio, Las manos se deben lavar con agua y jabn: despus de completar el trabajo y antes de irse del laboratorio despus de quitarse los guantes antes de cualquier otra actividad donde intervenga contacto entre manos y mucosas inmediatamente despus de un contacto accidental con sangre o fluidos corporales antes de ir al servicio sanitario. 11- Limpieza de superficies de trabajo. Todas las superficies de trabajo deben limpiarse antes y despus del trabajo con cloro casero diluido 1:10 o con alcohol yodado. Otros instrumentos a desinfectar son las tijeras y las centrfugas. La dilucin de cloro recomendado inactiva al HBV en 10 minutos y al HIV en 2 minutos. Cuando ocurra un derrame de sangre o fluidos corporales se debe proceder de la siguiente manera: utilizar guantes y gabacha absorber el lquido con una toalla o papel absorbente. El objetivo de este paso es eliminar la mayor cantidad de protena, ya que las soluciones de cloro son menos efectivas en presencia de altas concentraciones protenicas limpiar la superficie con cloro diluido. Colocar un papel absorbente empapado con cloro sobre la superficie sucia
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Limpiar de nuevo y descartar todo lo usado en un recipiente de bioseguridad 12- Precaucin con agujas. Los accidentes con agujas se pueden prevenir de la siguiente manera: No tapar las agujas despus de haber sido utilizadas. No separar las agujas de las jeringas. No manipular las agujas con las manos. Poner las agujas una vez utilizadas en un recipiente rojo o naranja con el smbolo de bioseguridad. Estos recipientes deben de estar colocados cerca del rea utilizada para las flebotomas. 13Descarte de material. Todo material que resulta luego de realizar las pruebas en el Laboratorio debe ser descartado en recipientes de plstico que contengan solucin de hipoclorito de sodio al 0.5%, aqu se incluyen tubos, pipetas, portaobjetos y frascos. Mientras tanto, el material seco como gasas, aplicadores, papel debe ser depositado en bolsas de basura de material resistente, estas bolsas deben de ser de color naranja o rojo y portar el smbolo de bioseguridad. Todos los residuos del Laboratorio que contengan fluidos corporales deben ser autoclavados previo descarte definitivo.
14- Otras medidas de seguridad. No consumir comidas ni bebidas en el laboratorio. No guardar alimentos en las refrigeradoras o congeladores que contengan muestras o bolsas de sangre. Estos equipos deben de ser rotulados tambin como biopeligrosos. Es totalmente prohibido fumar dentro del laboratorio.
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Procedimiento 1
La flebotoma o recoleccin de sangre. Principio: La recoleccin de sangre debe ser practicada mediante mtodos aspticos, con un sistema cerrado, guantes y una sola puncin venosa. En caso de que la primera puncin no fuera ptima, para la segunda puncin se debe utilizar un equipo nuevo. Mtodo: Antes de la flebotoma: - Revisar la identificacin de los tubos que se van a utilizar. - Rotular el tubo con el nombre y apellidos de la persona que pertenece la muestra, nmero de identificacin que puede ser el nmero de cdula. - Indicar la persona responsable de realizar el procedimiento, ya sea con las iniciales o un nmero designado por el Laboratorio. - Otra informacin importante de indicar es la ubicacin, fecha y hora de la extraccin. Preparacin de la puncin venosa: - Inspeccionar ambos brazos y seleccionar la mejor vena. - Limpiar con un algodn impregnado con alcohol al 70% un rea de 8 centmetros alrededor del sitio seleccionado para la puncin. - Realizar la limpieza de adentro hacia afuera en forma circular. - Limpiar en dos ocasiones cuando se amerite. - La zona debe de estar seca antes de la puncin venosa. Flebotoma: - Colocar el torniquete. - Introducir la aguja en la vena seleccionada en un ngulo de 45 y con el bisel hacia arriba. - Dejar que la sangre fluya libremente dentro del tubo.
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- Si se est recolectando sangre anticoagulada inmediatamente despus de retirado el tubo del adaptador procesa a mezclar la sangre con suavidad. - Aflojar el torniquete cuando la extraccin haya concluido. - Colocar un algodn sobre la vena. - Retirar la aguja y hacer presin con el algodn sobre la vena. - Indicar al paciente que doble el brazo y que lo mantenga en esa posicin por 10 minutos. - Descartar el material con la aguja en el envase de desecho. - Colocar las muestras obtenidas en el espacio correspondiente dentro de la gradilla. Cuidados: La recoleccin de sangre es un procedimiento sencillo y seguro para las personas. No representa riesgo alguno, sin embargo, en muy pocas ocasiones se pueden presentar ciertos inconvenientes como: Desvanecimiento, lipotimia, sncope Estas reacciones pueden explicarse por una descarga vasovagal. Si esto se presenta se debe indicar a la persona que coloque la cabeza entre las piernas o coloque al paciente en posicin de Trendelemburg. Si se presenta nauseas indicar al paciente que respire profundamente. Si hay hiperventilacin el paciente debe respirar en una bolsa de papel. Si se observa una tendencia a perder el conocimiento, proteja la persona de un golpe colocando en una posicin que evite las cadas. Tomar la presin y el pulso. Hematoma durante o despus de la flebotoma Si este se presenta se debe de: Retirar inmediatamente el torniquete y la aguja del brazo. Colocar tres o cuatro gasas estriles sobre el sitio de venipuntura y aplicar firmemente presin digital durante 7 10 minutos. Una alternativa
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consiste en aplicar un apsito ajustado, que se puede retirar 7 10 minutos despus para permitir la inspeccin. Si se desea, aplicar hielo, cubierto con una gasa, en el rea durante 5 minutos. Si se sospecha una puncin arterial, retirar la aguja de inmediato y aplicar presin firmemente durante 10 minutos. Aplicar un vendaje compresivo enseguida.
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Procedimiento 2
Suspensin de trabajo en el laboratorio de Inmunohematologa, glbulos rojos al 3-5%, Principio La suspensin de trabajo de glbulos rojos al 3-5% es un procedimiento de rutina en el laboratorio de Inmunohematologa. La suspensin no requiere ser exacta, sino que puede estar en un rango de concentracin entre un 3 a 5%. Esta concentracin permite una proporcin adecuada de reaccin entre los glbulos rojos y los anticuerpos presentes en los reactivos o muestras a analizar a travs de la reaccin de aglutinacin. Este procedimiento tiene como caracterstica principal ser un mtodo cualitativo, por lo que es importante desarrollar las destrezas necesarias para realizarlo correctamente.
Materiales y muestras 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Tubos 12x75 mm limpios y secos. Pipetas Pasteur o de transferencia. Solucin salina fisiolgicas (0.9%). Muestras de sangre anticoagulada con EDTA. Centrfuga serolgica (3000 rpm ). Guantes. Gabacha. Recipientes de descarte de material.
Mtodo: Cuantitativo 1. Transfiera al menos 1 ml de sangre total a un tubo de ensayo adecuadamente rotulado. 2. Aada solucin salina 1 centmetro antes de la boca del tubo.
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3. Centrifugue 1 minuto a 3500 rpm con la centrfuga serolgica hasta obtener un paquete de eritrocitos. 4. Descartar el sobrenadante. 5. Repetir los pasos 1 al 4 dos veces ms. El sobrenadante final debe de estar claro y puede ser completamente removido. 6. Con una pipeta automtica transfiera 0.3 ml de los glbulos rojos lavados a un tubo de ensayo que contenga 9.7 ml de solucin salina fisiolgica. 7. Tapar el tubo y mezclar con suavidad hasta homogenizar la solucin. Cualitativo 1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo. 2. Con una tcnica apropiada de uso de material biopeligroso tomar una pipeta Pasteur y transferir una pequea muestra de sangre al tubo. 3. Aadir solucin salina hasta alcanzar una coloracin rojo tomate. 4. Realice comparaciones visuales con soluciones ya preparadas al 3-5% 5. Descartar el material en los recipientes destinados en el laboratorio. Prctica: Realizar al menos 5 suspensiones de forma cualitativa hasta determinar qu cantidad de sangre y de solucin salina deben de se aadidos para hacer una suspensin de trabajo. Tenga presente que los seres humanos poseen diferentes valores de hematocrito (proporcin de glbulos rojos en sangre) por lo que la cantidad de muestra necesaria para realizar una buena suspensin de trabajo puede variar, de ah que es muy importante desarrollar la destreza para hacer suspensiones entre el 3-5%. Repita el procedimiento tantas veces sea necesario, hasta que domine la tcnica y las proporciones. Resultados, discusin y conclusiones: _______________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Procedimiento 3
Lavado de muestras en Inmunohematologa. Principio Los lavados de muestras sanguneas para obtener slo el paquete globular es un procedimiento de rutina dentro de cualquier seccin de Inmunohematologa. El propsito es eliminar cualquier interferente proteico que pueda alterar la reaccin de aglutinacin. Este aspecto es tan importante que se pueden obtener reacciones falsas positivas o negativas a partir de muestras mal lavadas. Materiales y muestras: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Tubos 12x75 mm limpios y secos Pipetas Pasteur o de transferencia Solucin salina 0.9% Centrfuga serolgica (3000 rpm ) Guantes Gabacha Recipientes de descarte de material Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA
Mtodo: 1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo. 2. Transferir con una pipeta Pasteur y tcnica apropiada de uso de material biopeligroso una muestra de sangre que no pase de 1 ml a un tubo de ensayo. 3. Aadir solucin salina hasta alcanzar 1 centmetro antes de la boca del tubo. 4. Equilibrar y centrifugar por 1 minuto a 3500 rpm en una centrfuga serolgica. 5. Una vez centrifugado debe de quedar un paquete globular. 6. Descartar el sobrenadante. 7. Resuspender los glbulos rojos. 8. Aadir solucin salina hasta 1 centmetro antes de la boca del tubo. 9. Repetir el mismo procedimiento dos veces ms.
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10. En el ltimo lavado debe de quedar un sobrenadante claro. 11. Descartar el sobrenadante y realizar una suspensin de trabajo al 3-5% 12. Descartar el material en los recipientes adecuados de la prctica. Prctica: Realizar al menos cinco lavados de glbulos rojos. Repetir el procedimiento tantas veces sea necesario hasta que domine la tcnica. Resultados, discusin y conclusiones: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________
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Procedimiento 4
Lectura, interpretacin y escore de las reacciones de aglutinacin. Principio Cuando se presentan reacciones de aglutinacin se pueden observar diferentes grados y fuerzas de reaccin entre los antgenos y los anticuerpos. Esta observacin es muy importante en Inmunohematologa, pues se puede utilizar estas caractersticas distintivas para identificar situaciones donde se presentan casos de mezclas de anticuerpos, mezclas de sangre e incluso haciendo uso de un escore o puntuacin determinar si los glbulos rojos en estudio son homocigotas o heterocigotos para un determinado sistema de grupo sanguneo.
Materiales y Muestras: 1- Reactivo anti-A. 2- Glbulos A al 3-5% 3- Tubos de ensayo 4- Pipetas volumtricas de 1 ml, 5ml y 10 ml 5- Pipetas automticas 6- Centrfuga serolgica (3500 rpm) 7- Solucin salina 0.9% 8- Recipientes de descarte de material 9- Un marcador permanente 10Guantes 11Gabacha Mtodo: Realizar a un volumen final de 100 ul diluciones dobles del antisuero (reactivo de anti-A) con solucin salina hasta una dilucin final de 1:512 de la siguiente manera.
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1- Rotular los tubos correspondientes. 2- Colocar 100 ul. de solucin salina del tubo rotulado 1:2 hasta el tubo 1:512. 3- Dispensar 100 ul. del reactivo anti A al tubo rotulado 1:1 y al tubo rotulado 1:2. 4- Mezclar el tubo 1:2 5- Transferir 100 ul del tubo 1:2 al siguiente tubo 1:4. 6- Mezclar, continuar el procedimiento de forma repetitiva hasta llegar al tubo 1: 512. 7- Descartar los ltimos 100 ul. 8- Aadir una gota de las clulas A a cada uno de los tubos. 9- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 10Desprender el botn con suavidad frente a la luz para observar el grumo. 11Anotar las caractersticas observadas en cada reaccin de aglutinacin y asignar el puntaje que correspondiente en base a la informacin de la tabla 1. Tabla 1: Caracterstica del grumo, intensidad de reaccin y puntaje obtenido. Designacin en cruces 4+ 3+ 2+ 1+ Positivo dbil +/H Escore o Puntuacin 12 10 8 5 2 12
Observacin Macroscpica Un solo grumo de aglutinacin Un grumo grande con varios medianos. Muchos grumos medianos Grumos pequeos con fondo turbio Fondo turbio con grumos muy pequeos Hemlisis
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Resultados: De las reacciones que obtuvo lea, interprete, describa y dibuje el grado de aglutinacin de las reacciones segn corresponda: Escore Una reaccin de 4+ Una reaccin de 3+ Una reaccin de 2+ Una reaccin de 1+ Una reaccin negativa Una reaccin de campo mixto Una reaccin de hemlisis Observacin
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Procedimiento 5
Determinacin en tubo del grupo sanguneo ABO en adultos. Principio: El sistema de grupo sanguneo ABO fue el primer sistema descubierto por el Dr. Karl Landsteiner en 1900 y que le vali el premio Nobel en Fisiologa y Medicina del ao 1930. (1)
Este sistema involucra tres antgenos: A, B y H. El antgeno H se produce por la accin de una fucosiltransferasa capaz de aadir una fucosa a la sustancia precursora. La sustancia H puede ser convertida en el antgeno de grupo sanguneo A por accin de la transferasa A que aade una N-acetil galactosamina a la cadena precursora o una galactosa en el caso de la transferasa B; el fenotipo O es el resultado de una transferasa inactiva, la cual es incapaz de aadir carbohidratos al antgeno H. Los seres humanos mayores de 3 a 6 meses de edad desarrollan a travs de una respuesta T independiente anticuerpos antitticos naturales del tipo IgM capaces de activar al complemento contra los antgenos ABO que no se posean. Se desarrollan a partir de la estimulacin de sustancias tipo azcares presentes en los alimentos y bacterias del medio. Este sistema es de gran importancia en el campo de la medicina transfusional y en la investigacin clnica. Ha sido de gran ayuda en el mbito antropolgico donde lo han utilizado como marcador serolgico en gentica de poblaciones, desarrollo embrionario, diferenciacin celular y en las neoplasias.(2,3) El siguiente procedimiento es un mtodo aceptable, sin embargo, recuerde que existen diferentes casas comerciales y que cada una utiliza distintos componentes para fabricar reactivos as como los tiempos de incubacin y de reaccin, por lo que nunca se debe de pasar por alto leer la especificacin tcnica que recomienda la casa comercial para el uso de reactivos.
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Materiales y muestras: Tubos de ensayo 12x75 mm Pipetas Pasteur Solucin salina Centrfuga serolgica Recipientes de descarte de material Guantes Gabacha Marcador permanente (pilot) Para realizar las determinaciones, generalmente se utilizan muestras de sangre total anticoagulada con EDTA (tubo tapn lila), sin embargo, tambin se pueden utilizar sangre sin anticoagunlante. (tubo tapn rojo). Los glbulos rojos pueden ser suspendidos en el suero autlogo, plasma o solucin salina, pueden ser lavados y resuspendidos en solucin salina antes de la prueba. Reactivos 1- Anti-A 2- Anti-B 3- Clulas A1 y B. Estas clulas pueden ser obtenidas comercialmente o preparadas diariamente en el laboratorio en una suspensin entre el 3-5% Mtodo: Grupo eritrocitario, (Prueba directa): 123456789Rotular 2 tubos como A y B. Homogenizar la muestra de sangre. Realizar una suspensin de trabajo entre el 3-5%. Agregar una gota de la suspensin de trabajo a los tubos rotulados como A y B. Aadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A. Aadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B. Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm. Resuspender suavemente el botn. Leer, anotar e interpretar las reacciones.
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Prueba en suero/plasma (grupo inverso) 12345678Centrifugar la muestra a analizar por 5 minutos. Rotular dos tubos como clulas A y clulas B. Aadir al tubo rotulado como clulas A una gota de clulas A al 3%. Aadir al tubo rotulado como clulas B una gota de clulas B al 3%. Aadir a cada tubo dos gotas de suero /plasma de la muestra centrifugada. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm. Leer, anotar e interpretar las reacciones. Comparar los resultados obtenidos con el grupo eritroctico.
Prctica: Determinar el grupo ABO eritroctico y srico de al menos 10 muestras sanguneas y que en ellas vayan todas las posibles combinaciones de grupos ABO. Resultados, discusin y conclusiones: Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Anti-A Anti-B Clulas - A Clulas- B Interpretacin
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Procedimiento 6
Determinacin en tubo del grupo sanguneo ABO en recin nacidos Principio La determinacin del grupo sanguneo ABO en el recin nacido es de suma importancia en la deteccin y diagnstico de la enfermedad hemoltica del recin nacido, as como en la terapia transfusional. En este tipo de paciente, debido a la inmadurez del sistema inmune al nacimiento no se tiene la capacidad de producir anticuerpos hasta los primeros tres a seis meses de vida, razn por la cual la prueba srica o inversa no puede ser aplicada. Tambin las reacciones de aglutinacin con el grupo eritroctico tienden a dar ms dbil que en los pacientes adultos debido a que los determinantes antignicos ABO en los glbulos rojos se encuentran en poca cantidad, pobremente ramificados y expresados en comparacin con los antgenos de glbulos rojos de personas adultas. Es por lo anterior que en la determinacin de grupo sanguneo ABO del Recin Nacido se aade a la batera de reaccin un tubo adicional para el reactivo antiAB que ayude a detectar y confirmar la reaccin. Una de las ventajas de utilizar este reactivo adicional es que va dirigido contra otros determinantes antignicos que los reactivos anti-A o anti-B individuales, por lo que al utilizar los tres reactivos en conjunto aumenta las posibilidad de deteccin antignica en contraposicin que si se utilizara slo un medio de reaccin, disminuyendo as las reacciones falsas negativas (1,2) Materiales y muestras Tubos de 12 x75 mm Pipetas Pasteur Solucin salina Centrfuga serolgica Recipientes de descarte de material Guantes
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Gabacha Marcador permanente (pilot) Muestras de Sangre de cordn umbilical Reactivos 1- Anti-A 2- Anti-B 3- Anti-AB Mtodo: Por lo general se utilizan muestras de sangre de cordn umbilical (tubo tapn rojo). A una alcuota de la muestra realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica. Del paquete globular lavado hacer una suspensin de trabajo entre el 3-5%. Lo anterior debido a que este tipo de muestra posee muchos elementos adiciones interferentes como son la mezcla de sangre materna y la gelatina de Wharton que interfieren con las reacciones de aglutinacin. 1- Rotular 3 tubos de prueba como A, B y AB. 2- Transferir una gota de la suspensin de trabajo a los tubos rotulados como A, B y AB. 3- Aadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A. 4- Aadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B. 5- Aadir al tubo rotulado como AB dos gotas del anti AB. 6- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3500 rpm. 7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.
Prctica: Realizar la determinacin de al menos 5 muestras de recin nacido, tratar que no sean del mismo grupo ABO.
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Muestra 1 2 3 4 5
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
Interpretacin
Comentarios y anotaciones adicionales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ____________________________________________________________
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Procedimiento 7
Determinacin en tubo de subgrupos sanguneos ABO. Principio El sistema de grupo sanguneo ABO presenta dentro de sus caractersticas algunos fenotipos poco frecuentes clasificados como subgrupos, los cuales se hacen evidentes a nivel de laboratorio como reacciones de aglutinacin ms dbil de lo esperado. Razones que justifican la presencia de estos subgrupos son: - Mutaciones en los genes A y B que provocan la expresin aberrante de los genes, codificando la produccin de glicosiltransferasas con menor actividad enzimtica para la conversin del antgeno H. - Expresin dbil de un alelo alterno que se ubica en el locus ABO. - Efecto de genes modificadores o inhibidores que regulen la expresin de los genes ABO. La mayor frecuencia de subgrupos ABO es para el antgeno A. Los eritrocitos de los diferentes subgrupos de A varan ampliamente en la densidad antignica. Se ha calculado que los eritrocitos que son A1 pueden expresar entre 1-1.5 millones de sitios antignicos en contraposicin con eritrocitos Am o Ael donde se ha podido determinar apenas expresan unos 2000 sitios antignicos. Los subgrupos de A se clasifican en: A1, A2, A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael. Los subgrupos de B se clasifican en: B3, Bx, Bm, Bel. Los subgrupos de ABO pueden ser detectados a travs de patrones de reaccin serolgica incongruentes entre los resultados de la prueba directa con la prueba inversa. La observacin minuciosa de los siguientes aspectos es fundamental para determinar las caractersticas de los diferentes subgrupos:
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Grado de aglutinacin con anti-A y anti-A1. Grado de aglutinacin con anti-AB. Grado de aglutinacin con anti-H. Presencia de anticuerpos anti-A1 en el suero. Presencia de sustancias A, B y H en secreciones de saliva. Estudios de Absorcin/Elucin para antgenos ABH en eritrocitos.
Mtodo: Tcnica en tubo para la deteccin del antgeno A1 utilizando la lectina Dolichos biflorus. A cada tubo adecuadamente rotulado aadir 1 gota suspensin entre el 3-5% de glbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O. A los tubos anteriores aadir 1 gota de la lectina anti-A1. Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm. Leer, anotar e interpretar los resultados obtenidos. Interpretacin: - Positivo: presencia de reaccin de aglutinacin de 1+ a 4+. - Negativo: Ausencia de reaccin de aglutinacin. Tcnica en tubo para la deteccin del antgeno H utilizando la lectina Ulex europeaus: Aadir 1 gota suspensin de glbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O a cada tubo adecuadamente rotulado. Aadir 1 gota de la lectina anti-H a cada tubo. Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm. Leer por aglutinacin y anotar los resultados. Interpretacin: - Positivo: presencia de reaccin de aglutinacin de 1+ a 4+. - Negativo: Ausencia de reaccin de aglutinacin.
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Prctica 1) Determinar el grupo ABO de al menos 10 muestras. Muestra 1 2 3 Anti-A Anti-B Clulas- A Clulas-B Interpretacin
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2) De las muestras clasificadas escoger las de grupo A y O para determinar la cantidad de sustancia A o H con las lectinas anti-A1 y anti-H. 3) Hacer las lecturas e interpretar los comentarios que considere necesarios. 4) Anotar en orden de fuerza de aglutinacin las reacciones utilizando Lectina anti - A1 y Lectina anti H para clulas A1B, A1, B, O, A2 y A2B. 5) Realizar determinaciones en recin nacido. 6) A las muestras de glbulos rojos rotulados como 1, 2, 3 y 4 realizar slo el grupo eritroctico y anotar el resultado. Muestra Anti-A
Grado de Aglutinacin Fondo
Anti-B
Anti-AB
Interpretacin
Anotaciones: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Procedimiento 8
Determinacin en tubo del antgeno Rh/ D. Principio La definicin de Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausencia del antgeno Rh (D) en los eritrocitos humanos. El primer anticuerpo contra el antgeno D fue descrito en 1939 por Levine y Stetson, encontrado en el suero de una mujer cuyo hijo haba padecido de una enfermedad hemoltica del recin nacido y adems haba presentado una reaccin hemoltica despus de haber sido transfundida con sangre de su esposo. En 1940, Landsteiner y Wiener describieron el anticuerpo obtenido por inmunizacin de cerdos y conejos con glbulos rojos del mono Macacus rhesus. Estos aglutinaron aproximadamente el 85% de las pruebas con eritrocitos humanos y fueron denominados con el correspondiente factor Rh positivo y los que no reaccionaron como Rh negativo. El trmino Rh se nombra en honor a la especie en que se descubri el antgeno Los antgenos del sistema Rh se encuentran en los seres humanos y en algunas especies de primates. El antgeno D est completamente desarrollado al nacer. Los reactivos anti-D pueden tener tres tipos de presentacin, los de alto contenido proteico, los salinos a base de IgM y los qumicamente modificados, que son IgGs con mayor capacidad aglutinante que los IgG nativos. Los de alto contenido proteico poseen una concentracin entre el 20-24% ms otros aditivos macromoleculares dando un resultado ms pronto y una lectura ms fiable. El diluyente de elevado peso molecular puede producir aglutinacin espontnea de los eritrocitos si estos se encuentran recubiertos de inmunoglobulinas como son los casos de autoinmunidad y de la enfermedad hemoltica del recin nacido.
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Un aspecto a tomar en consideracin es que estos sueros, debido a los aditivos que se le aaden para ayudar a la aglutinacin pueden producir reacciones falsas positivas. Para detectar estos falsos positivos, es importante correr paralelamente con la prueba de Rh una prueba control, utilizando un reactivo inmunolgicamente inerte preparado por la misma casa comercial del reactivo anti-Rh. Este control posee los mismos aditivos que estn en el reactivo anti-D, pero sin los anticuerpos. Si las clulas que estn en estudio son aglutinadas por este control, el resultado de la prueba debe ser invalidado, siendo necesario analizarlo por otro mtodo. En caso de ausencia del reactivo control se puede utilizar albmina bovina al 22% como medio control produciendo incluso menos falsos positivos que el anterior ya que la albmina no contiene los potenciadores de alto peso molecular pero s su alto contenido proteico.
Reactivos 1- Anti-D, IgG -IgM de alta concentracin proteica. 2- Reactivo para el control de Rh, manufacturado segn la casa comercial o Albmina al 22%. Materiales y muestras 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Tubos de pruebas limpios y secos. Pipetas Pasteur. Solucin salina 0.9%. Centrfuga serolgica (3000 rpm ). Guantes. Gabacha. Recipientes de descarte de material. Tubos de ensayo. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
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Mtodo: 1- Marcar dos tubos uno como D Rh y otro como control Ctrl. 2- Agregar al tubo rotulado como D, 1 gota del reactivo anti-D. 3- Agregar al tubo rotulado como control, 1 gota del reactivo control y en caso de no disponer de albmina. 4- Aadir 1 gota de la suspensin entre el 3-5% de los glbulos del paciente en estudio. 5- Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm en una centrfuga serolgica. 6- Resuspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.
Interpretacin: Tabla 2: Interpretacin de los resultados de Rh Control 0 0 Interpretacin Rh (D) Rh negativo Rh positivo
Anti-D 0 1+ a 4+
Si el control est positivo el resultado se considera invlido. Si esto ocurre, lave los eritrocitos con solucin salina a 37C previo a preparar la suspensin de clulas y repita la prueba. Si prevalece el resultado positivo en el control, el resultado del Rh (D) se considera invlido y se requiere investigacin adicional con la utilizacin de reactivos con anti-D salino o qumicamente modificado.
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Procedimiento 9
Deteccin del antgeno D dbil Principio Algunos glbulos rojos expresan ms dbilmente el antgeno D en la membrana, esta condicin puede provocar que en la primera fase del anlisis cuando se trabaja con reactivos de alto contenido proteico se presenten resultados positivos y con otros una reaccin negativa. Estas discrepancias se resuelven cuando las pruebas con resultados negativos se llevan a la fase de antiglobulina, detectando el antgeno con expresin dbil que en la primera fase no se logr detectar. Debido a la trascendencia desde el punto de vista transfusional o en la prevencin de la enfermedad hemoltica del recin nacido, todo estudio serolgico con anti-D proveniente de un donante de sangre o un recin nacido con una lectura negativa en la primera fase se debe continuar hasta la fase de antiglobulina para confirmar el resultado.
Mtodo: 1- Si la prueba de Rh da resultado negativo incubar el tubo estudio y el tubo control por 30 minutos a 37C. 2- Lavar 3 veces las muestras con solucin salina 0.9% 3- Secar bien la ltima gota. 4- Aadir dos gotas del reactivo de antiglobulina humana. 5- Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm. 6- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados 7- Confirmar reactividad de reactivo agregando una gota de Clulas Control de Antiglobulina Humana 8- Mezclar y volver a centrifugar los tubos por 15 segundos a 3500 rpm. 9- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.
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Interpretacin de resultados: La aglutinacin en el tubo de anti-D y la ausencia de aglutinacin en el tubo control indican un resultado positivo. La sangre debe de clasificarse como Rh positivo. La ausencia de aglutinacin en ambos tubos, el estudio y control indican un resultado negativo y la sangre debe de clasificarse como Rh negativo. Presencia de aglutinacin en el tubo control invalida la prueba y debe de repetirse. Si esta vuelve a dar positivo, se debe considerar un estudio para Anemia Hemoltica Autoinmune iniciando con una prueba de antiglobulina directa.
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Procedimiento 10
Clulas Control de Antiglobulina Humana. Principio Las Clulas Control de Antiglobulina Humana son glbulos rojos sensibilizados con inmunoglobulina tipo IgG, son utilizadas para validar metodologas en tubo con resultados negativos en la fase de antiglobulina humana. La presencia de aglutinacin despus de ser aadidas al medio de reaccin indica que los lavados fueron realizados adecuadamente y todos los restos proteicos fueron eliminados, no neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y el resultado de la prueba puede ser validado. Cuando una prueba de antiglobulina humana da un resultado negativo quiere decir que no hubo reaccin antgeno-anticuerpo, los glbulos rojos en prueba no contienen el antgeno especifico para el antisuero que se est probando o el suero en estudio no tiene anticuerpos contra ninguno de los antgenos expresados en los eritrocitos utilizados, por tanto, en el tubo de reaccin debe de quedar reactivo anti-IgG activo y funcional presente en el medio. Al adicionar las Clulas Control de Antiglobulina Humana las IgG activas libres reaccionan con las clulas provocando la aglutinacin. Por otro lado, si se presenta un resultado negativo despus de ser aadidas indica que los lavados fueron realizados incorrectamente, quedaron restos de inmunogloblinas que neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y la prueba debe ser invalidada y repetida.
Materiales y Reactivos: Clulas Control de Antiglobulina Humana entre el 3 5 % obtenidas de casa comercial o preparadas en el laboratorio. Tubos de pruebas Gradillas
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Pipetas Centrfuga serolgica Procedimiento: 1- Mezcle y resuspenda con suavidad las clulas del reactivo de Control de Antiglobulina Humana 2- Aada 1 gota de las Clulas Control de Antiglobulina Humana a cada tubo con resultado negativo en la prueba de inmunoglobulina humana incluyendo al control. 3- Mezcle y centrifugue 15 segundo a 3500 rpm 4- Resuspenda cuidadosamente, lea, anote e interprete los resultados.
Prctica: Determine el grupo ABO y Rh de al menos 10 muestras sanguneas.
Conclusin: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Resultados, discusin y conclusiones:

Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Clulas Control de AGH Interpretacin
10
Nota: No olvide reportar los resultados en cruces en base a la intensidad de aglutinacin.

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Procedimiento 11
Conservacin de Glbulos Rojos. Preservacin de la sangre: Los glbulos rojos pueden ser preservados con diversos propsitos como por ejemplo: - Preservacin de hemocomponentes para ser utilizados con fines teraputicos. - Investigacin. - Fuente de reactivos como las clulas rastreadoras, clulas control de Antiglobulina Humana, clulas A1, B. - Control de calidad de los antisueros utilizados de manera rutinaria en los Bancos de Sangre y servicios de Inmunohematologa y dems. Existen diversas soluciones que ayudan a anticoagular y conservar los glbulos rojos como son el: - ACD (adenina, citrato, dextrosa), - CPD (citrato, fosfato, dextrosa), - CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Otros pueden ser soluciones aditivas que lo que permiten es slo su conservacin brindando fuente de energa y sustancias precursoras para su biosntesis normal, entre los que se encuentra el Alsever, Adsol, y el Alsever modificado. La parte ms importante de las soluciones para la conservacin de clulas rojas en estado lquido, es que deben proporcionar el mantenimiento intacto del fenotipo eritrocitario y reducir los riesgos de contaminacin microbiana durante largo tiempo, lo cual posibilita su uso para pruebas diagnsticas in vitro y su comercializacin. Soluciones slo anticoagulantes como el EDTA, alteran a cabo de un tiempo la morfologa normal del glbulo rojo, por lo que no pueden ser utilizadas para este propsito.
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Mtodo Obtener una muestra de su propia sangre siguiendo instrucciones del procedimiento 1 de este manual. Recolectar 10 ml y dividirla entre un tubo con EDTA (tapn lila) y un tubo con solucin de Alsever. Rotular con sus datos personales el tubo con Alsever y colocarlo en la gradilla para ser guardado en refrigeracin a 4C. Es muy importante guardar la muestra pues con ella se trabajar en prcticas posteriores.
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Procedimiento 12
Determinacin del fenotipo Rh Principio Aparte del antgeno D se han descrito otros antgenos pertenecientes al sistema Rh, especficamente ms de 50 diferentes, sin embargo, de estos los principales por su capacidad de inducir una respuesta inmune y por ende implicados en reacciones transfusionales o en la enfermedad hemoltica del recin nacido son los antgenos C, E, c y e. La asociacin de estos factores antignicos indica que la actividad inmunolgica del sistema Rh proviene de un material de superficie con diversos determinantes antignicos. Algunas asociaciones de antgenos incluyen al D y otras no. La composicin de estas combinaciones antignicas est determinada genticamente. Dos genes homlogos y estrechamente ligados son los responsables de la produccin de los cinco antgenos principales del sistema Rh. Uno llamado RHD determinar la produccin o la no produccin del antgeno D, mientras que el otro gen RHCE ser el encargado de la produccin de los antgenos C, c, E y e. Se han reconocido numerosas combinaciones y variantes de estos genes, pero los cinco antgenos indicados y sus anticuerpos los ms frecuentes del sistema. De igual manera que para el antgeno D, se encuentran disponibles en el mercado reactivos pobres en protenas (qumicamente modificados o monoclonales) o ricos en protenas con anticuerpos especficos para determinar la presencia de los antgenos C, E, c y e. Pueden producir reactividad variable con diferentes haplotipos en los eritrocitos (fenmeno de dosis), por lo que esta debe ser considerada dependiendo de los antgenos expresados en membrana a la hora de hacer un fenotipo de Rh, por ejemplo CDE o CE son los responsables de la mayora de la expresin de C en los eritrocitos humanos.
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Se ha reportado antgenos variables E y c, pero son considerablemente menos comunes. Cualesquiera que sean los reactivos utilizados, las indicaciones del fabricante deben ser seguidas cuidadosamente. Los concentrados de sueros humanos usados para preparar reactivos, de los dems antgenos Rh; tienen riesgo significativo de contener especificidades contaminantes reactivas con la antiglobulina, anticuerpos irregulares e inducir poliaglutinacin. Para evitar estas y otras situaciones, es recomendable correr en paralelo con la prueba controles positivo y negativo para los antgenos en estudio. Los eritrocitos seleccionados para el control positivo deben tener preferiblemente una sola dosis del antgeno implicado. La frecuencia de estos antgenos en poblacin caucsica es de: C: 70%, c: 80%, E: 30% y e: 98% respectivamente. Materiales y Reactivos: Anti-C, Anti- c, Anti-E, Anti-e, Anti-D, anti-A, anti-B, anti-AB Clulas A1, clulas B, clulas control de antiglobulina humana Reactivo de antiglobulina humana Albmina 22% Solucin salina 0.9% Solucin de Alsever Tubos de ensayo para anlisis Pizetas Pipetas pasteur Centrfuga serolgica Guantes Gabacha Jeringas Agujas Tubos con EDTA Tubos con solucin de Alsever Algodn Alcohol al 70%
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Recipientes de descarte de muestras y material
Muestras: Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular.
Mtodo: Preparar una suspensin de clulas al 3 5% en solucin salina fisiolgica. Rotular tubos como D, C, E, c, e y control. Aadir una gota del reactivo a cada tubo rotulado. Aadir una gota de la suspensin a analizar a todos los tubos. Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer, anotar las reacciones Incubar los tubos que dieron reaccin negativa a 37C por 15 minutos. Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer, anotar e interpretar las reacciones.
Interpretacin de resultados: Una aglutinacin de 1+ a 4+ indica que hubo reaccin antgeno - anticuerpo, por lo que la prueba debe ser considerada positiva. La no presencia de aglutinacin en el medio indica la ausencia del antgeno y por lo tanto la prueba es negativa. Muchos de estos antisueros son del tipo IgM, o IgG qumicamente modificados por lo que no se debe de llevar hasta la fase de antiglobulina humana, slo con la incubacin a 37C y centrifugacin es suficiente.
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Prctica: Con el tubo de EDTA de su sangre realizar una suspensin entre el 3- 5% y determinar el grupo sanguneo ABO/Rh y el fenotipo C, E, c y e. Seguir realizando determinaciones de grupo en adulto y recin nacido. Resultados:
Anti-A
Anti-B
Clulas A
Clulas B
Anti-D
Control
Mi grupo sanguneo es:
Anti-C
Anti-c
Anti-E
Anti-e
Mi fenotipo Rh es:
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Muestra
Anti-A
Anti-B
Cel.- A
Cel.- B
Anti-D
Control
Clulas Control de AGH
Interpretacin
10
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Procedimiento 13
Determinacin de la sustancia H en saliva Principio El gen Se es el responsable de la expresin del antgeno H en las secreciones. En las personas secretoras se puede encontrar sustancia H en saliva, orina, lgrimas, lquido amnitico, leche y fluidos digestivos. La cantidad encontrada en estas secreciones puede variar dependiendo del grupo ABO. Si las personas son del grupo A, B o AB y heredaron el gen Secretor, se pueden detectar sustancias A, B o ambas en las secreciones. La mayora de la sustancia H encontrada en secreciones pertenecen a individuos del grupo O pasando por las secreciones de los individuos A o B, hasta llegar a individuos del grupo AB donde puede estar ausente debido a que prcticamente toda ha sido convertida. El gen Se es de carcter dominante sobre se. El 80% de la poblacin es secretora debido a que hered el gen Se. El gen se no se ha asociado con la codificacin de algn producto demostrable, por lo que se dice que es un gen amorfo y representa al 20% de la poblacin.
Reactivos y materiales Sets de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, anti H, albmina 22% y reactivo de antiglobulina humana Solucin salina fisiolgica Clulas al 3% de los grupos A1, B y O Muestras con sangre para analizar. Beacker de 10 25 ml Tubos tipo Pirex Pipeteadores Pipetas de 10 ml
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Trpodes Mecheros de bunsen Chispas para mechero Cedazos Centrfugas serolgica Centrfugas de tubos Pipetas Pasteur Goteros para pipetas pasteur Tubos de 12 x 75 mm Micropipetas de 100-200 ml (en este caso poner puntas de micropipetas) Pipetas de 1 ml Papel parafilm Material de descarte Gradillas metlicas Gradillas madera Puestos de descarte por mesa y material necesario para la limpieza de las mesas. Preparacin de la muestra: Colectar aproximadamente 5 ml de saliva fresca en un beaker o frasco de vidrio de boca ancha. Transferir la saliva a un tubo 12x75 mm y centrifugue 5 minutos a 3000 rpm. Transferir el sobrenadante claro a un tubo de vidrio tipo pirex. Colocar el tubo en un bao de agua hirviendo por 10 minutos Transferir nuevamente la saliva a un tubo 12 x 75 mm Centrifugar la muestra por 5 minutos a 3500 rpm Utilizar el sobrenadante claro y opalescente inmediatamente para su estudio. Si no lo va a procesar al momento se puede congelar a -20C para su posterior anlisis. Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos O, A1 y B.
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Preparacin de reactivos: El siguiente procedimiento se va a realizar por mesa de trabajo y de este van a realizar sus respectivas pruebas. Realizar diluciones dobles del reactivo anti-A, anti-B y anti-H hasta obtener una aglutinacin de 2+. Mtodo: Determinacin de la sustancia A, B o H en saliva: Pipetear 100 ul. del sobrenadante de la saliva en dos tubos de ensayo limpios. Rotular uno como H y otro como control negativo. Aadir 50 ul de solucin salina al tubo rotulado como control negativo. Aadir 50 ul de la lectina anti-H diluida al tubo rotulado como H. A otro tubo rotulado como control positivo aadir 100 ul de la lectina anti-H diluida con 50 ul de solucin salina. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Aadir 50 ul de la suspensin de glbulos rojos O a los tres tubos de reaccin. Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm. Resuspender, leer e interpretar lo resultados Realizar el mismo procedimiento cambiando el reactivo diluido anti A o anti B para determinar la presencia de sustancias A, B o ambas en saliva.
Interpretacin de resultados: Si la sustancia H est presente en la saliva, la lectina anti-H aadida al medio de reaccin es neutralizada y los glbulos rojos no aglutinan, a estos individuos los clasificamos como Secretores.
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Si en la muestra no hay sustancia H la lectina anti-H no es neutralizada y los clulas pueden aglutinar con el reactivo presente en el medio. A estos individuos los clasificamos como No Secretores. El anterior principio lleva al concepto de inhibicin de la hemaglutinacin. Para validar la prueba se debe correr un control positivo y negativo en paralelo a la muestra a analizar. En estos casos el control positivo debe de aglutinar indicando que el anti-H fue diluido correctamente y queda libre para reaccionar con los glbulos. El control negativo indica que no hay sustancias interferentes en la saliva que produzcan aglutinacin espontnea en el medio. Prctica: Determinar estado secretor en saliva. Seguir realizando determinaciones de grupos sanguneos.
Resultados:
Reaccin de inhibicin de la hemaglutinacin

Sustancia H Control Positivo Control Negativo Sustancia A Control Positivo Control Negativo Sustancia B Control Positivo Control Negativo
Estado secretor:
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Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Clulas Control de AGH Interpretacin
10
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Procedimiento 14
Determinacin fenotpica del sistema MNSs Principio Los antgenos M y N fueron descubiertos en 1927, cuando Landsteiner y Levine obtuvieron los anticuerpos que los definan mediante la inmunizacin de conejos con glbulos rojos humanos. Son dos genes estrechamente ligados uno que codifica para los antgenos MN y el otro para los antgenos Ss. En este sistema se agrupan 3 antgenos de alta frecuencia y al menos 30 de baja frecuencia. Los antgenos del sistema de grupo sanguneo MNSs se encuentran ubicados en protenas integrales de membrana del glbulo rojo de 43 KDa. Los antgenos MN se localizan en la glicoforina A (GPA) y los Ss en la glicoforina (GPB), tambin se han ubicado los antgenos del sistema Gerbich en las glicoforinas C y D. Las glicoforinas adems de interaccionar con el citoesqueleto del glbulo rojo poseen alta cantidad de cido silico en su estructura lo que ayuda a brindar la carga negativa a la membrana. La diversidad antignica est basada predominantemente en las recombinaciones genticas, recombinaciones homlogas o conversiones gnicas. Los eritrocitos que carecen de los antgenos S y s son tambin negativos para el antgeno del alta frecuencia U. Los antgenos M y N as como los S y s se comportan como productos de pares de genes allicos, manteniendo una clara relacin allica. Los anticuerpos contra antgenos del sistema MNSs se han involucrado como causa de reacciones hemolticas transfusionales, agudas o tardas, especialmente en pacientes politransfundidos.
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Los anticuerpos anti-M y anti-N pueden mostrar efecto de dosis dando reacciones significativas ms intensas y con altos ttulos en presencia de glbulos rojos homocigotos para los antgenos que frente a glbulos rojos heterocigotos. El anti-M se detecta en el suero humano como una aglutinina en solucin salina a temperatura ambiente sin antecedentes de transfusin; condicin que le permite su denominacin de anticuerpo natural. El anti-M rara vez produce problemas clnicos, aunque cuando reacciona a 37C o en fase de antiglobulina se puede considerar como significativo, especialmente si este es del tipo IgG. El hallazgo de un anti-N es menos frecuente que el anti-M, es una IgM y tpicamente se comporta como crioaglutinina, eventualmente puede presentarse como una IgG con expresin clnica significativa, como ocurre en los pacientes bajo hemodilisis. En estos pacientes posteriormente se logr asociar la produccin del anticuerpo anti-N con el uso de membranas de dilisis esterilizadas con formaldehido. Dado que las enzimas destruyen los antgenos, la reactividad anti-M y el anti-N puede ser eliminada por tcnicas enzimticas habituales. Los antisueros comerciales anti-M o anti-N debido a que han sido seleccionados y estandarizados para reaccionar adecuadamente con todos los glbulos en estudio en muy raras ocasiones presentan efecto de dosis a diferencia de los anticuerpos producidos por los pacientes. Frecuentemente se encuentran casos de anti-M que reaccionan slo con glbulos rojos homocigotos. Por el contrario, los sueros de anti-N rara vez producen este efecto. Los anticuerpos anti-S, anti-s y anti-U pueden aparecer posterior a una estimulacin eritrocitaria, se detectan en la fase de antiglobulina e in vivo muestran una significativa actividad hemoltica.
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La frecuencia de fenotipos del sistema MN en poblaciones caucsicas es de: MM: 28%, MN: 50% y NN: 22%
Reactivos Se dispone de reactivos comerciales para determinar los antgenos MNS y s. Estos se obtienen a partir de inmunizacin de animales, de origen humano, anticuerpos monoclonales de ratn y de lectinas. La lectina ms ampliamente utilizada como reactivo anlogo del anti-N es el extrado de las semillas de Vicia gramnea. En la mayora de los casos, los reactivos obtenidos de estas distintas fuentes darn reacciones concordantes, pero pueden a veces hallarse discrepancias por sutiles diferencias de especificidad, por lo que es imprescindible seguir estrictamente las indicaciones de la casa comercial. Materiales y muestras: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Tubos de pruebas limpios y secos Pipetas pasteur Solucin salina 0.9% Centrfuga serolgica (3000 rpm ) Guantes Gabacha Recipientes de descarte de material Tubos de ensayo Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA
Procedimiento para la deteccin de los antgenos MN: 123456Preparar suspensiones de glbulos rojos al 3-5% en solucin salina. Identificar los tubos a analizar como M y N. Aadir 50ul del antisuero correspondiente. Aadir 50ul de la suspensin de glbulo a analizar. Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. Resuspender las clulas e interpretar las reacciones
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Tabla 3:
Interpretacin de resultados sistema MN Anti-M 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-N 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpretacin MM NN MN
Siempre incluya como control muestras de glbulos rojos homocigotas para los antgenos a investigar tanto positivos como negativos. Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera invlido. Si esto ocurre, lave los eritrocitos con solucin salina a 37C previo a preparar la suspensin de clulas y repita la prueba. Si prevalece un resultado no conforme en el control, el resultado se considera invlido y se requiere investigacin adicional con la utilizacin de reactivos o tcnicas diferentes.
Procedimiento para la deteccin de los antgenos Ss: 1- Preparar suspensiones de glbulos rojos al 3-5% en solucin salina. 2- Identificar los tubos a analizar como S y s. 3- Aadir 50ul del antisuero correspondiente. 4- Aadir 50ul de la suspensin de glbulo a analizar. 5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37C 6- Lavar tres veces con solucin salina. 7- Aadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana. 8- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 9- Resuspender las clulas e interpretar las reacciones. 10Si el resultado es negativo, realizar la corroboracin con clulas control.
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Tabla 4:
Interpretacin de los resultados sistema Ss Anti-S 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-s 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpretacin SS ss Ss
Prctica: Con tcnica asptica transfiera una alcuota de la sangre preservada en ALSEVER a un tubo adecuadamente rotulado. Guardar el resto de la muestra con solucin de Alsever para prximas prcticas. De la muestra transferida, realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica y preparar una suspensin al 3-5%. Determinar el fenotipo para los antgenos M N S y s. Realizar determinaciones fenotpicas de grupo ABO y Rh de las muestras provistas en el laboratorio.
Resultados, discusin y conclusiones:
Anti-M
Anti-N
Anti-S
Anti-s
Fenotipo MNSs:
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Muestra
Anti-A
Anti-B
Cel.- A
Cel.- B
Anti-D
Control
Interpretacin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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Procedimiento 15
Determinacin fenotpica de los sistemas de grupo sanguneo Kell, Duffy y Kidd. Principio: Los antgenos del sistema de grupo sanguneo Kell se ubican en una protena de un solo paso transmembrana de 93 KD; en ella se han podido identificar al menos 25 antgenos distintos. Este sistema se caracteriza por estar constituido por antgenos de alta y de baja incidencia dentro de la poblacin. Se ha observado que 13 de estos antgenos son de alta frecuencia y al menos 5 de baja incidencia, algunos se encuentran organizados en cinco grupos allicos, mientras que otros, principalmente los antgenos de alta frecuencia, pueden ser expresados independientemente. El antgeno Kell (K) slo se expresa en la membrana del glbulo rojo. El promedio de sitios antignicos vara de 2300 a 6100 en eritrocitos homocigotos para K y de 200 a 3500 en clulas heterocigotas Kk. El grupo sanguneo Kell, es altamente inmunognico y est completamente desarrollado al nacer. Al igual que con otros sistemas de grupo sanguneo, el anti-K puede ser adquirido al exponerse a eritrocitos con presencia del antgeno ya sea por una transfusin de sangre o por un embarazo donde el nia/o hereda el antgeno paterno. Con muy poca frecuencia se han descrito casos de anti-K y anti-k (Cellano) de presentacin natural. Estos son del tipo IgM, reaccionan a temperatura ambiente y se presentan secundarios a infecciones agudas bacterianas, principalmente cuando el agente causal es una E. coli O125.b15. Desde el punto de vista inmune, los anti-K y anti-k son muy importantes, usualmente son anticuerpos del tipo IgG1 con fuerte actividad hemoltica in vivo.
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El sistema Duffy est constituido por una glicoprotena de 35-43 kDa que se expresa en la membrana del glbulo rojo. El nmero de sitios antignicos en clulas Fy (a+b-) se ha estimado en 6900 y de 17000. Los antgenos del sistema Duffy estn relacionados cuando menos con siete receptores diferentes de membrana, entre los que se incluyen al receptor de quimosinas y al receptor de los parsitos de la malaria. Un hecho importante y que se ha asociado mucho con procesos de evolucin y adaptacin de las especies, es que los glbulos rojos con fenotipo Fy (a-b-), muy comunes en individuos de raza negra, son resistentes a la invasin de los parsitos de las especies de Plasmodium vivax y Plasmodium knowlesi. Los anticuerpos Duffy pueden causar reaccin hemoltica severa, asimismo, su presencia en mujeres embarazadas debe de ser evaluada cuidadosamente monitoreando cambios constantes en el ttulo de anti- Fy maternos. Se ha establecido que ttulos de anticuerpos maternos de 1:64 o mayores deben de ser considerados de alto riesgo fetal y neonatal. En el sistema Kidd (Jk) se ha observado que sujetos Jk(a-b-) tienen resistencia a la lisis por la urea 2M, aunque conservan normal su funcin de permeabilidad al agua. Una caracterstica del anticuerpo producido contra antgenos del sistema Kidd es que muestra destruccin mediada por complemento, dichos anticuerpos se han observado en pacientes que son Jk(a-b-) en donde el 90% de las clulas Jk(a+b+) transfundidas son eliminadas en 30 minutos, mientras que se prolonga al triple cuando son clulas Jk(a+b-). Este anticuerpo tambin se encuentra asociado con la produccin de cuadros de enfermedad hemoltica severa. Materiales 1. Tubos de pruebas limpios y secos 2. Pipetas pasteur 3. Solucin salina 0.9%
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Centrfuga serolgica (3000 rpm ) Gradillas Guantes Gabacha Recipientes de descarte de material Tubos de ensayo
Muestras: Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA. Muestras preservadas con solucin de Alsever. Reactivos: Anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, albmina al 22%, antiglobulina humana, Clulas Control de Antiglobulina Humana.
Mtodo: 1. Preparar suspensiones de glbulos rojos al 3-5% en solucin salina. 2. Identificar los tubos a analizar como K, k, Fya, Fyb, JKa, Jkb, control. 3. Aadir 50ul del antisuero correspondiente a cada tubo rotulado 4. Al tubo control aadir 50 ul de de albmina al 22% 5. Aadir a todos los tubos 50ul de la suspensin de glbulo a analizar. 6. Mezclar e incubar por 30 minutos a 37C 7. Lavar tres veces con solucin salina. 8. Aadir dos gotas de reactivo de antiglobulina humana 9. Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos. 10. Resuspender las clulas, leer e interpretar las reacciones. 11. Si el resultado es negativo, realizar la corroboracin con clulas control.
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Tabla 5:
Anti-K 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-k 0
Interpretacin de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd.

Interpre. Anti-Fya KK kk Kk 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-Fyb 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpre. Anti-Jka Fy(a+b-) Fy(a-b+) Fy(a+b+) 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-Jkb 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpre. Jk(a+b-) Jk(a-b+) Jk(a+b+) Control 0 0 0
1+ a 4+ 1+ a 4+
Siempre incluya como control muestras de glbulos rojos conocidos, tanto positivos como negativos, para los antgenos a investigar. Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera invlido. Si esto ocurre, lave los eritrocitos con solucin salina a 37C previo a preparar la suspensin de clulas y repita la prueba. Si prevalece un resultado no conforme con el control, el resultado se considera invlido y se requiere investigacin adicional con la utilizacin de reactivos o tcnicas diferentes. Prctica: Tomar una alcuota de la sangre preservada en ALSEVER y transferir una muestra a un tubo adecuadamente rotulado. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica y preparar una suspensin al 3-5%. Determinar el fenotipo para los antgenos K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb. Realizar fenotipo ABO y Rh de las muestras dadas en el laboratorio.
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Resultados, discusin y conclusin:
Anti-K
Anti-k
Interpretacin
Anti-Fya
Anti-Fyb
Interpretacin
Anti-Jka
Anti-Jkb
Interpretacin
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Procedimiento 16
Clulas rastreadoras o clulas pantalla Principio Parte de la rutina de un Banco de Sangre es la bsqueda constante de anticuerpos irregulares presentes en el suero de donadores o pacientes que puedan causar alguna reaccin transfusional cuando se administra un hemocomponente. Se ha vuelto requisito obligatorio contar con clulas rastreadoras o pantalla que permitan establecer la presencia de alguno de estos anticuerpos. Estas clulas pueden ser obtenidas tanto comercialmente como realizadas en nuestro lugar de trabajo, deben ser del grupo O para evitar que los anticuerpos naturales interfieran en la deteccin de otros anticuerpos. Se obtienen a partir de donadores que son fenotipeados y que poseen los antgenos ms comunes dentro de la poblacin y que son reconocidos como de importancia clnica, es decir, capaces de causar una reaccin transfusional o una enfermedad hemoltica del recin nacido. Las clulas seleccionadas deben contar con al menos en una de ellas uno de los siguientes antgenos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb. Como el objetivo es detectar anticuerpos, la clula rastreadora ideal debe tener la mayor cantidad de expresin homocigota posible ya que estas clulas poseen doble dosis de antgeno en contraposicin con las clulas de individuos heterocigotas. Esto es importante pues hay mayor probabilidad de detectar anticuerpos que reaccionan dbilmente o que presentan bajo ttulo con clulas que expresan ms cantidad de antgeno. Las clulas rastreadoras provenientes de tres donadores debern ser homocigotas para antgenos del sistema Rh de la siguiente manera R1R1, R2R2 y rr.
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Tambin en combinacin debern tener los antgenos homocigotas Kidd, Duffy y MNSs, los cuales se ha observado que muestran efecto de dosis. Otro punto importante que deben de cumplir las clulas rastreadoras es contar con al menos una clula Kell positivo ya que el antgeno Kell es altamente inmunognico y de baja incidencia pudiendo llegar a producir severas reacciones transfusionales. Si un juego de reactivos no contiene un antgeno en particular el correspondiente anticuerpo no podr ser detectado cuando se realice la investigacin. Al interpretar un rastreo de anticuerpos se debe de contar con una tabla fenotpica en donde se indica cules antgenos estn presentes en las clulas y que deben acompaar al juego de clulas segn el lote del reactivo. Las clulas rastreadoras pueden estar disponibles en diferentes presentaciones a modo de: - Un nico vial, constituido por no menos de dos clulas de donantes que han sido mezcladas, a este se le conoce como pool, son menos sensibles y son utilizadas en el rastreo de anticuerpos en donantes de sangre. - Dos viales, cada una de un donador diferente, presentan baja sensibilidad. - Tres viales, proveniente de tres donantes diferentes, poseen una buena sensibilidad para la deteccin de anticuerpos y es la ms utilizada en el pas. - Seis viales, proveniente de 6 donantes diferentes son las que poseen la mayor capacidad de deteccin de anticuerpos. Para las pruebas pretransfusionales son requeridas la presencia de clulas rastreadoras de al menos tres viales para la deteccin de anticuerpos. La deteccin de niveles de anticuerpos muy bajos en el suero del receptor es importante porque la presencia de un antgeno positivo, puede resultar en una respuesta inmune secundaria con una rpida produccin de anticuerpo y destruccin del hemocomponente transfundido. Una vez confirmada la presencia de anticuerpo en un suero se tiene que investigar cual es el antgeno causante de la produccin de este, por lo que se hace uso de paneles de identificacin de anticuerpos que son un grupo de 8 a 16
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clulas con fenotipo completo y que en conjunto permiten establecer cul es el antgeno causante.
Mtodo: Preparacin de clulas pantalla Preparar suspensiones de eritrocitos de donadores O al 3% en solucin salina. Las clulas escogidas de referencia son R1R1, R2R2, rr. Hacer fenotipo para los grupos sanguneos Duffy, MNSs, Kk, Kidd, Lewis y P. Escoger el fenotipo de clulas I, II, III. Separar una cantidad de 150 cc de sangre, con el nmero de donador, fecha de extraccin y de separacin. Agregar 150 cc de solucin salina a la sangre separada. Aadir 2 cc de gentamicina. Aadir 1 cc de penicilina y agitar. Guardar a 4 C en el espacio de sangre en cuarentena. Las clulas se deben de cambiar cada mes. Si se considera necesario se puede aadir soluciones preservantes como CPD o Alsever para mantener la calidad y viabilidad de las clulas. Prctica: Proceder a anotar en la pizarra su fenotipo completo. Una vez anotados todos los integrantes, seleccionar los mejores perfiles para una clula rastreadora.
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Anotaciones y comentarios: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ____________________________________________________________
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Procedimiento 17
Prueba de inmunoglobulina indirecta. Principio En 1945 Coombs y colaboradores describieron una prueba para detectar anticuerpos no aglutinantes o sensibilizantes contra el antgeno Rh, demostraron de este modo el recubrimiento in vivo o in vitro de eritrocitos por anticuerpos del tipo IgG y por componentes del complemento. En la actualidad a esta prueba se le conoce como la prueba de antiglobulina humana y ha tenido gran desarrollo en el campo de la inmunohematologa y otras reas afines. Este antisuero puesto en contacto con el eritrocito recubierto de anticuerpos no aglutinantes provocar su aglutinacin. En inmunohematologa se utilizan dos tipos de pruebas de antiglobulina, la prueba directa e indirecta. La prueba de antiglobulina indirecta demuestra la presencia de anticuerpos no aglutinantes o irregulares en el suero de los pacientes, se utiliza para demostrar reacciones in vitro entre eritrocitos y anticuerpos, como en los casos de deteccin de anticuerpos, identificacin de anticuerpos, fenotipo de grupos sanguneos y pruebas de compatibilidad, tambin resulta positiva en algunas anemias hemolticas. El reactivo de antiglobulina se obtiene al inyectar un conejo con globulinas humanas (IgG y C3) que estimulan la produccin de anticuerpos frente a dichas protenas. El suero del animal, se somete a procesos de adsorcin para eliminar los anticuerpos no deseados, de tal manera que reaccionar especficamente contra las globulinas humanas. Un aspecto importante de tomar en consideracin en el procedimiento es la fase de los lavados, los cuales se deben de realizarse de forma cuidadosa para evitar que los anti-anticuerpos reaccionen con anticuerpos libres en el medio y sean neutralizados.
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Los eritrocitos recubiertos con globulina humana, una vez lavados son aglutinados por el reactivo de antiglobulina humana. El fragmento Fab de la molcula de antiglobulina humana reaccionar con el fragmento Fc de la IgG. Los eritrocitos no recubiertos no son aglutinados. La intensidad de la reaccin de aglutinacin observada es proporcional a la cantidad de globulina que recubre los eritrocitos.
Tipos de reactivos de antiglobulina humana Existen en el mercado varias modalidades de reactivos de antiglobulina humana, con diversas propiedades y aplicaciones, los principales son: - Poliespecfico: Contiene anti-IgG y anti-C3d. - Poliespecfico: Contiene anti-IgG humano, de conejo y anti C3b y C3d monoclonal de ratn - Anti-IgG: Contiene anti-IgG sin actividad anti-complemento - Anti-IgG (cadenas pesadas): Contiene slo anticuerpos que reaccionan con las cadenas gamma humanas - Anti-C3d y anti-C3b y anti-C3d, C4b, C4d: Contiene solo anticuerpos que reaccionan con uno o varios componentes del complemento. No tiene actividad anti-inmunoglobulina. - Anti-C3d (monoclonal de ratn) y C3b, C3d (monoclonal de ratn) Contiene slo anticuerpos reactivos contra el anti- componente designado del complemento, sin actividad anti-inmunoglobulina. La mayora de sueros monoclonales antiglobulina humana poliespecfico disponibles en el mercado son una mezcla de anti-IgG de conejo y un anti- C3b, C3d monoclonal. El anti-C3d, C3d monoclonal no contienen anti-C4, por lo que con este suero produce menos cantidad de reacciones no especficas. Las desventajas asociadas con el uso de un anti-IgG monoclonal incluyen: a) Resultados falsos negativos si la prueba no es leda en un estricto perodo de tiempo. Una reaccin prozona puede ocurrir si la prueba no es centrifugada y leda en 60 segundos despus de aadida la antiglobulina.
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b) No todas las subclases de IgG son detectadas usando este IgG monoclonal. Actualmente la tcnica en gel para la prueba de antiglobulina directa e indirecta es la prueba ms utilizada y de mayor sensibilidad que la tcnica en tubo.
Materiales y Reactivos: Tubos con muestras de suero para analizar. Tubos de 12 X 75 mm para realizar los estudios. Bao mara a 37C. Pipetas Pasteur. Bulbos de pipetas. 1 Juego de clulas rastreadoras 3%. 1 Frasco de suero de Coombs. 1 Frasco de albmina bovina 22%. 1 Dispensador con solucin salina fisiolgica. 1 Centrfuga serolgica. 1 Gradilla para tubos. 1 Frasco con clulas de control de antiglobulina humana. 1 Papel toalla. Mtodo - En dos juegos de 3 tubos rotule el nmero de muestra a analizar e indicar si se trata de: - Clulas I, - Clulas II y - Clulas III - Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de las clulas rastreadoras.
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- Aadir al tubo rotulado como clulas I 50ul de las clulas reactivo correspondiente I - Aadir al tubo rotulado como clulas II 50ul de las clulas reactivo correspondiente II - Aadir al tubo rotulado como clulas III 50ul de las clulas reactivo correspondiente III - No confunda los goteros, no deje reactivo en el gotero, cierre bien los reactivos despus de ser utilizados y colquelos en su lugar. - Aadir 100ul del suero 1 al juego de tres tubos rotulado como muestra 1. - Aadir 100ul del suero II al juego de tres tubos rotulado como muestra 2. - Aadir a todos los tubos 100ul del reactivo de albmina bovina al 22%. - Mezclar los tubos. A partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Fase I, Centrifugacin inmediata o prueba rpida: Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm. En esta fase se detectan anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-I, anti M, anti N, anti Lewis, etc. Resuspender con suavidad, leer y realizar las anotaciones. FASE II, Incubacin a 37C: Despus de la lectura anterior, colocar los tubos a 37C por 30 minutos. Recuerde que dependiendo de la necesidad o las normativas de funcionamiento de cada Banco de Sangre se pueden utilizar otros medios potenciadores de reaccin entre los cuales podemos mencionar la albmina, solucin de baja fuerza inica (LISS), polietilenglicol (PEG) y enzimas que facilitan las reacciones antgeno-anticuerpo y que son escogidos de acuerdo a las caractersticas de las tcnicas utilizadas.
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Para cada uno de ellos se deben de apegar para su utilizacin las instrucciones que el fabricante establezca. Al concluir la incubacin, centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm. Leer y hacer las anotaciones correspondientes. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica. FASE III o de antiglobulina: Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecfico (suero de Coombs). Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm. Leer y realizar sus anotaciones. Homogenizar las clulas reactivos de Control de Antiglobulina Humana. A las pruebas que dieron negativo, aadir 50ul de las clulas reactivo de Control de Antiglobulina Humana. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm. Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados obtenidos.
Resultados Fase I MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
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Fase II MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase III MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Clulas Control de AGH Interpretacin de Resultados: Muestra I: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Muestra II: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Anotaciones y consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ____________________________________________________________
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Procedimiento 18
Prueba de antiglobulina directa Principio El principal uso de la prueba de antiglobulina directa es la demostracin de anticuerpos y/o fracciones del complemento que estn recubriendo los eritrocitos in vivo. Se utiliza para el estudio de anemia hemoltica autoinmune, la hemlisis inducida por medicamentos, la enfermedad hemoltica del recin nacido y las reacciones aloinmunes frente a eritrocitos recientemente transfundidos. Reactivos y Materiales: Tubos con muestras de eritrocitos a analizar. Tubos con muestras de suero a analizar. Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones. Pipetas Pasteur. Bulbos de pipetas. Frasco de reactivo de antiglobulina humana. Pizetas con solucin salina fisiolgica. Centrfuga de serolgica. Gradillas. Frascos con clulas control de antiglobulina humana. Bao mara. Juego de clulas rastreadoras 3%. Papel toalla. Mtodo: - Rotular tres tubos con el nmero de muestra a procesar. - Tomar una alcuota de la muestra y transferir a un tubo rotulado. - Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica. - En el segundo tubo hacer una suspensin de trabajo al 3-5% a partir de la muestra de eritrocitos lavada. - Aadir al tercer tubo 50 ul de la suspensin de trabajo realizada. - Aadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana. - Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm
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- Resuspender , leer por aglutinacin y hacer las anotaciones respectivas. - A las pruebas que dieron negativo hacer la corroboracin con las clulas control de antiglobulina. Prctica: Muestras de suero: - Realizar prueba de inmunoglobulina indirecta. - Durante el proceso de incubacin de 30 minutos realizar las pruebas de inmunoglobulina directa. Muestras de glbulos rojos: - Realizar la prueba de antiglobulina directa.
Resultados
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA
MUESTRA I Lectura Clulas Control AGH
MUESTRA II
Interpretacin
de
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PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA Fase I MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Clulas Control de AGH Interpretacin de Resultados: Muestra I: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Muestra II: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Anotaciones y consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Procedimiento 19
Estudio de Anticuerpos Irregulares Principio El objetivo de esta prueba es detectar la presencia de anticuerpos clnicamente significativos fuera del sistema ABO en el plasma de los pacientes/donantes a los cuales se les realiza el estudio. Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37C y/o en la prueba de antiglobulina o en ambas, pueden causar reacciones transfusionales o hemolticas graves, as como producir un acortamiento de la sobrevida de las clulas transfundidas. Ejemplos de este tipo de anticuerpos son los dirigidos contra los sistemas de grupo sanguneo Rh, Kell, Duffy, Kidd, SsU, dentro de otros. Debe de realizarse rutinariamente en todos los receptores de hemocomponentes y no sustituye a la prueba cruzada. La incidencia de anticuerpos fuera del sistema ABO, en diferentes poblaciones oscila entre 0.78 y 1.64%. Un paso importante en los protocolos de pruebas pretransfusionales es el efectuar la determinacin del grupo ABO/Rh junto con la deteccin de anticuerpos irregulares. Los mtodos empleados en la deteccin de anticuerpos irregulares pueden incluir 2 a 3 clulas pantalla o rastreadoras. Deben de contar con la mayora de los antgenos de significancia clnica, ser incubados a 37C utilizando el medio de reaccin establecido por el Banco de Sangre como el salino, albmina, enzimtico o baja fuerza inica y finalizados con la prueba de antiglobulina humana de tipo IgG o anti IgG + C3d. De preferencia cuando la determinacin se realiza en tubo se debe utilizar el reactivo poliespecfico (anti IgG+C3d) debido a que con l se pueden detectar algunos anticuerpos poco frecuentes demostrados slo por la actividad del
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complemento como ocurre con los anticuerpos dirigidos contra el sistema de grupo sanguneo Kidd. Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser definida mediante la confrontacin del suero/plasma del paciente con las clulas del panel de identificacin de anticuerpos. Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un hemocomponente que no posea dicho antgeno, realizarle la prueba cruzada y una vez obtenido un resultado negativo proceder a transfundir al paciente. Materiales y reactivos Tubos con muestras de suero a analizar. Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones. Bao de Mara a 37C. Pipetas Pasteur. Bulbos de pipetas. 1 Juego de clulas rastreadoras 3%. 1 Frasco de suero de antiglobulina humana. 1 Frasco de albmina bovina al 22%. 1 Pizeta con solucin salina fisiolgica. 1 Centrfuga serolgica. Gradillas. 1 Frasco con clulas de control de antiglobulina humana. 1 Papel toalla. Mtodo: Rotular un juego de 3 tubos donde vaya indicado el nmero de muestra a analizar y en uno de ellos lo siguiente. Clulas I, Clulas II y Clulas III. Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos de las clulas rastreadoras Aadir 50ul de las clulas I al tubo rotulado como I. Aadir 50ul de las clulas II al tubo rotulado como II. Aadir 50ul de las clulas III al tubo rotulado como III. Aadir 100ul del suero/plasma en estudio a cada uno de los tubos.
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Aadir 100ul del reactivo de albmina bovina al 22% a todos los tubos. Mezclar y realizar las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados obtenidos. Durante el perodo de incubacin de 30 minutos analice los resultados de los casos presentados en la prctica. RESULTADOS Fase I MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
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Interpretacin de Resultados: Muestra I: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
Muestra II: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
Anotaciones y consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _____________________________________________________________
Prctica: Analizar los siguientes casos obtenidos de rastreos de anticuerpos.
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Procedimiento 20
Prueba de compatibilidad sangunea Principio La transfusin sangunea ha representado una parte importante en la prctica mdica desde hace ms de un siglo. En su inicio era utilizada como un recurso desesperado sin garanta de que el paciente obtuviese algn beneficio. Hoy en da, la medicina transfusional es una disciplina mdica exitosa y cientfica gracias a los conceptos bsicos aportados por varios investigadores dentro de los que se puede mencionar al creador del rea de la inmunohematologa Karl Landsteiner y colaboradores, quien en 1900 descubren los antgenos de grupo sanguneo ABO. A pesar de este descubrimiento se continuaron reportando xitos y fracasos a la transfusin hasta que Ottemberg en 1908 introduce el concepto de realizar las pruebas cruzadas ABO compatible antes de cualquier transfusin de sangre. Posteriormente, en mucho menor cantidad cada ciertos procesos transfusionales se seguan reportando reacciones transfusionales graves en pacientes ABO compatibles, hasta que en la dcada de los 40s se hace del conocimiento la presencia de otros tipo de sistemas de grupo sanguneo eritrocitarios, motivando el inicio de las investigaciones y mtodos de compatibilidad sangunea que conocemos hasta hoy en da. Los pioneros en este campo mezclaron el suero del paciente con las clulas rojas del donador y observaron la lisis, la aglutinacin o ambas del glbulo rojo lo que se conoce como la prueba cruzada mayor. Actualmente el cruce de sangre para la compatibilidad sangunea forma parte de una serie de procedimientos conocidos como pruebas pretransfusionales, las cuales tienen el propsito de seleccionar los hemocomponentes de la sangre que tengan una aceptable sobrevida y no causen dao al receptor,
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involucrando procedimientos de identificacin, serolgicos del donador y del receptor. Dentro de los procedimientos obligatorios que estipulan los estndares internacionales estn: - Solicitud, identificacin y coleccin de la muestra de sangre del receptor. - Pruebas del donador las cuales involucran el grupo ABO/Rh, determinacin del fenotipo Rh y Kell, deteccin de anticuerpos irregulares y las pruebas serolgicas para enfermedades transmisibles por transfusin sangunea. - Determinacin del grupo ABO y Rh del receptor. - Deteccin de anticuerpos irregulares del receptor. - Seleccin de hemocomponentes ABO y Rh apropiados para receptor. - Prueba cruzada mayor. - Revisin de la unidad del hemocomponente seleccionado donde se observan aspectos como la fecha de expiracin, realizacin de estudios serolgicos, deteccin de anticuerpos irregulares, estado general como por ejemplo no presencia de cogulos, hemlisis, roturas en la bolsa, etc. - Comparacin entre resultados actuales y el historial de las pruebas pretransfusionales previas del receptor. - Reidentificacin del receptor antes de la transfusin. Tomando en cuenta los antgenos del sistema de grupos sanguneos ABO y Rh (D) la compatibilidad puede alcanzar hasta un 98%; el resto del porcentaje restante se logra por medio del estudio de anticuerpos irregulares clnicamente significativos y la prueba de compatibilidad entre el suero del receptor y los eritrocitos del donador. En la actualidad, y a pesar de los procedimientos pretransfusionales, no es factible tener un 100% de seguridad absoluta de que todos los procesos
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prevengan la sensibilizacin de los receptores a los aloantgenos eritrocitarios y que se anulen las reacciones transfusionales tardas, causadas por la presencia de anticuerpos en cantidades no detectables, en el suero del receptor antes de la transfusin. PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES La Solicitud, identificacin y coleccin de la muestra de sangre: Aproximadamente el 50% de las reacciones por transfusin se deben a reacciones hemolticas secundarias a errores de tipo clerical por identificacin equvoca del paciente a transfundir, confusin al momento de extraer la muestra, o en el laboratorio. Los procedimientos exactos en la identificacin del paciente, la muestra sangunea y la unidad a transfundir, tienen que estar perfectamente definidos y escritos en Manuales de Procedimiento de Banco de Sangre, en forma de rutas crticas para ser consultados cuando sean requeridos. Antes de realizar la extraccin de sangre, el tubo y la solicitud deben de coincidir con la identificacin del paciente, preguntando directamente cuando sea factible al paciente o corroborando con brazaletes de identificacin; nunca se debe de guiar por los nmeros de cama ya que los pacientes pueden ser cambiados dependiendo de la necesidad del servicio. La solicitud debe tener como datos mnimos: Identificacin del paciente, nmero de cdula de identidad o pasaporte. Nombre completo y edad del receptor. Sexo. En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo grupo ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales, gestaciones, inmunizacin materno fetal, reacciones adversas que se hubieran presentando y medicamentos que se estn administrando. - Diagnstico de certeza o de probabilidad, as como el motivo de la indicacin transfusional. - Nmero de expediente, cama y nombre del servicio donde ser transfundido.
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- Sealar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades, volumen o caractersticas requeridas. - Fecha y hora en que se realizar la transfusin y, de ser necesario el sealamiento de la urgencia de la transfusin. - Fecha, nombre completo y firma del mdico que indica la transfusin. - Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para evitar al mximo la equivocacin. Despus de haber realizado una adecuada identificacin del receptor, la muestra de sangre debe ser obtenida, usando tcnicas muy cuidadosas para evitar hemlisis, ya que la misma produce activacin del complemento y algunos anticuerpos pueden ser enmascarados al requerirse del complemento para visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo. Si no existen problemas serolgicos de fondo son suficientes 5 ml de sangre del receptor para realizar todos los procedimientos inmunohematolgicos.
DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUINEO ABO/ Rh EN EL RECEPTOR Grupo ABO En la medida de lo posible los receptores debern recibir hemocomponentes sanguneos ABO idnticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser necesario hacer selecciones alternativas. La determinacin del grupo ABO es el paso ms importante de las pruebas serolgicas pretransfusionales. Se emplean antisueros hemoclasificadores anti A y anti B para determinar grupo eritroctico y glbulos rojos con antgenos A1 y B para la prueba inversa. En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales todava es inmaduro. En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearn tcnicas adicionales antes de establecer el tipo sanguneo.
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Cuando se est en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo ABO no se puede determinar se podr utilizar glbulos rojos empacados del grupo O para transfundir.
ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO: Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay alternativa transfusional, todas debern de transfundirse grupo ABO idntico. Si la solicitud se refiere a Glbulos Rojos Empacados se pueden utilizar alternativas como se indican en la tabla 1 dependiendo de las existencias y reservas del Banco de Sangre. Tabla 6: Alternativas de seleccin de unidades de Glbulos Rojos Empacados dependiendo del grupo ABO del paciente a transfundir Alternativas Primera O A B AB Segunda O O A* Tercera B* Cuarta O
Grupo del Paciente O A B AB
* Uno u otro de estos grupos sanguneos pueden ser utilizados en cualquier momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo. Debido a lo anterior, se prefiere la utilizacin de unidades del grupo A sobre B, ya que la frecuencia en la poblacin del grupo A es mayor y, por lo tanto, es ms frecuente encontrar ms cantidad de sangre A en reservas en los Bancos de Sangre.
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Grupo Rh La identificacin de antgeno Rh D se realiza usando el hemoclasificador anti D , la prueba puede realizarse en tubo o en placa de acuerdo a lo establecido por el fabricante y ser validado mediante una prueba de control en paralelo, que permita demostrar que el eritrocito previamente no tena inmunoglobulina tipo IgG adherida en la superficie, si el control es positivo, el resultado debe ser invalidado. Cuando la prueba da un resultado negativo, se investigar la expresin dbil del antgeno con la utilizacin del reactivo de antiglobulina humana, en neonatos y donadores de sangre. Las reacciones positivas con anti D, incluyendo el antgeno D expresado dbilmente se clasificarn como Rh POSITIVOS y los restantes como Rh NEGATIVOS. Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control tambin presenta aglutinacin y la transfusin es urgente podr ser utilizado glbulos rojos empacados Rh negativo. Los hemocomponentes Rh positivos debern rutinariamente ser enviados a receptores Rh positivos. El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido, aunque en forma ideal, debern de reservarse exclusivamente para pacientes o receptores Rh negativos. De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles, en esta situacin se podr optar por otras medidas alternativas, como posponer la transfusin o en caso de que el retardo de la transfusin ponga en peligro la vida del paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del paciente est negativo se podra utilizar sangre Rh positiva con un riesgo de inmunizacin de un 70%.
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PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIN DE ERITROCITOS El cruce de sangre en la actualidad ha sido expuesto a una serie de interrogantes en cuanto a si debe ser eliminada o no en aquellos pacientes que no presentan anticuerpos irregulares. Lo anterior, dado que el rastreo rutinario de anticuerpos en los sueros del receptor y del donador tiene una alta sensibilidad. Esto no aplica para cuando la transfusin sea destinada a un paciente que presente anticuerpos clnicamente significativos. A estos pacientes, una vez identificado el anticuerpo y seleccionada una unidad carente del antgeno es obligatorio realizar la prueba cruzada. La prueba cruzada mayor se refiere a la tcnica mediante el cual se demuestra la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los antgenos del glbulo rojo del donador. Por otro lado, la prueba cruzada menor se refera al cruce entre los eritrocitos del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayora de los bancos de sangre por el rastreo rutinario de anticuerpos clnicamente significativos en los donantes de sangre. En caso de existir en el donante un anticuerpo de baja incidencia en su plasma estos probablemente no causen una reaccin transfusional al ser diluidos en el plasma del receptor. Tambin se han modificado los medios de reaccin, las temperaturas ptimas y los perodos de incubacin, seleccionando procedimientos con un menor tiempo, costo y un mximo de detecciones de incompatibilidad. La incubacin de la prueba cruzada a temperatura ambiente ha sido siendo eliminada y se cambi por la fase I de lectura rpida. La prueba cruzada est constituida por tres fases que se describen en detalle en la parte del procedimiento y se considera que existe compatibilidad cuando no se visualiza hemlisis o aglutinacin en ninguno de los pasos de la prueba.
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PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES Urgencias. La necesidad urgente de transfusin en ciertas situaciones clnicas establece que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada. El mdico tratante debe estar consciente de este riesgo y firmar una hoja de autorizacin para que la unidad sangunea sea liberada, mientras el Banco de Sangre finaliza la prueba. En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en alguno de los pasos se dar aviso de inmediato al mdico encargado para que se administre el tratamiento oportuno. De acuerdo a la necesidad de liberacin urgente del producto sanguneo el Banco de Sangre puede optar por: - Enviar glbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se desconozca el grupo sanguneo del receptor. - Enviar sangre compatible a grupo ABO y Rh del receptor y donador. - Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugacin inmediata antes de enviar el producto sanguneo. - Cuando la transfusin no es de extrema urgencia, pero la sangre se requiere lo ms pronto posible, se puede acortar el tiempo de incubacin de la fase II de la prueba cruzada, empleando diferentes medios de reaccin que requieran un perodo de incubacin ms breve a 37C para finalizar con la fase de Antiglobulina Humana. Prueba de compatibilidad para productos plasmticos Debern ser transfundidos con la corroboracin previa del grupo inverso de acuerdo al esquema transfusional que se indica en la tabla 7. En el caso de la transfusin de plasma no se debe tomar en consideracin el tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el antgeno D.
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Para el caso de la transfusin de plaquetas, estas deben de ser transfundidas bajo el esquema de sangre total pues poseen componentes celulares y plasmticos. Tambin para las plaquetas, dependiendo del tipo de receptor y del volumen de clulas transfundidas se puede considerar la administracin de inmunoglobulina Rh a los pacientes Rh negativos transfundidos con productos Rh positivos. Tabla 7: Alternativas de seleccin de unidades de plasma dependiendo del grupo ABO a transfundir Alternativas
Grupo del Paciente
Primera Segunda Tercera Cuarta O O A* B* AB A A AB B B AB AB AB * Uno u otro de estos grupos sanguneos pueden ser utilizado en cualquier momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo.
Materiales y reactivos: Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina humana, albmina al 22%, clulas A y B al 3%. Tubos con muestras de eritrocitos a analizar. Tubos con muestras de suero a analizar. Clulas rastreadoras. Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones Solucin salina al 0.85% (Pizetas). Centrfugas Serolgicas. Microscopios. Frascos con clulas control de antiglobulina humana. Pipetas Pasteur.
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Bulbos para pipeta Pasteur. Baos de Mara a 37C. Portaobjetos. Caja de aplicadores. Gradillas metlicas. Gradillas madera. Papel toalla. Mtodo: - Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3 y Paciente 4 - Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4. - Aadir 50ul de la suspensin del donante 1 al tubo rotulado como Paciente 1. - Aadir 50ul de la suspensin del donante 2 al tubo rotulado como Paciente 2. - Aadir 50ul de la suspensin del donante 3 al tubo rotulado como Paciente 3. - Aadir 50ul de la suspensin del donante 4 al tubo rotulado como Paciente 4. - Aadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como paciente 1. - Aadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como paciente 2. - Aadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como paciente 3. - Aadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como paciente 4. - Aadir 100 ul de albmina bovina al 22% a todos los tubos. - Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. - Fase I: Centrifugacin inmediata o prueba rpida: Centrifugar los tubos 15 segundos a 3500 rpm. En esta fase se establece la compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros anticuerpos (ejemplo: auto-anti-I), pueden tambin ser detectados en esta fase. Leer y realizar las anotaciones.
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- Fase II o a 37C: Despus de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37C por 30 minutos. Al concluir la incubacin sacar los tubos del bao y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm. Leer y hacer las anotaciones correspondientes. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica. Llevar la prueba a la fase de antiglobulina. - Fase III o antiglobulina: Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecfico. Mezclar y centrifugue 10 segundos a 3000 rpm. Leer y realizar anotaciones. Las reacciones con resultado negativo confirmar con las clulas control. Durante el perodo de incubacin realizar las determinaciones de grupo sanguneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y donantes. RESULTADOS Prueba Cruzada Paciente 1/ Paciente 2/ Paciente 3/ Paciente 4/ Donante 1 Donante 2 Donante 3 Donante 4 Fase I Fase II Fase III Grupo ABO/Rh Donante Grupo ABO/Rh Paciente
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Anti-A
Anti-B
Anti-D
Control
Grupo eritroctico ABO /Rh
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4
Anti-A
Anti-B
Anti-D
Control
Grupo eritroctico ABO /Rh
Donante 1 Donante 2 Donante 3 Donante 4
Interpretacin de Resultados: Paciente 1: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Paciente 2: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Paciente 3: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Paciente 4: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Recomendaciones: Los resultados de las pruebas debern ser ledos contra luz blanca. Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden con la lectura de las pruebas. El botn de las clulas se resuspender, se har la lectura y se asignar los puntajes en cruces en la hoja de trabajo. En caso de resultados incompatibles debern ser investigados en busca de su causa.
Consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Procedimiento 21
Identificacin de Anticuerpos Principio Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular se debe identificar su especificidad y su importancia clnica. La determinacin de la especificidad de los anticuerpos detectados en los anlisis pretransfusionales es importante para seleccionar unidades que no posean el antgeno contra el cual va dirigido el anticuerpo. Los paneles de identificacin estn compuestos por juegos de 8 a 16 tipos diferentes de clulas del grupo O con fenotipo conocido contra los principales antgenos de grupo sanguneo. Estos paneles poseen clulas positivas y negativas en combinacin estratgica para poder identificar anticuerpos contra alguno de los siguientes antgenos de grupo sanguneo: D, C,E, c, e y usualmente V, VS, f, Cw M, N, S, s Fya, Fyb Jka, Jkb K, k y usualmente Kpa, Kpb, Jsa, Jsb Lua, Lub Lea, Leb P1 Xga Otros antgenos con fenotipo poco frecuente pueden ser incluidos dentro del panel e incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geogrfica donde se encuentre la investigacin. El panel de identificacin dispone de una tabla antignica de reaccin donde se indica la positividad de los diferentes antgenos en relacin a la clula que se
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est analizando, as como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar destinado para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus interpretaciones. Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las caractersticas de los anticuerpos como son: - rango trmico, - temperatura ptima de reaccin, - sensibilidad o aumento de reaccin con enzimas, - fuerza de reaccin de los resultados positivos, tanto aglutinacin como hemlisis. - Resultado del autocontrol para la deteccin de autoanticuerpos. Si se tiene la sospecha que en el estudio estn presentes dos o ms anticuerpos se puede hacer uso de diferentes tcnicas, procesos y reactivos durante el anlisis. La aplicacin de dos o ms tcnicas o medios de reaccin permite separar los anticuerpos en base a sus caractersticas de reaccin con sus antgenos respectivos, de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor claridad. Dentro de estas tcnicas se deben considerar la utilizacin de procedimientos de absorcin/elucin, reacciones a diferentes temperaturas y uso de enzimas como medio de reaccin. La mayora de pacientes se sensibilizan contra un nico antgeno y es fcil determinar su especificidad, basta con ubicarse en el perfil de reaccin dentro de la tabla antignica del panel.( 1,2 ) Caractersticas de los anticuerpos en las fases de reaccin: Fase de Centrifugacin Inmediata: A 22C reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N, Lewis, y el P.
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El anti I tiene un rango trmico desde 4C hasta fase de antiglobulina, sin embargo, su temperatura ptima es de 4C, por lo que para detectarlo mejor se debe incubar en el refrigerador. INCUBACION A 37C: En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la capacidad de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se pueden mencionar los anti C, c, E, e, que reaccionan ptimamente al ser incubados por 30 minutos. Tambin pueden reaccionar a esta temperatura el anti S, s, D y el Kell. FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA: En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes como el anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s y Cellano. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solucin salina fisiolgica Panel de identificacin Panel de identificacin tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reaccin. Centrfugas serolgicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Frascos con cloroformo. Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores.
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Mtodo: Panel de identificacin - Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de identificacin segn corresponda. - Rotular un juego de 11 tubos con el nmero y la muestra a analizar. - Aadir 50ul de las clulas reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado como clulas 1. - Aadir 50ul de las clulas reactivo correspondiente 2 al tubo rotulado como clulas 2 y as sucesivamente hasta completar los 11 tubos. - Aadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos. - A todos los tubos aadir 100ul del reactivo de albmina bovina al 22%. - Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. - Anotar los resultados obtenidos en la tabla antignica que corresponde al lote del panel. - Identificar segn perfil antignico obtenido el antgeno contra el cual va dirigido el anticuerpo en estudio.
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Procedimiento 22
Tcnica de adsorcin de anticuerpos Principio En inmunohematologa se habla de adsorcin cuando se utilizan clulas con fenotipo conocido para provocar que un anticuerpo se pegue a la superficie del glbulo rojo. A partir de un proceso de adsorcin se pueden separar a nivel de laboratorio dos o ms anticuerpos mezclados en un suero. Como primer punto para seleccionar las clulas a utilizar en la absorcin se deben agrupar las reacciones obtenidas en el panel de identificacin y establecer cules eventuales anticuerpos pueden estar presentes. Seguidamente se debe buscar dentro de las unidades del Banco de Sangre una unidad cuyo fenotipo posea slo uno de los antgenos que se sospecha. Una vez seleccionada la unidad se toma una alcuota y se realiza el proceso de adsorcin bajo las condiciones ptimas del anticuerpo en estudio. La parte final del proceso establece una centrifugacin que sirve para separar los glbulos rojos sensibilizados del plasma y as obtener los dos anticuerpos separados. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solucin salina fisiolgica Panel de identificacin Panel de identificacin tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reaccin. Centrfugas serolgicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur.
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Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Baos a 37C Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Mtodo: - Seleccionar una unidad adecuada para adsorcin de glbulos rojos y tomar estrilmente una alcuota de unos 20 ml. - Lavar tres veces el paquete con solucin salina fisiolgica. - Dejar el paquete el mximo posible sin salina despus del ltimo lavado. - Agregar igual cantidad del suero en estudio. - Incubar a 37C por 30 minutos. - Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorcin. - Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina humana directa. - Mantener en incubacin a 37C, hasta que se alcance el mximo de positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una aglutinacin de 3 a 4 cruces. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y los eritrocitos sensibilizados. - Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo centrifugado. - Al suero realizar el panel de identificacin de anticuerpos. - Al paquete globular realizar procedimiento de elucin.
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Procedimiento 23
Tcnica de Elucin de Anticuerpos Principio El trmino elucin significa en Inmunohematologa liberar los anticuerpos unidos a la membrana del glbulo rojo proveniente de un proceso de adsorcin. Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se puede: - Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glbulo rojo o se puede - Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante agentes qumicos como el ter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones fsicas extremas como la congelacin o el calor. Una vez liberado el anticuerpo en el eludo se procede a determinar su especificidad a travs del panel de identificacin de anticuerpos. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solucin salina fisiolgica Panel de identificacin Panel de identificacin tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reaccin. Centrfugas serolgicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Frascos con cloroformo. Baos a 37C. Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos.
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Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Mtodo: Tcnica de elucin con cloroformo - Tomar el paquete de glbulos rojos sensibilidados despus del proceso de adsorcin. - Lavar una vez con solucin salina. - A un volumen igual de clulas lavadas agregar un volumen de cloroformo. - Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, - El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo, otra de restos de membrana y un eluido o hemolizado donde se encuentra el anticuerpo separado. - Transferir el eludo a otro tubo y realizar un panel de identificacin de anticuerpos. Recomendaciones: Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por aglutinacin as como los negativos deben ser comparados con la tabla antignica del panel en su lote respectivo. Para trabajar procedimientos de adsorcin/elucin siempre tomar en consideracin la temperatura ptima de reaccin. Esta va a ser la temperatura donde ocurri la aglutinacin ms fuerte. Anotaciones y consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Prctica: Esta prctica incluye los procedimientos del 20 al 22 inclusive. Se trabajar en grupo de trabajo por mesa en dos sesiones de laboratorio. La primera sesin realizar la identificacin de anticuerpos con panel corriente y panel con enzima. Con las muestras indicadas realizar proceso de adsorcin y elucin de anticuerpos. Obtener el suero adsorbido y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente sesin de laboratorio. Obtener el eludo y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente sesin de laboratorio. La segunda sesin de laboratorio realizar la identificacin de anticuerpos del suero adsorbido y del eludo. Hacer el anlisis y resolucin de los casos de identificacin de anticuerpos propuestos.
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PRACTICA DE CASOS:
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Procedimiento 24
Incompatibilidad materno- fetal Principio La enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) es una enfermedad en la cual la madre en gestacin produce in vivo aloanticuerpos del tipo IgG contra antgenos de glbulo rojo del feto que este hered del padre. Debido a esta sensibilizacin, los glbulos rojos sufren una destruccin acelerada tanto antes como despus del nacimiento. Para los recin nacidos que padecen la enfermedad hemoltica la elevacin de los niveles de bilirrubina se convierte en un problema clnico ms grave que la prdida de la capacidad de transporte de oxgeno como resultado de la hemlisis. Los antgenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal. Los antgenos contra el sistema de grupo sanguneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por mencionar algunos, presentan al nacimiento una potencia antignica similar a la observada en los eritrocitos de una persona adulta. Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ah que su expresin antignica sea menor que los antgenos de un eritrocito de una persona adulta, ejemplos de estos antgenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y Lutheran. Tambin hay antgenos que estn muy pobremente expresados al nacimiento y es hasta despus del primer ao de vida cuando logran expresarse completamente, ejemplos de estos antgenos son los del sistema Lewis y el antgeno I. El contar con este tipo de informacin es importante pues a pesar de que la madre sea portadora de alguno de los anticuerpos de la clase IgG contra algn antgeno que no est bien desarrollado al nacimiento, como por ejemplo un anti-
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Lea, la debilidad o ausencia antignica en el eritrocito del feto, impide que se inicie o exprese la enfermedad. En estos casos, puede existir la incompatibilidad eritrocitaria, sin embargo, no es una evidencia irrefutable del diagnstico etiolgico de la enfermedad hemoltica. Las acciones bsicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias en que se ubica el mdico y el paciente. Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres grupos: el feto o neonato, la madre y el padre. Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su estudio: Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, rastreo de anticuerpos con las clulas pantallas y con las clulas A1 y B procedente del eludo de la muestra. Si la muestra lo permite rastreo de anticuerpos con las clulas A1 y B procedente del suero de la muestra. Que se busca con estos anlisis? - Demostrar la presencia del antgeno en los glbulos rojos del feto/neonato. - Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glbulo del feto neonato y por consiguiente la reaccin hemoltica que se est produciendo. Anlisis en la madre: - Determinar grupo ABO/Rh. - Realizar estudio de anticuerpos. - Fenotipo Que se busca con ellos? - Demostrar la ausencia del antgeno.
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- Demostrar la presencia del anticuerpo. Anlisis al padre: - Determinar grupo ABO/Rh. - Determinar el fenotipo eritrocitario. Que se busca con ellos? - Demostrar la presencia del antgeno en los glbulos rojos paternos. De esta manera se puede contar con un panorama ms completo de la situacin y se puede iniciar la evaluacin del caso. La enfermedad hemoltica del recin nacido, desde el punto de vista inmunohematolgico, se puede clasificar en tres categoras principales dependiendo de la especificidad del anticuerpo sensibilizante: - Enfermedad Hemoltica por ABO, principalmente por un anti-A,B en mujeres del grupo O. - Enfermedad Hemoltica por Rh, debida al anti-D. - Enfermedad Hemoltica por otros anticuerpos irregulares.
Transfusin intrauterina y del neonato La sangre para transfusin intrauterina debe ser seleccionada compatible con los anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta. Los glbulos rojos empacados seleccionados para la transfusin intrauterina debern ser de preferencia O Rh negativo, y utilizando el suero de la madre para realizar las pruebas de compatibilidad. Para las unidades de exanguneotransfusin debern ser compatibles con cualquier anticuerpo materno que hubiera entrado a la circulacin fetal. Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos debern ser del grupo sanguneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 das de recolectada y en el caso para las exanguneotransfusin el plasma para su reconstitucin deber ser compatible con el grupo ABO del recin nacido.
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Materiales y Reactivos: Tubos 12 x 75 mm de reaccin. Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solucin salina fisiolgica. Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albmina bovina al 22%, reactivo de antiglobulina hunana. Panel de identificacin de anticuerpos. Frascos con clulas control de AGH. Juego de clulas rastreadoras 3%. Baos mara a 37C. Centrfugas serolgicas. Gradillas de madera. Gradillas de metlicas. Microscopios. Papel toalla. Mtodo: - Realizar a la muestra de sangre rotulada como nio una prueba de inmunoglobulina directa. - Determinar el grupo sanguneo ABO/Rh del nio. - Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificacin de anticuerpos. - Realizar una prueba cruzada entre la muestra del nio y el plasma del donador. RESULTADOS: Tipo de incompatibilidad materno fetal analizada: ________________________________________________________________
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Rastreo de anticuerpos materno: ________________________________________________________________ Identificacin de anticuerpo materno: ________________________________________________________________ Prueba cruzada: ________________________________________________________________
Anotaciones y consideraciones finales: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Procedimiento 25
Anemia Hemoltica Autoinmune Principio La anemia hemoltica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida del glbulo rojo debido a/o a travs del sistema inmune, especficamente por los autoanticuerpos. Las anemias hemolticas autoinmune se clasifican en: Anemia Hemoltica Autoinmune por anticuerpos calientes Sndrome de aglutininas fras Hemoglobunuria paroxstica al fro Anemia Hemoltica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fros y calientes) - Anemia Hemoltica Inmune inducida por drogas - Anemia Hemoltica Inmune inducida por alloanticuerpos -
Cada una de estas se subclasifica en grupos de enfermedades dependiendo de la causa que desencadena la enfermedad, es decir, si es primaria o secundaria. La Anemia Hemoltica Autoinmune es designada como primaria si se considera como una entidad idioptica, es decir, si no est asociada con alguna enfermedad demostrable que la desencadene. En contraste, la secundaria est asociada con un desorden primario y con razones suficientes para sospechar que su asociacin es ms que meramente fortuita. Estos desordenes son diagnosticados en base a las caractersticas serolgicas de reaccin. La mayora de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya reaccin es en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los
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glbulos rojos humanos es a 37C y que por lo general es una inmunoglobulina de la clase IgG. El Sndrome de Aglutininas fras es generalmente causado por un autoanticuerpo de la clase IgM y que exhibe una reactividad mxima a 4C. El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna es una inmunoglobulina IgG bifsica que difiere en su modo de accin. Este anticuerpo se detecta in vitro por su habilidad de causar hemlisis de los glbulos rojos normales en un procedimiento que lleva dos pasos, una incubacin en fro seguido por una incubacin a 37C en presencia del complemento. Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia hemoltica pero aqu el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga o sus metabolitos. Reactivos y materiales: Tubos 12 x 75 mm de reaccin Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solucin salina. Reactivo de antiglobulina humana poliespecfico. Reactivo de antiglobulina humana monoespecfico IgG. Reactivo de antiglobulina humana monoespecfico C3 Panel de identificacin eritrocitos. Frascos con clulas control de AGH. Juego de clulas rastreadoras 3%. Baos mara a 37C. Centrfugas serolgicas. Gradillas de madera. Gradillas de metlicas. Microscopios. Papel toalla.
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Mtodo: De la muestra en estudio: Hacer una suspensin de trabajo entre el 3-5% y: - Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo poliespecfico. - Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo monoespecfica IgG. - Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo monoespecfico C3. Realizar un rastreo e identificacin de anticuerpos. RESULTADOS Prueba de antiglobulina humana directa:
MUESTRA
Poliespecfico
Monoespecfico IgG
Monoespecfico C3
Rastreo de anticuerpos: _________________________________________
Identificacin: ___________________________________________________ Interpretacin de Resultados: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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Anexo 1
Reactivos anti-A y anti-B
Los antisueros para ser utilizados en inmunohematologa pueden ser obtenidos de diferentes fuentes. Cada una de estas fuentes involucra distintos costos de produccin as como distintas especificidades y sensibilidades. Este tipo de variacin de los reactivos puede ser utilizada de manera secuencial y escalonada a ser requerida segn el estudio que se est realizando, por ejemplo, en el estudio de subgrupos, fenotipo pocos frecuentes y en las anemias hemolticas inmunes. REACTIVOS: Reactivos anti-A y anti-B: A partir de aloanticuerpos: Con anticuerpos del tipo IgM en su mayora con pequeas concentraciones de IgG, los cuales son dirigidos contra antgenos ABH que no posee la fuente de obtencin. La reactividad anti-A y anti-B observada en secreciones como leche, saliva, lgrimas, fluido cervical y asctico son del tipo IgA. Isoaglutininas con especificidad anti-A1 se encuentran en individuos fenotipeados como A2B. Anticuerpos de origen natural se pueden encontrar en sueros de donadores fenotipeados como A1 y A1B son de baja potencia y presentan dos especificidades: anti-H y anti. HI.
A partir de Anticuerpos Inmunes: Los anticuerpos obtenidos son en su mayora del tipo IgG. Las especificidades anti-A y anti-B encontradas en sujetos O generalmente no pueden ser separadas por absorcin, en tal forma que se dice que tienen una especificidad anti-A+B. La presencia de antgenos Ii son esenciales para optimizar la reaccin de este tipo de sueros, siendo su especificidad del tipo anti-AI, anti-BI, anti (A+B) I y anti-HI.
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Los anti H con mayor potencia se encuentran en individuos con fenotipo Bombay. Se ha reportado su presencia natural en animales como perros, gatos, cerdos, conejos y pollos. Adems se puede preparar por inmunizacin de conejos, cabras o pollos con eritrocitos O. A partir de Hibridomas: Se han producido una gran variedad de anticuerpos monoclonales con especificidades anti-A, anti-B y anti-A+B aplicando la tecnologa de hibridomas, algunos ejemplos son: 1) anti-A del tipo IgM del hibridoma AH21, del tipo IgG el hibridoma AH16; 2) anti-B del tipo IgM del hibridoma 3E-7; 3) anti-H del tipo IgM, del hibridoma BE2, del tipo IgG del hibridoma 101. 4) Anti A 1 hibridoma la clona S12 Lectinas: Se ha descrito un gran nmero derivadas de semillas de leguminosas. 1) Con especificidad anti-A, ejemplos Dolichos biflorus, Vicia cracca, Phaseolus lunatus limensis y Helio promatia. 2) Lectinas especficas anti-B se han encontrado slo en hongos, tales como Polyporus formentarius y Marasmius oreades. 3) Lectinas con especificidad anti-A+B, la lectina 1 de la Bandeirae simplicifolia. 4) Ulex europaeus, otras semillas con la misma especificidad son Cytitus sessilifolius y Laburnum alpinum.
Pueden presentarse discrepancias en la realizacin de la prueba. Estas son inherentes a los eritrocitos, el suero, la tcnica o a errores humanos. En cualquiera de los casos se debe resolver primero esta discrepancia antes de cualquier otro procedimiento adicional.
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Cuando las discrepancias se asocian a problemas inherentes al paciente se debe solicitar informacin necesaria para resolver la misma como pueden ser la edad, diagnstico, historia transfusional, historia de medicacin, niveles de inmunoglobulinas, historia ginecolgica. Aspectos a estudiar y resolver cuando se presentan incongruencias de grupo son: 1- Prueba inversa dbil (concentracin de anticuerpos baja ) a. Recin nacidos b. Ancianos c. Hipogammaglobulinemias d. Neoplasias e. Tratamiento con inmunosupresores f. Sndrome de inmunodeficiencias g. Trasplante de mdula sea h. Se recomienda la incubacin de la prueba inversa a temperatura ambiente por 15 minutos, si es negativa incubar 15-30 minutos a 4C. 2- Prueba directa dbil (concentracin de antgenos baja ) a. Subgrupo de A o de B b. Depresin de antgenos por diseritropoyesis c. Antgeno B adquirido como consecuencia de una obstruccin intestinal, carcinoma de colon o recto. d. Anticuerpos contra antgenos de baja incidencia presentes en reactivos anti-A o anti-B. e. Se recomienda el cambio de lote de reactivos. 3- Discrepancias entre la prueba directa e inversa asociada a concentraciones anormales de protenas. a. Mieloma mltiple b. Uso de expansores como dextrn y polivinilpirrolidona c. Gelatina de Wharton. d. La recomendacin inicial es lavar la muestra de eritrocitos con solucin salina y repetir el grupo. Diluir el suero 1:2 con solucin salina y repetir la prueba con la dilucin.
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Anexo 2
Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes. 2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinacin
Principio Los reactivos Thiol tienen la capacidad de romper las uniones disulfuro de la molcula pentamrica de IgM. Los autoanticuerpos que reaccionan en fro son en su mayora de esta clase, por lo que se puede hacer uso de estos para separar la aglutinacin causada por un autoanticuerpo reactivo al fro. La presencia de autoanticuerpos en un suero puede entorpecer o anular la realizacin de otras pruebas serolgicas que queremos como puede ser la determinacin del grupo sanguneo, pruebas de compatibilidad, as como enmascarar la presencia de alloanticuerpos clnicamente significativos. Es en estas situaciones donde hacemos uso de ellos y as poder realizar las pruebas que se necesiten sin interferentes. Estos reactivos se encuentran disponibles como 2-mercaptoetanol (2-ME) o ditiotreitol (DTT) y pueden ser utilizados para el tratamiento de glbulos rojos que aglutinan espontneamente debido a la presencia de autoanticuerpos fros.
Materiales: DTT 0.01 M 2-ME 0.1 M Buffer de PBS a Ph 7.3 Glbulos rojos empacados para ser tratados, lavados tres o cuatro veces. Mtodo: - Diluir los glbulos rojos a un 50 % de concentracin en PBS.
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- Aadir un volumen igual de DTT 0.01 M en PBS o 2-ME al 0.1 M en PBS a los glbulos rojos. - Mezclar e incubar a 37C por 15 minutos si utiliza DTT o 10 minutos si utiliza el 2-ME. - Lavar los glbulos rojos tres veces con solucin salina fisiolgica. - Diluir los glbulos rojos tratado a un 3-5% de concentracin en solucin salina fisiolgica y utilizar esta suspensin para realizar las pruebas de grupo sanguneo.
2.2 Autoadsorcin en fro

Principio La autoadsorcin puede ser utilizada para remover autoanticuerpos reactivos al fro, seguida por la deteccin de alloanticuerpos de importancia clnica. Materiales: Ficina al 1% papana al 1% 2 ml de suero a ser adsorbido 3 ml de glbulos rojos empacados Mtodo - Lavar los glbulos rojos 4 veces con solucin salina a 37C y divdala en tres alcuotas iguales en tubos 13 x 100 mm. - Remover completamente el sobrenadante despus de cada lavado. - Aadir un volumen igual de ficina al 1% o de papana al 1% a cada alcuota de glbulos rojos lavados. - Mezclar e incubar a 37C por 15 minutos. - Lavar los glbulos rojos tres veces en solucin salina fisiolgica. - Centrifugar el ltimo lavado por 5 minutos a 1000 xg y remover el mximo sobrenadante como sea posible.
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- A uno de los tubos tratado con enzima aadir 2ml del suero autlogo - Mezclar e incubar a 4C por 30 a 60 minutos - Centrifugar a 1000 x g por 5 minutos y transferir el suero a un segundo tubo de glbulos rojos tratado con enzima. - Mezclar e incubar a 4C por 30 a 40 minutos. - En muchos casos, dos adsorciones son ms que suficientes para remover los autoanticuerpos. Si el autoanticuerpo es particularmente fuerte, repetir una nueva adsorcin con un tercer tubo de glbulos rojos tratados con enzima. - Despus de la adsorcin final, utilizar el suero para ver la actividad de alloanticuerpos.
Nota: La dilucin del suero en estos procesos puede provocar una prdida de reaccin de los alloanticuerpos, por lo que es importante remover el mximo de salina residual en el cada paso. La autoadsorcin no puede ser utilizada si el paciente ha sido transfundido recientemente. En estos casos se recomienda la absorcin con estroma de eritrocitos de conejo.
2.3 Tcnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas fras

Principio La reactividad de un autoanticuerpo fro de la clase IgM puede ser reducida o eliminada utilizando las pruebas precalentadas. Muchos problemas encontrados en las pruebas de compatibilidad, deteccin de anticuerpos y pruebas de identificacin pueden ser causados por aglutininas fras los cuales pueden ser resueltos a travs de esta tcnica.
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Materiales: Solucin salina fisiolgica calentada a 37C Suero del paciente Albmina bovina al 22% Clulas reactivo ( rastreadoras, panel o para donador)
Mtodo: - Rotular adecuadamente los tubos que se van a utilizar. - Aadir una pequea cantidad de la suspensin de clulas al tubo correspondiente, reactivos, solucin salina y colocarlos en el bao a 37C. - Realizar el procedimiento deseado siempre dentro del bao de mara guardando la temperatura apropiada.
2.4 Adsorcin de autoanticuerpos fros utilizando estroma de eritrocitos de conejo.

Principio Los procedimientos de autoadsorcin no son recomendados cuando el paciente ha sido recientemente transfundido. Los eritrocitos de conejo son conocidos porque son ricos en el antgeno I, el estroma hecho de eritrocitos de conejo es ideal para realizar estas adsorciones. Materiales Estroma de eritrocitos de conejo Suero del paciente que contiene el autoanticuerpo
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Mtodo - Centrifugar al menos 2 minutos una muestra del reactivo de eritrocitos de conejo y remueva completamente el sobrenadante. - Aadir 1 ml del suero a adsorber. - Mezclar fuertemente preferiblemente utilizando un vortex. - Incubar a 4C por 15 a 60 minutos y mezclar ocasionalmente. - Centrifugar al menos 2 minutos y transferir el suero adsorbido a un tubo limpio. - Realizar el rastro de anticuerpos, identificacin o prueba de compatibilidad con este suero acorde a los procedimientos de rutina. Nota: Adems del antgeno I, los eritrocitos de estroma de conejo poseen antgeno B, antgenos del sistema P y antgenos del sistema H. Tenga presente que el suero adsorbido con estroma de eritrocitos de conejo no puede ser utilizado para realizar el tipeo srico para el sistema ABO. Algunos alloanticuerpos incluyendo el anti-D, anti-E y el anti-Leb, se han reportado que tambin son adsorbido con el estroma de eritrocitos de conejo.
2.5 Disociacin de IgG utilizando cloroquina

Principio La mayora de las anemias hemolticas autoinmunes poseen una reactividad en caliente (37C), donde se presentan autoanticuerpos de la clase IgG. Este tipo de muestra presenta una prueba de antiglobulina humana directa positiva. En ocasiones se requiere hacer anlisis adicional como la determinacin de grup o fenotipo, las cuales son de difcil realizacin debido a la interferencia de los autoanticuerpos que recubren a los glbulos rojos.
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Bajo condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de los glbulos rojos con el mnimo dao a la membrana. Utilizando este procedimiento se puede realizar fenotipo completo de los glbulos rojos que poseen una prueba de antiglobulina humana directa positiva. Materiales: Solucin de difosfato de cloroquina. Glbulos rojos sensibilizados por una IgG Glbulos rojos control heterocigotos para el antgeno de la prueba a ser fenotipeado. Reactivo de antiglobulina humana monoespecfico anti-IgG Mtodo: - A un volumen de los glbulos rojos sensibilizados lavados aadir 4 volmenes de la solucin de difosfato de cloroquina. - Tratar el control de la misma forma. - Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. - Remuever una pequea alcuota de los glbulos tratados y lavarlos 4 veces con salina fisiolgica. - Pruebar los glbulos lavados con el reactivo de antiglobulina humana monoespecfico anti-IgG - Si la prueba da negativo, lavar el resto de la muestra y el control tres veces y utilizarlos para las pruebas de fenotipo. - Si la prueba da positiva seguir incubando por espacios de 30 minutos por un mximo de 2 horas hasta que la prueba de un resultado negativo. Nota: El difosfato de cloroquina no disocia molculas del complemento, por lo que slo se puede utilizar el reactivo monoespecfico IgG. Incubaciones mayores de dos horas o a 37C pueden resultar en hemlisis, dao o prdida de antgenos del glbulo rojo. Puede haber desnaturalizacin de antgenos Rh.
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2.6 Adsorcin autloga de autoanticuerpos con reactividad caliente

Principio Los autoanticuerpos con reactividad caliente pueden enmascarar la presencia de alloanticuerpos coexistentes en el suero. La adsorcin del suero con glbulos rojos autlogos puede remover los autoanticuerpos, permitiendo la deteccin de los alloanticuerpos. Clulas autlogas circulantes, sin embargo, tambin estn cubiertas por autoanticuerpos. Algunos de los autoanticuerpos pueden ser removidos de la superficie de glbulos rojos autlogos. La autoadsorcin no se puede realizar si se ha realizado una transfusin reciente. Procedimiento enzima y calor: Materiales: Albmina bovina al 6%, preparada por dilucin con salina. Ficina al 1% o papana activada con cistena al 1%. Muestra de sangre que contiene un autoanticuerpo caliente. Mtodo: - Lavar al menos 4 veces 2 ml de los glbulos rojos y descartar el sobrenadante final. - Aadir al paquete celular un volumen igual de albmina a 6%. - Mezclar e incubar a 56C por 3 a 5 minutos. - Agitar la mezcla durante este tiempo. - Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y separar el sobrenadante. - Lavar los glbulos tres veces en solucin salina y descartar el sobrenadante final.
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Aadir 1 ml de ficina al 1% o papana a los glbulos rojos. Mezclar e incubar a 37C por 15 minutos Lavar los glbulos 3 veces con solucin salina. Centrifugar el ltimo lavado 5 minutos a 1000 xg. Utilizar succin para remover el mximo posible de sobrenadante. Dividir los glbulos en dos alcuotas iguales. A una alcuota aadir 2 ml de suero del paciente. Mezclar e incubar a 37C por 30 minutos. Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda alcuota de glbulos tratados con enzima. - Mezclar e incubar a 37C por 30 minutos. - Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido. - Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la tcnica de la antiglobulina indirecta.
2.7 Tcnica utilizando ZZAP

Materiales Papana activada con cistena al 1% Buffer PBS pH 7.3 Ditiotreitol al 0.2 M Muestras de sangre que contengan autoanticuerpos calientes. Mtodos - Preparar reactivo ZZAP mezclando 0.5 ml de papana activada cistena con 2.5 ml de DTT y 2 ml de PBS a pH 7.3. - Alternativamente puede utilizar 1 ml de ficina, 2.5 ml de DTT y 1.5 ml de PBS a pH 6.5 - A dos tubos que contengan 1 ml de glbulos rojos empacados aadir 2 ml del reactivo ZZAP.
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Mezclar e incuba a 37C por 30 minutos Lavar los glbulos tres veces con salina. Centrifugar el ltimo lavado por 5 minutos a 1000 xg. Utilizar succin para remover todo el sobrenadante. Dividir los glbulos en dos alcuotas iguales. A una alcuota aadir 2 ml de suero del paciente. Mezclar e incubar a 37C por 30 minutos. Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda alcuota de glbulos tratados con enzima. - Mezclar e incubar a 37C por 30 minutos. - Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido. - Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la tcnica de la antiglobulina indirecta.
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Anexo 3
Tcnicas de elucin de anticuerpos
Principio La liberacin del anticuerpo adsorbido a los antgenos del glbulo rojo en una prueba de antiglobulina humana directa es utilizado por los investigadores para determinar si los anticuerpos asociados son autoanticuerpos calientes o alloanticuerpos de importancia clnica y para la separacin de mezclas de anticuerpos de la clase IgG. En estos procedimientos, a diferencia de la utilizacin de cloroquina, se pretende separar el o los anticuerpos manteniendo la integridad de estos para ser identificados sin importar la membrana del glbulo rojo.
3.1 Elucin cida con digitonina

Materiales: Digitonina al 0.5 % Glicina al 0.1 M, pH 3.0 Buffer de fosfato 0.8 M, pH 8.2 Suero de albmina bovina al 30% 1 ml de glbulos rojos empacados lavados 6 veces en salina fisiolgica Resupender en salina en el ltimo lavado. Mtodo: - Calientar los reactivos a 37C antes de su uso. - Mezclar 1 ml del paquete de glbulos lavados con 9 ml de salina fisiolgica en un tubo 16 x 100 mm. - Aadir 0.5 ml de digitonina y mezclar 1 minuto por inversin hasta que los glbulos sean hemolizados. - Centrifugar a 1000 xg por 5 minutos y descartar el sobrenadante. - Lavar el estroma al menos 5 veces hasta que este aparezca de color blanco.
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Centrifugar al menos 2 minutos a 1000 g durante el proceso de lavado. Descartar el sobrenadante final y aadir 0.2 ml de glicina al estroma. Mezclar por inversin al menos por 1 minuto. Centrifugar el tubo a 1000 xg por 5 minutos. Transferir el eluato del sobrenadante a un tubo limpio y aadir 0.2 ml de buffer de fosfato. - Mezclar y centrifugar a 1000 xg por 2 minutos. - Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y aadir un tercio de volumen de albmina bovina al 30%. - Realizar las pruebas de identificacin de anticuerpo con el eludo.
Nota: El pH bajo de la solucin del buffer cido aumenta la elucin de los anticuerpos del estroma de los glbulos rojos. El buffer de fosfato es aadido para restaurar la neutralidad del eludo cido. La acidificacin persistente puede causar lisis de los glbulos rojos aadidos al eludo. La adicin de la albmina bovina al eludo protege contra la hemlisis.
3.2 Tcnica de Rubin modificada

Mtodo: - Lavar un paquete de eritrocitos en estudio 3 veces con solucin salina, descartar la salina en cada lavado. - Agregar 0.5 ml de solucin salina fisiolgica. - Agregar ter a la mitad del volumen anterior , tapar y agitar fuertemente por 30 segundos. - Destapar, colocar el tubo en un beaker con una corriente continua de agua a 50C y girar constantemente durante 5 minutos a 56C en un bao de mara. - Centrifugar un minuto a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo.
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- La mezcla contiene el anticuerpo eludo de los eritrocitos, hacer el estudio de anticuerpos para conocer su especificidad.
3.3 Tcnica de eludo de Lui

Mtodo: Lavar los glbulos rojos tres veces con salina. Agregar 0.5 a 1.0 ml de solucin salina congelada a 1C. Incubar por 15-30 minutos a -20C. Descongelar la muestra. Centrifugar 5 minutos a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo. Hacer el estudio de anticuerpos para conocer su especificidad.
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Anexo 4
Procedimientos para estudio de anemias hemolticas inducidas por medicamentos
4.1 Demostracin de la formacin de complejos inmunes inducidos por droga

Principio Ciertos tipos de medicamentos y sus respectivos anticuerpos pueden formar complejos inmunes que atacan a los glbulos rojos. Estos no son especficos contra los antgenos del glbulo rojo, pero su unin inespecfica a la membrana puede activar el complemento, lo cual va a producir hemlisis in vivo. Este procedimiento provee los mecanismos para demostrar la formacin del complejo inmune asociado con la interaccin del complejo droga-antidroga. Materiales Medicamento bajo investigacin, en la misma forma que el paciente lo recibe. (tabletas, soluciones o cpsulas) PBS a pH 7.0-7.4 Suero del paciente Suero normal fresco como fuente de complemento y conocido que carezca de anticuerpos. Glbulos rojos O tratados y no tratados con enzimas proteolticas Mtodo - Preparar 1 mg/ml de la suspensin del medicamento en buffer de PBS. - Centrifugar y ajustar el pH del lquido supernatante a 7.0 con NaOH 1N o HCL 1N.
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Utilizar 0.2 ml de cada reactante como sigue: Suero del paciente + medicamento Suero del paciente + complemento (suero normal) + medicamento Suero del paciente + complemento (suero normal) + PBS Suero normal + medicamento Suero normal + PBS A 150 ul de cada mezcla de prueba aadir 50 ul de una suspensin al 5% de glbulos rojos O. A otro juego de tubos de cada mezcla de prueba aadir 50 ul de una suspensin al 5% de glbulos rojos O tratados con enzima. Mezclar e incubar a 37C por 1 o 2 horas, mezclar cada cierto tiempo. Centrifugar y examinar por aglutinacin y hemlisis. Lavar los glbulos 4 veces con solucin salina fisiolgica y realizar la prueba de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecfico.
Interpretacin: Hemlisis, aglutinacin o recubrimiento puede ocurrir. Cualquier actividad en las pruebas que poseen el suero del paciente y ausencia en los controles indican interaccin de la droga-antidroga.
4.2 Deteccin de anticuerpos contra penicilina o cefalotina

Principio Los glbulos rojos pueden ser cubiertos con la penicilina o cefalosporinas. Este recubrimiento puede estar asociado con la positividad de la prueba de antiglobulina humana directa. Materiales Buffer de salina barbital (BBS) a pH 9.6 Penicilina (1 x 106 U por 600 mg) Solucin de cefalotina (Keflin) 400 mg 2 ml de glbulos rojos lavados del grupo O Suero o eluato aprobar.
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Mtodo - Preparar clulas cubiertas con penicilina incubando 1 ml de glbulos rojos con 600 mg de penicilina en 15 ml de BBS por 1 hora a temperatura ambiente. - Lavar 3 veces con solucin salina y almacenar en solucin de Alsever a 4C. - Preparar glbulos rojos sensibilizados con cefalotina incubando 1 ml de glbulos rojos con 400 mg de cefalotina de sodio en 10 ml de BBS por 2 horas a 37C. - Lavar 3 veces con solucin salina fisiolgica y almacenar en solucin de Alsever a 4C. - Mezclar 100 ul del suero o eluato con 50 ul de la suspensin del 5% de las clulas sensibilizadas. - Diluir el suero 1:20 con solucin salina fisiolgica las clulas cubiertas con cefalotina. - Pruebar en paralelo con eritrocitos sin sensibilizados y el suero del paciente. - Incubar la prueba a 37C por 30 a 60 minutos. Centrifugar y examinar macroscpicamente por aglutinacin. - Lavar los glbulos 4 veces en solucin salina fisiolgica y realizar la tcnica de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecfico y monoespecfico IgG. Nota: Todos los sueros normales reaccionan con los glbulos rojos cubiertos con cefalotina debido a la adsorcin de protenas no inmunolgicas. Esta reactividad se logra eliminar si el suero es diludo 1:20 antes de usar.
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Bibliografa 1) American Association of Blood Banks. Manual Tcnico. 15 Edicin, Bethesda MD. American Association of Blood Banks, 2005. 2) Rodrguez, M. Carboni, L. Garanta de Calidad en Banco de Sangre. San Jos, Costa Rica. Publicaciones de la UCR, 1995 3) Silva MA, ed. Standards for blood Banks and transfusion services. 23 rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005:88 4) Clinical laboratory safety; approved guideline. NCCLS document GP17A. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Wayne, PA: NCCLS, 1996. 5) Quality Control in Blood Banking. American Association of Blood Banks: 1973 6) Standard for Blood Banks and Transfusion Services. Edition 21. Bethesda MD. American Association of Blood Banks, 2002 7) Modern Blood Banking and Transfusion Practices. Harmening Denise M. Library of Congress Cataloging in Publication Data. 4 Editions. USA. 8) Sally Rudman. Textbook of Blood Banking and Transfusion Medicine. W Saunders Company. Philadelphia 1995. 9) Karl Landsteiner and the first human marker locus. R Owen Genetics. 2000 July; 155(3): 995-998 Judd WJ. Methods in immunohematology. 2 ed. Durham, NC: 10) Montgomery Scientific Publications, 1994. Judd WJ. Practice guidelines for prenatal and perinatal 11) immunohematology, revisited. Transfusion 2001; 41: 1445-52 12) Agre P, Cartron JP. Molecular biology of the Rh. antigens. Blood 1991;78:551-3 13) Avent ND, Reid ME. The Rh. blood group system: A review. Blood 2000; 95:375-87. 14) Rodrguez M, H. El Banco de Sangre y la Medicina Transfusional,. Mxico, D.F: Mdica Panamericana, 2004 15) Dueas, V. El Banco de Sangre: (teora, principios y procedimientos.. Coleccin ciencias fsicas, exactas y naturales. Universidad del Valle. 2003
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16) Blood Banking and Tarnsfusion Medicine. Basic Principles and Practice, Hillyer, C. Churchill Livingstone Elsevier. USA. 2 Ed, 2007. 17) Immune Hemolytic Anemias. Petz, L. Churchill Livingstone Elsevier. USA. 2 Ed, 2004 18) Chiaroni, J. Groupes sanguins rythrocytaires Red-cell blood groups EMC-Hmatologie 2 (2005) 53112.
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Manual de Laboratorio

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Gua de pruebas de laboratorio para Inmunohematologa y Banco de Sangre

Anexo 3 ............................................................................................................................. 128 Tcnicas de elucin de anticuerpos ................................................................................... 128

Anotaciones: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Prctica: Determine el grupo ABO y Rh de al menos 10 muestras sanguneas.

Conclusin: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Resultados, discusin y conclusiones:

Nota: No olvide reportar los resultados en cruces en base a la intensidad de aglutinacin.

Recipientes de descarte de muestras y material

Muestras: Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular.

Mi grupo sanguneo es:

Clulas Control de AGH

Reaccin de inhibicin de la hemaglutinacin

Interpretacin de resultados sistema MN Anti-M 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-N 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpretacin MM NN MN

Interpretacin de los resultados sistema Ss Anti-S 1+ a 4+ 0 1+ a 4+ Anti-s 0 1+ a 4+ 1+ a 4+ Interpretacin SS ss Ss

Resultados, discusin y conclusiones:

Clulas Control de AGH

Interpretacin de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd.

Resultados, discusin y conclusin:

Resultados Fase I MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Fase II MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Fase III MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Clulas Control de AGH

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA

MUESTRA I Lectura Clulas Control AGH

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA Fase I MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Fase II MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Fase III MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Clulas Control de AGH

Clulas Control de AGH Interpretacin de Resultados: Muestra I: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Fase II MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Fase III MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III

Clulas Control de AGH

Clulas Control de AGH

Interpretacin de Resultados: Muestra I: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Muestra II: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Prctica: Analizar los siguientes casos obtenidos de rastreos de anticuerpos.

Grupo del Paciente O A B AB

Grupo del Paciente

Grupo eritroctico ABO /Rh

Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4

Grupo eritroctico ABO /Rh

Donante 1 Donante 2 Donante 3 Donante 4

Rastreo de anticuerpos: _________________________________________

Identificacin: ___________________________________________________ Interpretacin de Resultados: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

2.2 Autoadsorcin en fro

2.3 Tcnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas fras

2.4 Adsorcin de autoanticuerpos fros utilizando estroma de eritrocitos de conejo.

2.5 Disociacin de IgG utilizando cloroquina

2.6 Adsorcin autloga de autoanticuerpos con reactividad caliente

2.7 Tcnica utilizando ZZAP

3.1 Elucin cida con digitonina

3.2 Tcnica de Rubin modificada

3.3 Tcnica de eludo de Lui

4.1 Demostracin de la formacin de complejos inmunes inducidos por droga

4.2 Deteccin de anticuerpos contra penicilina o cefalotina

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Anotaciones:

Conclusin:

Clulas Control de AGH Interpretacin de Resultados: Muestra I:

Interpretacin de Resultados: Muestra I:

Muestra II:

Identificacin: _ Interpretacin de Resultados: ______________