TCNICAS PARA MEDICIN DE BIOMASA

Avils Montes Yomar1; Doria Espitia Mara Alejandra1*; Martnez Urango Adela1; Romeros Martnez Mara Alejandra1; Melndez Gonzales Edwin1; Ortega Luz Estella1.

RESUMEN Biomasa es un trmino que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. En un bioproceso la determinacin de biomasa es una variable importante debido a que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. En este laboratorio se realiz la medicin de la biomasa de un cultivo de levadura (sacharomyces cerevisiae) a diferentes concentraciones, por medio de las tcnicas de peso seco, Cmara de Neubauer y densidad ptica. El objetivo de este ensayo es desarrollar la habilidad y competencias para medicin de la biomasa microbiana que interviene en los bioprocesos a travs de las tcnicas de cmara de Neubauer, peso seco, y densidad ptica. ABSTRACT Biomass is a term that refers to the microorganisms present in a system. Determining a bioprocess in biomass is an important variable because its determination leads to an understanding of efficiency. This laboratory performed the measurement of the biomass of a culture of yeast (Saccharomyces cerevisiae) at different concentrations, by means of techniques of dry weight, Neubauer chamber and optical density. The aim of this paper is to develop the ability and skills to measure microbial biomass involved in bioprocesses through techniques Neubauer chamber, dry weight and optical density.

Estudiantes del programa de Ingeniera de alimentos de la Universidad de Crdoba. Facultad de ingenieras. Km 10 va Cinaga de oro Berastegui -Colombia. Tel/fax: 7561413, Email: mariaaleja02@hotmail.com*

1. RESULTADOS Y ANALISIS 1.1. Medicin de la biomasa microbiana por conteo directo en cmara de Neubauer: Para determinar la concentracin final de las muestras problemas se aplic la siguiente ecuacin partiendo de la solucin madre previamente preparada:

Como el factor de dilucin es:

El volumen de los 5 cuadros es:

( ) ( ) ( ( ) )

[0 g/L] [0.1 g/L] [0.2 g/L] [0.3 g/L] [0.4 g/L] [0.5 g/L]

Cuadro 1 0 3 4 6 9 9

Cuadro 2 0 4 7 6 7 8

Cuadro 3 0 5 4 6 7 10

Cuadro 4 0 7 4 4 8 11

Cuadro 5 0 5 7 6 6 5

Total 0 24 30 36 37 43

Tabla 1. # Clulas por cuadro para cada concentracin en la cmara de Neubauer

El nmero de clulas para cada dilucin es: [ ]

Al calcular el nmero de levaduras en cada dilucin utilizando la formula anterior reportamos los siguientes resultados. [Concentracin] dilucin. [0 g/L] [0.1 g/L] [0.2 g/L] [0.3 g/] [0.4 g/L] [0.5 g/L] Nmero total de celulas 0 cel/L 360000000o cel/L 4500000000 cel/L 5400000000cel/L 5550000000cel/L 6450000000cel/L

Tabla 2. Clulas / litros en cada dilucin.

A travs del recuento directo en la cmara de Neubauer, es posible visualizar las caractersticas morfolgicas de las clulas; el nmero de levaduras corresponde a lo esperado debido a que, en el tubo en el cual no se adicion lquido de la solucin madre no se contabilizaron ninguna clula. Entonces, a medida que va aumentando la cantidad de lquido madre en la dilucin el nmero de Sacharomyces cerevicea, aumentaba paulatinamente; por lo tanto se verific que el tubo 6 que contena una concentracin de 0.5 g/l de levadura el nmero de clulas por unidad de volumen fue de 6450000000cel/L, mucho mayor a por ejemple, al tubo 2 donde su concentracin fue de 0.1g/L donde se hallaron 360000000o cel/LG. Segn, Mara J Gualtieri A et al el nmero de clulas por unidad de volumen de Sacahromyces cerevisiae reportado en el efecto del residuos de pulpa de Coffea arabica L, para el crecimiento de esta levadura est alrededor de 1*10^6 cel/ml en medios de cultivo de extracto de cido de caf. Este valor es similar a los reportados en la anterior prctica de medida de la biomasa para la levadura en discusin. Los inconvenientes de esta tcnica radican en que el laboratorista se puede confundir al momento de contar las clulas en cada cuadro, adems puede cansarse y contar varias veces la misma levadura. Un error que se pudo presentar en el laboratorio fue al momento de llenar la cmara de Neubauer con la dilacin en estudio es que era necesario lavarla y por ello podran haber quedado restos de la solucin y distorsionar los resultados.

1.2. Medicin de la biomasa microbiana por densidad ptica: Absorbancia vs nmero de cedula/L

Nmero total de clulas/L 0

Absorbancia 0

3600000000 4500000000 5400000000 5550000000 6450000000

0,003 0,004 0,006 0,007 0,013

Tabla 3. Datos de correlacin nmero de clulasSacharomices cerevisiae (celulas/L) vs Absorbancia

Absorbancia vs Numero de celulas/L

0.014 0.012 0.01 Absorbancia 0.008 0.006 0.004 0.002 0 -0.002 0 -0.004 2E+09 4E+09 6E+09 8E+09 1E+10 Nmero de clulas/L Sacharomyces cerevisiae Absorbancia Linear (Absorbancia ) y = 2E-12x - 0.0015 R = 0.7402

Figura 1. Curva de calibracin que relaciona el nmero de cedulas de las soluciones preparadas con su respectiva absorbancia.

Por medio de la absorbancia podemos medir la masa del microorganismo en una suspensin y por el conteo directo en cmara de Neubauer podemos determinar el nmero de clulas con estos dos parmetros se realiz un curva de calibracin como se muestra en la Figura 1 observando que a medida que aumenta el nmero de cedulas de la Sacharomyces cerevisiae, aumenta tambin la absorbancia, indicando una proporcionalidad positiva. Lo anterior hace referencia a mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. La curva se realiza con el objetivo de la determinacin de una curva de calibracin representativa del sistema en estudio pero segn el R 2 obtenido nos da entender que no se representa de la mejor forma la correlacin entre absorbancia y nmero de clulas de la levadura en estudio. Para el caso de la Sacharomyces cerevisiae, y bajo las condiciones del experimento se tiene la siguiente ecuacin, con un coeficiente de determinacin de 0.7472 :

Donde:

A:

Absorbancia de la muestra

Nc: Numero de clulas de Sacharomyces cerevisiae/L Estas ecuaciones nos permiten en cualquier caso dado conocer la concentracin de la muestra simplemente midiendo la absorbancia de la solucin. Segn Rodrguez, et al (2005), para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario que ms de un milln de clulas por ml, para la utilizacin de un espectrofotmetro. Por lo que los mtodos de turbidimetra para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente pequeo de bacterias y o levaduras no es un mtodo til. Caceres, et al. (2002), relacion el conteo directo de levaduras sacharomyces cerevisiae por cmara de Neubauer con la densidad ptica a una longitud de onda de 600 nm, obtuvo una ecuacin lineal con un coeficiente de correlacin de 0,9888 lo que indica un buen ajuste de los datos mediante la tcnica del conteo directo. En base a su ecuacin se cuantificar la cantidad de microrganismos para los modelos primarios o secundarios de los microrganismos. En el caso de nuestro experimento se evidencian errores debido a que existe mucha desviacin de los datos en cuanto al conteo directo, adems esta metodologa confiere a errores debido a que depende totalmente de la observacin del analista. Medicin de la biomasa microbiana por peso seco celular: Nmero del tubo Peso tubo con solido Peso tubo sin solido gramos de clula gcel/L T1 T2 T3 T4 T5 T6 11,789 12,603 11,379 12,681 12,293 12,516 11,787 12,599 11,374 12,674 12,285 12,507 0,002 0,004 0,005 0,007 0,008 0,009 0,2247 0,4494 0,5102 0,7865 0,8988 1,011
Tabla 5.Resultados peso seco celular

Atendiendo a los resultados obtenidos en la tabla 5 en la determinacin de peso, se observa que para la solucin patrn (T1), que contena agua se present registr de peso, lo que se pudo presentar por: contaminacin de pipetas, al momento de transferir el agua al tubo; tambin se pudo presentar, que el agua presentaba turbidez, o no estar en las condiciones adecuadas. Si se observa a partir del tubo 3 se obtiene gramos de clulas mayor que el adicionado a la solucin de un litro, pero esto se debe a las interferencias del proceso, y se evidencia en que el tubo que contena solamente agua presento un peso seco, es decir, que existan en el agua slidos.

Absorbancia vs peso seco celular

gcel/L Absorbancia

0,2247 0

0,4494 0,003

0,5102 0,004

0,7865 0,006

0,8988 0,007

1,011 0,013

Tabla 4. Datos de correlacin g/L de levadura Sacharomices cerevisiae (g/L) vs Absorbancia

Absorbancia vs peso seco celular g/L

0.014 0.012 0.01 lAbsorbancia 0.008 0.006 0.004 0.002 0 -0.002 0 0.5 1 1.5 Peso seco celular g/L de Sacharomyces cerevisiae Series1 Linear (Series1) y = 0.0137x - 0.0034 R = 0.8731

Figura 2. Curva de calibracin que relaciona la concentracin de las soluciones preparadas con su respectiva absorbancia.

Como se observa en la Figura 2 a medida que aumenta el peso seco celular de la Sacharomyces cerevisiae en peso hmedo, aumenta tambin la absorbancia, indicando una correlacin positiva. Lo que indica, que a medida que exista mayor concentracin de clulas de levadura en una solucin, la absorbancia ser mayor, por lo que, la cantidad de luz que atraviesa a la solucin se reduce a medida que aumenta la concentracin de sta. Segn Scragg (1996), el mtodo espectrofotomtrico es muy provechoso, ya que de acuerdo a la Ley de Beer Lambert, para este caso, en una celda las clulas microbianas desvan la luz, de modo tal que la cantidad de sta que llega al detector del espectrofotmetro, se encuentra relacionada directamente con el nmero de clulas presentes en la muestra. De acuerdo a la posicin de Scragg, es aprovechable la relacin positiva de la concentracin de clulas en un cultivo con respecto a la absorbancia, ya que al relacionar los gramos de clulas presentes en una solucin frente a la absorbancia, se obtiene una ecuacin que relaciona estos parmetros y que puede usarse para experimentos posteriores con el mismo microorganismo a condiciones similares o iguales. Para el caso de la Sacharomyces cerevisiae, y bajo las condiciones del experimento se tiene la siguiente ecuacin, con un coeficiente de determinacin de 0.8731, es decir, que la ecuacin explica el comportamiento del experimento:

Dnde:

A: Absorbancia de la muestra de Sacharomyces cerevisiae y P: Peso seco de la muestra Es indispensable resaltar, que la absorbancia es afectada por el tamao y la forma de las clulas. La relacin entre la absorbancia y el nmero de clulas cambia si el tamao o forma de estas cambia durante el crecimiento del cultivo, lo que puede conllevar a posibles errores en los experimentos, debido al momento de la cintica de crecimiento en que se encuentren los microorganismos. Segn Toro (2005), la relacin que existe directamente entre la absorbancia y el peso seco de alguna solucin, slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones en el experimento. En este experimento, se comprob esta afirmacin, debido a que la absorbancia de las muestras no supero el 0,013. Roma, et al (2003), realizaron un estdio sobre l preduccin de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus en un Biorreactor de Tanque Agitado, para examinar dicha produccin se realizaron estudios relacionados con el crecimiento de levaduras en diferentes condiciones operativas y nutricionales. Para obtener los resultados del estudio, determinaron biomasa realizando la curva de calibracin para el peso seco (kg.m-3) y la densidad ptica (DO) leda por espectrofotometra a 570 nm, determinndose que 1 OD equivale a 0.469 kg.m-3 de clulas.

2. CALCULOS Y CONSULTAS Calcule y reporte la concentracin de cada una de las diluciones problemas (clulas/mL, Absorbancia y gr de clula/L).

Calculo de las concentraciones de las disoluciones problemas para peso seco: Cultivo madre: Cm [ ] [ [ ] ]

Concentraciones de muestras problemas Para determinar la concentracin de la solucin problema. Se tiene

Donde C1: concentracin solucin madre V1: Volumen solucin madre

V2: Volumen solucin final (10ml)

C2: Concentracin de muestra problema

Luego para la solucin problema 1, se tiene una concentracin:

0, Este procedimiento se realiz para la determinacin de la concentracin de las dems muestras problema, las cuales se muestran en la tabla 6. Nmero de muestra M1 M2 M3 M4 MM5 6 Concentracin g/L 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Tabla 6. Concentraciones de soluciones problema (g/L) para biomasa microbiana por peso seco celular

Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin de la biomasa microbiana.

Mtodos microscpicos mediante epifluorescencia

La microscopa de epifluorescencia comenz a emplearse a principios de los 70 y hoy en da se considera como uno de los mejores mtodos para la estimacin de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adicin de algn anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algn componente celular autofluorescente. Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tincin de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopa ptica con iluminacin de epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observacin directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedaran englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actan especficamente sobre cidos nuclecos u otros componentes celulares. El segundo incluira a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad metablica, son convertidos en molculas fluorescentes. Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimacin de la poblacin total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten distinguir clulas de partculas e identificar bacterias no slo por su color, sino tambin por su forma y tamao. El naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las clulas emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los cidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan

un color verde fluorescente. EI fluorocromoDAPI es un colorante especfico del ADN y su pico de excitacin se encuentra prximo a la regin ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las clulas muertas, metablicamente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en clulas muertas.El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina o el DAPI, es un colorante especfico de cidos nucleicos. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del cido 1 -anilino-8 naftalensulfnico (Mg-ANS) tien principalmente componentes celulares como protenas, lpidos o membranas celulares. En cambio, el comportamiento de estos agentes fluorocromos es el comentado anteriormente, sobrestiman el nmero de clulas viables al no distinguir clulas vivas de muertas. En el segundo grupo quedaran englobados fluorocromos como el cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC) el 5 y 6 diacetato de sulfofluorescena (SFDA) .Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores, distinguen bacterias metablicamente activas de las que no lo son mediante la observacin microscpica del producto fluorescente resultado de la actividad metablica para la que son especficos. En el caso del CTC 1a actividad metablica es la respiratoria y en el del SFDA es la actividad esterasa. La epifluorescencia basada en fluorocromos como el CTC y el SFDA pondr de manifiesto aquellos microorganismos en los cuales estn presentes dichas actividades metablicas, pero sin cuantificarlas. Salvando este obstculo se encuentran las medidas bioqumicas de determinacin indirecta de la biomasa, que s cuantifican actividades metablicas. La epifluorescencia es un mtodo simple y rpido. No obstante, su reproducibilidad est cuestionada y necesita un equipamiento relativamente caro. La fluorescencia mediante anticuerpos marcados con agentes fluorescentes est basada en las propiedades inmunolgicas de las clulas. Es una tcnica muy sensible y especfica, y puede realizarse in situ. Tambin puede llevarse a cabo mediante hibridacin de sondas fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ hybridization, FISH), cada vez ms utilizadas en Ecologa Microbiana. Mtodos de siembra El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas clulas viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1- 1 ml de la suspensin microbiolgica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensin sobre la superficie del medio de cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volumen de la suspensin microbiolgica. Para que el recuento sea estadsticamente significativo, el nmero de colonias deber estar comprendido entre 30 y 300 colonias. En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear la filtracin de membrana, en la que tras la filtracin de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente sobre el agar. Mtodos indirectos de determinacin de biomasa. Estos mtodos se basan fundamentalmente en la determinacin de algn componente celular especfico, en la cuantificacin de alguna actividad enzimtica (mtodos bioqumicos) o en la

medida de consumo de sustrato o de la formacin de algn producto (mtodos cinticos). Tambin se incluyen en este apartado algunos mtodos fisicoqumicos. Los mtodos bioqumicos y cinticos determinan, ms que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen ms del estado metablico de los microorganismos que del nmero de individuos (Arniz et al, 2000). Componentes celulares. Cualquier componente celular seleccionado para la estimacin de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente nicamente en clulas vi vas, ser rpidamente degradado en clulas vivas, ser relativamente constante en concentracin respecto a cambios en el estado fisiolgico celular y entre distintas epsecies. Hasta el momento no existe ningn componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin embargo, los ms adecuados para estimar biomasa viva (Arnizet al, 2000), son: cidos nucleicos, El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya sntesis es proporcional a la tasa de crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varan considerablemente con el estado fisiolgico celular, la cantidad de ADN es relativamente ms constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometra, tras su extraccin y purificacin. Existen diversas tcnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificacin son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos (Arnizet al, 2000). Protenas, Existen varias tcnicas para el anlisis de protenas totales de una muestra biolgica. Algunos estn muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el caso de las tcnicas de Lowry et al. y Bradford.La principal desventaja de la determinacin de protenas es que su cantidad en las clulas est sujeta a fuertes variaciones debido, fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoqumicas y al estado fisiolgico celular (Arnizet al, 2000). Polisacridos, La mayora de las clulas procariotas contienen cido murmico (un peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias tcnicas para 1a determinacin del cido murmico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversin del cido murmico a lactato, seguida del anlisis enzimtico o qumico de la concentracin de lactato. El cido murmico se extrae de 1as clulas mediante una hidrolisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografa de intercambio inico. Otros anlisis ms sensibles necesitan del uso de cromatografa lquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas estas tcnicas son laboriosas. Muy largas y necesitan de un equipamiento caro (Arnizet al, 2000). Lpidos, Los lpidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinacin para la estimacin de la biomasa de una poblacin bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros mtodos. La principal ventaja es su alto contenido especfico y que se encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los lpidos no forman parte de las reservas ceiulares y se degradan rpidamente durante la lisis bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lpidos de las membranas celulares est en forma de fosfolpidos. Las tcnicas de anlisis se basan, fundamentalmente, en la extraccin celular de los fosfolpidos con un disolvente orgnico, su posterior hidrlisis cida para liberar el fosfato y, por ltimo, 1a determinacin colorimtrica de ste. Son tcnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato) (Arnizet al, 2000).

ATP, El ATP presenta las ventajas de ser un componente bioqumico central presente en todos los microorganismos y especfico de los microorganismos vivos, circunstancias ambas que permiten relacionarlo con la biomasa viva. Una de las tcnicas ms utilizadas para medir ATP se basa en la reaccin luciferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las lucirnagas y que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe que intervienen luciferina (fenol heterocclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de magnesio y oxgeno en un proceso de oxidorreduccin que ocurre en doble etapa: Ya que por cada molcula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinacin del ATP en una muestra biolgica puede hacerse mediante extraccin por ebullicin en tampn Tris (hipocloruro de tris-hidroximetilaminoetano) del ATP, incubacin con luciferina-luciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotmetro con registro. La mayor desventaja de esta tcnica es 1a necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado fisiolgico de las clulas cambia rpidantente tras la toma de muestra. La relacin entre el ATP, el ADP y el AMP y el contenido total de desoxirribonucletidos refleja la carga energtica de las clulas [(ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). Esta relacin puede duplicarse en slo unos segundos. Algunos autores sugieren que la carga energtica es un valor mucho ms preciso que el contenido absoluto de ATP ya que la composicin celular de desoxirribunucletidos vara con el estado fisiolgico de los microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energtico disminuye, al disminuir la concentracin de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Arnizet al, 2000). Mtodos bioqumicos. Las medidas de alguna actividad enzimtica pueden considerarse como una alternativa a los mtodos tradicionales. Los ensayos enzimticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rpidamente. Adems. El equiparniento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayora de las medidas de actividad enzimtica se realiza mediante la conversin de sustratos especficos a productos coloreados que son cuantificados fotomtricamente. La principal desventaja de los mtodos bioqumicos es la variacin de las actividades enzimticas celulares con los cambios fisiolgicos y que, una vez que los microorganisrnos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas .Entre las distintas medidas de actividad enzimtica cabe destacar: Actividad esterasa Actividad deshidrogenasa Mtodos cinticos. La base de estos mtodos es la medida del consumo de sustrato o de la formacin de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo ms tpico en microorganismos aerobios es la determinacin de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolucin a travs del consumo de oxgeno del medio. Adaptaciones del Respirmetro de Warburg Tasa de respiracin Tasa de desaparicin de sustrato Potencial bioqumico de produccin de metano Recuento electrnico.

Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes. [1] Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las tcnicas utilizadas en este experimento.

Medicin de la biomasa microbiana por conteo directo en cmara de Neubauer: Ventajas - Es rpido - Las exigencias del equipo son mnima - Se pueden observar las diferencias morfolgicas de los microorganismos Desventajas - No se distinguen clulas vivas de muertas - Se analiza poca cantidad de muestra - Provoca cansancio del operador - Slo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por ml - Difcil distinguir los microorganismos de las partculas de la muestra - Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos ocasiona errores Medicin de la biomasa microbiana por densidad ptica: Es unos mtodos indirectos de medicin de masa celular. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es

directamente proporcional microorganismo.

al

peso

seco,

independientemente

del

tamao

celular

del

Ventajas de los mtodos de dispersin de luz: El mtodo puede realizarse tanto en el rango de luz visible, como el de ultravioleta dando un gran espectro de accin Se puede trabajar con densidades microbianas bajas, de microorganismos de tamao de unos cuantos nanmetros.

Desventajas Las suspensiones con las que se trabajan no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. El trabajar con suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin. Medicin de la biomasa microbiana por peso seco celular:

Ventaja El peso seco de las clulas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen a una determinada temperatura hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de clulas. (Nio, 2009) Desventaja

Los mtodos gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. Este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado. (Snchez et al; 2012) Adems en esta tcnica, en la determinacin incluye no solo organismos activos, si no microrganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares, y materia orgnica absorbida. (Snchez et al; 2012)
Qu son los colorantes supravitales y para qu se usan?

La coloracin vital. Tincin supravital es un mtodo de tincin utilizado en microscopa para examinar las clulas vivas que se han eliminado de un organismo. Se diferencia de la tincin intravital, que se realiza mediante la inyeccin o de otro modo la introduccin de la mancha en el cuerpo. As, una mancha supravital pueden tener una mayor toxicidad, ya que slo unas pocas clulas necesitan para sobrevivir en un corto tiempo. El trmino "colorante vital" es utilizado por algunos autores para referirse especficamente a una tincin intravital y otros indistintamente con

una mancha supravital, el concepto central es que la clula se est examinando todava est vivo. Cuando las clulas estn vivas y no fijadas, fuera del cuerpo, manchas supravitales son de naturaleza temporal. En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las clulas, no modifican la estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloracin vital. Ejemplo de Colorantes supravitales comunes Colorantes supravital de glbulos rojos:

Azul de metileno nuevo Azul de cresilo brillante Cristal violeta Violeta de metilo Nilo Azul.

3. CONCLUSIONES

Despus de haber realizado la prctica de medicin de biomasa podemos concluir que: La determinacin de peso seco no solo determina las clulas presentes en las diluciones tambin lo hace con los nutrientes o compuestos en donde venden las levaduras, por el contrario la cmara de Neubauer tiene la ventaja con respecto a la prueba mencionada y es porque la cmara solo cuenta las clulas presentes. La determinacin de biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso, ya que establece las tazas de produccin y de consumo de nutrientes, hoy en da existen muchas tcnicas para la medicin de biomasa entre esas estn las realizadas en este laboratorio. Luego de terminar cada una de las pruebas para determinar podemos inferir que los resultados obtenidos a travs de la tcnica de densidad ptica es una de las ms confiables, sencillas y rpida.

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