1

Produccin de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus en

un Biorreactor de Tanque Agitado

Lorena Roma, Miriam Ferrari, Joaqun Orejas

Universidad Nacional de Ro Cuarto Facultad de Ingeniera - Dpto. de Tecnologa Qumica Grupo de
Ingeniera de las Reacciones (G.I.R.). Ruta Nacional 36, Km. 601 (5800) Ro Cuarto ARGENTINA
E-mail: mferrari@ing.unrc.edu.ar , jorejas@ing.unrc.edu.ar

RESUMEN

Cepas de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus poseen la capacidad de producir
etanol bajo condiciones aerbicas. Estudios relacionados con el crecimiento de levaduras en
diferentes condiciones operativas y nutricionales, han mostrado distintos rendimientos en la
produccin de biomasa y etanol. En el presente trabajo, se estudi la influencia de la
concentracin inicial de glucosa y la velocidad de agitacin en la produccin de
Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus y etanol en un biorreactor escala laboratorio. Las
experiencias se planificaron mediante un diseo factorial 2
2
replicado. Los resultados
experimentales fueron analizados mediante un modelo de regresin lineal multiparamtrico y
la significancia de los parmetros fue determinada en base a conceptos relacionados con el
estadstico t-Student. Los valores de biomasa y etanol obtenidos estuvieron relacionados con
las concentraciones iniciales de glucosa y velocidad de agitacin empleada, determinndose
que los mejores rendimientos en etanol ocurren para elevadas concentraciones iniciales de
glucosa y bajas velocidades de agitacin.

INTRODUCCIN

La cepa Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus fue aislada por Andrews y Gilliland
(1952) como un contaminante durante la fabricacin de la cerveza (Sakai y otros, 1986) y
debido a la gran diversidad existente dentro de esta especie, fue necesario subdividirla en seis
grupos sin valor taxonmico aunque con relevancia prctica. Estos grupos son: cerevisiae,
ellipsoideus, oviformis, cheresanus, logos y diastaticus (Carro y Pia, 2001). En el gnero
Saccharomyces, la glucosa es el principal sustrato regulatorio en condiciones aerbicas. La
represin de la respiracin por glucosa en condiciones aerbicas, lleva a un decrecimiento en
la velocidad especifica del consumo de oxgeno y consecuentemente en la acumulacin de
etanol. Este mecanismo es ampliamente conocido como efecto Crabtree o efecto glucosa y
tambin como fermentacin aerbica (Suomalainen y Oura, 1971, Fiechter y otros, 1981,
Gadd, 1988). Poseen la capacidad de crecer en ausencia de aire (proceso fermentativo) o en su
presencia (proceso oxidativo). Las caractersticas del crecimiento y produccin de productos
dependen de las condiciones de desarrollo. La formacin aerbica de etanol a partir de
glucosa ha sido observada en diferentes tcnicas de cultivo: batch (cultivo discontinuo), semi-
batch (discontinuo alimentado) y en cultivos continuos (Von Meyenburg, 1969, Hop Thi Bich
y otros, 1998). En las primeras etapas de los cultivos batch, el azcar es consumido con
produccin concomitante de etanol, seguido por una corta fase de latencia y restauracin del
crecimiento a partir del etanol. Esta fase de latencia se debe a la induccin de las enzimas del
ciclo del glioxilato y gluconeognesis, necesarias para la sntesis de compuestos de C
3
-C
6
a
partir del etanol. Los procesos batch se caracterizan por baja densidad celular debida a la
inhibicin por el etanol.
2
Cepas de S. cerevisiae var. diastaticus tienen la capacidad de producir y secretar una
enzima extracelular denominada glucoamilasa, que favorece la produccin de etanol a partir
del almidn. La misma difunde hacia el medio de cultivo hidrolizando a unidades de glucosa
desde el extremo no reducido de la cadena de este polisacrido, y es capaz de fermentar las
dextrinas (Andrews y Gilliland, 1952, Hopkins, 1955, Suomalainen y Oura, 1971). Adems,
poseen la capacidad de fermentar la maltotetralosa la cual no es fermentada por cepas de S.
cerevisiae y S. uvarum (Allen, 1994).
La produccin industrial de etanol como combustible a partir del almidn involucra tres
pasos: (a) licuefaccin del almidn por una endoamilasa (amilasa) y una -amilasa, (b)
sacarificacin enzimtica (glucoamilasas y enzimas desramificantes) y (c) fermentacin de la
glucosa (Forgaty y Kelly, 1979, Laluce y Matton, 1984, Pretorius y otros, 1986, Bentez y
otros, 1992). Por lo antes expuesto, las cepas de S. cerevisiae var. diastaticus resultan de
inters para la produccin de etanol a partir de materias primas amilceas, ya que poseen
glucoamilasas, con lo cual el proceso de sacarificacin resulta ms sencillo. Adems, se ha
encontrado que estas levaduras son altamente tolerantes al etanol (Wang y Sheu, 2000,
Bentez y otros, 1992).

MATERIALES Y MTODOS

Microorganismo y medios de cultivo
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ATCC 28338.
Medio de produccin: se formul un medio sinttico compuesto por una base mineral y
solucin vitamnica a la que se le agreg glucosa en diferentes concentraciones.
Solucin de minerales (kg.m
-3
): (NH
4
)
2
SO
4
: 5.19, KH
2
PO
4
: 3, MgSO
4
7H
2
O: 1.55, CaCl
2
:
0.13, H
3
BO
3
: 0.01, CuSO
4
5 H
2
O: 0.004, ZnSO
4
7H
2
O: 0.01, MnSO
4
1 H
2
O: 0.003, KI:
0.001, FeSO
4
7 H
2
O: 0.002, AlSO
4
: 0.003.
Solucin de vitaminas (kg.m
-3
): cido nicotnico: 0.005, cido pantotnico: 0.00625,
Biotina: 0.000125, Inositol: 0.125, Piridoxina: 0.00625, Riboflavina: 0.000225, Tiamina:
0.005.
Fuente carbonada (kg.m
-3
): Glucosa: 10 y 35
Determinaciones analticas
Biomasa: se realiz la curva de calibracin para el peso seco (kg.m
-3
) y la densidad ptica
(DO) leda por espectrofotometra a 570 nm, determinndose que 1 OD equivale a 0.469
kg.m
-3
de clulas.
Glucosa residual: fue medida con el mtodo descrito por Reese-Mandels modificado
(Chaplin y Kennedy, 1986) basado en la reaccin del azcar con el de cido 3-5
dinitrosaliclico.
Etanol: fue determinado mediante un kit enzimtico marca SIGMA Diagnostics
catlogo 332-A.
Instalaciones y Equipos
Las experiencias fueron realizadas en un biorreactor marca Applikon de 2.5 lts de
capacidad de trabajo, equipado con controladores de velocidad de agitacin, pH y
temperatura. Los detalles del mismo se muestran en la Tabla 1. El biorrector fue operado en
forma discontinua respecto de la fase lquida y continua respecto de la fase gas (aire). El pH
3
del medio fue monitoreado con un sensor PHOENIX en forma continua y controlado en 4.5
0.2 unidades por la adicin de OHNa 1 M empleando un controlador (Cole Parmer 29041-02)
y bomba peristltica. La temperatura se control en 30 0.5 C y la velocidad de aireacin se
mantuvo constante en 0.6 (m
3
aire.m
-3
de medio.min
-1
). La velocidad de agitacin fue
controlada por medio de un controlador ADI 1012 (Applikon Instruments) y para la
determinacin de la concentracin de oxgeno disuelto en el medio de cultivo, se emple un
sensor YSI 5750 provisto de membranas YSI 5775 (material: FEP Tefln, espesor: 2.54 x 10
-5
m).
Tabla 1: Detalles del biorreactor
Capacidad de trabajo (m
3
) 0.0025
Volumen de lquido sin airear (m
3
) 0.00225
Dimetro del biorreactor (m) 0.13
Altura de lquido sin airear (m) 0.17
Tipo de agitador Rushton
Nmero de paletas de un agitador 6
Dimetro del agitador (m) 0.045
Ancho de una paleta (m) 0.011
Longitud de una paleta (m) 0.011
Nmero de agitadores 2
Posicin desde la base 1
er
agitador (m) 0.04
Posicin desde la base 2
do
agitador (m) 0.125
Nmero de deflectores 3
Ancho de un deflector (m) 0.013
Tipo de distribuidor de aire tubo perforado
Nmero de orificios del distribuidor 7
Dimetro de los orificios (m) 0.001
Posicin desde la base (m) 0.015
Planificacin de las experiencias
Existen numerosas variables que pueden afectar la produccin de la especie S. cerevisiae
var. diastaticus, no obstante, en el presente trabajo se seleccionaron la composicin del medio
de cultivo y la velocidad de agitacin. Con relacin a la composicin del medio de cultivo, se
estudi la influencia de la concentracin inicial de glucosa ya que la misma tiene gran
influencia en la produccin de etanol en condiciones de aerobiosis, en tanto que la velocidad
de agitacin fue seleccionada como variable operativa por su influencia sobre la transferencia
de oxgeno al medio de cultivo.
Los valores empleados para cada una de las variables experimentales analizadas se
muestran en la Tabla 2. Las experiencias fueron realizadas en forma aleatoria, segn un
diseo factorial 2
2
replicado.
Tabla 2: Lmites de los factores analizados

Glucosa (G) kg.m
-3
Velocidad de Agitacin (R) r.p.s
Nivel superior 35 8.33
Nivel inferior
10 2.50
Los resultados experimentales fueron analizados mediante un modelo de regresin lineal
multiparamtrico dado por la ecuacin 1:
c + | + | + | + | =
2 1 12 2 2 1 1 0 q
x x x x y
(1)
4
Donde y
q
representa la respuesta de inters (y
1
: concentracin de biomasa, y
2
:
concentracin de etanol). El coeficiente
0
es el efecto promedio del total de las observaciones
y los parmetros
1
y
2
corresponden a la mitad del valor de los efectos principales, mientras
que
12
es la mitad de la interaccin. El trmino c corresponde al error del modelo (Box y
otros, 1978). Las variables x
1
y x
2
pueden tomar los valores 1, 0 o 1 y representan la
concentracin adimensional de glucosa (G) y velocidad de agitacin (R) respectivamente y se
calculan segn las siguientes ecuaciones:
( )
( ) 2 / G G
2 / G G G
x
baja alta
alta baja
1

+
=
;
( )
( ) 2 / R R
2 / R R R
x
baja alta
alta baja
2

+
=

(2)
Con la finalidad de establecer si las variaciones introducidas en las experiencias afectan a
las respuestas seleccionadas en forma significativa, los resultados experimentales se
analizaron sobre la base de conceptos relacionados con el estadstico t-Student para un nivel
de incertidumbre del 5 %.
Las experiencias se realizaron de acuerdo a la planificacin experimental que se muestra
en la Figura 1 donde cada vrtice representa una condicin ensayada.
Experiencia 4 Experiencia 2
Experiencia 3 Experiencia 1
35
8.33
2.50
10
8.33
2.50
35 10
B
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

a
g
i
t
a
c
i

n

(
r
.
p
.
s
.
)
Glucosa (kg.m
-3
)

Fig. 1: Diagrama de la planificacin experimental

RESULTADOS Y DISCUSIN
Los experimentos fueron llevados a cabo en el biorreactor de acuerdo al plan experimental
antes mostrado. A intervalos regulares de tiempo se tomaron muestras para la determinacin
de la concentracin de glucosa residual, biomasa, oxgeno disuelto y etanol.
Tabla 3: Valores experimentales para la concentracin de biomasa (kg.m
-3
)
Experiencia x
1
x
2
2 (hs) 3 (hs) 5 (hs) 7 (hs) 24 (hs)
1 -1 -1 0.431 0.611 1.085 0.999 2.091
Rplica 1 -1 -1 0.419 0.574 1.106 1.164 2.588
2 -1 1 0.398 0.544 0.968 1.111 2.982
Rplica 2 -1 1 0.408 0.581 1.191 1.484 3.320
3 1 -1 0.425 0.636 1.602 2.300 3.998
Rplica 3 1 -1 0.472 0.708 1.554 3.500 3.957
4 1 1 0.401 0.579 0.998 1.754 5.683
Rplica 4 1 1 0.328 0.472 0.907 1.670 5.561
|
0
0.410 0.588 1.176 1.747 3.894
o 0.031 0.049 0.087 0.440 0.210
|
0
: respuesta promedio. o: error experimental
5
El estudio estuvo orientado al anlisis que ejercen las diferentes condiciones
experimentales ensayadas tanto en la produccin de biomasa como de etanol. En las Tablas 3
y 4 se muestran los resultados obtenidos para la concentracin de biomasa y etanol
respectivamente en las condiciones definidas por las variables codificadas x
1
y x
2
para
diferentes tiempos de operacin del biorreactor.
Tabla 4: Valores experimentales para la concentracin de etanol (kg.m
-3
)
Experiencia x
1
x
2
2 (hs) 3 (hs) 5 (hs) 7 (hs) 24 (hs)
1 -1 -1 1.375 1.485 1.970 2.583 1.313
Rplica 1 -1 -1 1.401 1.333 1.622 2.101 0.925
2 -1 1 1.425 1.597 2.453 1.910 0.000
Rplica 2 -1 1 1.231 1.576 1.644 2.249 0.000
3 1 -1 6.675 10.050 13.000 11.096 6.000
Rplica 3 1 -1 5.000 7.000 10.900 10.000 5.570
4 1 1 2.791 3.807 5.295 5.300 3.668
Rplica 4 1 1 1.924 3.438 4.139 5.998 3.668
|
0
2.727 3.785 5.127 5.154 2.643
o 0.670 1.085 0.903 0.504 0.204
|
0
: respuesta promedio. o: error experimental

En las Figuras 2 a 5 se muestra la evolucin de las variables en funcin del tiempo para
cada una de las condiciones ensayadas.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0
2
4
6
8
10
12
Oxgeno
Glucosa
Biomasa
Etanol
Exp.original(10-150)


B
i
o
m
.
(
k
g
.
m
-
3
)
,
E
t
a
n
o
l

(
k
g
.
m
-
3
)
,
O
2

(
p
.
p
.
m
)
Tiempo(hs)
0
2
4
6
8
10
G
l
u
c
o
s
a

(
k
g
.
m
-
3
)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0
2
4
6
8
10
12
Glucosa
orig 10500
B
i
o
m
.

(
k
g
.
m
-
3
)
,
E
t
a
n
o
l

(
k
g
.
m
-
3
)
,
O
2

(
p
.
p
.
m
)
Tiempo (hs)
0
2
4
6
8
10

G
l
u
c
o
s
a

(
k
g
.
m
-
3
)
Etanol
Biomasa
Oxgeno

Fig. 2: Exp.1: Glucosa 10 kg.m
-3
. Velocidad
de agitacin 2.50 r.p.s.
Fig. 3: Exp.2: Glucosa 10 kg.m
-3
. Velocidad
de agitacin 8.33 r.p.s.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0
2
4
6
8
10
12


Oxgeno
Biomasa
Etanol
orig 35150
B
i
o
m
.
(
k
g
.
m
-
3
)
,
E
t
a
n
o
l

(
k
g
.
m
-
3
)
,
O
2

(
p
.
p
.
m
)
Tiempo (hs)
0
4
8
12
16
20
24
28
32
Glucosa

G
l
u
c
o
s
a

(
k
g
.
m
-
3
)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0
2
4
6
8
10
12
Oxgeno
Biomasa
Etanol
orig 35500
B
i
o
m
.
(
k
g
.
m
-
3
)
,
E
t
a
n
o
l

(
k
g
.
m
-
3
)
,
O
2
(
p
.
p
.
m
)
Tiempo (hs)
0
4
8
12
16
20
24
28
32


Glucosa

G
l
u
c
o
s
a

(
k
g
.
m
-
3
)

Fig. 4: Exp.3: Glucosa 35 kg.m
-3
. Velocidad
de agitacin 2.50 r.p.s
Fig. 5: Exp. 4: Glucosa 35 kg.m
-3
. Velocidad
de agitacin 8.33 r.p.s
Puede observarse que en todas las experiencias se presenta crecimiento diuxico, ya que la
biomasa aumenta como consecuencia del consumo de etanol. Por su parte, la mxima
concentracin de etanol ocurre cuando se agota la glucosa. En relacin a la evolucin del
6
oxgeno disuelto, para las experiencias donde se utiliz el nivel superior de concentracin de
glucosa independientemente de la velocidad de agitacin, este sustrato tom valores cercanos
a 0.2 p.p.m. para tiempos de produccin superiores a 8 hs., en tanto que para la experiencia 2
(Figura 3), este nutriente estuvo en exceso durante todo el cultivo, lo que implica que la
transferencia de oxgeno al medio super a la demanda como consecuencia de la menor
cantidad de fuente carbonada para la oxidacin.
Del anlisis de los resultados experimentales obtenidos, se puede observar la influencia
que ejerce el tiempo de produccin en el biorreactor tanto en la concentracin de biomasa
como en el contenido de etanol. Sin embargo, es difcil obtener conclusiones con relacin al
efecto que producen las diferentes concentraciones iniciales de glucosa y la velocidad de
agitacin aplicada durante las experiencias. Por lo antes expuesto, los resultados se analizaron
sobre la base de conceptos estadsticos. Los valores experimentales presentados en las Tablas
3 y 4 fueron correlacionados por el modelo dado en la ecuacin 1 y la significancia de cada
uno de los factores se determin usando la distribucin t-Student con un 5 % de
incertidumbre. Las variables cuyos valores resultaron estadsticamente significativos, se
resumen en la Tabla 5.
Tabla 5.- Influencias significativas sobre la biomasa y el etanol a diferentes intervalos de tiempo
Edad
(hs)
y
1
(biomasa) y
2
(etanol)

1

2

12

1

2

12

2 0 0 0 1.370 -0.885 -0.855
3 0 0 0 2.288 -1.181 -1.270
5 0.089 -0.160 -0.152 3.206 -1.745 -1.871
7 0.558 0 0 2.944 -1.290 -1.159
24 1.027 0.614 0 2.083 -0.809 -0.249
Si se planifica operar el biorreactor por un perodo inferior o igual a 3 hs., la produccin de
biomasa no es afectada ni por la velocidad de agitacin ni la concentracin inicial de glucosa.
Para tiempos de operacin de 7 o 24 hs. la concentracin de biomasa es favorecida si se
disea el medio de cultivo con altas concentraciones de glucosa. Particularmente, para un
perodo de produccin de 5 hs. se presenta un valor significativo para la interaccin lo que
dificulta el anlisis por separado de cada una de las variables. En relacin a la produccin de
etanol, para todas las edades analizadas las interacciones resultaron significativas, pero en
todas las edades puede observarse que altas concentraciones de glucosa y bajas velocidades de
agitacin seran favorables para aumentar los rendimientos de este metabolito. A los efectos
de analizar los efectos en forma individual, el diseo factorial tendra que ampliarse a un
diseo compuesto.
CONCLUSIONES
La produccin de biomasa y de etanol empleando Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus ATCC 28338, es funcin del tiempo de operacin del biorreactor, de las
concentraciones iniciales de glucosa en el medio de cultivo y de la velocidad de
agitacin.
Para lograr una buena produccin de biomasa, el medio de cultivo deber prepararse con
elevadas concentraciones iniciales de glucosa y el biorreactor deber operarse con el
nivel superior de agitacin, a los efectos de lograr una buena transferencia del oxgeno
del aire hacia el medio de cultivo para facilitar la disponibilidad del oxgeno por ser un
nutriente esencial para su desarrollo.
A los efectos de lograr una buena produccin de etanol, la mejor condicin dentro del
rango experimental ensayado, se logr cuando el proceso se realiz con altas
concentraciones iniciales de glucosa y bajas velocidades de agitacin.
7
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo brindado por la Secretara de Ciencia y Tcnica de la
Universidad Nacional de Ro Cuarto (SECYT) y por la Agencia Crdoba Ciencia S.E. (ACC).