UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR Laboratorio de Microbiologa BC3361

Autores: Irina Santana 10-11299 Zirza Daz 10-11302 Andrea Duarte 10-10819

Caracas, 23 de Abril de 2013.

OBJETIVOS Especfico Ensayar y comparar algunas de las tcnicas de cultivo ms comnmente utilizadas en microbiologa.

Generales Comprender la importancia de la esterilidad durante el proceso de siembra de cultivos y de los instrumentos utilizados. Comparar las ventajas y desventajas de las tcnicas de cultivo ms comnmente utilizadas en microbiologa para la obtencin de un cultivo bacteriano puro. Discutir acerca de las propiedades selectivas y diferenciales de algunas tcnicas de cultivo.

MATERIALES Y MTODOS Se sigui el protocolo de la Prctica 1: Tcnicas de manejo y cultivo de microorganismos. En: Gua de prcticas del laboratorio de microbiologa BC-3361. 1-8, 50 pp. (Universidad Simn Bolvar, 2012). Sin embargo se hicieron las siguientes modificaciones: 1. Experiencia 2: Se realizaron 4 diluciones seriadas; la primera tomando 0,05ml de cultivo original y diluida en 5ml de solucin salina se obtuvo una dilucin de orden 10, la segunda tomando igualmente 0,05ml de la dilucin anterior y diluida en 5ml de solucin salina se obtuvo una dilucin de orden 104, la tercera tomando ahora 0,5ml de la dilucin anterior y diluida en 5ml de solucin salina se obtuvo una dilucin de orden 105 y finalmente la cuarta se hizo tomando 0,5ml de la dilucin anterior y diluida en 5ml de solucin salina se obtuvo una dilucin de orden 106; de esta manera se utilizo 0,1ml de las diluciones de orden 104, 105 y 106 como inculo de cada cultivo. 2. Experiencia 4: Para la inoculacin del agar nutritivo en cua se invirti el orden descrito en la gua, primero se inocul el tubo por puncin y al sacar la aguja del agar se realiz el estriado sobre la cua.

RESULTADOS TABLA 1. Experiencia 1: Siembra en placa por el mtodo de estriado MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO OBSERVACIONES RESULTADO

E. coli

En el cuadrante ms diluido pueden contarse colonias individuales

S. aureus

Agar nutritivo

Pocas colonias diferenciables aun en los cuadrantes ms diluidos

Serratia marcescens

Present una pigmentacin naranja. Difcil contar las colonias individuales ya que la dilucin fue poca

TABLA 2. Experiencia 2: Siembra en superficie por extendido MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO DILUCIN # COLONIAS RESULTADO

E. coli

10-4

Incontable

E. coli

Agar nutritivo

10-5

4,16x10^8 en 0,1ml

E. coli

10-6

5,6x10^8 en 0,1ml

TABLA 3. Experiencia 3: Siembra de agar por mtodo de profundidad MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO
DILUCIN

#
COLONIAS

RESULTADO

E. coli

10-4

Incontables

E. coli

Agar nutritivo blando fundido

10-5

2,84x10^8

en 0,1ml

E. coli

10-6

6,3x10^8 en 0,1ml

TABLA 4. Experiencia 4: Siembra en tubo sobre agar inclinado MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO OBSERVACIONES RESULTADO

E. coli

La bacteria se desarroll superficialmente (sobre la cua) en el estriado. No crece en el interior del agar

S. aureus Agar nutritivo

La bacteria se desarroll superficialmente (sobre la cua) en el estriado. No crece en el interior del agar

Serratia marcescens

La bacteria se desarroll superficialmente (sobre la cua) en el estriado. No crece en el interior del agar. Coloracin naranja

TABLA 5. Experiencia 5: Crecimiento en medio de cultivos selectivos y diferenciales MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO OBSERVACIONES RESULTADO

E. coli

CEPA* CSH36
CEPA* CSH50

Se desarroll completamente. Present coloracin verderojo metlico Creci en la zona inicial de mayor concentracin de la cepa No se desarroll EMB Levine

S. aureus

No se desarroll

E. coli

CEPA* CSH36

Creci por completo con coloracin blanca No se desarroll Manitol (salado)

CEPA* CSH50

Se desarroll por completo

S. Aureus *Cepa de la bacteria E. coli

Creci en la zona inicial de mayor concentracin de la cepa

DISCUSIN Para obtener un cultivo de microorganismos exitoso, de cualquier tipo, es necesario conocer en detalle las caractersticas de dicho microorganismo y as poder elegir el mejor medio de cultivo en base al conocimiento de sus propiedades. En ese mismo orden de ideas, la utilizacin de una tcnica de cultivo de microorganismos tambin juega un papel fundamental ya que ayudar a la obtencin de colonias puras y a la facilidad del conteo de stas, entre otras cosas; asociado a todo este proceso, la esterilidad y la higiene del rea de trabajo, los implementos de laboratorio y las muestras (puras o mixtas) deben estar presente sea cual sea el resultado especfico que se desee obtener. En la prctica 1: Tcnicas de manejo y cultivo de microorganismos, se utilizaron las cuatro tcnicas de cultivo ms importantes, ellas son: siembra por estriado en placas, siembra por extendido en placas, siembra por mtodo de profundidad en agar y siembra en tubo por agar inclinado (en cua). Estos mtodos favorecen o desfavorecen la obtencin de cultivos puros y colonias fcilmente contables, los cuales son algunos de los objetivos principales al hacer un cultivo. En la experiencia 1, donde se emple la siembra en placa por el mtodo estriado, se observ que la bacteria anaerobia facultativa y con capacidad fermentativa E. coli (1) se desarroll en su totalidad, esto se debe a que el agar nutritivo est compuesto por caldo de carne, peptona, agar y agua, los cuales son componentes necesarios para su desarrollo, adems de que posee un pH de 7,00, el cual es ptimo para el desarrollo de esta bacteria (2). Como este medio es apto, al realizar el mtodo de estriado, el cual se caracteriza por la dilucin progresiva de la muestra a medida que se aumentan los trazos sobre el agar (3) se pudieron diferenciar colonias individuales a medida que la muestra se haca ms diluida (llegaba al final del trazo) (Tabla 1). En el caso de las bacterias S. aureus y Serratia marcescens las muestras iniciales posean gran cantidad de microorganismos por lo que, al realizar el estriado, no se pudo lograr la diferenciacin de colonias incluso en la zona final del trazo (Tabla 1). Por otra parte, en las experiencias 2 y 3, comparando la tcnica del mtodo de siembra en superficie por extendido con la tcnica de siembra en agar por el mtodo de profundidad, debe resaltarse que en ambas tcnicas se realizaron diluciones de la muestra pura para obtener mejores resultados en el aislamiento y diferenciacin de las colonias. Ambas experiencias debieron arrojar resultados tericos similares en cuanto a las cifras del conteo de colonias diferenciadas puesto que en ellas se utilizaron las mismas concentraciones de la misma bacteria como inculo, sin embargo, los resultados experimentales reflejan una leve

discrepancia entre los valores que corresponden a la dilucin de orden 10-5 (Tabla 2, Tabla 3) que puede deberse a una manipulacin torpe e ineficiente del operador mientras se realizaba el sembrado de la muestra ya que la expansin con la esptula de Drigalsky debe hacerse rpida y uniformemente para evitar la absorcin del inculo en un solo lugar y la homogenizacin del agar blando al ser vertido en la placa debe hacerse con movimientos suaves pero rpidos de manera que los microorganismos puedan separarse la mayor cantidad de espacio posible unos de otros en ambos casos (3). Si comparamos el mtodo del estriado con las tcnicas anteriormente mencionadas se observa que stas son ms lentas para obtener colonias individuales ya que hay que realizar diluciones previas para alcanzar buenos resultados, sin embargo, stos son muy confiables. Mientras que la dilucin que proporciona la tcnica del estriado resulta ms rpido ya que se realiza en la misma placa pero no siempre se cuenta con la obtencin de colonias puras. El mtodo de la siembra en tubo sobre agar inclinado (en cua), de la experiencia 4, representa un mtodo poco eficaz para la obtencin de cultivos puros y, en comparacin con los mtodos anteriormente mencionados, es el que refleja la menor diferenciacin de colonias posible (Tabla 3). Aunque las bacterias E. coli, S. aureus y S. marcescens son facultativas anaerobias (1), (4), (5) no se observ crecimiento de colonias en el interior del agar (puncin) solo en el estriado; es posible que la mayor concentracin de microorganismos a nivel de la cua haya proporcionado facilidad para el crecimiento y resistencia de la que carecieron las pocas bacterias que fueron sembradas en el interior del agar. En la quinta experiencia, se sembraron cuatro muestras diferentes: E. coli, S. aureus, CSH36 Y CSH50 (cepas de E. coli) en medios de cultivo selectivo y diferencial, como EMB Levine y Manitol salado. El agar EMB Levine posee propiedades propicias para el desarrollo de E. coli y su cepa CSH36 pues posee como componente principal lactosa (6), lo cual coincide con los resultados obtenidos (Tabla 5) en la cual E. coli present una coloracin brillante verde oscuro; Escherichia coli es una bacteria fermentadora de lactosa, por otro lado la cepa CSH36 no lo es y por lo tanto no presenta coloracin (6). Las dems bacterias como S. aureus y la cepa de E. coli CSH50 no se desarrollaron en este medio ya que no estn aptas para crecer en l y no poseen capacidades fermentativas. Por otra parte, el Manitol es un medio de cultivo altamente salado rico en NaCl que es ampliamente utilizado para la diferenciacin y nutricin especfica de estafilococos (7) por lo que la muestra en la placa de S. aureus deba desarrolarse ampliamente y la muestra de E. coli y sus cepas deban inhibirse; sin embargo, en los resultados experimentales las colonias de E. coli y su cepa CSH50 se desarrollaron ampliamente, probablemente porque

desarrollaron resistencia a los medios inhibidores del cultivo selectivo y sobrevivieron, al contrario de la cepa CSH36 que no se desarroll en absoluto; las colonias de S. aureus no se desarrollaron por completo (slo donde haba mayor concentracin de ella al principio del estriado) (Tabla 5) y se presume que fue debido a un error de manipulacin del operador durante el proceso de sembrado ya que se expuso la muestra en el asa de inoculacin muy cercana a la llama del mechero. Los diferentes comportamientos de las cepas de E. coli se deben a que justamente por su condicin de cepas, poseen variantes fenotpicas y caractersticas diferentes unas de otras, aunque siguen siendo de la misma especie (8), estas cepas se obtienen a partir de un solo germen obtenido de un enfermo, y multiplicado por pases sucesivos en diferentes medios de cultivo (9) y dotan de comportamientos diferentes al microorganismo al ser expuesto a medios selectivos y/o diferenciales. Durante cada uno de los procesos es imprescindible un ambiente estril que elimine cualquier forma de vida existente en los instrumentos y en el rea de trabajo para as tomar la muestra para inoculacin y garantizar la obtencin de cultivos puros.

BIBLIOGRAFA

1) Varios. 2013. Escherichia coli. Referencias electrnicas. Hallado el 2804-2013 en: http://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli 2) Varios. Agar Macconkey. Referencias electrnicas. Hallado el 28-042013 en: http://www.ehowenespanol.com/tipos-agar-nutritivoinfo_77051/ 3) .:("*"BLacK BuLLeT"*"):. 2009. Tcnicas Bsicas Para El Cultivo de Microorganismos. Referencias electrnicas. Hallado el 28-04-2013 en: http://es.scribd.com/doc/14173131/5-Tecnicas-Basicas-Para-El-Cultivode-Microorganismos 4) Varios. 2013. Staphylococcus aureus. Referencias electrnicas. Hallado el 28-04-2013 en: http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus#Detecci.C3.B3n_de _laboratorio 5) Varios. 2013. Serratia marcescens. Referencias electrnicas. Hallado el 28-04-2103 en: http://es.wikipedia.org/wiki/Serratia_marcescens

6) Annimo. Levine EMB Agar. Referencias electrnicas. Hallado el 28-042013 en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/levinembagar.htm 7) Annimo. Manitol Salado Agar. Referencias electrnicas. Hallado el 2804-2013 en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm 8) Varios. 2013. Cepa. Referencias electrnicas. Hallado el 28-04-2013 en: http://es.wikipedia.org/wiki/Cepa 9) Dr. Garca, M. 2011. Cepa bacteriana. Referencia electrnica. Hallado el 28-04-2013 en: http://www.portalesmedicos.com/diccionario_medico/index.php/Cepa_b acteriana