Instituto Nacional de Producci n de Biol gicos (INPB) ANLIS Dr. Carlos G.

Malbr n

ANTISUEROS TIPIFICADORES PARA EL DIAGNOSTICO Escherichia coli

INTRODUCCIN E. coli es un bacilo Gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae , que puede aislarse tanto de fuentes humanas como de fuentes animales, y se encuentra distribuido en la naturaleza de forma muy amplia. Aunque es uno de los grupos de organismos m s corrientes en nuestro medio ambiente y generalmente no son pat genos, algunos pueden provocar enfermedad en el hombre. Puede causar 3 tipos de infecciones en el humano: infecciones urinarias (ITU), meningitis neonatal; infecciones intestinales (ITG). El desarrollo de estas patolog as depende de los factores de virulencia, siendo el Sndrome Ur mico Hemoltico (SUH) la expresi n de las diarreas m s significativas. Seg n en su mecanismo de patogenicidad y cuadro clnico, las cepas de E. coli causantes de diarrea se clasifican en seis grupos: Enterotoxig nica (ETEC), Enterohemorr gica, tambi n conocidas como productoras de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (EHEC o VTEC o STEC), Enteroinvasiva (EIEC), Enteropat gena (EPEC), Enteroagregativa (EAEC) Adherencia difusa (DAEC). Los miembros de E. coli pueden poseer hasta tres tipos diferentes de ant genos: antgeno som tico (tambi n llamados antgeno O), antgeno capsular (llamado K) y antgeno flagelar (llamado ant geno H). La combinaci n de los diferentes ant genos presentes permite definir la serovariedad. USO DEL PRODUCTO Los antisueros tipificadores de E. coli que provee el INPB, son reactivos de uso in vitro empleados para la caracterizaci n serol gica de microorganismos pertenecientes a E. coli . Los antisueros para tipificar ant genos O y antgenos K, se utilizan en reacciones de aglutinaci n en l mina, mientras que los antisueros para tipificar ant genos H se utilizan en reacciones de aglutinaci n en tubo. PRINCIPIO DEL MTODO Los antisueros tipificadores de E. coli provistos por el INPB poseen aglutininas espec ficas para detectar mediante una interacci n antgenoanticuerpo los antgenos que posee la cepa en estudio, dicha interacci n se evidencia con una reacci n de aglutinaci n. ORIGEN DEL PRODUCTO Los antisueros tipificadores de E. coli son sueros policlonales preparados por hiper-inmunizaci n de conejos sanos con cepas de referencia inactivadas. Algunos antisueros deben ser purificados para eliminar aglutininas inespec ficas. Los productos se diluyen para el uso y se esterilizan mediante filtraci n por membrana de 0,22 m de poro. PRESENTACION Los reactivos para E. coli se presentan en estado lquido, diluidos para su uso y est riles. Los antisueros para tipificar ant genos O, H y K, se presentan en envases de 2 mL y con agregado de conservante (merthiolate en concentraci n final 1/10.000). ESTABILIDAD Y CONSERVACION -La temperatura de conservaci n es de 2-8C. -Fecha de vencimiento en la etiqueta del producto. PRECAUCIONES A CONSIDERAR -Estos reactivos son exclusivamente para uso in vitro .

-Los antisueros deben ser usados por personal de laboratorio suficientemente entrenado. -La completa tipificaci n de un cultivo requiere del conjunto de resultados de pruebas bioqu micas y ensayos serol gicos. -No congelar los reactivos ni usarlos pasada su fecha de vencimiento, ya que pueden dar resultados err neos. -Se recomienda que las muestras sean consideradas como potencialmente infecciosas, y entonces manipuladas seg n los lineamientos de las autoridades locales. -Siempre que se trabaje con aislamientos de la familia Enterobacteriacea e , deben aplicarse las pr cticas y procedimientos de Bioseguridad Nivel 2. Informaci n espec fica del microorganismo puede encontrarse en http:// www.phac- aspc.gc.ca/msdsftss. MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO -Medio no- selectivo (ej.TSA, extracto de carne) -Caldo nutritivo (ej.TSB) -Agar blando 0,7% p/v (ej.agar para movilidad) -Tubos de Craigie con agar 0,4% p/v) -Soluci n Fisiol gica (NaCl 0,85% p/v) -Soluci n Fisiol gica Formolada 0,5% v/v (NaCl 0,85% p/v- formalina al 0,5%v/v) -Soluci n Fisiol gica Formolada 1% v/v (NaCl 0,85% p/v- formalina al 1% v/v) -Lminas de vidrio -Tubos de vidrio tipo ensayo -Palillos -Cron metro -Micropipetas -Tips -Ansa -Fuente de luz -Ba o termost tico -Estufa de incubaci n a 37C -Material general de laboratorio INSTRUCCIONES PARA SU EMPLEO * AGLUTINACION SOMATICA DE SCREENING (SUERO OK) . Preparaci n del antgeno: -Opci n A (Suspensi n antig nica): Repicar el aislamiento de E. coli en estudio a una estr a de TSA (u otro agar no selectivo) e incubar 18- 24 hrs. a 37C. Suspender el crecimiento con 2 mL de soluci n fisiol gica. -Opci n B: suspender, sobre una placa de vidrio, una ansada (1 L) del cultivo bacteriano en 20 L de soluci n fisiol gica.
Nota: si bien se recomienda la opci n A ya que proporciona una suspensi n estandarizada, la opci n B permite disminuir el tiempo de la caracterizaci n serol gica.

Control de autoaglutinaci n : -Colocar sobre una l mina de vidrio, 20 L de la suspensi n bacteriana y 20 L de soluci n fisiol gica. -Mezclar con un palillo, rotar la l mina por 1 minuto y observar bajo fuente de luz indirecta. -Registrar la reacci n observada. Si se observa aglutinaci n, el cultivo se encuentra en su forma rugosa (R) y debe cultivarse en medios de enriquecimiento como Agar sangre o Agar Meller-Hinton hasta obtener un cultivo liso (S). Slo entonces puede realizarse la serotipificaci n.
Nota: no siempre es posible obtener un cultivo liso y ausencia de autoaglutinaci n, en estos casos el cultivo es no serotipificable.

Reacci n : -Colocar sobre una l mina de vidrio, 20 L de la suspensi n bacteriana y 20 L de antisuero. -Mezclar con un palillo, rotar la l mina por 1 minuto y observar bajo fuente de luz indirecta. -Registrar la reacci n observada.
Nota : el antisuero de screening OK debe usarse con el cultivo sin calentar. Se debe considerar que un resultado positivo debe ser confirmado con un antisuero som tico monovalente espec fico o remitido al Centro de Referencia.

 AGLUTINACION SOMATICA (SUERO O) . Preparaci n del antgeno (suspensi n bacteriana): -Repicar cada uno de los aislamientos de E. coli en estudio a una estra de TSA e incubar 18- 24 hrs. a 37C. -Suspender el crecimiento con 2 ml. de soluci n fisiol gica o soluci n fisiol gica formolada al 0,5%. -Calentar la suspensi n a Ba o Mara durante 1 hora a 100C. Control de autoaglutinaci n : -Colocar sobre una l mina de vidrio, 20 L de la suspensi n bacteriana y 20 L de soluci n fisiol gica. -Mezclar con un palillo, rotar la l mina por 1 minuto y observar bajo fuente de luz indirecta. -Registrar la reacci n observada. Si se observa aglutinaci n, el cultivo se encuentra en su forma rugosa (R) y debe cultivarse en medios de enriquecimiento como Agar sangre o Agar Meller-Hinton hasta obtener un cultivo liso (S). Slo entonces puede realizarse la serotipificaci n.
Nota: no siempre es posible obtener un cultivo liso y ausencia de autoaglutinaci n, en estos casos el cultivo es no serotipificable.

-La aparici n de una aglutinaci n de tipo flagelar (fl culos esponjosos, f cilmente disociables) dentro de la hora (sin aglutinaci n en el control con soluci n fisiol gica) debe considerarse como una reacci n positiva. -Reacciones de tipo som tico (precipitados finos), tardas no deben tenerse en cuenta. . CONSIDERACIONES -La temperatura de los reactivos puede influir en los resultados obtenidos. Dejar atemperar a 1525C al menos 30 minutos previo al uso. -Es conveniente contar con cepas de referencia para usar como control positivo. -El an lisis serol gico debe realizarse sobre cultivos puros previamente caracterizados por reacciones bioqu micas como E. coli , ya que podran ocurrir reacciones positivas debidas a otros g rmenes que tienen estrecha relaci n antig nica. -Los aislamientos sujetos a examen serol gico deben hallarse en su forma lisa (S), ya que en la forma rugosa (R) no expresan correctamente sus antgenos som ticos y causan falsos positivos (autoaglutinaci n). -Los cultivos deben ser m viles para poder expresar correctamente sus ant genos H y as ser detectados. Si luego de 15 d as no se observa movilidad en el medio exaltador de movilidad, la cepa debe considerarse inm vil y por lo tanto no tipable. REFERENCIAS 1. Edwards- Edwing.1986. Identification of Enterobacteriaceae, 4 th Ed.Eisevier Science Publishing Co.,New York.

Reacci n : -Colocar sobre una l mina de vidrio, 20 L de la suspensi n bacteriana y 20 L de antisuero. -Mezclar con un palillo, rotar la l mina por 1 minuto y observar bajo fuente de luz indirecta. -Registrar la reacci n observada.

AGLUTINACION FLAGELAR Preparaci n del antgeno (suspensi n bacteriana): -Repicar cada uno de los aislamientos de E. coli en estudio a un caldo de 2 mL de TSB e incubar 4 hrs. a 37C -Exaltar la movilidad aplicando una ansada del TSB en el centro de una placa de 100 mm, o en el extremo de una placa de 50mm con agar blando al 0,7% (la ansada se debe aplicar en la superficie del agar); un m todo alternativo de exaltaci n es por punci n en un tubo de Craigie (0,5 cm por debajo del borde del tubo interior). Si la movilidad es tal que el microorganismo se desplaza 50 mm a trav s del medio en 24h., el cultivo est listo para ser evaluado. De lo contrario repetir el procedimiento hasta lograr el grado de movilidad necesario. -Tomar material del extremo opuesto al origen de siembra (en placa) o bien de la superficie externa (en tubo de Craigie), sembrar en un caldo nutritivo de 5ml (ej. TSB) e incubar 18- 24hs a 37C. -Inactivar el cultivo con 5 mL de soluci n fisiol gica formolada al 1%. Homogeneizar y dejar en reposo por 1 hora. Control de autoaglutinaci n : -Colocar en un tubo de ensayo, 1 mL de la suspensi n bacteriana y 40 L de soluci n fisiol gica. -Incubar en ba o termost tico a 50C durante 2 horas y observar bajo fuente de luz indirecta.
Nota: tener precauci n de manipular suavemente el tubo de modo tal que el posible fl culo no se disgregue.

INSTITUTO NACIONAL DE PRODUCCION DE BIOLOGICOS ANLIS Dr. CARLOS G. MALBRAN Av. Vlez Sarfield 563 C.A.B.A. Tel: 54 11 4303 1809/ 11 (interno 152) e- mail: antisueros @anlis.gov.ar
Revisado en VI/2011

-Registrar la reacci n observada. Si se observa aglutinaci n, repetir el procedimiento con otra colonia. Reacci n : -Colocar en un tubo de ensayo, 1 mL de la suspensi n bacteriana y 40 L del antisuero flagelar. -Incubar en ba o termost tico a 50C durante 2 horas y observar bajo fuente de luz indirecta. -Registrar la reacci n observada. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Aglutinaci n Som tica/Capsular -La aparici n de una aglutinaci n granular visible al ojo dentro del minuto (sin aglutinaci n en el control con soluci n fisiol gica) debe considerarse como una reacci n positiva. -Aglutinaciones tard as no deben considerarse positivas. Aglutinaci n Flagelar