Mtodo para marcar neuronas de la mdula espinal de roedor.

La neurobiotina es un derivado amino de la biotina, sus principales ventajas son: Puede ser usado en vivo. Alta solubilidad. Adecuado para iontoforesis. Alta permanencia en las neuronas. No es txico. Puede ser fijado con formalina o glutaraldehdo. Para la deteccin de la neurobiotina se usa el Sistema Biotina-Avidina. Recientemente la avidina ha sido reemplazada por la estreptavidina (producida por estreptococos), que tiene mayor afinidad y menor tendencia a adherirse inespecficamente a los tejidos. La molcula de estreptavidina posee cuatro sitios de unin para la biotina.

La constante de disociacin del complejo estreptavidina-biotina tiene una Kd de 10-14 M lo que la situa en una de las uniones no covalentes ms fuerte que se conoce. Sus ventajas sobre la avidina son: Un punto isoelctrico neutro Su naturaleza qumica (al no tratarse de una glicoprotena no presenta afinidad por las lecitinas). La unin se mantiene en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventes orgnicos, agentes desnaturalizantes, detergentes y peptidasas. La estreptavidina se encuentra unida covalentemente a la fluorescena lo que permite una gran amplificacin con muy poco fondo, resultados difciles de obtener con otros procedimientos inmunohistoqumicos.

Protocolo para el Sistema Neurobiotina-Estreptavidina-Fluorescena.

Marcado de las neuronas. 1. Reconstituir el vial comercial de neurobiotina: a. Se prepara agregando una pequea cantidad de solucin de llenado de las pipetas (gluconato de K suplementado) al vial comercial, esto es para facilitar la disolucin. b. Luego se ajusta el volumen final hasta obtener una concentracin de 0.2%-0.5 %. c. Alicuotar en varios viales que sern almacenados en congelacin (-20C).

2. Se llena nicamente la punta de la pipeta de patch y para el resto de la pipeta se usa la solucin intracelular pero sin neurobiotina (opcionalmente: Este proceso se realiz en cmara hmeda). 3. La alcuota en uso se conserva en refrigeracin (4C) o en una cubeta con hielo durante todo el experimento. 4. No es necesario aplicar corriente elctrica para inyectar la neurobiotina, ya que bastan 5 minutos para que difunda y llene toda la neurona. Cortes Histolgicos. La manera ms rpida de endurecer de los tejidos blandos es la congelacin inmediata de las muestras, para ser cortadas en criotomo. Este procedimiento permite obtener cortes ms finos (10 a 30 m) que con vibratomo y sin necesidad de inclusin. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido se debe congelar la muestra muy rpidamente, normalmente en nitrgeno lquido mezclado con isopentano para conseguir un bao termosttico a una temperatura de -160 C., lo que evita la formacin de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares. Cuando no se realizan los cortes inmediatamente se requiere fijar la muestra, de acuerdo al siguiente protocolo. 1. Preparacin de paraformaldehdo (PFA) al 4% en buffer de fosfatos (prepara de acuerdo al anexo 1), de acuerdo al protocolo del anexo 2. a. El PFA se libera en forma de gas formaldehido cuando se disuelve en agua por lo que no se recomienda almacenarlo por mucho tiempo. 2. Se fija la seccin de mdula espinal que ha sido marcada con neurobiotina en paraformaldehdo-PBS al 4% durante 24 hrs. a 4C. a. El PFA es la forma polimerizada del formol. El agente fijador es el monmero de formaldehido el cual une dos protenas muy prximas formando un puente. b. El PFA es un buen fijador para lpidos por lo que fija correctamente estructuras celulares y membranas. c. El tejido fijado presenta una gran estabilidad y la matriz de entrecruzamientos es permeable a anticuerpos sin necesidad de un pre-tratamiento con proteasas. d. El PFA es compatible con la mayora de las tcnicas de tincin histolgicas, incluidas las de inmunocitoqumica e hibridacin de cidos nucleicos.

3. Crio-proteccin de las muestras para cortar en criotomo. a. Con ello se evita que durante la congelacin se formen cristales de hielo grandes que puedan daar las estructuras celulares. b. Despus de varios lavados en PBS (preparado de acuerdo al anexo 1) las muestras se cambian a una solucin de sacarosa al 10% en buffer de fosfatos, por 24hr. o hasta que las muestras dejen de flotar.

c. Repetir el paso b pero con una solucin al 20% de sacarosa. d. Repetir el paso b pero con una solucin al 30% de sacarosa. 4. Gelatinizacin de portaobjetos (ver anexo 2). La superficie del portaobjetos donde se colocaran los cortes debe tratarse previamente para que las muestras queden adheridas durante el proceso de revelado. Para ello los portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina, albmina, u otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y el tejido.

5. Llevar las muestras a la platina del criotom para congelar y cortar. a. Recuperando los cortes con un pincel fino.

b. Cortes montados directamente en el portaobjetos gelatinizado.

Revelado de las neuronas marcadas. 1. Llevar las muestras en una caja de multiposo de 96.

2. Permeabilizado de las muestras con tritn. La fijacin con solventes como acetona o metanol no solo fija las clulas sino que produce una extraccin de los lpidos por lo que no es necesaria ninguna permeabilizacin. Por el contrario cuando las clulas son fijadas con cross Linkers como formaldehido o glutaraldehdo los lpidos no son extrados. Si el antgeno es intracelular es necesario permeabilizar. Lo ms normal es permeabilizar con Tritn X-100 al 0.1%-0.4% durante mximo 10 minutos. Es un detergente no-inico que sirve para solubilizar protenas en su estado nativo. Otros metodos de permeabilizacin alternativos emplean diferentes detergentes como saponina, digitoxina, SDS o Tween20.

3. Enjuagar con PBS tres veces durante 5 min cada lavado. Remover la solucin en cada lavado mediante succin, evitando que la muestra se seque.

4. Revelado de la neurobiotina con streptavidina. Incubar con estreptavidina de fluorescena durante 15 minutos en la cmara oscura. La concentracin ptima del conjugado de estreptavidina debe ser determinada por titulacin; intervalo recomendado 1020 g/ml en PBS. Lavar exhaustivamente con PBS. 5. Montado de la preparacin con Cytoseal 60. Conservar las laminillas en un lugar oscuro a temperatura ambiente

6. Observacin de la marca fluorescente en un microscopio de epifluoresencia. La streptavidina tiene una excitacin mxima de 495 nm y una emisin mxima a 515 nm.

ANEXO 1
PB (BUFFER FOSFATOS 0,1 M, pH 7.5)
SOLUCIN A NaH2PO4 SOLUCIN B Na2HPO4 [M] 0.2 [M] 0.2 PM 137.99 PM 141.96 g/500ml de H2Od 13.799 g/1000ml de H2Od 28.392

Para preparar un litro de buffer de fosfato 0.1 M entonces se deber mezclar: 1. 500 ml de H2Od 2. 95 ml de SOLUCIN A 3. Agregar 405 ml de SOLUCIN B poco a poco hasta ajustar pH a 7.4

ANEXO 2
PREPARACIN DE PARAFORMALDEHDO (PFA) 4%
1.- 500ml de PB 0.1M. 2.- Pesar 24gr de PFA (Se debe usar guantes, cubreboca, bata y trabajar en campana de extraccin) 3.- Disolver los 24gr de PFA en 500ml de PB 0.1 M a 60C. 4.- Agregar hidrxido de sodio NaOH 1M en gotas hasta disolver. Notas: Es importante que nunca exceda los 60C; as que en caso necesario se retira de la plancha y se deja enfriar un poco. Tampoco es aconsejable que se enfre la solucin a 50C, o no se disolver el PFA. El hidrxido de sodio ayudar a disolver el PFA, volviendo el pH alcalino. Es importante no excederse con el NaOH, en tal caso con algunas gotas de HCl se reajusta el pH. 5.- Ajustar el pH a 7.4 aadiendo cido clorhdrico. Notas: Se utilizan tiras medidoras de pH. Si se va a utilizar un pHmetro se debe usar un electrodo exclusivo para el PFA, ya que el PFA se adhiere fuertemente a las paredes de vidrio del electrodo. 6.- Aforar a 600ml con PB 0.1 M. Listo! Ahora tenemos 600ml de PFA al 4% en PB, con un pH 7.4. 7.- Filtrar con papel filtro.

ANEXO 3
GELATINACIN DE PORTAOBJETOS
Agua destilada Gelatina Knox Sulfato de cromo y potasio (Cr K (SO4)2) 800ml 4gr. 0.4gr.

PREPARACIN: 1) Se muele el sulfato de cromo y potasio en un mortero, hasta que quede como polvo fino. 2) Se calienta el agua destilada, cuando empieza a hervir se le agrega la grenetina lentamente para que no se formen grumos. 3) Una vez que est bien disuelta y este hirviendo, se le agrega el sulfato de cromo. 4) Se afora a 1000ml 5) Se filtra y se guarda en un recipiente a 4C.

PROCEDIMIENTO: a) Las laminillas nuevas se limpian con etanol. b) Se sumergen en la solucin de grenetina. c) Se escurren un poco en papel secante, se pueden dejar secar a temperatura ambiente o en el horno a temperatura baja. d) Una vez secas, se vuelven a sumergir en la grenetina (3 veces ms), hasta completar 4 capas, dejndolas secar cada vez. e) Al terminar se puede guardar la grenetina sobrante para volverse a usar.