UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA CARRERA DE CIRUJANO DENTISTA REA BIOLGICA PRIMER AO

Manual de prcticas de laboratorio del mdulo:

Introduccin al Proceso Salud Enfermedad, Nutricin, Metabolismo y Bases Farmacolgicas Parte A 2007

PRCTICA # 1 MANEJO DEL MICROSCOPIO I. OBJETIVO Que el alumno conozca las partes del microscopio, su funcin, manejo y cuidados para conservarlo en las mejores condiciones de trabajo y as lograr el mayor provecho de sus prcticas de laboratorio. II. INTRODUCCIN Para llevar a cabo las prcticas del laboratorio de microbiologa, se requiere de la observacin de microorganismos y dado que estos no se observan a simple vista, es necesario el uso del equipo adecuado, en este caso, el microscopio como apoyo para la identificacin y comprensin de los objetivos planteados para cada una de las mismas. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Definicin de microscopio 2. Definicin de microorganismo 3. Formas de agrupacin de las bacterias IV. MARCO TERICO El microscopio, es el instrumento ms utilizado y fundamental en el Laboratorio de Microbiologa, proporciona la amplificacin gracias a la cual el hombre es capaz de ver organismos y estructuras que a simple vista son invisibles. Se dispone de microscopios que permiten amplias escalas de aumento; se cuenta tambin con varios tipos de microscopios y se han ideado muchas tcnicas por las cuales las muestras de microorganismos se preparan para el examen con mximo detalle. (ver esquema 1) Cada tipo de microscopio y cada mtodo de preparar las muestras ofrecen alguna ventaja para demostrar algunos aspectos morfolgicos. Existen microscopios simples, que emplean una sola lente y microscopios compuestos, que utilizan dos o ms lentes. El alumno utilizar un microscopio compuesto, por lo que se dar una descripcin de ste. Consta de varios sistemas: A) B) C) D) Sistema de soporte Sistema ptico Sistema de Ajuste Sistema de iluminacin

A) SISTEMA DE SOPORTE Este sistema consta de: 1. 2. 3. 4. 5. Brazo Es la parte del microscopio utilizada para transportarlo. Se sostiene con la mano izquierda y por el pie con la mano derecha. Tubo de Microscopio Comunica y sostiene el ocular con el revolver. Se desplaza en forma vertical por medio de dos tornillos: el macromtrico y el micromtrico. Revlver Se comunica con el tubo del microscopio y sostiene los objetivos: Es una pieza giratoria para seleccionar el objetivo y colocarlo en una posicin vertical respecto al ocular. Generalmente contiene 3 a 4 objetivos. Platina Es la parte donde se coloca la preparacin a observar; puede tener pinzas para sostener el porta objeto o bien un carro que se maneja con un tornillo que permite el desplazamiento hacia arriba y abajo y otro tornillo que desliza a la derecha e izquierda. Pie Sostiene al microscopio B) SISTEMA OPTICO Dado que la funcin del microscopio es hacer visibles las cosas demasiado pequeas para poder verse a simple vista, esto se logra por medio de un sistema de lentes de aumento y poder de resolucin suficiente para que los pequeos elementos muy prximos en la muestra examinada se vean separados, de tal modo que se obtenga una imagen claramente definida. El microscopio compuesto, Consta de dos sistemas de lentes: 1. Ocular 2. Objetivos Brazo Tubo del Microscopio Revlver Platina Pie

Ocular Est formado por un sistema de lentes, que aumenta la imagen producida por el objetivo. Esta situado cerca del ojo del observador y lleva grabado el aumento que proporciona. Algunos microscopios son monoculares y otros binoculares. Objetivos La resolucin del microscopio, depender solo del objetivo. Son cuatro las clases de objetivos generalmente usados: a. Objetivo 5X (lupa). Es el objetivo explorador, se utiliza una visin de conjunto y para localizar estructuras grandes. b. Objetivo 10X (seco dbil). Tambin se llama seco dbil. El rea observada disminuye pero la amplificacin es mayor. Se utiliza de preferencia para observar clulas o tejidos o bien para localizar estructuras ms fcilmente y llevarlas al centro del campo para enfocarlas con el siguiente objetivo. c. Objetivo 40X (seco fuerte). Tambin se conoce como seco fuerte. Se obtiene un mayor aumento y el campo se reduce, observndose los detalles de la estructura enfocada. d. objetivo100x (de inmersin). Conocido como objetivo de inmersin, ya que para su uso es necesario colocar a la preparacin aceite de inmersin. Con este objetivo se obtiene una imagen ms definida y ms grande. Estas dos lentes, el ocular y el objetivo, estn separadas por un tubo a una distancia tal que el ocular amplifica la imagen producida por el objetivo. La amplificacin total de u microscopio, es el producto del aumento que da el objetivo (con el que se esta observando), y el del ocular. As la amplificacin total de los objetivos 5X, 10X, 40X y 100X y con el ocular 10X, ser de 50, 100, 400 y 1000 veces respectivamente. Por ejemplo una clula o estructura que mide 6 micras al observarla con los diferentes objetivos tendremos que: Lupa (5X) x ocular (3X 5X) x 6 micras = 150 micras. Seco dbil (10X) x ocular (5X) x 6 micras = 300 micras. Seco fuerte (40X) x ocular (5X) x 6 micras = 1200 micras. De inmersin (100X) x ocular (5X) x 6 micras = 3000 micras = 3 mm. Como se demuestra el incremento de la imagen ya permite al ojo humano observar detalles en la estructura microscpica.

C) SISTEMA DE AJUSTE Est constituido por dos tornillos: 1. Tornillo macromtrico 2. Tornillo micromtrico Tornillo macromtrico. Permite el desplazamiento rpido y vertical del tubo del microscopio. Se localiza debajo de la platina. Se utiliza para hacer el ajuste grueso de la imagen que se desea observar. Tornillo micromtrico. Puede estar localizado debajo del tornillo macromtrico o ser la parte central de ste. Permite el desplazamiento lento y vertical del tubo del microscopio hasta que la imagen se aclara y queda bien definida. Se utiliza para obtener un ajuste preciso y enfocar los diferentes planos de la estructura observada. D) SISTEMA DE ILUMINACIN Consta de tres partes: 1, Fuente luminosa (lmpara o espejo) 2, Condensador 3. Diafragma 1. Lmpara Consta de un foco cuya intensidad luminosa puede regularse por medio de un transformador o bien ser constante. Espejo Es por lo general doble, plano por un lado y cncavo por el otro. El espejo cncavo es el ms utilizado ya que capta mejor los rayos solares o la luz de una lmpara externa y los transmite a la preparacin que se encuentra en la platina. 2. Condensador En su estructura presenta un sistema de lentes que sirven para concentrar los rayos luminosos en el campo de observacin. 3. Diafragma Situado en la parte inferior del condensador. Est compuesto de laminillas metlicas que se abren o se cierran para regular la cantidad de luz necesaria a la observacin y as lograr una imagen ms definida.

1.- Ocular 2.- Revlver y objetivos 3.- Platina 4.- Carro 5.- Tornillo macromtrico 6.- Tornillo micromtrico 7.- Diafragma 8.- Condensador 9.- Botn del condensador 10.- lminas de ajuste del condensador 11.- Interruptor de luz 12.- Transformador o regulador de intensidad de la luz

ESQUEMA 1 Para poder hacer una observacin en el microscopio, se deben seguir los siguientes pasos: 1.- Colocar la preparacin en la platina 2.- Ver lateralmente para bajar el tubo del microscopio con el tornillo macromtrico cerca de la preparacin y utilizar el objetivo de menor aumento. 3.- Observando por el ocular, subir el tubo del microscopio hasta localizar el objeto de observacin con el macromtrico 4,. Mover lentamente el micromtrico, para precisar la imagen 5.- Girar el revlver para colocar el objetivo seco fuerte, observar por el ocular y detallar la imagen con el tornillo micromtrico. 6.- Para observar con el objetivo 100X o de inmersin, seguir los pasos siguientes: a) Despus de observar con seco fuerte (40X), gire el revlver para colocar el objetivo de inmersin y antes de concluir esta operacin, colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. b) Bajar el tubo del microscopio usando el tornillo macromtrico observando del lado hasta que el objetivo entre en contacto con el aceite de inmersin y posteriormente se ajuste el enfoque por medio del tornillo micromtrico. Cuidados: Para una mejor observacin, se requiere mantener al microscopio en perfectas condiciones mecnicas, limpio y manejarlo correctamente. Para lograr esto, hay que tener en cuenta las siguientes indicaciones: 1) Si no est en uso, debe mantenerse en su estuche o funda protectora 2) Debe alejarse de la accin de cidos y lquidos corrosivos.

3) Debe transportarse con cuidado en forma vertical y por medio del brazo y de preferencia colocando la otra mano debajo del pie 4) Limpiarlo antes y despus de usarlo, para el caso de las lentes se aconseja utilizar papel seda. 5) Al terminar la observacin, colocar el objetivo de menor aumento y guardar el microscopio en su estuche o cubrirlo con su funda. V. MATERIAL POR EQUIPO 1 Microscopio ptico 1 Preparacin de frotis sanguneo 1 Preparacin de frotis de microorganismos 1 Preparacin de letras de papel peridico 1 Preparacin de parsito Aceite de inmersin Papel seda VI. METODOLOGA 1.- Bajo la supervisin del profesor, adiestrarse en el conocimiento del microscopio haciendo un repaso y reconocimiento de las partes del microscopio, identificando su manejo. 2.- Enfocar a seco dbil, seco fuerte e inmersin, las preparaciones proporcionadas 3.- Despus de utilizar el microscopio entregarlo al laboratorio considerando los cuidados necesarios. VII. RESULTADOS Reportar los resultados obtenidos y hacer dos esquemas de cada una de las observaciones realizadas con el microscopio: una que demuestre lo observado con el objetivo 40X o seco fuerte y la otra con el objetivo de 100X u objetivo de inmersin. VIII. CUESTIONARIO 1) 2) 3) 4) 5) 6) Defina ndice de refraccin Cul es la funcin del aceite cuando se usa el objetivo de inmersin? Con cul de los objetivos hizo una mejor observacin? Qu aplicaciones se obtienen con el microscopio de luz? Explique que es el poder de resolucin de un microscopio Cmo se determina el grado de amplificacin?; determnelo con cada uno de los objetivos que utiliz. 7) Cul es la diferencia entre resolucin y aumento?

IX. BIBLIOGRAFA 1.-Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica de Jawetz. 16 ed. Mxico, D.F.: Editorial Manual Moderno, 1999: 11-12. 2.- BOB. A Freeman, Ph.D. Microbiologa de Burrows. 22ed. Mxico: Editorial Mc Graw Hill, 1989: 17-55. 3.-Philip L Carpenter. Microbiologa. 4 ed. Mxico, D.F: Editorial Interamericana, 1996: 28-46. 4.-Jos A. Garca-Rodrguez. J.J. Picazo. Compendio de Microbiologa Mdica. Madrid, Espaa: Editorial Harcourt Brace, 2000: 20-22. 5.-Elemer W. Koneman, M.D. Diagnstico Microbiolgico. 5 ed. Buenos Aires, Argentina: Editorial Mdica Panamericana, 2001: 81-96.

PRCTICA # 2 ESTRUCTURA BACTERIANA I. OBJETIVO El objetivo de esta prctica es facilitar al alumno la identificacin de la estructura bacteriana por medio de la realizacin de frotis, tinciones y su observacin en el microscopio para apoyar los conocimientos adquiridos en la teora. II. INTRODUCCIN La presente prctica, apoya el conocimiento de las bacterias y sus caractersticas morfolgicas lo cual es bsico para su identificacin, mismo que es de suma importancia en la formacin del Cirujano Dentista, para el diagnstico de enfermedades de origen microbiolgico. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS 1.- Conocer la importancia de la flora bacteriana normal de la cavidad oral. 2.- Reconocer por medio de tinciones especiales, su estructura. 3.- Saber clasificar las bacterias, segn la tcnica de Gram. IV. MARCO TERICO Los seres vivos segn Robert Wittaker (1969), se clasifican en 5 reinos: Animal, Vegetal, Protista, Fungi y Monera. Estos cinco agrupamientos se establecieron sobre la base de: A) Tipo celular: procarionte o eucarionte; B) Tipo de nutricin: fotosntesis, absorcin, ingestin; C) Tipo de organizacin: Unicelulares, coloniales, multicelulares, multinucleados. Las bacterias son microorganismos que pueden producir alteraciones a nivel sistmico y en cavidad bucal; su tipo celular es procarionte, se nutren principalmente por absorcin, y su tipo de organizacin es unicelular formando colonias. A continuacin se hace una descripcin de la estructura bacteriana, sealando sus partes y la funcin de cada una de ellas: ESTRUCTURA BACTERIANA (Ver esquema 1) CPSULA Cubierta estructural altamente viscosa y firmemente adherida a la pared celular de ciertas especies bacterianas, Streptococcus salivarius, produce una cpsula de polisacridos.

La cpsula protege al microorganismo de la desecacin y de la fagocitosis, adems puede proporcionarle a la bacteria la capacidad de adherirse a las superficies, Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis, forman un material muy parecido a la cpsula en presencia de sacarosa que permite que se adhiera a la superficie dental e inicien la formacin de la placa microbiana bucal. FLAGELOS (del latn flagelo, ltigo) Son filamentos delicados, largos y ondulados, sirven para el movimiento bacteriano. Se originan de la membrana citoplsmica y poseen un cuerpo basal localizado en la membrana y pared celular su constitucin es proteica. (Flagelina) Los organismos se pueden clasificar segn la localizacin de sus flagelos: 1) Polar: Localizados en uno o en ambos extremos de la bacteria. 2) Pertricos. (del griego trichos, pelo) Localizados en toda la superficie del organismo PILI. Tambin denominados fimbrias (del latn flecos). Estructura muy pequea y delgada, rgida, recta, constituida por una protena llamada pilina. Vara en nmero; se asocia principalmente con bacterias Gram negativas, mviles e inmviles. Participa en la conjugacin en el paso de informacin gentica. PARED CELULAR. Es rgida, constituida por cido murmico, peptidoglicanos, glucopptido y mucopptido. Es responsable de la forma de la bacteria, pues protege a la delicada membrana celular de la alta presin osmtica intracelular y del medio. Todas las bacterias al ser despojadas de la pared, toman un forma esfrica y se llaman protoplastos. Ver tabla I La pared celular difiere en las bacterias Gram positivas y Gram negativas Pared celular Complejidad Lpidos Polisacridos cidos teicoicos Lipopolisacridos Gram positiva menor 0-2% 35-60% + Gram negativa mayor 10- 20% 15-20% +

TABLA I Diferencias entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. MEMBRANA CITOPLASMTICA. Es la estructura mas externa de la porcin viva de la clula; constituida por fosfolpidos y protenas. Presenta selectividad y controla el paso de nutrientes y productos de desecho entre el medio y el citoplasma. Algunas enzimas

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respiratorias y oxidativas estn asociadas con la membrana, adems de las enzimas que sintetizan la pared celular. CITOPLASMA Es el material viviente de la clula constituido principalmente por agua. En clulas jvenes aparece homogneo, en viejas es granular. En el se encuentran mesosomas, ribosomas, grnulos y material nuclear que se encuentran incluidos en una matriz que contiene iones, aminocidos y protenas, entre otros. MESOSOMAS Son invaginaciones de la membrana citoplasmtica; sirven para dar sostn al material nuclear para su sntesis. Los mesosomas laterales tienen funciones excretoras y secretoras. Pueden presentar forma vesicular, concntrica o lamelar. RIBOSOMAS Son complejos articulados de protenas y cido riboniucleico. Los grupos de ribosomas se mantienen juntos en el RNA mensajero formando poli ribosomas. Son los sitios de actividad enzimtica de sntesis de protenas. En las clulas bacterianas, se pueden disociar en subunidades grandes 50S y pequeas 30S. MATERIAL NUCLEAR El ncleo o cuerpo de cromatina est disperso en el citoplasma . El material nuclear se une al mesosoma durante la divisin celular. Tambin se encuentra en el citoplasma en forma de plsmidos. ENDOSPORAS Son formadas por los gneros Bacillus y Clostridium en condiciones adversas. Son cuerpos fuertemente refractarios y se consideran fases resistentes en el ciclo de vida. Resisten la accin de agentes qumicos, ebullicin y desecacin. Contienen todos los componentes de la clula vegetativa ms cido dipicolnico. Son difciles de teir, pero una vez teidas son difciles de decolorar. Su localizacin dentro de la clula vegetativa, puede ser central, terminal o subterminal. Es importante considerar la como forma de reproduccin de las bacterias. Es importante no considerar a las endosporas como forma de reproduccin en las bacterias.

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Membrana celular Grnulo Endosp ora

Clula procaritica
Pili

Cpsula Ribosom as Pared celular Mesosom a Material nuclear Flagel o

Esquema 1. Estructura bacteriana tipo. TINCIONES Para estudiar las bacterias, se necesita el uso de tinciones, puesto que stas son incoloras y refringentes de tal manera que sera muy difcil observarlas al microscopio de luz. Los colorantes adems de tener la propiedad de impartir color, deben ser resistentes a la luz y al lavado, as como tambin la propiedad de unirse a un material por medio de una reaccin qumica o depositarse sobre dicho material. Todos los colorantes son de naturaleza orgnica, principalmente aromticos. La estructura qumica de los colorantes se encuentra dividida en dos grupos: 1. Grupo Cromforo. Grupo qumico, que confiere a la molcula la propiedad de proporcionar color. 2. Grupo Auxcromo. Grupo qumico que suministra las propiedades de formar sales y de transferir el color de un colorante a una sustancia sobre la cual acta. Segn el tipo de grupo auxcromo, los colorantes se dividen en 2 clases: a) Colorantes bsicos, que tienen el grupo auxcromo NH2 (amino). b) Colorantes cidos, que presentan el grupo zuxocromo SO 3H (sulfnico), COOH (carboxilo). Los colorantes de naturaleza bsica, son los ms ampliamente usados en microbiologa y probablemente el ms utilizado es el azul de metileno. En el laboratorio, suelen utilizarse dos tipos de tinciones para estudiar la estructura de los microorganismos:

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a) Tinciones Simples. b) Tinciones diferenciales o compuestas. Las tinciones simples son aquellas que utilizan un solo colorante, con objeto de distinguir nicamente la forma del organismo. Las tinciones diferenciales, son las que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o partes de una clula bacteriana. La retencin de determinados colorantes por las bacterias depende grandemente de la estructura celular de la bacteria, principalmente de la pared celular. En la tcnica de tincin de Gram. se utilizan dos colorantes, por tanto es un mtodo de tincin diferencial; esta tcnica, divide a las bacterias en dos grandes grupos: las bacterias Gram negativas, que toman el colorante de contraste que es la safranina y las bacterias Gram positivas, que toman el colorante primario, el cristal violeta. Esta tcnica se considera una tincin diferencial. La tcnica de Gram., introducida por el dans Hans Christian Gram, en 1884, proporciona importancia taxonmica. El procedimiento de la tincin de Gram se inicia con la tincin de la clulas bacteriana fijadas al calor, con el colorante bsico, cristal violeta. Posteriormente, se trata con una solucin yodada, el yodo forma un complejo con el cristal violeta que es insoluble en agua y soluble slo en alcohol acetona; sta ltima mezcla, extrae a los lpidos de la pared celular de los gram (-), aumentado la porosidad y el complejo sale. Despus se realiza la coloracin de contraste para las bacterias que perdieron el colorante primario, usando el colorante safranina, que puede ser sustituido por otro colorante por ejemplo, la fucsina. En la Tabla II, se enlistan las bacterias Gram (+) y Gram (-), de mayor importancia en cavidad bucal. BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Streptococcus mutans Streptococcus sanguis Streptococcus mitis Streptococcus salivarius Streptococcus sp Peptostreptococcus sp Enterococcus faecalis Peptococcus Nocardia sp Actinomyces Israelli Actinomyces naeslundii Corinebacterium diphteriae Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus Propionibacterium acnes Rothia dentocariosa Corynebacterium matruchotii

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Vellonella alkalescens Neisseria sp Fusobacterium nucleatum Prevotella melaninogenica Bacteroides oralis Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Prevotella intermedia Porphyromona gingivalis Actinobacillus actinomycetemcomitans

TABLA II. Microorganismos Gram positivos y Gram negativos de mayor importancia en cavidad bucal.

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V. MATERAL POR EQUIPO CEPAS: Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Bacillus megaterium Bacillus subtilis Corynebacterium sp Streptococcus mutans COLORANTES: Cristal violeta Safranina Alcohol acetona Lugol Rojo congo Tinta china Mordiente de cpsula Fucsina Mordiente de Knaysi Colorante de Albert Verde de malaquita (solucin, acuosa al 5%) Saf Portaobjetos Cubreobjetos Asa y porta-asa Microscopio Aplicador VI. METODOLOGA PREPARACIN DEL FROTIS: 1.- Preparar el frotis bacteriano de la siguiente manera: a. En un portaobjeto perfectamente limpio y desengrasado, coloque sobre l una pequea gota de agua con el asa bacteriana. b. Trabajando cerca del mechero, tomar con el asa poco crecimiento de Klebsiella pneumoniae, y hacer una emulsin con la gota de agua sobre el portaobjeto extendiendo. El asa bacteriolgica, deber ser esterilizada al calor antes y despus de este paso. c. Hacer lo mismo que en paso b) con Staphylococcus aureus y colocarlo en la misma gota donde fue puesta Klebsiella pneumoniae, con el fin de realizar una mezcla bacteriana de Gram (+) y Gram (-). Esterilizar el asa antes y despus de este paso. d. El porta objeto con la muestra bacteriana se fija al calor, pasndola por la flama del mechero 2 o 3 veces sin calentar mucho. 2.- Tincin de Gram

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a) Agregue cristal violeta dejando actuar durante un minuto. b) Lave con agua de la llave, procurando que no pegue de lleno el agua sobre la preparacin. c) Agregue yodo de gram por un minuto. d) Lave con agua corriente y deje secar por un poco. e) Agregue alcohol acetona durante 30 seg. f) Lave con agua corriente. g) Coloque safranina, cubriendo la preparacin por 30 seg. h) Lave con agua corriente y deje secar al aire i) Observar al microscopio ptico con los objetivos 10X, 40X y 100X. NOTA: Para observar con el objetivo de inmersin (100X), colocar sobre la preparacin una gota de aceite de inmersin y observar. 3.- Demostracin de Cpsula: A.- Mtodo de la tinta china frotis hmedo a. b. c. d. Colocar 1 gota de agua en un portaobjeto limpio Hacer una suspensin con Klebsiella pneumoniae Colocar a un lado, una gota de tinta china. Homogenizar con el asa, colocar encima un portaobjeto y presionar con un fragmento de papel secante con cuidado. Si el portaobjeto no es presionado suficientemente, los microorganismos tienden a ser conducidos a todas direcciones por la tinta y pueden ser enmascarados por las capas de tinta, si se presiona demasiado, las cpsulas pueden distorsionarse. e. Observar con los objetivos 10X, 40X y 100X Las cpsulas aparecen como zonas claras entre el contorno de las clulas y el fondo oscuro. B.- Mtodo de rojo congo a.- Colocar 1 gota de colorante rojo congo en un portaobjeto limpio b.- Hacer una suspensin con Klebsiella pneumoniae c.- Dejar secar al aire y fijar al calor. d.- Adicionar mordiente de cpsula y dejar de actuar por 3 minutos. e.- Lavar con agua de la llave f.- Dejar secar y observar con los objetivos 10X, 40X y 100X. Las cpsulas aparecen como zonas claras y las clulas y el fondo de color rojo. 4.-Demostracin de pared celular 1. Preparar el frotis con Bacillus magaterium y fijar al calor. 2. Tincin con la Tcnica de Knaysi

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a. Colocar mordiente de Knaysi durante 10 minutos. b. Lavar con agua de la llave. c. Colocar una gota de fucsina e inmediatamente colocar un cubre objetos, procurando la no formacin de burbujas de aire. d. Observar al microscopio con los objetivos 10X, 40 X y 100X. La pared se observa brillante bien delimitada alrededor de la bacteria. 5.- Demostracin de grnulos meta cromticos. 1. Prepara el frotis con Corynebacterium sp. Y ijar al calor muy suavemente. 2. Tincin con la Tcnica de Albert : a. Cubrir el frotis con colorante de Albert durante 5 minutos. b. Pase por encima de l portaobjetos con el colorante, el mechero Para calentar un poco (30 segundos). No permita que hierva el colorante. c. Lavar con agua y secar d. Aplique solucin de yodo lugol durante 1 minuto e. Lave con agua de la llave y deje secar al aire f. Observar al microscopio con los objetivos 10X, 40X y 100X Los grnulos metacromticos aparecen de color azul oscuro y el citoplasma verde plido. 6.- Demostracin de Endosporas 1.- Hacer frotis con Bacillus subtilis, dejar secar y fijar al a calor 2.- Tincin con la tcnica de Shaeffer- Fulton : a. Cubrir la preparacin con solucin acuosa de verde de malaquita al 5% y calentar hasta la formacin de vapores durante 1 minuto. b. Lavar con agua de la llave c. Contrastar con solucin acuosa de safranina al 0.5% durante 30 segundos. d. Lavar con agua de la llave y dejar secar al aire e. Observar al microscopio con los objetivos 10X, 40X y 100X. Las esporas se tien de color verde y el citoplasma rojo. VII. RESULTADOS 1. Realizar esquemas de todas las tinciones con el objetivo 100x del microscopio mencionando nombre de la bacteria, estructura observada as como el nombre de la tcnica de tincin utilizada para cada una de ellas.

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VIII. CUESTIONARIO 1. Qu es un mordiente y cul se utiliza en la tcnica en la tcnica de Gram? 2. Definir colorante. Cul es el colorante primario utilizado en la tcnica de Gram. Puede ser sustituido por otro colorante? 3. En qu se basa la tcnica de Albert y cul es su utilidad? 4. Cules son las diferencias principales entre bacterias Gram. (+) y Gram. (-). 5. Qu estructuras bacterianas son utilizadas para la identificacin de una bacteria? 6. Qu funcin tienen las esporas? 7. Qu funcin tienen la cpsula y la pared celular?

IX. BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 22-24 2. Negroni Marta. Microbiologa estomatolgica fundamentos y gua prctica. Ed. Mdica Panamericana Buenos Aires, Argentina: 1999: 481-488 3. Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica de Jawetz. 14 ed. Mxico, D.F.: Editorial Manual Moderno, 1991: 11-33 4. Nolte W.A. Microbiologa Odontolgica 4 ed. Mxico, D.F. Editorial Interamericana, 1984 5. Davis B.D; Dulbecco R; Eisen HN; Ginsber H.S. Tratado de Microbiologa 4 ed. Barcelona Espaa. Editorial Masson 1996 19-46.

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PRCTICA # 3 CULTIVO DE BACTERIAS I. OBJETIVO Conocer los factores de nutricin que requieren los microorganismos para su crecimiento a travs diferentes medios de cultivo de acuerdo a su composicin y su uso en el laboratorio, as como las diferentes tcnicas de siembra de los mismos y estructura morfolgica colonial para apoyar los conocimientos tericos. II. INTRODUCCIN El estudio de los microorganismos incluye aquellos que pueden estar involucrados con problemas de salud, por ello es necesario conocer las caractersticas de nutricin, crecimiento y fisiologa de los mismos, en esta prctica se revisarn medios de cultivo que facilitarn el crecimiento bacteriano a partir de tcnicas especificas de laboratorio. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS -Definir tcnica invitro y tcnica invivo. -Saber cuales son las necesidades nutricionales de los microorganismos -Definir medio de cultivo y su uso en el laboratorio

IV. MARCO TERICO Para estudiar los microorganismos y determinar su relacin con enfermedades infecciosas es necesario conocerlos por tcnicas especificas de laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuales son los nutrientes y las condiciones fsicas que requieren, ya que muchos de los microorganismos pueden sintetizar sus componentes orgnicos a partir de fuentes de carbono simple mientras que otros requieren de fuentes ms complejas para crecer. Existen nutrientes esenciales para los organismos que son metabolitos que no pueden sintetizar por ellos mismos, por lo tanto tienen que provenir de fuentes externas proporcionados con los medios de cultivo. Solo las bacterias, micoplasmas, hongos, levaduras y protozoarios pueden crecer por medios de cultivo artificiales invitro, mientras los virus rickettsias, y clamidias requieren de cultivos de clulas vivas( in vivo) como embrin de pollo o animales para su crecimiento y reproduccin. Cada organismo para su crecimiento o reproduccin, requiere, dependiendo de sus sistemas enzimticos, de diferentes nutrientes, por lo cual de acuerdo a su forma de nutricin en se clasifican en:

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1- Auttrofos: Viven y se multiplican en un ambiente inorgnico, poseen sistemas enzimticos que los hacen capaces de metabolizar sustancias inorgnicas para formar sus componentes celulares. Algunos son foto sintticos y otros quimiosintticos. 2- Hetertrofos: Requieren de materia orgnica preformada para la sntesis de sus componentes celulares. Aqu se incluyen los microorganismos de la flora normal humana. 3- Hiptrofos: Requieren de clulas vivas para poder crecer, ya que han perdido los sistemas enzimticos para reproducirse por los que son parsitos obligados. Otro factor que influye tambin en el crecimiento de los microorganismos, es la temperatura y pueden clasificarse de acuerdo a la temperatura optima que requieren para poder crecer: a) Psicroflicos Son microorganismos que crecen mejor a bajas temperaturas: 10 a 15C y 2 a 4C. b) Mesoflicos Son los microorganismos que tienen sus temperaturas ptimas de crecimiento entre 25 y 40C. Muchos de los microorganismos mesofilicos que causan enfermedad, tienen las ptimas entre 35 y 37C. c) Termoflicos Presentan temperaturas ptimas de crecimiento entre 50 y 60 C, no son de importancia para la salud humana, se encuentran en el suelo d) Termodricos Son aquellos que resisten temperaturas mayores a 60C El grado de acidez o alcalinidad (referido como pH) del medio, es otro factor que tambin influye de manera importante en el crecimiento de los microorganismos. Muchas bacterias patgenas, crecen a un pH ligeramente por encima del neutro (pH =7) (neutrfilos). Otros como lactobacilos, cndida, y hongos en general, crecen mejor a un pH de 5 (cido) (cidofilos). Mientras otros crecen a un pH alto (basfilos). Ciertos organismos requieren de oxigeno para poder crecer, mientras que otros necesitan de CO2 para estimular su crecimiento. Ciertas bacterias crecen en medio con una presin osmtica creada por 0.75% de sales, mientras que otras necesitan de CO2 para estimular su crecimiento. Un medio de cultivo es una sustancia que se prepara en el laboratorio con los nutrientes necesarios para facilitar la reproduccin de microorganismos para su estudio se pueden clasificar de acuerdo a su composicin. Medios naturales: Se obtienen a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como carne, vsceras, leche, papa, entre otros, por ello su composicin no puede ser constante, varia de un organismo a otro. Medios sintticos: Artificiales o precisos qumicamente. Son aquellos en las que sus componentes estn qumicamente definidos cuyos nutrientes permiten

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el desarrollo de microorganismos no exigentes en cuanto a su requerimiento nutricional por ejemplo agar nutritivo. Medios semi sintticos: Tambin llamados empricos son aquellos medios a los cuales se les agregan nutrientes naturales de origen natural, animal, vegetal o de otros microorganismos por ejemplo papa, extracto de carne o de verdura lo que hace que su composicin sea exacta variando de un lote a otro son los de mayor uso en el laboratorio, por ejemplo agar sangre, caldo infusin cerebro corazn: BHI. Los medios de cultivo por su composicin qumica y usos se pueden dividir en: Medios simples, medios ricos, medios de enriquecimiento, medios diferenciales, medios especiales, medios selectivos. a) Medios simples: Son los que constan de todas las fuentes nutritivas mencionadas en forma de compuestos simples. Ejemplo: Caldo nutritivo, agar nutritivo. b) Medios ricos: Constan de fuentes nutritivas complejas. Estn enriquecidos con tejidos orgnicos como sangre, extracto de carne, lquido de ascitis. En ellos pueden crecer mayor cantidad de bacterias en los medios simples, especialmente de difcil crecimiento ejemplo. Agar sangre, agar soya tripticasa. c) Medios de enriquecimiento: Por lo general se trata de medios lquidos; contienen adems fuentes nutritivas complejas, agentes selectivos para un tipo de microorganismos. Ejemplo: Caldo Selenita, que sirve para enriquecer una muestra sospechosa de Salmonella; contiene selenito de sodio que es un toxico para bacterias de otros gneros. d) Medios especiales: Son medios a los cuales se les adiciona factores de crecimiento como vitaminas, hemina, entre otros. necesarios para el crecimiento de determinado microorganismo. Ejemplo: Medio de Levinthal. e) Medios diferenciales: Son medios que revelan caractersticas especificas, sin inhibir el crecimiento de algn microorganismo son muy tiles para identificacin de bacterias. Ejemplo: EMB, Endo, MacConkey, agar sangre. F) Medios selectivos: los microorganismos que existen en la poblacin, pueden ser separados favoreciendo su crecimiento por inhibicin de otros mediante la adicin de sustancias inhibidoras o pH, entre otros Ejemplo: estafilococo 110 (S110) para estafilococos, agar rogosa para lactobacilos, agar mitis salivarius para estreptococos. Los medios de cultivo, se pueden dividir de acuerdo a su consistencia en: lquidos, slidos y semislidos. a. Los medios lquidos. Nos permiten el estudio del crecimiento bacteriano en trminos de masa celular, lo cual se puede evidenciar por turbidez a simple vista o por medio de un fotocolormetro.

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El crecimiento microbiano es exponencial, mientras no disminuyan las fuentes de nutrientes y en cuanto esto sucede, el crecimiento se hace ms lento, llegando a una fase estacionaria, para seguir con una fase de declinacin o muerte. Lo anterior se puede demostrar mediante una curva de crecimiento:
Log de crecimiento bacteriano Nivel estacionario mximo Masa celular
Fase exponencial

Fase de declinacin

Fase log

b. Medios slidos. Estos medios constan esencialmente de agar, gelatina o albmina. El agar es un polisacrido extrado de varias algas rojas consiste principalmente de galactosa con un derivado sulfatado el agar es una sustancia ideal para hacer medios slidos, ya que no es txico para las bacterias a una concentracin de 1.5 a 2%, la superficie del agar es los suficientemente hmeda para soportar el crecimiento y lo suficientemente seco para mantener las colonias separadas. Slo los microorganismos mviles como Proteus requieren de 5% de agar. Los usos del medio slido son: Contar clulas viables, aislamiento, diferenciacin e identificacin de microorganismos. c. Medios semislidos: Contienen de 1 a 1.5 % de agar. Son especialmente tiles para observar movilidad y para conservar vivas las cepas de los cultivos por largos periodos. Todo medio de cultivo, consta: una fuente de carbono para construir los esqueletos de las molculas, una fuente de nitrgeno para la sntesis de protenas, una fuente de energa para realizar todas las funciones y una fuente de hidrgeno. EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO Agar nutritivo. Contiene extracto de carne, (pulverizado que brinda hidratos de carbono, compuestos nitrogenados, vitaminas hidrosolubles, levadura y sales), peptona (obtenida como producto de la digestin de sustancias proteicas sirve como fuente de carbono, nitrgeno y energa) y agar,(da solidez al medio de cultivo se obtiene de algas marinas y no sirve como nutriente ya que es resistente a la hidrlisis bacteriana que generalmente se agrega a los medios de cultivo en contracciones de 1 al 2%. Se usa como medio de cultivo general para la mayora de las bacterias no demasiado exigentes como agar base. Este medio se vende ya preparado y deshidratado; para utilizarlo es necesario resuspender 23grs. de medio en 1000ml de agua

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destilada y calentar hasta completa disolucin y dejar hervir un poco. Se esteriliza y se vaca a placas o tubos. Agar sangre. Contiene infusin de corazn, triptosa, cloruro de sodio, agar y sangre de carnero. (Aporta factores de crecimiento). Se prepara un medio base al cual se le adiciona sangre de carnero con el objeto de cultivar bacterias ms exigentes, patgenas. El crecimiento en ste medio es generalmente exuberante y en l se puede observar diferentes grados de hemlisis, que es caracterstica diferencial de algunos organismos. Para prepararse se resuspenden 40grs. De medio base deshidratado en 1000ml. De agua destilada y calentar a ebullicin para disolver el medio. Esterilizarlo y dejarlo enfriar a aproximadamente a 45- 50C, agregar sangre desfibrinada en condiciones aspticas en proporcin del 5%. Agar Endo. Contiene peptona, lactosa, fosfato dipotsico, agar , sulfito de sodio fucsina bsica. Es un medio diferencial utilizado para bacterias intestinales (coliformes). Se usa en el diagnstico de enfermedades intestinales para aislar agentes patgenos y en Microbiologa Sanitaria. La fucsina se usa como indicador para diferenciar los organismos fermentadores de la lactosa de los no fermentadores. Los organismos que son fermentadores de la lactosa aparecen como colonias blancas o incoloras y las que la fermentan dan colonias rosas. Medio Estafilococo 110: Contiene extracto de levadura, triptona, gelatina, lactosa, manitol cloruro de sodio, fosfato dipotsico, este agar es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. La selectividad de ste medio consiste en su alta concentracin de cloruro de sodio, la cual no soportan los dems microorganismos. Medio SIM: Contiene extracto de carne, peptona , fierro peptonizado, tiosulfato de sodio y agar. Se utiliza como medio de rutina para la identificacin de miembros de los medios de Salmonella y Shigella, por la produccin de cido sulfhdrico, indol y movilidad. Estas caractersticas junto con otras son importantes para la identificacin de miembros Gram negativos del grupo entrico. Este medio es semislido, para permitir la movilidad de organismos flagelados; la identificacin del cido sulfhdrico se identifica por un precipitado de color negro y la produccin de indol se identifica por la adicin del reactivo de Kovacs o de Ehrlich: el color rojo indica produccin de indol.

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V. MATERIAL POR EQUIPO Cepas: 1 Tubo con agar simple con Staphylococcus aureus 1 Tubo con agar simple con Klebsiella pneumoniae 1Caja con medio de cultivo con Colonias Bacterianas. 1Caja con agar sangre 1Caja con agar estafilococo 110 1 caja con agar simple 1 Tubo con agar simple inclinado 1 Tubo con caldo nutritivo 1 Tubo con medio SIM 1 Paquete con 3 hisopos estriles Asa y porta asa Mechero VI. METODOLOGA 1. Con diferentes hisopos estriles, se tomaran las siguientes muestras y sembrar por el mtodo de estra cruzada como sigue: Exudado farngeo Exudado farngeo Exudado farngeo Sembrar en agar sangre Sembrar en agar estafilococo 110 Sembrar en agar simple

a) Tomar la muestra con el hisopo y depositarla en la parte superior de la caja, sembrando masivamente hasta cubrir la mitad de la caja.

b) Quemar el hisopo y desecharlo en la basura

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c) Con el asa previamente esterilizada y enfriada, realizar el segundo cuadrante de estras, tomando solo una vez parte de la muestra colocada en el segmento anterior.

d) Esterilizar el asa, enfriar y hacer el tercer cuadrante de estras, sin tocar el primer cuadrante. Incubar durante 24 horas.

Hacer la estra cruzada como se indica en el esquema. 2. A partir de cultivos puros de Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae hacer resiembras en tubos con agar simple inclinado (slido), caldo simple (lquido) y medio SIM (semislido) como sigue: primeramente hay que asegurarse de que los tubos no tienen los tapones pegados, girando suavemente y destaparlos cerca del mechero. Deben marcarse con la cepa que se va a sembrar y la fecha. A) Siembra en medio inclinado (Agar simple) 1. Esterilizar el asas a la flama del mechero hasta que se ponga al rojo 2. Enfriar el asa cerca del mechero o bien sumergindola en un trozo de agar no sembrado. 3. Tomar una asada del cultivo de Staphylococcus aureus y sembrar por estra simple, deslizando el asa desde el fondo del medio. 4. Al terminar la siembra, esterilizar el asa.

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B) Siembra en caldo Realizar los pasos 1 y 2 del inciso A 2. Tomar una asada del cultivo de Staphylococcus aureus y sembrara el caldo mediante agitacin del asa dentro de l.

4. Esterilizar el asa.

C) Siembra por picadura (Medio SIM) Realizar los pasos 1 y 2 del inciso A b) Con el asa totalmente recta, tomar una asada de Klebsiella pneumoniae y sembrar en el tubo con medio SIM en posicin vertical, tratando de meter y sacar el asa por el mismo lugar para que la picadura quede recta.

e) Esterilizar el asa. 3. Realizar la lectura de la Morfologa Colonial que presenten las bacterias en los siguientes medios de cultivo: Agar sangre, estafilococo 110 y agar simple. Leer tamao de las colonias, color, forma, elevacin, bordes, superficie, textura, Tambin observar la morfologa colonial en el medio de cultivo ya sembrado. VII. RESULTADOS 1. Realizar esquemas de cada una de las tcnicas de sembrado que realiz, especificando la utilidad de cada una. 2. Hacer una tabla de la morfologa colonial bacteriana observada en los diferentes medios de cultivo.

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VIII. CUESTIONARIO 1. Definir el concepto de medio de cultivo. 2. Mencione tipos de cultivo segn su composicin y defina cada uno 3. Qu clase de nutrientes proporciona cada uno de los ingredientes del caldo y agar nutritivo? 4. Qu objeto tiene la regulacin del pH en los medios de cultivo? 5. Qu es una colonia bacteriana? 6. Qu significa esterilizacin? 7. Qu es un cultivo puro? 8. De las tcnicas que utilizo Cul empleara para aislar microorganismos de cavidad bucal?

IX. BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 83-86,263 2. Negroni Marta. Microbiologa estomatolgica fundamentos y gua prctica. Buenos Aires, Argentina: 1999: 488-492

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PRCTICA # 4 DETERMINACIN DEL NMERO DE BACTERIAS PRESENTES EN SALIVA I OBJETIVO Que el alumno conozca el nmero aproximado de bacterias viables presentes en la saliva humana, as como el tipo de flora de la cavidad bucal. II. CONOCIMIENTOS PREVIOS. 1.- Concepto de saliva 2.- Funciones de la saliva 3.- Tincin de Gram III. INTRODUCCIN El conocimiento de que existen microorganismos en la cavidad bucal, es de fundamental importancia para el cirujano dentista, al igual que conocer el tipo de flora que existe, ya que dependiendo del tipo de flora que se instala, esta puede ser considerada como factor de riesgo para patologas en la cavidad bucal. La presente prctica facilitar al alumno el aislamiento de microorganismos en saliva y le permitir a travs de la tcnica de Gram identificar de manera general, ssu clasificacin y morfologa IV. FUNDAMENTO TERICO La saliva como un fluido corporal tiene principalmente dos funciones: digestin y proteccin. 1. Digestin: Los alimentos slidos y semislidos son disueltos en la saliva como un prerrequisito para el comienzo de la digestin, amilasa, que es una enzima que hidroliza los almidones es el mayor componente proteico de la saliva. Las secreciones mucinosas y serosas que conforman la saliva se encargan de lubricar las estructuras orales con lo cual ayudan a la masticacin, deglucin y fonacin. 2. Actividad protectora: Los amortiguadores (Buffers) salivales evitan los cambios extremos del pH ocasionados por alimentos cidos o productos bacterianos. Tambin la saliva contiene enzimas antimicrobianas que pueden ocasionar gran impacto al desafo o ataque bacteriano externo, aunque a la flora microbiana normal de cavidad oral no la perjudique. Algunos componentes minerales de la saliva juegan papeles importantes en los mecanismos de proteccin de los dientes ante los ataques de cidos que provocan la desmineralizacin y remineralizacin del esmalte. Las secreciones mucionosas son muy importantes para la proteccin de las membranas mucosas evitando la deshidratacin.

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Aproximadamente 700-800 ml. De saliva son secretados y tragados por da, siendo la saliva un factor importante en la conservacin del agua para el organismo. Al mismo tiempo como la saliva pasa por todas las regiones de la cavidad bucal como son los carrillos, lengua, dientes, surco gingival, placa bacteriana, entre otros. Realiza un barrido parcial de la flora microbiana que se aloja en cada una de estas zonas, por lo que es muy fcil encontrar en un cultivo de saliva a microorganismo como: estreptococos, peptoestreptococos, veillonella, corynebacterium, neiserias, nocardia, fusobacterium, bacteroides, actinomyces, lactobacilos, espiroquetas, levaduras, protozoarios y otros. (Tablas 1 y 2). Al realizar un cultivo de saliva obtenemos un nmero aproximado de bacterias presentes en cavidad bucal, pero esto no quiere decir que al realizar el cultivo vamos a tener la certeza del tipo de microorganismos de la flora microbiana bucal. Tabla 1. Gneros y especies microbianas en la cavidad bucal ( Piovano SH y Marcantoni M 1997)
Bacilos Grampositivos Anaerobios y anaerobios facultativos Lactobacillus Propionibacterium L. acidophilus P. acnes L. brevis P. propionicum (A.propionica) L. casei L. cellobiosus Eubacterium . plantarum E.ingrens** L. fermentium E. brachy L. oris (NE) E. nodatum L. salivairus Filamentosos Actinomyces A. naeslundii A. viscosus A. odobntolyticus Bacterionema (B. Matruchiotii) Corynebaterium matruchotii Rothia R. dentocariosa 1) Micoplasma M. salivarium M. buccale M. faucium M. orale * Pigmentados ** Sacarolticos No sacarolticos Aerobios Otros microorganismos 2) Hongos 3) Bacilos 4) Pseudomonas entricos C. albicans C.torpicalis C. stellatoidea C. krusei #Anaerobios facultativos NE Nueva especie (denominacin anterior) E. timidum E. lentum E. alactolyticum E. saburreum** Bifidobacterium B. dentium B.eriksonii T. orale T.mucosum T. sokranskii T.macrodentium T. scoliodentium T. vincentii T. denticola T. oralis Cocobacilos Gram negativos Anaerobios facultativos y capnfilos Haemophilus H. paraprophilus H segnis H. aprophilus H. parainfluenzae Actinobacillus Actinobacilus actinomycetemcomitans (H. actinomycetemcomitans) Espiroquetas Gram negativas Microdermfilas o anaerobias Treponemas anaerobios

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Tabla 2. Gneros y especies microbianas en la cavidad bucal (Piovano SH y Marcantoni M 1997)

Cocos Gram positivos Aerobios, anaerobios facultativos Anaerobios microaeroflicos Streptococcus Enterococcus Peptostreptococcus S. salivarius E. faecalis P. anaerobius Grupo mutans P. micros S. mutans Stomacoccus P. prevotii S. cricetus S. mucilaginosus S. rattus Peptococcus S. sobrinus Staphylococcus P. niger Grupo mitis S. mitis S. aureus S. sanguis tipo S. epidermidis 2 S. mitior S. oralis Staphylococcus Gurpo milleri S. intermedius S. sacharolyticus S. anginosus S. constellatus Streptococcus MG Grupo sanguis S. sanguis tipo1 S. gordoniii S. parasanguis Cocos Gram negativos Aerobios, anaerobios facultativos microaerofilicos Neisseria N. sicca N. flavcescens N. subclavia Moraxella M. catarrhalis (B. catarrhalis)

Anaerobios Veillonella V. alcalescens V. parvula V. disspar V. atipica Acidaminococcus A. frementans

Bacilos Gram negativos Aerobios, anaerobios Anaerobios facultativos microaeroflicos Capnocytopphaga Prevotella Porphyromonas C. gingivalis P. veroralis P. gingivalis C. ochracea P. P. denticola zoogleoformans

C. sputigena

P. denticola* P. intermdia* P. loeschii * P. melaninogenica*

P. endodontalis P. asacharolyticao Selenomonas S. sputigena S. noxia (NE) S. artemidis (NE)

Eikenella E. corrodens

Campylobacter C.sputorum (V. sputorum) Kingella K.oralis

P. oralis P. oris P. nigrescens*

P. buccae P. buccalis Mitsoukella M. dentalis (NE) Campylobacter C. showae (NE) C. curvus (W. curva) S. concisus S. C. rectus (W. recta) Wollinella W. succinogenes

Fusobacterium F. nucleatum F. periodonticum Bacteroides B. forsythus (NE) B. gracilis B. urealyticus

Leptotrichia L. bucalis Centipeda

C. periodontii

* Pigmentados #Anaerobios facultativos No sacarolticos (denominacin anterior) Antes Bacteroides Aerobios ** Sacarolticos NE Nueva especie

Al realizar estudios de la flora microbiana bucal, nos vamos a encontrar con varios problemas, pues la flora microbiana presenta cambios progresivos hasta que madura y an as seguir cambiando a causa de la edad, cambios hormonales, problemas sistmicos, dieta, incluso la hora de la toma de la muestra de saliva nos va a variar el resultado o conteo microbiano en un mismo individuo, es por esto que da cifras exactas de nmero de bacterias en saliva no es conveniente, por eso se dan aproximaciones en cuanto a cantidad y tipo de microorganismos existentes en cavidad oral.

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Nolte, menciona que en 1 ml de saliva de un adulto podemos encontrar aproximadamente 6,000 millones (6 x 10 9)) de bacterias. Para el estudio de bacterias de cavidad bucal, se han utilizado principalmente dos tcnicas el frotis directo y el cultivo en placa. El frotis directo nos va a decir que tipo de bacterias estamos viendo al microscopio ms no el nmero de ellas. El cultivo en placa nos va a determinar el nmero de colonias o (CFU) unidades productoras de colonias que se encuentran en 1 ml. de saliva, aunque si recordamos lo que se refiere Nolte, es imposible cuantificar seis mil millones una caja de Petri, por lo que se hace necesario la utilizacin de diluciones decimales antes de la siembra. Antes de realizar la siembra debemos tomar en cuenta otros factores como son en que medio vamos a sembrar y por que tcnica. Referente al medio de cultivo debemos tener bien claro si queremos cuantificar el total de bacterias o si queremos solo un tipo de ellas; en este caso queremos conocer el total de bacterias por lo tanto, vamos a utilizar un medio de cultivo como el Agar Soya Tripticasa, que es un medio rico para el crecimiento de todas las bacterias. Respecto a la tcnica, vamos a utilizar el vaciado en placa, porque solo utilizaremos 1 ml. de saliva y esta tcnica favorece la diseminacin de las bacterias en todo el Agar. Recordamos que vamos a cuantificar no a aislar. V. MATERIAL 1 Tubo estril para colectar la saliva 6 Pipetas de 1 ml. estriles 3 Cajas de Petri estriles 1 Matraz con medio de Agar Soya Tripticasa 6 Tubos con 4.5 ml. de solucin salina estril 1 Equipo de tincin de Gram 1 Equipo de tincin de Ziehl Neelsen Hisopos estriles Portaobjetos Microscopio Mechero

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VI. METODOLOGA 1. Hacer un frotis de alguna de las zonas o regiones de la cavidad bucal (carrillo, lengua, etc.) con un hisopo estril, fijarlo al calor y teirlo de Gram. TCNICA DE GRAM 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Cubrir el frotis con Cristal Violeta .............60 seg. Lavar con agua Aplicar Lugol ............................................60 seg. Lavar con agua Decolorar con Alcohol-Acetona..............2 a 4 seg. Lavar con agua Cubrir con Safrina al 0.5% .......................30 seg. Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio, con aceite de inmersin.

PREPARACIN DE LAS DILUCIONES 1. Preparar seis diluciones decimales de saliva colectada en condiciones de esterilidad de la siguiente manera: Tubo 1 ...0.5ml. de saliva + 4.5ml. de sol. salina=1:10 (10-1) Tubo 2 ...0.5ml. de dilucin 1:10+4.5ml. sol. salina=1:100 (10-2) Tubo 3 ...0.5ml. de dilucin 1:100+4.5ml. sol. salina=1:1000 (10-3) Tubo 4 ...0.5ml. de dilucin 1:1000+4.5ml. sol. salina=1:10000 (10-4) Tubo 5 ...0.5ml. de dilucin 1:10000+4.5ml. sol salina=1:100000 (10-5) Tubo 6 ...0.5ml. de dilucin 1:100000+4.5ml.sol salina=1:000000 (10-6) 2. Pipetear 1.0 ml. de las tres ltimas diluciones (tubos 4, 5 y 6) en tres cajas de petri estriles previamente etiquetadas con los tubos correspondientes (caja 4 para tubo 4 etc.) 3. Adicione a cada caja 15 o 20 ml. de agar soya tripticasa previamente fundido y a temperatura de aproximadamente 37C., homogenizar el medio con la saliva y dejar solidificar. 4. Incubar a 37C por 24 Hrs. 5. Constar el nmero de colonias en las placas, en caso de ser demasiado el crecimiento en las cajas, dividir en cuatro y contar las de un cuadrante multiplicar el resultado por cuatro y as tenemos el resultado de toda la caja, despus multiplicar este resultado por la inversa de la dilucin correspondiente, y obtener de esta forma el nmero de bacterias por mililitro de saliva. VII. RESULTADOS 1. Reportar el tipo de microorganismos Gram + y Gram que predominan en la regin seleccionada de la cavidad bucal. 2. Reporta el nmero de bacterias por ml. de saliva o unidades formadoras de colonias por ml. de saliva.

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VIII. CUESTIONARIO 1. Qu importancia cree que tenga el hallazgo de un nmero de bacterias por mililitro de saliva superior al normal en un paciente? 2. Enliste las caractersticas ms importantes de la saliva. 3. Cul es el pH normal en saliva y que problemas sistmicos lo pueden variar? 4. Explique brevemente de que forma ayuda la saliva en las siguientes funciones: Fonacin, Deglucin y Masticacin. IX. BIBLIOGRAFA 1. Ross Holbrook, Microbiologa Bucal y Clnica, Editorial PLM Cientfica, Agosto 1989, Mxico. 2. George W. Burnett, Henry W. Scherp, Gerorge S. Schuster, Manual Moderno de Microbiologa y Enfermedades Infecciosas de la boca, Ediciones Ciencia y Tcnica S.A. Tomo 2 Mxico 1987. 3. Paller Morton, Marcel Dekker, Inc, Oral Hygiene Products and Practice, Capitulo 3, New York 1988. 4. W. Nolte, Microbiologa Odontolgica, Editorial Interamericana, 4ta Edicin Mxico 1985. 5. Negroni Marta. Microbiologa Estomatolgica, Fundamentos y Gua prctica, Editorial Mdica Panamericana 1ed. 3 reimpresin. Buenos Aires, Argentina. 2004.

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PRCTICA # 5 METABOLISMO MICROBIANO I. OBJETIVO Observar algunas reacciones fisiolgicas de las bacterias en medios de cultivo indicadores, para conocer caractersticas metablicas que sirven para identificarlos. II. INTRODUCCIN El conocimiento de la fisiologa bacteriana permite comprender el funcionamiento de los procesos bacterianos y sus reacciones, los cuales pueden tener repercusin en el organismo causando alteraciones a diversos tejidos, en esta prctica se conocern algunas reacciones metablicas de los microorganismos que sirven como base para su caracterizacin. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS -Conocer el uso de los medios de cultivo indicadores -Definir metabolismo y enzimas. IV. MARCO TERICO Las bacterias al igual que todos los seres vivos tienen requerimientos naturales y condiciones de crecimiento especifico, para ello requieren llevar acabo reacciones de asimilacin y desasimilacin conocidas como metabolismo. Las formaciones celulares de las bacterias quedan sujetas al medio donde se desarrollan ya que del mismo depende los nutrientes y las condiciones fsicas y /o qumicas pH, humedad presencia y ausencia de oxigeno y temperatura entre otros. La utilizacin de oxigeno o bixido de carbono por parte de las bacterias conocidas como oxidaciones biolgicas, permiten clasificarlas en dos grandes grupos a aquellas que utilizan el oxigeno como aceptor son conocidas como aerobias. Y los que sobreviven en presencia de bixido de carbono se llaman anaerobios. Cada una de las estructuras celulares juega un papel importante en el desarrollo bacteriano por ejemplo la membrana citoplasmtica es el sitio de colonizacin de algunas funciones tales como. 1) Transporte de sustancias dentro y fuera de la clula. 2) Actividad preoperatorio enzimtico 3) Asimilacin de la pared y otras estructuras celulares Los carbohidratos se utilizan para la sntesis de sustancias celular y la conversin a glicgeno como reserva alimenticia formando grnulos para la degradacin de carbohidratos la va que utilizan es la gluclisis y la va de Embden-Meyerhoff en la cual la glucosa se convierte en cido piruvico y es

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degradado a bixido de carbono y agua por el ciclo de Krebs obtenindose durante este proceso 38 molculas de ATP por molculas de glucosa. En condiciones anaerobias en glucosa ni se oxida completamente sino que se obtiene productos finales como cido lctico, actico, propinico y alcohol entreotros (fermentacin). Cuando se trata e protenas el proceso de degradacin es conocido como proteolisis las enzimas proteolticas son muy importantes factores de invasividad ya que la composicin de los tejidos y las sustancias intercelulares es principalmente proteica como en el caso de la colgena que rodea la raz de los rganos dentarios y un microorganismo proteoltico que produzca la encima colagenasa puede dar como resultado movilidad, perdida de los dientes. El medio SIM adems de permitir la identificacin de movilidad sirve como medidor bacteriano de la degradacin de protenas ya que contiene aminocidos azufrados como metionina y cistena. Los cuales son convertidos por algunas bacterias a cido sulfhdrico, el cual reacciona con una solucin de fierro que contiene el medio y el producto formado, es un sulfuro de fierro que se observa como un precipitado de color negro. El tripsteno que es otro aminocido que contiene el medio, es degradado por estas bacterias a Indol (azcar) el cual se demuestra por la formacin de un color rojo sobre el medio cuando se agrega el reactivo de Kovacks o el reactivo de Erlich. Para demostrar la respiracin y/o fermentacin se utiliza en medio de HughLeifson al que se le agrega manitol (carbohdrato) como sustrato para demostrar la reaccin. A una de estos medios se le coloca un sello de nujol para impedir el paso del oxgeno demostrado con esto se existe degradacin del carbohidrato en cualquiera de los dos conducen a travs del consumo de color del medio oxida completamente sino que se obtienen productos finales como cido lctico, actico, propionico y alcohol entre otros la fisiologa de los microorganismos no solo se limita a procesos de nutricin y crecimiento, tambin ayuda a los mismos a adaptase a condiciones ambientales adversas, como ejemplo en esta prctica se demuestra la produccin de una enzima llamada catalaza que descompone el peroxido de hidrgeno (H2 O2)en *oxigeno y agua . Otras pruebas que se utilizan para la demostracin del metabolismo bacteriano en esta prctica, incluyen la utilizacin del citrato como fuente de carbono en el medio citrato de Simmons, fermentacin y degradacin de protenas y carbohidrato en leche tornasol y degradacin de urea en el medio caldo urea.

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V. MATERIAL POR EQUIPO Cepas: Eschericia coli Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus mutans Salmonella typhi 1 Caja con agar nutritivo 2 Tubos con caldo glucosa y rojo de fenol 2 Tubos con caldo sacarosa y rojo de fenol 2 Tubos con medio SIM 2 Tubos con leche tornasol 2 Tubos con medio citrato 1 Tubo con medio de Hugh- Leifson, ms Manitol con sello de nujol 1 Tubo con medio de Hugh- Leifson ms Manitol, sin sello de nujol 2 Tubos con agar urea de Christensen 1 mechero Asa y porta-asa Peroxido de hidrgeno (agua oxigenada) al 3% Reactivo de Kovacs VI. METODOLOGA 1. UTILIZACION DE L CITRATO COMO FUENTE DE CARBONO: a. Sembrar por estras simple en un tubo con medio inclinado de citrato (desde el fondo del tubo) con Escherichia coli. b. Sembrar de la misma manera en otro tubo con medio citrato con Salmonella typhi c. Incubar durante 24 horas a 37C. d. Observar si hubo cambio o no del medio. - El medio es de color verde - Si cambio de verde a azul, es positivo ( hay utilizacin del citrato). - Si no hay cambio es Negativo. 2. DEGRADACIN DE LECHE TORNASOL: a. Sembrar dos tubos con leche tornasol mediante agitacin del asa, uno con Bacillus subtilis y el otro con Streptococcus mutans. b. Incubar a 37C durante 24 horas. c. Observar Resultados: El color medio es morado: - Si el color cambia a rosa, es una acidificacin. - Si el color cambia a azul, es una alcalinizacin. - Si el medio es incoloro (blanco), es una deduccin del indicador. - Formacin de cogulo, es coagulacin. - Retraccin del coagul, es peptonizacin.

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- Puede observarse produccin de gas, que se manifiesta por la formacin de burbujas debido a la fermentacin de la lactosa en cido y gas. 3. DETECCIN DE ACIDO SULFHIDRICO, INDOL Y MOVILIDAD: a. Sembrar por picadura con el asa recta en dos tubos con medio SIM, en uno Salmonella typhi y en el otro Escherichia coli. b. Incubar por24 horas a 37C c. Observar: Resultados: - Si hay movilidad, que se detecta por el crecimiento fuera de la estra. - Si hay formacin de cido sulfhdrico, que se detecta por un precipitado negro (sulfuro de fierro). - Si hay produccin de indol, el cual es detectado mediante la adicin de dos gotas de reactivo de Kovacs y observar la aparicin del color rojo en la superficie. 4. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: a. Incubar un tubo con sacarosa y otro con glucosa por agitacin con Escherichia coli. b. Inocular un tubo con sacarosa y otro con glucosa por agitacin con Streptococcus mutans. c. Incubar durante 24 horas a 37C d. Observar: Resultados: El color del medio es rosa fuerte o rojo, sin inocular. Si le medio vira de color rojo a amarillo, es porque el ph del medio bajo debido a la producci de acido. (Positivo). Si el medio permanece de color rojo(Negativo)

5. OXIDACIN O FERMENTACIN DE LA GLUCOSA: a. Inocular un tubo con medio de Hugh-Leifson, ms Manitol sin sello de nujol, por picadura con el asa recta con Staphylococcus epidermidis b. Inocular un tubo con medio de Hugh- Leifson, ms Manitol con sello de nujol, por picadura, Straphylococcus aureus. c. Incubacin durante 48 horas a 37C d. Observar: Resultados: El medio sin inocular es de color verde Tubos sin sello Amarillo Amarillo Azul o verde Tubos con sello Verde Amarillo Verde Resultados Oxidacin Fermentacin Ninguna accin sobre el carbohidrato

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NOTA: Este medio tambin puede emplearse para detectar la produccin de gas y la movilidad. 6.- PRODUCCIN DE UREASA: a. Sembrar por estra simple en un tubo con agar urea con Klebsiella pneumoniae. Repetir el mismo procedimiento con Staphylococcus aureus b. Incubar durante 24-48 horas a 37C Resultados: Reaccin positiva: color rosa intenso Reaccin negativa: color ante o amarillo plido (no se produce cambio de color. 7.- ACTIVIDAD DE LA CATALASA: c. Sembrar por estra simple y abierta en una caja con agar nutritivo dividida en dos partes: en un lado sembrar Staphylococcus aureus otro Streptococcus mutans. d. Incubar durante 24 horas a 37C. e. Adicionar 1 gota de perxido de hidrgeno sobre cada una de las capas y detectar la presencia de la catalasa que se manifiesta por la formacin de burbujas ( desprendimiento de oxgeno): 4H2O2 4H2O +2O2 VII. RESULTADOS Anotar los resultados de acuerdo a las anotaciones que se encuentran indicadas en cada uno de los puntos de la metodologa. VIII. CUESTIONARIO 1. Diga qu entiende por metabolismo y cul es la importancia del metabolismo microbiano en las enfermedades bucales. 2. Qu es una enzima y cul es su funcin? 3. Qu tipo de enzima es la catalasa y cmo se demuestra su presencia. 4. Cul prueba principal se realiz en laboratorio para distinguir 2 gneros de bacterias importantes de cavidad bucal?. IX. BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 61-76 2. Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica. 16 ed. Mxico D.F. Editorial Manual Moderno. 1994: 79-104 3. Bernal D. Davis, Herman N. Eisen, Herman N. Eisen Harold S. Ginsberg. Tratado de Microbiologa. 4 ed. Madrid Espaa. Editorial Masson. 1996: 74-59 4. Marta Negroni. Microbiologa Estomatolgica Fundamentos y Gua prctica. 1 ed. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana. 1999: 3341

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PRCTICA # 6 FORMACIN DE PLACA MICROBIANA DE CAVIDAD BUCAL IN VITRO I. OBJETIVO Conocer la capacidad de algunos microorganismos de cavidad oral, para adherirse a superficies slidas en y ausencia de carbohidratos, identificando por medio de la tincin de Gram a los que componen la placa microbiana. II. INTRODUCCIN La caries dental y la enfermedad periodontal comparten un origen comn conocido como placa bacteriana, de aqu que el conocimiento y la comprensin de los mecanismos involucrados en la formacin de sta son importantes para el odontlogo, ya que le permiten implementar medidas preventivas y de control. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS 1.- Definir la placa bacteriana. 2.- Explicar el mecanismo de formacin de placa bacteriana. 3.- Definir caries y enfermedad periodontal. IV. MARCO TERICO La cavidad bucal proporciona diferentes sitios para la colocacin y crecimiento microbiano entre los que se encuentran saliva, labios, mejillas, paladar, lengua, enca y dientes. Las caractersticas anatmicas y la composicin bioqumica de los dientes pueden favorecer la instalacin proliferacin de microorganismos (principalmente bacterias) para dar origen la placa Bacteriana Bucal. El inicio en la formacin de placa dental es la formacin de pelcula adquirida que se da gracias a glucoprotenas principalmente derivadas de la salival, que se depositan sobre la superficie de los dientes a partir de las cargas elctricas de ambos. Figura 1 Glucoprotenas salivales +++++++++++++++

-------------- - - - Esmalte - - - dental

Figura 1. Muestra la afinidad de las cargas de las glucoprotenas salivales y su afinidad por el esmalte dental

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Sobre la superficie del esmalte, comienza a depositarse una pelcula delgada amorfa que oscila entre 0.1 y 1.0 micras de espesor. Los mecanismos que intervienen en la formacin de la pelcula sobre el esmalte incluyen fuerzas electrostticas, tipo Van der Walls e hidrfobas. Es por ello, que en la superficie de la hidroxiapatita que posee grupos fosfato con carga negativa, interacta con protenas y glucoprotenas salivales y del fluido crevicular con carga positiva. La pelcula formada adquiere funciones protectoras al proporcionar lubricacin a las superficies e impidiendo la prdida de humedad del tejido. Adems, posee molculas que funcionan como sitos de unin para la adherencia de microorganismos y enzimas de origen salival,. Las glucoprotenas que se encuentran en la pelcula adquirida derivan de la saliva y entre ellas se encuentran la amilasa, histatinas, estaterinas, lisozima, anticuerpos (principalmente Ig A), entre otras. Una vez que se forma la pelcula adquirida, es colonizada por microorganismos que residen en la cavidad bucal. Las bacterias se adhieren a las glucoprotenas de la pelcula en forma casi inmediata. Algunos mecanismos por los cuales las bacterias se unen a las superficies dentales es mediante receptores especficos de la pelcula mediante molculas bacterianas especficas llamadas adhesinas lo que facilita su adherencia y proliferacin. Las principales adhesinas son: a) la capa mucosa,b) la cpsula c) las glucosiltransferasas (GTF), d) protenas que fijan glucanos, e) protenas o glucoprotenas que se fijan a la pelcula que recubre materiales como prtesis o los dientes, g) los cidos teicoicos, en forma especial los lipoteicoicos de las paredes celulares bacterianas h) los polisacridos del antgeno O e i) las fimbrias . Estos elementos bacterianos van unidos al cuerpo de la clula, pero otras veces se separan y excretan del mismo (p.e. capa mucosa o glucosiltransferasas) o estn incluidos en las vesculas superficiales (que tambin pueden desprenderse de las bacterias) que forman las bacterias Gram negativas o a expensas de su membrana externa. Figura 2

Sustancia bacterian a Receptor especfic o

Esmalte dental Figura 2. Muestra las sustancias bacterianas y los receptores especficos para ellas Los receptores son compuestos del hospedero que interactan con las adhesinas, y pueden ser: a) elementos celulares (p.e. glicocalix, protenas y glucoprotenas de la membrana citoplasmtica, b) sustancias existentes en el origen del medio celular (p.e. fibronectina o mucina) y c) superficies lisas a travs de la pelcula adquirida que las recubre.

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Algunos autores mencionan que otro factor que permite la unin de los microorganismos o las superficies dentales es la formacin de puentes de calcio con carga positiva, que permiten la unin de componentes bacterianos con carga negativa a la superficie dental que tambin posee carga negativa. Figura 3

------------------------Ca
++

Ca

++

Ca

++

Ca

++

Ca

++

Ca

++

____________________ __ -------------Esmalte dental Figura 3. Muestra la unin de las bacterias a la pelcula adquirida mediante puentes de calcio. Otros factores que se consideran involucrados en este proceso son los polisacridos extracelulares que se unen a la pelcula adquirida, algunos de ellos son, dextranas derivadas de la glucosa, levanos derivados de la fructosa y mutanos derivados de la glucosa. Estos son producidos por bacterias tales como estreptococos y algunos actinomicetos. Sin duda alguna el azcar de la dieta ms importante desde el punto de vista metablico par las bacterias es la sacarosa que es un disacrido formado por glucosa y fructuosa el cual es utilizado por los microorganismos para producir los polisacaridos adherentes y cidos involucrados con un proceso de acumulacin de placa y la produccin de caries dental y enfermedad periodontal La colonizacin microbiana especfica comprende diferentes momentos que incluyen la adherencia, agregacin, coagregacin ( fenmeno que consiste en la adherencia de una nueva capa de microorganismos sobre los ya instalados. Estas interacciones suceden especficamente a travs de protenas especficas de tipo lectinas y menos especficas resultantes de las fuerzas hidrofobas, electrostticas y de Van der Walls), crecimiento y reproduccin de los microorganismos que se adhieren a la pelcula adquirida.

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V. MATERIAL POR EQUIPO 1 Caja con agar sacarosa 1 Tubo de 16 x 150 con tapn de hule con 15 mls. De medio base rojo fenol adicionados de sacarosa al 5%. 1 Tubo de 16x150 con tapn de hule con15mls. De medio base rojo fenol. 1 Paquete con 4 hisopos estriles. 1ml. De saliva. Equipo de Gram. Microscopio Porta objetos Mechero Asa y porta-asa 1 Tubo de 16X150 con tapn de hule con 15mls. de medio base rojo fenol. 1 Tubo de 16x 150 con tapn de hule con 15mls. de medio base rojo fenol. VI. METODOLOGA 5. Preparar los tubos como se muestra a continuacin: Tubo No.1 Tubo No. 2 Medio sin azcar (Por Grupo) (Por equipo) Testigo *+Microorganismos de placa +0.5ml de saliva

de de

de de

Medio de sacarosa

Testigo *+Microorganismos de placa +0.5ml de saliva.

La obtencin de microorganismos de placa microbiana , se realiza raspando con un hisopo estril en el sitio de acumulacin de placa en una persona que no se haya efectuado limpieza dental. La saliva se colecta directamente en el tubo de medio, cerca del mechero; con una aplicacin es suficiente. NOTA: Se utiliza un hisopo para cada tubo y los testigos, son por grupo 2. Incubar los tubulos a 37C y hacer observaciones diariamente durante 7 das. NOTA: Los tubos nunca debern ser agitados, de lo contrario no se observar formacin de placa.

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3. Este material ser utilizado para la practica siguiente de Aislamiento de microorganismos de placa microbiana bucal. 4. Con el tercer hisopo estril, hacer un raspado de placa bacteriana y realizar un frotis en un portaobjetos limpio y desengrasado. Fijarlo al calor y teir mediante la tcnica de Gram. 5. Con un cuarto hisopo, realizar un raspado de placa bacteriana y sembrar en la caja con Agar Sacarosa por estra cruzada. 6. Incubar a 37C durante 7 das con lectura diaria. VII. RESULTADOS 1. Reportar si hubo formacin de placa alrededor del tornillo y comparar el crecimiento bacteriano y la producen de cido en todos los tubos. 2. Describir e ilustrar la observacin del frotis directo de la placa bacteriana en 40x y 100x. 3. Describa la morfologa colonial del crecimiento en agar sacarosa. VIII. CUESTIONARIO 1. Mencione cules son los microorganismos cariognicos y cuales los relacionados con la enfermedad periodontal. 2. Mencione a qu se debe el cambio de color del medio en los tubulos sembrados y la produccin de burbujas. 3. Explique qu es y a que se debe la formacin de una pelcula blanca alrededor del alambre en su experimento. Si no se forma explique sus causas. 4. Qu es el trtaro dentario? IX BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 541-559 2. Marta Negroni. Microbiologa Estomatolgica Fundamentos y Gua prctica. 1 ed. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana. 1999: 89217 3. Mouton Christian, Robert Jean-Claude, Bacteriologa Bucodental. Barcelona. Editorial Masson S.A. P.p19-46

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PRCTICA # 7 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE PLACA MICROBIANA DE CAVIDAD BUCAL I . OBJETIVO Identificar a los microorganismos presentes en la placa bacteriana por medio de medios de cultivo especficos, destacando la morfologa colonial y microscpica de cada uno de ellos. II. INTRODUCCIN El ecosistema bucal esta sujeto a constantes cambios a la dieta, fluido salival, erupcin de los dientes, higiene, ingesta de medicamentos, etc. As la placa bacteriana bucal que se encuentra en la profundidad de la placa dental. Sufre cambios en el metabolismo debido a su ubicacin. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS - Define microorganismos aerobios y anaerobios - Define aerosistema IV. MARCO TERICO La placa dental fue descrita por primera vez en 1898 por Black, como una masa microbiana que recubra las lesiones cariosas. En 1976, Bowen define a la placa dental como depsitos blandos que forman una biopelcula que se adhiere a la superficie dentaria o a otras superficies duras de la boca. En el ao 2000, Marsh y Martn, definen a la placa dental como una comunidad microbiana compleja que se encuentra en la superficie de los dientes, embebida en una matriz de origen microbiano y salival. La placa dental se clasifica segn su localizacin en supragingival y subgingival, segn sus propiedades en adherente y no adherente, y por su potencial patognico en cariognica y peridontopatognica. La placa supragingival est constituida principalmente por microorganismos Gram positivos capaces de producir azcares relacionados con la caries dental; esta placa se puede extender hacia el surco gingival y entrar en contacto con la enca denominndose placa marginal. La placa que se encuentra en el interior del surco gingival es la que recibe el nombre de placa subgingival y est constituida principalmente, por microorganismos de tipo anaerobio proteolticos Gram negativos periodontopatognicos. La placa dental es un medio donde se realiza intensa actividad metablica por parte de los microorganismos que en ella se encuentran dando por resultado alteraciones en los tejidos duros y blandos de la cavidad bucal donde se localiza. Segn Marsh, Streptococcus sanguis es el primer microorganismos en colonizar la pelcula adquirida y posteriormente se une a Actinomyces

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viscosus lo cual para algunos autores es prerrequisito para la posterior colonizacin de especies como Veillonella y Fusobacterium. Otras bacterias involucradas en el proceso de colonizacin son estreptococos del grupo oralis ( S.oralis y S.mitis) , Actinomyses sp. Neisserias sp, y Haemophilus sp. Se han descrito coagregaciones entre S. sanguis con A. Viscocus y entre Capnocytophaga ochracea con A. Viscosus. Tambin entre especies Gram positivas con Gram negativas como Streptococcus sp. o Actinomyces sp. con Prevotella sp. y Prphyromonas sp, Capnocytophaga sp, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Veillonella sp, y entre especies Gram negativas como Prevotella melaninogenica con F. Nucleatum. En las ltimas fases de formacin de la placa, es probable que predomine la coagregacin entre especies Gram negativas anaerobias como F. Nulceatum con Prevoltella gingivalis, este fenmeno provee las condiciones para la interaccin patognica caracterstica de las infecciones periodontales. La matriz intercelular de la placa dental madura, est formada por productos microbianos, clulas (epiteliales y leucocitos), materiales orgnicos (polisacridos, protenas y glucoprotenas) e inorgnicos (calcio y fsforo) derivados de la saliva y el fluido gingival (crevicular). Esta matriz intercelular es el medio donde se producen las interacciones metablicas entre las diferentes especies microbianas). Durante la fase de colonizacin primaria de los microorganismos existe multiplicacin activa, posteriormente, existe una disminucin en la velocidad de crecimiento de algunos de ellos y se incorporan otros que son transportados por los mismos mecanismos que utilizaban los primeros que llegaban a la pelcula adquirida. No obstante, aunque se siguen dando los procesos adhesivos, lo ms caracterstico de esta etapa, son los fenmenos de agregacin y en especial de coagregacin, siendo estos ltimos los que incluyen uniones heterotpicas entre especies pertenecientes a gneros diferentes entre las que destacan las de tipo lectina-carbohidrato. De esta forma, la estructura de la placa cambia sensiblemente, hay un incremento de formas bacilares y aparecen las tpicas imgenes de forma de mazorca de maz (coagregacin de cocos sobre bacilos) y mixtas. La sntesis de polisacridos extracelulares especialmente mutanos, por estreptococos del grupo mutans, contribuyen de manera importante a la integridad de la placa, estos polisacridos extracelulares junto con dextranas y levanas de estos y otros estreptococos, siguen originando microcolonias que cada vez se harn ms confluentes. Es importante mencionar que despus de pasado cierto tiempo los estreptococos a partir de la glucosiltransferasas habrn tenido la oportunidad de producir mayor cantidad de polisacridos adherentes por lo que los lactobacilos disponen ya de mallas ms complejas para quedar retenidos.

V. MATERIAL POR EQUIPO

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1 Tubo de 16 x 15 con 15 ml. de medio base rojo de fenol ms sacarosa al 5% ms placa microbiana y saliva. 1 Caja con agar sangre 1 Caja con agar Staphylococcus- 110 1 Caja con agar Rogosa 1 Caja con Agar Streptococcus- mitis- salivarius (SMS) 1 Equipo de Gram 1 Mechero 1 Microscopio Porta objetos Asa y porta- asa. VI. METODOLOGA 1. Sin agitar, sacar el tornillo (donde hubo formacin de placa microbiana) del tubo con medio de sacarosa 5% + placa bacteriana + saliva y sembrar por estra cruzada, para el aislamiento de microorganismos en los siguientes medios de cultivo: a. Agar sangre (medio enriquecido) b. Agar Staphylococcus-110 (medio selectivopara Staphylococcus) c. Agar Rogosa (medio selectivo para Lactobacillus). d. Agar Streptococcus-mitis salivarius (SMS). (medio selectivo para Streptococcus).

Mtodo de estra cruzada: a. Con el tornillo, sembrar en el primer cuadrante del medio de agar, procurando de hacer estras juntas y de no picar el medio . Hacer esto en los 4 medios de cultivo. b. Una vez sembrado, el primer cuadrante de todos los medios, con el asa estril al valor, sembrara el segundo cuadrante ; volver a esterilizar el asa y sembrar el tercer cuadrante realizando pocas estras y separadas y esterilizar por ltimo el asa hacer esto en todo los medios de cultivo ESQUEMA:

6. Incubar a 37C durante 24 horas.

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7. Realizar un frotis de la placa microbiana formada en el alambre, en un porta objeto limpio y desangrado, fijar al calor y teir mediante la tcnica Gram. Observar al microscopio con los objetivos 40x y 100x. VII. RESULTADOS 1. Reportar si hay crecimiento en los 4 medios de cultivo . 2. Si hubo crecimiento, registrar en una tabla la descripcin de la morfologa colonial en cada uno de los medios, adems del tipo de hemlisis en medio de agar sangre. 3. Describir e ilustrar la observacin del frotis de placa bacteriana en el objetivo 100x. VIII. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Qu papel juegan los microorganismos anaerobios en la placa dental? Qu papel se atribuye a Veillonella, dentro de la placa microbiana? Por qu se considera necesario evitar el desarrollo de la placa? Si en alguno de los medios de cultivo, no hubo crecimiento, explique porque

IX. BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 541-559 2. Marta Negroni. Microbiologa Estomatolgica Fundamentos y Gua prctica. 1 ed. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana. 1999: 89217 3. Mouton Christian, Robert Jean-Claude, Bacteriologa Bucodental. 4. Barcelona. Editorial Masson S.A. P.p19-46

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PRCTICA # 8 IDENTIFICACIN DE ALGUNOS FACTORES DE RIESGO PARA CARIES DENTAL I OBJETIVO Al trmino de esta prctica el alumno comprender la multifactorialidad del proceso de caries y estar en posibilidad de identificar a pacientes con riesgo para padecerla en el futuro mediato a travs de la realizacin de un Cariograma. II. INTRODUCCIN La caries dental es sin duda alguna un padecimiento generalizado en la poblacin, por ello es importante que el cirujano dentista identifique factores de riesgo relacionados con la misma durante su ejercicio profesional, para su prevencin. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 3. 4. 5. Placa bacteriana (origen y formacin). bacterias relacionadas con el proceso de caries dental. factores relacionados con el proceso de caries. ndices CPO e IHOS. medidas preventivas para caries dental.

IV. FUNDAMENTO TERICO La caries dental es un proceso infeccioso de etiologa microbiana, ampliamente diseminado en la poblacin, que por sus caractersticas de evolucin, se considera una de las principales enfermedades que son la causa de la prdida de los rganos dentarios. De aqu el inters de los profesionales de la salud bucal en prevenirla y prueba de ello, son todas las acciones que hasta la fecha se promueven de forma general a la poblacin en diferentes servicios de salud y las campaas nacionales de salud bucal organizadas por la Secretara de Salud. Los factores que estn relacionados con este proceso son muchos como: genticos, presencia de microorganismos cariognicos, dieta anatoma, posicin y composicin dental, caracterstica y composicin de la saliva y hbitos higinicos, entre otros. El Dr. Brathall y colaboradores en la Facultad de Odontologa de la Universidad de Malm en Suiza, disearon un mtodo para predecir el futuro mediato (del momento en que se realiza hasta un ao aproximadamente) del estado de caries en un individuo, basado en diferentes factores considerados de riesgo relacionados entre s, al que le dieron el nombre de Cariograma, el cual incluye diferentes variables incluidas en un crculo:

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1 Oportunidad 1 . O P O R T U N 5 4 2 3 1 2 Dieta 3 Bacterias 4 Susceptibilidad 5 Circunstancia

1.-OPORTUNIDAD: la posibilidad de evitar la aparicin de nuevas lesiones de caries 2.- DIETA: La ingestin de alimentos as como su contenido 3.- BACTERIAS. La cantidad de placa acumulada y el tipo de bacterias. 4.- SUSCEPTIBILIDAD: se refiere a la resistencia del diente (fluoruros) y las caractersticas de la saliva. 5.- CIRCUNSTANCIAS: la experiencia pasada de caries (CPO), la presencia de enfermedades sistmicas y sus condiciones. Los puntos ms importantes a considerar cuando se utiliza el Cariograma para evaluar el riesgo son: La posibilidad de evitar la aparicin de nuevas lesiones cariosas debe ser entre 0 y 100% (no puede ser negativa o mayor al 100%) Las circunstancias son importantes sumadas a la dieta, bacterias y susceptibilidad. La prediccin basada en los puntos anteriores es posible ajustarla al ojo clnico. DIETA. En cuanto a la dieta los puntos ms importantes a considerar para calcular o medir el porcentaje son: La frecuencia de los alimentos. En 1940, Stephan hizo un estudio donde demuestra que despus de la ingestin de los alimentos, (sobre todo aquellos que contienen azcares) existe una disminucin temporal del pH salival, lo cual condiciona el ataque o bombardeo de cido salival que puede desmineralizar los rganos dentarios. La concentracin de sacarosa en los alimentos. La sacarosa es considerada por muchos autores como el azcar asesino, ya que est compuesta por glucosa y fructuosa, que son el sustrato adecuado para que los

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microorganismos produzcan cidos que promueven la desmineralizacin de los rganos dentarios. SUSCEPTIBILIDAD. Para medir la susceptibilidad, se deben considerar aspectos mensurables (medibles) de los dientes y la saliva como: Si existen en los dientes anatoma y/o posicin adecuadas, integridad del esmalte, presencia de aditamentos o restauraciones adecuadas o inadecuadas, entre otros. En cuanto a la saliva: si la secrecin es adecuada en cantidad (1,500ml por da aprox.), si posee o no mecanismos de defensa como capacidad amortiguadora o presencia de enzimas antimicrobianas, entre otros. CIRCUNSTANCIAS. Aqu, se consideran la experiencia pasada de caries (ncideCPO), la presencia de enfermedades sistmicas que pueden estar relacionadas por s mismas (como la diabetes) o por su tratamiento (como la hipertensin) con el riesgo de padecer caries. Por ejemplo en el caso de la diabetes, existe una descompensacin del balance hdrico, lo que hace que la cantidad de saliva que normalmente se secreta por da, se disminuya, situacin que favorece la instalacin y metabolismo de microorganismos en las superficies dentales para la produccin de caries; en el caso del tratamiento de pacientes que padecen hipertensin arterial, requieren de la toma peridica de antihipertensivos y se ha comprobado que algunos de ellos, producen resequedad bucal, lo que al igual que en el caso anterior, favorece la instalacin y el metabolismo microbiano en las superficies dentales con la subsecuente desmineralizacin de los mismos. BACTERIAS. El porcentaje de este rubro se marca con base en la cantidad de placa acumulada en las superficies dentales (IHOS) y el tipo de bacterias presentes en la saliva (recuento de estreptococos mutans y lactobacilos o recuento total de bacterias en saliva). En esta prctica con relacin al nmero de bacterias, se llevar a cabo el recuento de estreptococos mutans en saliva por la tcnica de Matsukubo y col. Modificada (descrita en la metodologa), para considerarlo en el espacio correspondiente a bacterias, con una asignacin de porcentaje. De 0 a 100% con base en el resultado obtenido en los tubos correspondientes. Esta tcnica ha recibido gran aceptacin, y a nivel comercial, ya existen pruebas para hacer el recuento no solo de estreptococos sino tambin de lactobacilos en saliva, que se pueden llevar a cabo en el consultorio dental, lo que facilita al profesional, llevar a cabo esta prueba como un medio predictivo con relacin al proceso de caries en un individuo y aplicar o prescribir medidas preventivas, que permitan el control de este padecimiento, modificando en la medida de lo posible los factores relacionados con el mismo. En esta prctica se realizar un ensayo de cariograma, para determinar con base en las variables antes mencionadas, el riesgo para la aparicin de nuevas lesiones de caries en un futuro mediato (un ao aproximadamente). Mientras ms pequeos sean cada uno de los espacios correspondientes a

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cada una de las variables exceptuando la oportunidad, menor ser la probabilidad de que existan nuevas lesiones de caries, as por ejemplo:

5 2

1 OPORTUNIDAD DE NO PADECER CARIES 2 DIETA 5 CIRCUNSTANCIAS BAJO RIESGO DE CARIES MENOS DE 60% DE OPORTUNIDAD DE EVITAR LA APARICIN DE NUEVAS LESIONES. IZQUIERDA: Todos los factores estn reducidos, resultando en un riesgo para caries reducido. EN MEDIO. La dieta es poco favorable, pero los otros factores la compensan. DERECHA. Las circunstancias en general, son las poco favorables, ya que por ejemplo, existe un CPO muy elevado (gran experiencia pasada de caries), pero el resultado en los otros factores, ha permitido que la situacin se encuentre bajo control. Con base en el ejemplo anterior, podemos darnos cuenta de que los factores involucrados en el cariograma, pueden ser tan diferentes, que puede existir gran cantidad de combinaciones, que den lugar al mismo nmero de predicciones. V. MATERIAL POR EQUIPO 1 Explorador 1 Espejo dental 1 Punta de pipeta Ependorff limpia 1 Tubo con caldo mitis salivarius con bacitracina y telurito de potasio 1 Mechero 1 Tubo de kahn limpio

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VI. METODOLOGA 1. Una persona del equipo (de preferencia la misma a la que se le tom la muestra de placa microbiana), colocar una muestra de saliva pequea en el tubo de Kahn. 2. Tomar de la muestra de saliva, 100 microlitros y sembrarlos en el tubo de caldo mitis salivarius. 3. Incubar a 37C durante 24 horas con una inclinacin de 60 aproximadamente. 4. Despus de 24 horas, colocar el contenido del tubo escurrindolo bien y de una sola intencin en un recipiente esterilizable. 5. Frente a una fuente de luz adecuada, se procede a contar el nmero de colonias en las paredes del tubo, reportando los resultados de la siguiente manera: a. Si no aparecen colonias en las paredes del tubo........0= corresponde a no infectado ( no existe S. mutans identificable el la saliva) PORCENTAJE PARA EL CARIOGRAMA = 0 b. Si el nmero de colonias es menor de 10 .......+ = baja infeccin( menos de 30,000 clulas de S. mutans en saliva PORCENTAJE PARA EL CARIOGRAMA = 25 c. Si el nmero de colonias es mayor a 10 pero menor de 100.....++= moderada infeccin ( entre 30,000 y 100,000 clulas de S. mutans en saliva) PORCENTAJE PARA EL CARIOGRAMA = 50 d. Si el nmero de colonias es mayor de 100 pero menor de 300..... +++= alta infeccin ( ms de 100,000 clulas de S. mutans en saliva, pero menos de 1, 000 000) PORCENTAJE PARA EL CARIOGRAMA = 75 e. Si el nmero de colonias es mayor de 350 dndole al tubo la apariencia de un cristal nevado..... ++++ = ms de 1,000 000 de clulas de S. mutans en saliva). PORCENTAJE PARA EL CARIOGRAMA = 100 6. Levantar el IHOS a la persona que don la muestra de saliva. 7. Levantar el ndice CPO a la persona que don la muestra de saliva. 8. Interrogar al donador acerca del padecimiento de enfermedades sistmicas y si actualmente se encuentra bajo tratamiento y en caso de ser afirmativo cual es el medicamento que est tomando y en que dosis. VII. RESULTADOS Reportar los datos obtenidos y hacer una aproximacin del cariograma con los mismos. VIII. CUESTIONARIO 1. Mencione por lo menos dos factores de riesgo para caries no considerados en este documento. 2. Diga a qu se debe que los estreptococos se adhieran a las paredes del tubo.

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3. En el caso de que la prueba se hubiera realizado en un nio de 10 aos de edad, cuya denticin mixta se encuentra presente y el resultado del cariograma fuera de alto riesgo para caries, cul sera su actitud profesional con el paciente?

IX BIBLIOGRAFA 1. Anders Thylstrup, Fejerskov Ole. Caries. Edit. Ediciones Doyma Barcelona, 1988 2. Silverstone. Caries Dental etiologa patologa y prevencin. Mxico. Edit. El Manual Moderno 1985. 3. Macfarlane T. Wallace, Samaranayake Lakshman P. Oral Microbiology. London Edit. Butterworth & Co. Publishers. 1989 4. Matsukubo T. et al. A semicuantitative Determination of Streptococcus mutans using the Adherent Ability in a Selective Mdium Caries. Caries Res. 1981 15, p.p 40-45. 5. Rodrguez Mir M.J. et al. Streptococcus mutans. Su relacin con la Actividad Cariognica. Rev. Cubana Estomatolgica. 1989. 26 jul-sept. P.p 191-206. 6. http://www.db.od.mah.se/car/data/riskprincip.html

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PRCTICA # 9 DETERMINACIN DE LA ACCIN BACTERIOSTATICA Y BACTERICIDA DE ALGUNOS AGENTES DESINFECTANTES I. OBJETIVO: Que el alumno conozca la accin que estos agentes tienen sobre el crecimiento bacteriano, para que pueda en el futuro escoger el tipo de agentes adecuados para ciertos propsitos desinfectantes en su practica profesional. II. INTRODUCCION: La presente prctica tiene como propsito que el alumno conozca la actividad antimicrobiana de algunos agentes qumicos de uso comn para su aplicacin en la actividad prctica profesional. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS Definicin de desinfectante Conceptos de bactericida y bacteriosttico IV. FUNDAMENTO TERICO El uso de agentes qumicos como medio de prevenir infecciones se introdujo por primera vez en el campo de la medicina. En 1847, Semmlweis not la muy alta frecuencia de muerte por fiebre puerperal en la clnicas y crey que los mdicos y practicantes eran los responsables por contaminar a los pacientes, lo cual disminuyo bastante la mortalidad al introducir el uso de una solucin clorinada mezclada con limn. Lister, el padre de la ciruga asptica, introdujo el uso de soluciones acuosas de fenol para tratamiento de heridas y para desinfectar el material quirrgico, tambin para desinfectar la piel antes de operar. La exposicin de los microorganismos a concentraciones bajas, moderadas o altas, de agentes germicidas producen varios efectos que van del estmulo a la muerte. Esta variacin en la actividad de los agentes germicidas sobre los microorganismos se refiere al espectro desinfectante, el cual puede ser separado en 3 zonas de acuerdo con el efecto del germicida. A extremadamente bajas concentraciones el agente pude no afectar al microorganismo. A concentraciones ligeramente ms altas puede haber una estimulacin del crecimiento. A concentraciones mayores se obtiene inhibicin del crecimiento. Una bacteria se considera muerta si es incapaz de multiplicarse en un ambiente ptimo. Cuando los microorganismos se exponen a ciertos agentes qumicos como los mercuriales orgnicos por periodos cortos, pueden ser revividos si se cultivan en un medio que contenga grupos sulfhidrilo libres, por tanto la accin de los mercuriales bajo estas condiciones, se considera bacteriosttica. Un agente bacteriosttico es el que inhibe la reproduccin microbiana. Un agente bactericida es el que tiene una accin irreversible que resulta en muerte de la clula microbiana. Los germicidas y desinfectantes actan como agentes bactericidas si se usan en concentraciones adecuadas,

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mientras que los antispticos pueden ser bactericidas o bacteriostticos. La diferencia bsica entre estos dos tipos de accin est grande mente determinada por la concentracin y tiempo de exposicin. Las propiedades deseables de agentes qumicos recomendados para desinfeccin son: 1. Habilidad para destruir a los microorganismos a bajas concentraciones en pocos minutos, poseer amplio espectro microbiano. 2. Permanecer estables en agua y otros vehculos sin perder su poder de matar. 3. Que no sean txicos para los tejidos (relativamente). 4. Buen poder de penetracin a superficies donde se aplique y que no se combine con la materia orgnica. 5. Que no se corrosivos y que no tian.

AGENTES QUMICOS LCALIS ACIDOS Son activamente bactericidas, la presencia de molculas no disociadas altamente permeables promueve la penetracin del cido dentro de las clulas. SALES: El cloruro de sodio se ha usado por muchos aos como preservativo de carnes y pescados por impedir el crecimiento bacteriano. METALES PESADOS: Entre ellos Hg ++ y Ag+ encabezan la lista, siendo efectivos a menos de 1 ppm. Su accin antimicrobiana se debe a la combinacin del in metlico con ciertas protenas de la clula microbiana; estas se inactivan, precipitan y finalmente producen la muerte HALOGENOS (IODO) Se combina irreversiblemente con protenas, es un agente oxidante, es bactericida y se utiliza en la desinfeccin de piel o para heridas menores AGENTES ALQUILANTES Como el formaldehdo o el xido de etileno que reemplaza el dbil enlace H de los grupos - NH 2 y - OH abundantes en protenas. Las reacciones del formaldehdo son en parte reversibles, para la alta energa de los puentes epxido de etileno permiten reacciones irreversibles. Esto agentes alquilantes en contraste con otros desinfectantes son tan activos contra esporas como con clulas vegetativas. FENOL: Su accin bactericida involucra la lisis celular. Los compuestos fenlicos son ms activos mezclados con jabones que incrementan su solubilidad y promueven su penetracin

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ALCOHOLES: La accin desinfectante de los alcoholes alifticos incrementa con la longitud de su cadena. Su mecanismo de accin consiste en la desnaturalizacin de protenas por inhibicin de la produccin de metabolitos esenciales. Aunque el alcohol etlico ha recibido mayor uso es mejor el alcohol isoproplico ya que es menos voltil y no esta sujeto a las restricciones del alcohol etlico por ser ingerible. Es ms efectivo en la solucin acuosa al 50 o 70% que absoluto. PERXIDO DE HIDRGENO: Su nivel de desinfeccin es alto. La accin antimicrobiana se debe fundamentalmente a la oxidacin de los componentes de la clula microbiana. El perxido de hidrgeno en concentraciones del 6% y 10% posee altos niveles de actividad bactericida y esteriliza qumicamente en inmersin durante 30 minutos, aunque en esas concentraciones es irritante para los tejidos y corrosivo para el instrumental. En solucin al 3% an cuando su accin es limitada por la presencia de materia orgnica e inhibida por la catalasa de las bacterias y los tejidos, es til en la antisepsia de las heridas y elimina mecnicamente restos de tejidos y microorganismos atrapados en ellas por el burbujeo que genera la liberacin de oxgeno. V. MATERIAL POR EQUIPO SOLUCIONES: Yodo, Lugol 5% Benzal 5% Merthiloate Alcohol 70% Fenol 10% Perxido de hidrgeno al 3% 1 Gradilla 5 Tubos con solucin salina al 0.85% 2 Cajas de gelosa nutritiva 1 pipeta de 10ml estril Discos de papel filtro estriles CEPAS Salmonella typhi Stapylococcus aureus VI. METODOLOGA 1. Sembrar masivamente con una asa estril Salmonella typhi , en una caja de gelosa nutritiva , y otra caja con Staphylococcus aureus. 2. Humedezca 1 disco de papel filtro, impregnarlo en una de las soluciones desinfectantes proporcionadas. Haga lo mismo con todas las soluciones. 3. Coloque el disco humedecido sobre una porcin de la caja sembrada masivamente. Reparta los discos alrededor de la caja, etiquetando. 4. Incubar durante 24 hrs. A 37C. Observe si hubo inhibicin del crecimiento.

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5. Coloque en una gradilla 5 tubos de ensaye, aada 5 ml. de las soluciones desinfectantes proporcionadas. 6. Las cepas se le proporcionarn en tubo inclinado, aada a cada cepa 6 ml. de solucin salina 0.85%. Remueva el crecimiento de la superficie de agar inclinado, hasta que se enturbie la solucin salina. 7. Tome 1ml. de bacterias diluidas en solucin salina y coloque esta cantidad en cada uno de los tubos con solucin desinfectante, deje actuar durante 10 minutos (MEZCLE). 8. Tome de esta mezcla 1 ml. de cada tubo y siembre en tubos con caldo nutritivo de la siguiente manera: a) Siembre 1 ml. de bacterias tratadas con merthiolate en 1 tubo con caldo nutritivo + tioglicolato de sodio al 0.05%. b) Siembre 1 ml. de bacterias tratadas con lugol en caldo nutritivo + tiosulfato de sodio al 1%. c) Siembre 1 ml. de bacterias tratadas con fenol en caldo nutritivo + tween 80 al 1%. d) Siembre 1 ml. de bacterias tratadas con alcohol en caldo nutritivo simple; lo mismo se hace para benzal. e) Siembre 1 ml de bacterias tratadas con perixido de hidrgeno al 3% en caldo nutritivo simple. Incubar durante 24 hrs. a 37C observar si hubo o no crecimiento .

VII. RESULTADOS EXPERIMENTO I Reportar de acuerdo a la inhibicin que se presenta en las cajas de Petri con cruces de menor a mayor. Ejemplo MICROORGANISMO LUGOL BENZAL MERTHIOLATE FENOL ALCOHOL Salmonella typhi + + +++ ++ ++++ Staphylococcus + ++ + ++++ ++ aureus EXPERIMENTO II Reportar de acuerdo a los resultados obtenidos en los caldos de cultivo, la actividad de cada desinfectante ( bactericida o bacteriosttico), segn sea el caso. Ejemplo
MICROORGANISM O Salmonella typhi Staphylococcus aureus LUGOL bactericida bacteriosttic o BENZAL bacteriosttic o bactericida MERTHIOLAT E bacteriosttico bactericida FENOL ALCOHOL

bactericid bacteriosttic a o Bactericid bacteriosttic a o

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Concluya acerca de la accin de los agentes qumicos utilizados de acuerdo a sus resultados VIII. CUESTIONARIO 1. Qu es el coeficiente fenlico y cul es su utilidad? 2. Cul es la diferencia entre agente bactericida y bacteriosttico? 3. Qu caractersticas debe tener un desinfectante para esterilizar instrumental y cules para desinfectar piel? IX .BIBLIOGRAFA 1. -D.Davis; Dulbecco Renato; N.Eisen H; Ginsberg HS. Tratado de Microbiologa.4 ed. Editorial Masson. Barcelona. 1996: 58-59 2. -Brooks G.F., Butel J.S., Morse S.A. Microbiologa Mdica de Jawetz 16ed. Editorial El Manual Moderno. Mxico, 1999. 179-216. 3. Ryan K.J. Ray C.G Sherris Microbiologa Mdica 4 ed. Editorial Mc Graw Hill Interamericana. Mxico 2004. 193-202 4. http://www.encolombia.com/medicina/ginecologia/obste52101-ignaz.htm 5. Marta Negroni. Microbiologa Estomatolgica Fundamentos y Gua prctica. 1 ed. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana. 1999: 85100

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PRCTICA # 10 ESTRUCTURA EUCARITICA DE HONGOS Y PARASITOS I. OBJETIVO a. Conocer la diferencia entre los organismos eucariotes y procariotes b. Conocer los principales hongos y parsitos que se encuentran o se pueden encontrar en cavidad bucal. c. Conocer la utilidad de la tcnica de laboratorio del microcultivo para la observacin de hongos. II. INTRODUCCIN En esta prctica trataremos acerca de los microorganismos eucariticos que se encuentran en cavidad bucal: Hongos, protozoarios y helmintos. Se observar la estructura de algunos gneros de hongos y helmintos. En general, estos organismos tienen mayor preferencia por los tejidos blandos, mucosa bucal, lengua. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS Caractersticas de las clulas eucariticas Principales caractersticas de los hongos Formas de reproduccin de los hongos IV. MARCO TEORICO Los hongos se encuentran dentro del reino Fungi de la clasificacin de Whittaker, ya que presentan clulas de tipo eucaritico (con ncleo rodeado por membrana), se nutren por absorcin y su forma de agrupacin es unicelular (como las levaduras) o multicelular y/o multinucleada. Estos se asemejan a las plantas, pero no presentan clorofila. Los protozoarios, se encuentran en el reino Protista. Estos organismos son eucariotes, ya que presentan un ncleo verdadero, con membrana nuclear, cromosomas mltiples y un aparato mittico. En la tabla I se encuentran las principales diferencias entre organismos eucariotes y procariotes.

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CARACTERSTICAS Glucopeptidos en pared celular Esteroides en membrana celular Mesosomas Membrana nuclear Divisin celular Cromosomas Complejo DNA-histona Organelos citoplsmicos Nucleolo

PROCARIOTES + + UNO SOLO -

EUCARIOTES + + + MULTIPLES + + +

TABLA I. Principales diferencias entre clulas procariotes y eucariotes Los mohos presentan un cuerpo vegetativo compuesto de filamentos largos ramificados; Cada filamento es llamado Hifa y el conjunto de hifas se llama micelio. Las hifas poseen una rgida pared de quitina, la cual puede presentar septos formando una hifa septada o no presentar septos formando una hifa no septada o cenoctica, que contiene muchos ncleos. Las paredes transversalmente divididas, dan la apariencia de un filamento compuesto de clulas. El micelio se divide en dos porciones: el micelio vegetativo, que proporciona al moho los nutrientes y el micelio areo, que contiene las estructuras reproductoras. En el esquema No 4. Se encuentran las estructuras de hifas, esporas y cuerpos fructferos. La pared celular de los hongos no poseen cido murmico que es caracterstico de bacterias, algunos tienen quitina o celulosa en sus paredes. Los hongos se dividen en grupos, basndose en el tipo de micelo Areo, que contiene las estructuras reproductoras. La pared celular de los hongos no poseen cido murmico, que es caracterstico de bacterias, algunos tienen quitina o celulosa en sus paredes. Los hongos se dividen en grupos, basndose en el tipo de micelio (septado o cenoctico) y el tipo de reproduccin, que se clasifica segn sus esporas en sexual (tabla II) o asexual (tabla III).Las esporas difieren mucho en color forma y tamao; pueden contener ms de un ncleo. Su morfologa y origen, constituyen la base principal para la clasificacin de los hongos que carecen de reproduccin sexual. Algunas especies producen un tipo de espora y otros hasta cuatro. Las esporas asexuales externas se conocen con el nombre genrico de conidios y se observan con frecuencia en hongos de inters mdico. Pero con ms frecuencia, este trmino se reserva para aquellas esporas que se

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forman por un proceso semejante a la gemacin de los extremos de las hifas especializadas que reciben el nombre de conidiforos. En la tabla II se muestran las diferentes esporas sexuales que se pueden presentar en los hongos
ESPORA 1) Ascosporas. Descripcin Se forman dentro de un saco denominado asca, que resulta de la fusin sexual de dos clulas especializadas. Cada asca tiene 4 a 8 esporas, propias de los Ascomycetes Se forman en el basidio, que es el resultado de la fusin de dos clulas especializadas; son propias de los Basidiomycetes.

2) Basidiosporas.

3) Oosoporas. 4) Zygosporas.

Se forman por la unin de dos clulas 60reamente60n60nte diferentes; Son caractersticas de los Zygomycetes. Forman por la unin de dos clulas 60reamente60n60nte diferentes; son caractersticas de los Zygomycetes

TABLA II. Diferentes esporas sexuales que pueden presentar los hongos

BASIDIOSPORAS

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ESPORAS ASEXUALES: ESPORA Descripcin

1.Artrosporas (del griego arthron, Se forman de la fragmentacin de una articulacin) hifa separada 2 Blastosporas (del griego blastos, brote, yema) Formadas por pseudomicelio en levaduras. Presentan gemacin 3 Clamidosporas (del griego chlamy, Formadas por fragmentacin del micelio; manto) es una espora de pared gruesa, muy resistente al calor y la desecacin. 4 Conidiosporas (del griego Konis, Cadenas de esporas que se extienden polvo) areamente en las hifas reproductoras llamadas conidiforos. 5. Esporangiosporas (del griego Son similares a las conidias, pero son angeion, vasos) formadas dentro de sacos llamados esporangios que estn en el extremo de filamentos llamados esporangiforos. 6. Aleuriosporas. (del griego aleuron, Esporas que carecen de conidios, pero harina de trigo) que se desarrollan sobre cortas ramas laterales o directamente sobre las hifas, ms que en conidiforos especializados.

TABLA III. Esporas asexuales que pueden presentar los hongos.

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Artrosporas

En la clase Fungi Inperfecti o Deuteromycetos, no existen esporas sexuales, que incluye algunas levaduras patgenas como Candida.

Las levaduras como Candida albicans, son cuerpos unicelulares ovales que pueden producir peudomicelio. Estas levaduras se dice que son dimrficas porque producen levaduras unicelulares y micelio multicelular. Su reproduccin puede ser sexual o asexual; en general se reproducen por gemacin.

La estructura de los protozoarios es muy simple ya que son organismos unicelulares que se incluyen en varios subphylum; los protozoarios de importancia en cavidad bucal, son: Mastigophora o Flagelados, como Entamoeba gingivalis. Otros organismos eucariticos, que ejercen algn efecto en cavidad bucal, son los nemtodos, que son gusanos redondos, multicelulares, ms complejos con aparatos ms o menos organizados. Ejemplo: Trichinella spiralis. En la tabla IV se muestran los principales organismos eucariticos y su relacin con patologas de la cavidad bucal.

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TABLA IV. PRINCIPALES ORGANISMOS EUCARIOTES EN CAVIDAD BUCAL

ORGANISMO

MORFOLOGIA

ENFERMEDAD EN CAVIDAD ORAL

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HONGOS MICROSPORIUM Macroconidias fusiformes al final de D Dermatitis Labial la hifa TRICHOPHYTON Microconidias en forma de racimo D Dermatitis Labial de uvas. EPIDERMOPHYTON Macroconidias multiseptadas en grupos CANDIDA ALBICANS Levaduriforme unicelular con blastosporas, pseudomicelio. GEOTRICHUM Clulas rectangulares CRYPTOCOCCUS Levaduriforme monofsica COCCIDIOIDES IMMITIS Difsico, levaduriforme y micelio setado, artrosporas. BLASTOMYCES DERMATITIDIS Difsico, levaduriforme y micelio setado . artrosporas. PARACOCCIDIODES BRAZILIENSIS Difsico, levaduriforme, micelio con blastosporas y clamidosporas. HISTOPLASMA CAPSULATUM Granuloma dental despus de extraccin. Ulceras en mucosas oral Papiloma labial y lceras, granulomas. Infeccin oportunista, lcera del paladar, lesiones granulomatosas en lengua. Infeccin crnica de amgdalas In Infeccin de canales de la raz y al algodoncillo D Dermatitis Labial

Difsico, levaduriforme, micelio conUlcera de borde indurado en lengua, pice dental clamidosporas. y paladar . Oportunista, monofsico micelio con conidioforo y conidiosporas Lesiones en seno maxilar, sinusitis, paladar blando y epiglotis.

ASPERGILLUS

FLAGELADOS:

PROTOZOARIOS

TRICOMONAS TENAX LEISHMANIA DONOVANI

Forma de pera 4 flagelos se alimenta de restos celulares Cuerpos ovales dentro de clulas reticuloendoteliales. Cuerpos ovales dentro de clulas retculo endoteliales Flora normal, trofosoito unicelular con pseudopodos Cuerpos pequeos dentro de eritrocitos (esquizonte) HELMINTOS

Se considera no patgeno, pero esta en gingivitis y lcera gingival Leishmaniasis muco cutnea de labios y carrillos Kala-aza, transmitido por picadura de mosco , lesin o oronasal, paladar y fauces Periodontitis, aislada de clculo suave, lesin periodontal supurativa crnica y amigdalitis

SARCODARIOS O AMIBAS:

ENTAMOEBA GINGIVALIS ESPOROZOARIOS: PLASMODIUM MALARIAE

Trinquiniasis en lengua

NEMATODA TRICHINELLA SPIRALIS

Larva enquistada en msculo esqueltico

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Ejemplo dealgodoncillo en Adulto nio

Ejemplo de algodoncillo en

(Fotos: cortesa de QFB. Patricia Vidal Milln, QFB. Pablo Jurez de los Santos)

V. MATERIAL Preparaciones fijas de las siguientes cepas de hongos: Trichopyton sp (Micelio y clamidosporas) Microsporum sp (Micelio y macroconidias) Geotrichum sp (Micelio y artrosporas) Aspergillus sp (Micelio, cuerpo fructfero, conidias) Alternaria sp (Micelio y macroconidias) Preparaciones fijas de parsitos (Tremtodos) Cepa de Candida sp Micro cultivo de Penicillium sp Caja de petri con crecimiento de una cepa de hongos 1 frasco con azul de metileno Portaobjetos Cubreobjetos Asa y porta asa Microscopio Pinzas Formol 10% VI. METODOLOGIA 1. Observacin microscpica de las preparaciones fijas de hongos y parsitos 2. Observacin de la morfologa colonial de mohos. 3. A partir del microcultivo, practicar la tincin simple: a. Con una pipeta Pasteur, desechar el glicerol y substituirlo por formol al 10%. Dejar actuar por 1 hora. b. Colocar una gota de azul de metileno en el centro de un portaobjeto limpio y desengrasado. c. Con unas pinzas, separa el cubreobjetos del microcultivo d. Colocar el cubreobjeto sobre la gota de colorante y presionar un poco sobre el cubreobjetos con el fin de eliminar las burbujas de aire . e. Observar al microscopio con los objetivos 10X y 40X. f. A partir del porta objetos, se puede obtener otra preparacin , quitando el medio de cultivo del porta objetos con una aguja de diseccin.

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g. Colocar una gota de colorante en el centro del crecimiento y colocar un cubre objeto limpio y presionar. h. Observar al microscopio

Ejemplo de microcultivo
(Foto: cortesa de QFB. Patricia Vidal Milln, QFB. Pablo Jurez de los Santos)

4. Observacin de un hongo levaduriforme (Candida sp) a. En un porta objeto limpio, colocar una gota de agua con el asa. b. Cerca del mechero, tomar una asada del cultivo Candida sp y homogenizar en la gota de agua, extendiendo procurando hacer un frotis delgado. c. Dejar secar al aire y fijar al calor, pasando dos o tres veces al portaobjetos por la llama del mechero, rpido. d. Colocar una gota de azul de metileno sobre el frotis durante 1 minuto. e. Lavar con agua de llave, procurando que el agua no pegue directamente sobre la preparacin. f. Dejar secar al aire y observar al microscopio. VII. RESULTADOS 1. Haga esquemas de la morfologa microscpica de los hongos observados, sealando cuales son levaduras, tipos de esporas y micelio. 2. Haga esquemas de los parsitos observados. 3. Describa la morfologa macroscpica del hongo observado en la caja de Petri.

VIII. CUESTIONARIO 1. Principal diferencia entre un moho y una levadura 2. Qu es un microcultivo y para qu se utiliza? 3. Qu es un protozoario y cules son los de importancia odontolgica? 66

4. Qu es una Tincin simple y cul es su utilidad? 5. Compare entre las bacterias, hongos y parsitos que observ cules son sus diferencias? IX. BIBLIOGRAFA 1. Libana Urea J. Microbiologa oral. 2 ed. Madrid Espaa. Editorial Mc Graw Hill. 2002: 11-43 2. Marta Negroni. Microbiologa Estomatolgica Fundamentos y Gua prctica. 1 ed. Buenos Aires. Editorial Mdica Panamericana. 1999: 5869 3. D.Davis; Dulbecco Renato; N.Eisen H; Ginsberg HS. Tratado de Microbiologa.4 ed. Editorial Masson. Barcelona. 1996: 707-733 4. http://www.mdpaquarium.com.ar/revista/explorando04-oct00.htm 5. http://www.cdeea.com/identificacion.htm

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PRCTICA # 11 DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA COMO MECANISMO DE DEFENSA INESPECFICO

I. OBJETIVO. Al trmino de esta prctica, el alumno comprender la funcin e importancia de la lisozima como mecanismo de defensa inespecfico del organismo y de cavidad bucal. II. INTRODUCCIN Al ser la cavidad bucal una de las principales vas de entrada microbiana al organismo, es de suma importancia para el cirujano dentista conocer los mecanismos de defensa inespecficos presentes en el sistema estomatogntico, as como sus funciones, incluyendo la lisozima. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS. 1. Funcin del sistema inmunolgico. 2. Estructura del sistema inmunolgico del organismo. 3. Componentes del sistema inmune presentes en cavidad bucal. 4. Importancia de la lisozima en cavidad bucal IV. FUNDAMENTO TERICO Los mecanismos de defensa de nuestro organismo son diferentes y se pueden dividir en: - Especficos - Inespecficos La cavidad bucal tiene ambos mecanismos de defensa, los cuales como su nombre lo indica son los encargados de cuidar y preservar la salud y bienestar de nuestro organismo. Los mecanismos de defensa locales o inespecficos reciben su nombre porque actan contra cualquier agente extrao sin distinguir su tipo y estos se pueden dividir en: A. Barreras fsicas o mecnicas. Mucosas: Las cuales estn constituidas en cavidad bucal por los tejidos que forman una superficie continua de epitelio plano estratificado que protege a los tejidos profundos funcionando como una barrera mecnica la cual se ve apoyada para su funcin defensiva por la descamacin y la queratinizacin. Flujo salival y movimientos de la boca: los cuales impiden la proliferacin y adherencia de microorganismos y detritus. Esmalte dental: El cual tambin es una barrera anatmica de gran importancia para defender rganos dentarios. Anatoma y posicin dentaria. B. Barreras bioqumicas:

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Tiocianato Lisozima Peroxidasa Lactoferrina Mucopolisacridos Complemento Capacidad amortiguadora salival Fluido gingival C. Barreras biolgicas:

Leucocitos que participan en fagocitosis Trasudacin de fluido gingival. D. Barreras bacterianas:

Flora microbiana normal. (Relaciones ecolgicas microbianas)

En 1927, Fleming report la presencia de una sustancia en la secrecin nasal que causaba destruccin de Micrococcus lysodeiktucus, esta sustancia fue nombrada lisozima. La cual esta ampliamente distribuida en los tejidos y fluidos corporales incluyendo la saliva, tejido y fluido gingival, surco gingival, y a nivel general se encuentra en orina, lgrimas, sudor, calostro, lquido prosttico y vaginal, etc. La lisozima es una enzima que acta sobre el peptidoglicano de la pared celular de ciertas bacterias principalmente Gram. Las fuentes de lisozima en saliva, surco gingival, etc, son las glndulas partida, mandibular, sublinguales y los leucocitos salivales en degeneracin. V. MATERIAL POR EQUIPO. 1 Caja de medio Soya Tripticaseina 1 tubo con Micrococcus lysodeikticus 1 Asa bacteriolgica 1 Tubo c/5 discos de papel filtro estriles 1 Pinza de curacin 1 Mechero 1 Gradilla 1 Tubo con solucin salina estril

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VI. METODOLOGA 1. Sembrar con Micrococcus lysodeikticus en forma masiva con el asa bacteriolgica la caja con Agar Soya Tripticaseina. 2. Colocar distribuidos en la caja de Petri previamente etiquetada un disco humedecido con: a) saliva b) sudor c) lgrimas d) solucin salina estril Las muestras deben ser de un mismo donador para cada caja (1 por equipo) 3. Incubar a 37 C por 24 horas. 4. Leer y medir halos de inhibicin de crecimiento por accin de la lisozima. Identificando a que secrecin pertenece cada halo. RESULTADOS. Realizar una tabla con los siguientes datos: Secrecin Saliva Sudor Lgrima Solucin salina Analizar sus resultados en cuanto a la actividad de la lisozima presente en cada secrecin y su eficacia. Halo de inhibicin en mm. Eficacia en cruces

VII. CUESTIONARIO 1. A qu se le llama mecanismos de defensa inespecficos? 2. Explique dos mecanismos de defensa inespecficos en cavidad bucal diferentes a la lisozima. 3. Escriba cul es la importancia de los mecanismos de defensa inespecficos en cavidad bucal. 4. Porqu causa se produce la enfermedad parodontal con relacin a los mecanismos de defensa inespecficos? IX. BIBLIOGRAFA 1. Nolte, W.A. Microbiologa odontolgica. 4 ed. Mxico. Edit. Nueva Editorial Nueva Editorial Interamericana S.A. de C.V. 2. Libana Urea J. Microbiologia Oral. 2 ed. Espaa. Editorial Mc GrawHill Interamericana de Espaa. 2002 3. Jawetz, E. Microbilogia Medica. 16 ed. Mxico. Editorial El Manual Moderno S.A. de CV.1999

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PRCTICA # 12 FAGOCITOSIS I. OBJETIVO: Al concluir esta practica, el alumno conocer la importancia de la fagocitosis como mecanismo de defensa inespecfico del organismo y de cavidad bucal. II. INTRODUCCION El conocimiento de una de las reacciones de nuestro organismo y de la cavidad bucal ante la entrada de agentes extraos es de suma importancia para el cirujano dentista, y la fagocitosis es una de las reacciones primarias que el organismo tiene para defenderse de estos agentes. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS. 1. Defina fagocitosis 2. Enuncie y explique los pasos de la fagocitosis 3. Mencione la importancia de la fagocitosis en cavidad bucal. IV. FUNDAMENTO TEORICO Los fagocitos o clulas fagocticas estn ampliamente distribuidas en el cuerpo, pudindose encontrar en sangre, mdula sea hgado, tejido conectivo, tejido nervioso, cavidades cerosas, estas clulas forman parte del mecanismo de defensa y participan en los fenmenos inmunolgicos tempranos o primarios. Elie Metchikoff en 1892 denomin a estas clulas macrfagos por ser capaces de dirigir grandes partculas. La fagocitosis se puede definir como La ingestin y destruccin de clulas vivas o antgenos no viables por clulas fagocticas, y consta de varias etapas que son: - Reconocimiento - Quimioatraccin o quimiotaxis - Opsonizacin - Ingestin - Muerte - Exocitosis Al penetrar una partcula extraa, por ejemplo una bacteria, primeramente las clulas de defensa de nuestro cuerpo identifican y/o reconocen a esta, por lo que los macrfagos son atrados al sitio donde se encuentra (quimiotaxis o quimioatraccin) mediante la liberacin de sustancias conocidas como opsoninas (opsonizacin) que hacen atractiva a la partcula extraa, entonces los macrfagos engloban a esta partcula (endocitosis) y la meten en su interior (ingestin), despus liberan diferentes enzimas que destruyen dicha partcula (digestin) provocando la muerte o destruccin de la partcula y los restos de dicha partcula son enviados al exterior del macrfago (exocitosis). En cavidad bucal la fagocitosis se lleva a cabo principalmente en el surco gingival ya que el fluido gingival contiene leucocitos polimorfonucleares, neutfilos y monocitos.

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V. MATERIAL - Microscopio - Preparaciones fijas de fagocitosis - Aceite de inmersin VI. DESARROLLO Observar cuidadosamente a 100x (inmersin) las preparaciones fijas identificando los pasos de la fagocitosis. Realizar dibujos de las observaciones. VII. RESULTADOS - Realizar los dibujos de las observaciones mencionando que pasos de la fagocitosis observ VIII. CUESTIONARIO 1. Defina enzima 2. Mencione que enzimas y sustancias intervienen en la destruccin de partculas extraas durante la fagocitosis. 3. Defina pinocitosis

IX. BIBLIOGRAFA 1. Nolte, W.A. Microbiologa odontolgica. 4 ed. Mxico. Edit. Nueva Editorial Nueva Editorial Interamericana S.A. de C.V. 2. Libana Urea J. Microbiologia Oral . 2 ed. Espaa. Editorial Mc Graw- Hill Interamericana de Espaa. 2002. 3. -Jawetz, E. Microbilogia Medica. 16 ed. Mxico. Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.1999

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PRCTICA # 13 REACCIONES DE AGLUTINACIN I. OBJETIVO Que el alumno identifique a la aglutinacin como una de las tcnicas inmunolgicas que existen en el laboratorio para cualificar o cuantificar antgenos y anticuerpos para comprender el fundamento de diferentes pruebas diagnsticas que se basan en ellas. II. INTRODUCCIN El conocimiento de las diferentes reacciones que pueden presentarse in vitro entre un antgeno y un anticuerpo, son importantes desde el punto de vista diagnstico para la deteccin de enfermedades o para la identificacin de elementos o sustancias que se encuentran en el organismo por diversas causas, de aqu la importancia de conocer de manera bsica, estas reacciones y algunas de sus aplicaciones. La presente prctica ilustra de manera muy general, la reaccin de aglutinacin. III. CONOCIMIENTOS PREVIOS A) Definiciones de antgeno y anticuerpo B) Inmunidad humoral

IV. FUNDAMENTO TEORICO Esta prctica, est basada en una tcnica inmunolgica humoral (tambin llamada serolgica) la cual recibe este nombre debido a que el efector inmunolgico que reacciona con el antgeno es un anticuerpo, es de tipo cualitativa porque solo se detecta la presencia del antgeno y tambin es indirecta, ya que el anticuerpo se encuentra en una fase slida (partcula de ltex). Las reacciones antgeno y anticuerpo forman parte de los mecanismos de defensa del cuerpo humano, sin embargo, muchas sustancias que forman parte del organismo han sido usadas como antgenos y han sido inoculadas en modelos animales para estimular la produccin de anticuerpos, que una vez formados, son obtenidos para utilizarlos con fines de diagnstico y/o identificacin en orina, suero o en sangre humanos. Se denomina aglutinacin a la interaccin secundaria in vitro de un antgeno particulado (por lo general clulas) con su anticuerpo especfico. Cuando la molcula antignica con la que interacciona el anticuerpo especfico no forma parte de la estructura nativa de la partcula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinacin que tiene lugar se denomina genricamente aglutinacin pasiva o indirecta, los soportes utilizados pueden ser inertes como partculas de ltex. Un ejemplo claro de esta reaccin es la del diagnstico de embarazo, cuya prueba se base en la identificacin de la presencia de la hormona gonodotropina corinica humana (HCG), misma que se incrementa durante el embarazo y se detecta en la sangre o en la orina. Esta hormona aumenta

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rpidamente durante el primer trimestre, llegando a su nivel mximo entre los 60 y 80 das despus de la fertilizacin, para luego descender de forma precipitada a un 10 un 30% del valor mximo durante el resto del embarazo. La hormona sirve para mantener la produccin de progesterona por el cuerpo lteo al principio del embarazo. Cuando los niveles del HCG descienden, a principios del segundo trimestre, la placenta produce suficiente progesterona para mantener el endometrio. V. MATERIAL POR EQUIPO. Muestra de la primera orina de la maana de una paciente con sospecha de embarazo. Reactivo de ltex recubiertas con anticuerpo anti-gonadotropina corinica humana Agitadores Pipetas Pasteur con bulbo Loseta VI. METODOLOGA Cada equipo realizar una prueba de embarazo por mesa. Colocar en una loseta limpia una gota del reactivo de ltex con anti HCG humana. Agregar a la gota de reactivo, una gota de la muestra de orina. Mezclar perfectamente con ayuda del palillo. Esperar resultados. VII. RESULTADOS Debemos recordar que en esta prueba la Gonadotropina corinica humana funciona como antgeno, ya que las partculas de ltex estn recubiertas con anticuerpos obtenidos a partir de un modelo animal formados contra la gonadotropina corinica humana. La presencia de grumos en al mezcla en un lapso de dos minutos, indica la unin antgeno anticuerpo, por lo tanto quiere decir que la prueba es positiva y hay embarazo. La ausencia de grumos indica que no existe gonadotropina corinica en la muestra de orina, por tanto la prueba es negativa y quiere decir que NO existe embarazo.

Hacer una breve reflexin de los resultados obtenidos. VIII. CUESTIONARIO 1. Defina aglutinacin 2. Defina precipitacin 3. Indique la diferencia entre precipitacin y aglutinacin 4. Mencione por lo menos otra prueba diagnstica que implique una reaccin de aglutinacin y cul es su importancia. 5. D tres ejemplos de tcnicas inmunolgicas de aglutinacin: una con saliva, otra con suero y con orina, explicando su uso.

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IX. BIBLIOGRAFA 1. Brooks, Butel, Morse. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelbert. 16 ed. Editorial el Manual Moderno. Mxico 1999. 2. Negroni Marta. Microbiologa Estomatolgica. Fundamentos y Gua Prctica. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires Argentina, 1999. 3. Tristram G.I. Parslow, Daniel P. Stites, Abba I Terr, John B. Imboden. Inmunologa Bsica y Clnica. 10 ed. Editorial El Manual Moderno. Mxico 2001.

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