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Tesis
víctor m. blanco
 Tesis Doctoral

Cinética y mecanismos del edema celular isosmótico

producido por amoníaco y amonio en células de
neuroblastoma

Presentada al Programa de Doctorado en Neurociencias y

Biología del Comportamiento de la Universidad
Pablo de Olavide por

Víctor Martín Blanco

Licenciado en Genética por la Universidad Nacional de Misiones,
Argentina.

Director: Dr. Francisco Javier Álvarez-Leefmans

Tutor: Dr. José María Delgado García (Universidad Pablo de Olavide)

Realizada en:
-Laboratorio de Neurofisiología, Depto. de Farmacología y Toxicología, Wright
State University, Dayton, Ohio, Estados Unidos.
-Unidad del CINVESTAV en el Instituto Nacional de Psiquiatría, México D.F., México.
a Pau y Jere,
a mis padres,
Aჟrâdēcịლịĕռţöა

Al Dr. Francisco J. Alvarez-Leefmans, por su apoyo y su estímulo. Por descubrir, para mí, la
ciencia.

A los Dres. Agnés Gruart Masso y José M. Delgado García, por su confianza y aliento
constantes.

A mis compañeros del Laboratorio de Neurobiología en México, Sergio Márquez, José

Fernández, René Garduño, Jaime Herrera Pérez, Andrés Nani y Alicia Maldonado, por su
ayuda invaluable en la realización de esta tesis, y su solidaridad en todo momento.

Al Dr. Robert W. Putnam, por su enorme generosidad, humana y científica.

Al Dr. Mel Goldfinger, por el estímulo y la ayuda brindados.

A Alejandro Múnera y a Elena Domínguez, por estar allí, y dejarme encontrarlos.

A mis viejos, porque este paso es también de ellos.

A Paula, por los sueños compartidos, por acompañarme, alentarme y sostenerme todos estos
años.

Թ
víctor
. INDICE
Resumen 1
Abstract 2
Abreviaturas 3

1. Introducción 4
Parte I.
1.1. Aspectos fisiológicos del amoníaco y del amonio 5
1.2. Metabolismo del amonio en el cerebro 8
1.3. Efectos del par NH3/NH4+ sobre el volumen celular acuoso y el pH intracelular 10
1.3.1. Modelo teórico de los cambios de volumen celular acuoso y de pH intracelular
inducidos por la exposición a NH3/NH4+ 12
1.3.2. Vías de transporte de NH4+ a través de la membrana plasmática 14
1.4. Regulación del pH intracelular y su relación con el volumen celular 15
1.5. Homeostasis del volumen en células neurales 17
1.6. Alteraciones del volumen celular en el sistema nervioso central producidas por
hiperamonemia 18
1.6.1. Fisiopatología del edema cerebral inducido por NH3/NH4+. 19
Parte II
1.7. Control del volumen celular 23
1.7.1. Estrategias para el estudio de los procesos de regulación del volumen celular 25
1.7.2. Cambios en el volumen celular acuoso en medios isosmóticos 27
1.7.3. Elementos celulares que intervienen en las respuestas de osmoregulación 29
1.7.3.1. Mecanismos de detección de los cambios de volumen 29
1.7.3.2. Transducción intracelular de los estímulos osmóticos 31
1.7.3.3. Mecanismos efectores de la regulación del volumen celular 32
1.7.4. DRV y ARV: paradigmas experimentales en el estudio de los fenómenos
de osmoregulación 32
1.7.4.1. Disminución reguladora del volumen, DRV 32
1.7.4.2. Aumento regulador del volumen, ARV 34

2. Objetivos 36

3. Materiales y Métodos 37
3.1. Células 37
3.2. Cultivo celular 37
3.3. Soluciones experimentales 38
3.3.1. Sustitución de iones 39
3.3.2. Bloqueadores de canales y transportadores 40
3.4. Fundamentos de la técnica de microscopía de fuorescencia para la medición
del volumen celular 40
3.5. Carga de las células con indicadores fluorescentes 43
3.6. Registro de las señales fluorescentes 44
3.7 Calibración osmótica de las células y conversión de la señal fluorescente

I
 en unidades de volumen celular acuoso relativo 48
3.8. Protocolo experimental 50
3.9. Evidencia de que los cambios de fluorescencia producidos por el par NH3/NH4+
no son espurios 51
3.10. Corrección de la deriva y análisis de las señales fluorescentes 52
3.10.1. Análisis de los cambios en el VCA 52
3.10.2. Análisis de los cambios en el pHi 53
3.11. Calibración del pHi 54
3.12. Criterio de selección de las células para el análisis de los cambios
en el VCA y en el pHi 55
3.13. Ventajas y desventajas de las técnicas fluorescentes 56
3.14. Detección de la enzima glutamina sintetasa por el método de Western Blot 57

4. Resultados 58
4.1. Cambios paralelos en el volumen celular acuoso y en el pH intracelular
producidos por el par amonio/amoníaco en células de neuroblastoma 58
4.1.1. ¿Es posible explicar el aumento inicial del VCA por la acumulación
intracelular de NH4+? 61
4.1.2. El volumen celular cambia en función de la concentracion externa de NH4Cl 64
4.1.3. Efectos diferenciales del NH3 y el NH4+ sobre el VCA y el pHi 65
4.2. Estimación del flujo y de la permeabilidad al NH3 68
4.3. Reproducibilidad de la respuesta celular a los pulsos de NH3/NH4+ 71
4.4. Otros posibles factores determinantes del aumento inicial del volumen celular
acuoso en células N1E-115 expuestas al NH3/NH4+ 74
4.4.1. Síntesis y acumulación de glutamina 75
4.4.2. Influjo neto de iones 77
4.4.2.1. Substitución del Cl- externo por gluconato 78
4.4.2.2. Sustitución de Na+ externo por n-metil-d-glucamonio 80
4.5. Factores determinantes de la disminución reguladora del volumen en células
expuestas a soluciones isosmóticas conteniendo NH3/NH4+ 82
4.5.1. Cambios en la tensión mecánica de la membrana celular
4.5.1.1. Efectos de la inhibición de canales no selectivos a cationes, activados
por aumentos en la tensión de membrana plasmática, sobre la DRVi 83
4.5.2. Magnitud de la expansión inicial: relación entre la amplitud del aumento
inicial del VCA y la DRVi 84
4.5.3. Alteraciones osmóticas resultantes del influjo de NH4+ 85
4.5.4. Cambios en el pH intracelular 87
4.5.5. Posible eflujo electrodifusional de Cl- y K+ durante la DRVi 88
4.5.5.1. Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl- y al K+ sobre el pHi 90
4.6. Posibles vías de transporte del NH4+ 91

5. Discusión 93
5.1. El método mide cambios fidedignos en el pHi y en el volumen celular acuoso
de células individuales 93
5.2. Cambios de pH y volumen en células expuestas al par conjugado amoníaco/amonio 93
5.2.1. La permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 y al NH4+ determina

II
 la cinética de los cambios de pHi y VCA 95
5.2.1.1. Gradiente electroquímico y permeabilidad de la membrana celular al NH4+ 97
5.3. Factores determinantes del aumento del VCA mediado por el par NH3/NH4+ 98
5.3.1. Acumulación intracelular de NH4+ y un anión acompañante 99
5.3.2. Síntesis y acumulación de glutamina 99
5.3.3. Influjo de Cl- y Na+ 101
5.3.3.1. Cambios en el pHi basal inducidos por la remoción del Cl- o del Na+ externos 102
5.4. Factores determinantes de la DRVi en células expuestas a soluciones conteniendo
NH3/NH4+ 103
5.4.1. Cambios en la tensión de la membrana plasmática 103
5.4.1.1. Activación de canales catiónicos activados por aumentos en la tensión
de la membrana 104
5.4.1.2. Expansión inicial del volumen 105
5.4.2. Efectos osmóticos del NH4+ 105
5.4.3. Posible influencia del pHi sobre la DRVi 106
5.4.4. Activación de vías electrodifusionales (canales iónicos) durante la DRVi 107
5.5. Probables vías de influjo del NH4+ 110
5.6. Posibles implicaciones fisiopatológicas 111

6. Conclusiones 112

7. Perspectivas 114

8. Referencias 116

III
. RESUMEN

La base neutra amoníaco (NH3) y su ácido conjugado, el ión amonio (NH4+), juegan un
papel central en el metabolismo del nitrógeno en los seres vivos. A pesar de su importancia fi-
siológica, el par NH3/NH4+ es potencialmente tóxico. Por ejemplo, los aumentos en la concen-
tración plasmática de NH3/NH4+ (hiperamonemia) juegan un papel importante en la génesis
del edema cerebral característico de la encefalopatía hepática. Desde hace más de un siglo se
sabe que la exposición transitoria de células al par NH3/NH4+ produce cambios característicos
en el pH intracelular (pHi), siendo ésta una maniobra experimental común para el estudio de
los mecanismos reguladores del pHi. A partir de consideraciones teóricas se ha hipotetizado,
pero no demostrado, que la acumulación intracelular de NH4+ tras la exposición al par
NH3/NH4+ debe producir, además, un aumento en el volumen celular. En el presente trabajo se
estudian, mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa, los efectos del NH3/NH4+ sobre
el volumen celular acuoso (VCA) y el pHi en células individuales y diferenciadas de neuro-
blastoma (N1E-115) in vitro, cargadas con el indicador fluorescente BCECF. El VCA se estu-
dia registrando la fluorescencia emitida por el indicador al excitarlo en su punto isosbéstico
(PI) intracelular (~438 nm), que es insensible al pH, pero sensible a cambios en su concentra-
ción intracelular, a partir de los cuales se calculan los cambios en el VCA. El pHi se midió
utilizando el cociente de fluorescencias excitando a 495nm (frecuencia sensible al pH) y al PI.

Se encontró que la exposición y remoción de soluciones isosmóticas conteniendo

NH3/NH4+ (NH4Cl 0,5-30 mM) produce cambios paralelos en el pHi y en el VCA, que constan
de cuatro fases: 1) un aumento inicial del pHi, que precede en pocos segundos a un aumento
en el VCA. 2) Una fase lenta de acidificación intracelular, concomitante con una disminución
reguladora del volumen (en medio isosmótico; DRVi). La remoción del pulso de NH4Cl pro-
duce 3) una caída pronunciada y simultánea del pHi y del VCA, tras lo cual se observa 4) una
fase de recuperación parcial o total del pHi y del VCA. Al variar de manera independiente las
concentraciones de NH3 y NH4+ en las soluciones experimentales, se observa que el aumento
inicial del pHi y del VCA dependen de la concentración externa de NH3 y no de la de NH4+.
La alcalinización intracelular inicial resulta de la protonación del NH3 que ingresa rápidamen-
te a las células formando NH4+ (NH3 + H+ → NH4+). Aproximadamente el 60% del aumento
inicial del VCA puede explicarse por la acumulación intracelular de NH4+ y de un anión acom-
pañante (no identificado), necesario para preservar la electroneutralidad. La fracción restante
del aumento de VCA no parece resultar del influjo de Cl- o de Na+, ni de la acumulación
intracelular de glutamina, osmolito sintetizado por la glutamina sintetasa a partir del NH3 y el
glutamato y postulado como factor causal del edema cerebral observado en las hiperamo-
nemias agudas. La fase 2 (de acidificación gradual) resulta principalmente de la entrada de
NH4+ a las células, siguiendo su gradiente electroquímico. Este influjo de NH4+ ocurre, en
parte, a través de canales de K+ sensibles al Ba2+, y posiblemente a través del cotransportador
de Na+,K+,2Cl-. La DRVi que procede paralelamente se bloquea con Gd3+ ó NPPB, sugiriendo
que en la misma participan canales catiónicos activados por aumentos en la tensión de la
membrana y canales aniónicos. Un bloqueo parcial de la DRVi se observa también en presen-
cia de Ba2+, lo cual sugiere la participación de canales de K+ en este proceso. La DRVi podría
estar modulada, además, por los cambios paralelos que ocurren en el pHi. Se concluye que el
par NH3/NH4+ induce, a través de efectos osmóticos directos, cambios en el volumen celular.
Aún cuando las implicaciones fisiopatológicas de este modelo in vitro son limitadas, creemos
que el mismo constituye una herramienta valiosa para el estudio de los cambios asociados con
la hiperamonemia en células neurales.

1
 ABSTRACT

The neutral base ammonia (NH3), and its conjugated acid, the ammonium ion (NH4+) play
a pivotal role in nitrogen metabolism in living organisms. In spite of its importance, the pair
NH3/NH4+ is toxic when present in high concentrations. For instance, an increase in plasma
levels of NH3/NH4+ (i.e. hyperammonemia) is a key element in the development of brain
edema associated with hepatic encephalopathy. For over a century it has been known that
transient cell exposure to NH3/NH4+ induces characteristic changes in intracellular pH (pHi).
This maneuver is commonly used nowadays to study pH regulatory mechanisms. Based on
theoretical considerations, it has also been hypothesized, but not demonstrated, that intracel-
lular NH4+ accumulation following NH3/NH4+ exposure must result in cell swelling.
In this work we used the intracellular fluorescent indicator BCECF and quantitative
fluorescence microscopy to study the effects of NH3/NH4+ on cell water volume (CWV) and
pHi in single, differentiated neuroblastoma cells (N1E-115) in vitro. CWV is determined from
the emitted fluorescence after exciting BCECF at its intracellular isosbestic point (IP; ~438
nm), which is insensitive to pH but sensitive to changes in the dye’s concentration, and from
which changes in CWV are estimated. pHi was measured from the ratio of collected fluores-
cence when exciting BCECF at 495 nm (i.e. the pH-sensitive wavelength) and at its IP.

We found that short exposure to isosmotic solutions containing NH3/NH4+ (NH4Cl 0.5-30
mM) induces parallel changes in pHi and CWV, which can be defined as having four phases:
1) an initial increase in both pHi and CWV. 2) A slow intracellular acidification, paralleled by
a regulatory volume decrease (in isosmotic media; iRVD). NH4Cl removal produces 3) a
marked, simultaneous fall in both pHi and CWV, followed by 4) a partial or complete recovery
phase of both pHi and CWV. By independently varying the NH3 and NH4+ concentrations in
the experimental solutions, we found that both the pHi increase and the cell swelling depend
on external NH3 concentration, rather than on external NH4+ concentration. The initial
alkalinization can be readily explained by the protonation of rapidly entering NH3, forming
intracellular NH4+ (NH3 + H+ → NH4+). About 60% of the initial CWV increase can be
accounted for by intracellular accumulation of NH4+ and an unidentified accompanying anion,
the latter being required to preserve electroneutrality. The remaining of the swelling does not
seem to be due to influx of Cl- or Na+, or intracellular accumulation of glutamine, an osmolyte
synthesized by the enzyme glutamine synthetase from NH3 and glutamate and proposed to
mediate the brain edema seen during acute hyperammonemia. The gradual acidification
following the initial increase in pHi (phase 2) is mainly due to NH4+ influx governed by its
electrochemical gradient. NH4+ influx is mediated, at least in part, by Ba2+-sensitive K+
channels, and possibly by the Na+,K+,2Cl- cotransporter. Both Gd3+ and NPPB block the iRVD
that develops in parallel with this acidification, suggesting that stretch-activated cation
channels, as well as anion channels, play a role in the iRVD. The iRVD is also partially
blocked by Ba2+, suggesting the involvement of K+ channels in this regulatory process. In
addition, our findings indicate that the iRVD may be modulated by changes in pHi. We
conclude that the pair NH3/NH4+ induces changes in cell volume, which are the consequence
of direct osmotic effects. Although the pathophysiological implications of this in vitro model
are clearly limited, we believe that this model represents a valuable tool to study the changes
produced by hyperammonemia in neural cells.

2
Abreviaturas empleadas:

VCA: volumen celular acuoso; pHi: pH intracelular; DRV: disminución reguladora del
volumen; DRVi: disminución reguladora del volumen en medio isosmótico; ARV: aumento
regulador del volumen; ARVi: aumento regulador del volumen en medio isosmótico. BCECF:
2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-6-carboxifluoresceina; HE: encefalopatía hepática; GS: glutamina
sintetasa; BHE: barrera hematoencefálica. LCR: líquido cefalorraquídeo.

3
1. INTRODUCCIÓN

El objetivo general del presente trabajo es estudiar los mecanismos y la dinámica de los
cambios de volumen y de pH que ocurren en células nerviosas al ser expuestas a medios
conteniendo amoníaco (NH3) y amonio (NH4+). Para ello se utiliza una nueva metodología de
microscopía de fluorescencia cuantitativa, desarrollada y validada en nuestro laboratorio, que
permite el registro continuo y simultáneo del volumen celular acuoso (VCA) y del pH intrace-
lular (pHi) en células individuales mantenidas in vitro, mediante el uso de marcadores fluores-
centes. Como modelo de neurona se utilizó una línea celular, N1E-115, proveniente de un
neuroblastoma de ratón.
Estos estudios son importantes desde dos puntos de vista: uno eminentemente biofísico, el
otro fisiopatológico. Desde la perspectiva biofísica, la exposición transitoria al par amonía-
co/amonio (NH3/NH4+) constituye una maniobra experimental comúnmente usada para alterar
de manera predecible y controlada el pHi y poder estudiar sus mecanismos de regulación, así
como toda función celular que sea a su vez modulada por cambios en el pHi. Como veremos,
estos cambios en el pHi se acompañan de cambios significativos en el volumen celular acuoso
cuya ocurrencia, sospechada desde hace muchos años, nunca ha sido objeto de estudio cuanti-
tativo y sistemático. Desde la perspectiva fisiopatológica, el modelo experimental y la metodo-
logía empleados constituyen una nueva estrategia para estudiar, in vitro y a nivel celular y
molecular, la fisiopatología de las hiperamonemias agudas. Estas últimas se caracterizan por
generar trastornos en el equilibrio osmótico y metabólico de las neuronas y las células gliales
como consecuencia, en la mayoría de los casos, de una insuficiencia hepática aguda, que pue-
de culminar con la muerte del individuo por edema cerebral. Los mecanismos a escala celular
y molecular subyacentes a estas alteraciones del equilibrio osmótico celular se desconocen.

Esta Introducción consta de dos partes. En la primera se abordan aspectos básicos de la

homeostasis del gas NH3 y del ión NH4+ en los vertebrados, así como los fundamentos teóricos
y empíricos de la presente investigación. Asimismo, se consideran en cierto detalle los meca-
nismos fisiopatogénicos del edema cerebral por hiperamonemia. En la segunda parte se revi-
san los fundamentos básicos del control del volumen celular.

4
 Parte I

1.1 Aspectos fisiológicos del amoníaco y del amonio. La base neutra NH3 y su ácido conju-
gado, el ion NH4+, juegan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del nitróge-
no en los organismos vivos. No obstante su importancia fisiológica en el metabolismo, estas
sustancias son tóxicas a concentraciones extracelulares elevadas. El par NH3/NH4+ se genera
principalmente a partir del catabo-
lismo proteico, resultando además
de otros procesos como el metabo-
lismo de los ácidos nucleicos (pu-
rinas), de las metilaminas y de la
creatina. Si bien el par NH3/NH4+
es muy soluble en agua, los ani-
males requieren de grandes canti-
dades de agua para mantener la
concentración de estas sustancias
por debajo de los niveles tóxicos.
La disponibilidad de agua es, por
lo tanto, uno de los factores deter-
minantes de la forma bajo la cual
se excretan los productos finales
Figura 1. Metabolismo del nitrógeno en los animales. Los
animales utilizan el nitrógeno (proveniente de la dieta) para la
del metabolismo del nitrógeno. La
síntesis de proteínas y ácidos nucleicos, principalmente. La mayoría de los organismos acuá-
degradación de estas moléculas resulta en la producción de
NH3/NH4+. En los diversos grupos de animales, estas sustancias ticos excreta principalmente NH3.
se eliminan bajo tres formas principales: NH3, urea y ácido úrico.
Los vertebrados terrestres (y algu-
nos acuáticos), por el contrario, incorporan el NH3 a dos productos metabólicos principales: el
ácido úrico y la urea (Fig. 1). Estas sustancias pueden existir en concentraciones mayores que
el NH3/NH4+ en los fluidos corporales, con la ventaja de ser menos tóxicas y de requerir
menos agua para su eliminación. A través de la formación de ácido úrico y urea se favorece a
un mismo tiempo la retención de agua y la eliminación de desechos nitrogenados

5
(NH3/NH4+) potencialmente tóxicos1,2. El ácido úrico resulta del metabolismo de los ácidos
nucleicos (purinas). A diferencia del resto de los mamíferos, los primates no tienen la enzima
urato oxidasa (uricasa), por lo que eliminan, por vía renal, ácido úrico además de urea. En el
hombre, varios gramos de NH3/NH4+ pasan diariamente por las venas del sistema portal
hepático3,4, siendo metabolizados en el hígado a través de dos procesos secuenciales: la sínte-
sis de urea y, en menor grado, de glutamina5,6 (Fig. 2A).

Figura 2. Metabolismo del par amoníaco/amonio en varios órganos. A) Hígado. El NH3/NH4+ producido
por la degradación de proteínas en los intestinos se metaboliza en el hígado a través de la síntesis de urea en
los hepatocitos periportales, y en menor grado de glutamina (Gln), en los hepatocitos perivenosos7,8. La forma-
ción de glutamina está catalizada por la enzima glutamina-sintetasa (GS). B) Riñón. La mayor parte del NH4+
renal se genera en los túbulos contorneados proximales (TCP) de las nefronas9,10. El NH4+ se produce a partir
de la conversión de glutamina a glutamato y a α-cetoglutarato, a través de reacciones secuenciales mediadas
por las enzimas glutaminasa (G) y glutamato dehidrogenasa (GDH)12,13. En condiciones fisiológicas, aproxima-
damente dos tercios del NH4+ derivado de la glutamina es eliminado en la orina11. El metabolismo del α-ceto-
glutarato resulta en la producción de 2 moléculas de HCO3-, que son cotransportadas con Na+, hacia el
intersticio, a través de la membrana basolateral. Esto contribuye a la eliminación neta de ácido en la orina. A
través de dicha membrana, el NH4+ ingresa a la células vía la bomba de Na+/K+14 y por intercambio con K+10.
Todo esto resulta en una tendencia al acúmulo intracelular de NH4+, generándose un gradiente para la salida
de este ión, que es transportado apicalmente hacia el lumen tubular por el intercambiador de Na+/H+,
principalmente15. De esta manera se secreta amonio en el TCP para su posterior absorción y eliminación a
través del resto del sistema tubular renal. Así, en los túbulos ascendentes del asa de Henle (TA) se lleva a cabo
el transporte de NH4+ desde la luz tubular hacia el espacio intersticial de las nefronas, desde donde es a su vez
transportado hacia los túbulos colectores (TC). En los TA, el transporte de NH4+ a través de la membrana
apical está mediado principalmente por el triple cotransportador de Na+,K+(NH4+),2Cl- (NKCC2), y por los
intercambiadores de K+/NH4+ (H+) y de Na+/H+(NH4+), así como por una vía electroconductiva no selectiva a
cationes16,17. El transporte de NH4+ desde las células del TA hacia el intersticio ocurre a través de la membra-
na basolateral de éstas, y está mediado principalmente por el intercambiador de Na+/H+(NH4+), y en menor
grado por la bomba de Na+/K+(NH4+), el cotransportador de K+ (NH4+),Cl- y una vía electroconductiva17. La
salida pasiva de NH3, para el cual la membrana basolateral de las células del TA presenta una permeabilidad
mayor que la exhibida por la apical, contribuye al eflujo de NH4+. Este último es incorporado a las células del
TC a través de al menos dos sistemas de transporte, el cotransportador de Na+,K+(NH4+),2Cl- (NKCC1) y la
bomba de Na+/K+(NH4+), localizados en la membrana basolateral18. Previo a su eliminación por la orina, la
secreción de NH4+ hacia el lumen tubular ocurre, según el modelo más aceptado, a través de la difusión pasiva
de NH3 por la membrana apical, paralelamente a la secreción de H+ por medio de una bomba19. Estudios
recientes postulan que el NH4+ podría ser transportado selectivamente a través de esta membrana por medio de
la glucoproteína RhCG20. C) Músculo esquelético. En el músculo esquelético el NH4+ se utiliza principalmente
en la generación de alanina, a partir de glutamato y piruvato, en una reacción mediada por la enzima alanina
aminotransferasa (AAT)21. Además, el glutamato junto con el NH3(NH4+) forma glutamina por medio de una
reacción catalizada por la GS. D) Ciclo de la glutamina y el glutamato en el cerebro. Parte del glutamato libe-
rado por las neuronas en las terminales sinápticas excitadoras es captado por los astrocitos, en donde es con-
vertido a glutamina por la enzima GS, en una reacción que consume NH3(NH4+). La glutamina liberada por los
astrocitos al espacio extracelular es a su vez captada por las neuronas, en donde es convertida a glutamato por
la enzima glutaminasa, en una reacción que produce NH3(NH4+)22,23.

6
7
1. 2 Metabolismo del amonio en el cerebro. Las evidencias experimentales indican que el
par NH3/NH4+ entra al cerebro principalmente como NH3, y que lo hace por vías difusivas
antes que por sistemas de transporte saturables24-28. Para un amplio margen de concentraciones
(hasta 25 mM), el índice de incorporación de NH3/NH4+ en el cerebro es independiente de la
concentración de NH3/NH4+ en la sangre29. En un estudio realizado en primates, utilizando
trazadores de nitrógeno (13N), se propuso que la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
(BHE) al NH4+ representa apenas ~0.5% de la permeabilidad al NH330. Sin embargo, debido a
que la concentración de NH4+ en la sangre es considerablemente mayor que la de NH3, y dado
que las células endoteliales que conforman la BHE presentan diversos mecanismos de trans-
porte iónico capaces de mediar el transporte de NH4+, se considera que una fracción
importante (~20%) del NH3/NH4+ ingresa al cerebro como NH4+31,32. Es importante destacar
aquí, con relación a una de las hipótesis centrales del presente trabajo, que la entrada pasiva de
NH3 al cerebro resulta en una rápida generación de NH4+ en el parénquima nervioso, supo-
niendo que existen, inicialmente, diferencias entre el pH del cerebro y el de la sangre (ver
abajo).
En condiciones normales, el contenido de NH3/NH4+ en el cerebro duplica aproximada-
mente al de la sangre, que es de ~40-50 µM en los seres humanos33. Esto se debe principal-
mente a que la proporción relativa de NH3 y NH4+ en los líquidos biológicos está determinada
por el pH, siendo éste más ácido en las células cerebrales que en la sangre. De manera
consistente, una serie de estudios muestra que los efectos tóxicos del NH3/NH4+ son mayores
cuanto mayor es el pH de la sangre 24,34.
Al igual que en otros órganos extrahepáticos, la remoción del NH3/NH4+ en el cerebro
(proveniente de la sangre ó generado por el propio tejido) tiene lugar, principalmente, a través
de la formación de glutamina, un aminoácido neutro, en una reacción mediada por la enzima
glutamina sintetasa (GS) 27,35:

NH3 + glutamato + ATP → glutamina + ADP + Pi (Rx. 1)

La enzima GS se expresa principalmente en los astrocitos36,37 y en menor proporción en las

neuronas38, células en donde se ha estimado que podría residir ~20% de la actividad total de la

8
GS en el cerebro de rata39. La presencia de la enzima GS se demostró además en oligodendro-
citos40,41 y en células de neuroblastoma Neuro-2a42, NG-108 y N1E-115, modelo, este último,
utilizado en el presente trabajo (resultados propios, no publicados).
La glutamina sintetizada en los astrocitos y liberada al medio extracelular puede ser
transportada a la sangre a través de la BHE43, puede ser recaptada por los astrocitos, o puede
ingresar a las neuronas, en donde es convertida a glutamato en una reacción mediada por la
enzima glutaminasa (G), que resulta en la producción de NH3/NH4+:

glutamina + H2O → glutamato + NH3 (Rx. 2)

Parte del glutamato liberado por las neuronas durante la neurotransmisión es captado por
los astrocitos, estableciéndose así lo que se conoce como el “ciclo de la glutamina y el
glutamato” (Fig. 2D). A pesar de que la existencia de este ciclo es ampliamente reconocida,
tanto en organismos invertebrados como en vertebrados, su importancia fisiológica es aún
incierta, pues tanto en astrocitos como en neuronas, diversas reacciones enzimáticas, además
de aquellas catalizadas por las enzimas GS y G, utilizan como substratos a la glutamina y al
glutamato mediando así la transferencia de NH3/NH4+. Por ejemplo, en ambos tipos celulares,
el glutamato puede ser desaminado produciendo α-cetoglutarato y NH3/NH4+, en una reacción
reversible mediada por la enzima glutamato dehidrogenasa (GDH):

glutamato + NAD(P)+ + H2O ⇆ α-cetoglutarato + NAD(P)H + NH4+ (Rx. 3)

La glutamina puede ser también utilizada por los astrocitos como sustrato energético, ó
puede ser convertida a α-cetoglutarato y NH3 por la acción de la glutamina aminotransferasa y
la ω-amidasa, enzimas cuya actividad es muy marcada en los plexos coroideos44. Interesan-
temente, los niveles de α-cetoglutaramato, metabolito intermediario entre una y otra reacción
enzimática, se ven aumentados en el LCR de pacientes en coma hepático45. Finalmente, otra
reacción generadora de NH3/NH4+ en el cerebro es la mediada por la AMPdeaminasa, enzima
que interviene en el ciclo de las purinas y utiliza como sustrato al aspartato46.

9
1.3. Efectos del par NH3/NH4+ sobre el volumen celular acuoso y el pH intracelular. La
exposición de células al par NH3/NH4+ es una maniobra experimental común para inducir
cambios en el pHi y estudiar los mecanismos celulares que median el transporte de ácidos y
bases a través de las membranas47,48.
En la mayoría de las células, la exposición a sales de amonio (comúnmente cloruro de
amonio, NH4Cl) induce una alcalinización intracelular, de amplitud y curso variado, que
refleja característicamente cuán permeables son sus membranas plasmáticas al NH349-51. El
NH3 es un gas de bajo peso molecular qué, con notables excepciones52-55, atraviesa con
facilidad la membrana plasmática. En células de mamiferos, la permeabilidad de esta última al
NH3 varía, de acuerdo con el tipo celular estudiado, entre ~10 y 1000 µm/s56. Por otro lado, el
NH4+ es un catión, que al igual que otros iones, puede cruzar la membrana a través de vías
electrodifusivas (canales), y/o sistemas de transporte primario (ej: la Na+/K+ ATPasa) o
secundario (ej: cotransportador Na+,K+,2Cl-) (véase Fig. 2B y Ref. 56. La tasa de difusión del
NH4+ a través de las membranas celulares es, por lo general, de cuatro a cinco órdenes de
magnitud menor que la del NH357. Algunas excepciones son los astrocitos cerebrales de ratón
neonato58 y los ovocitos de Xenopus59, que exhiben una alta permeabilidad relativa al NH4+.

En solución acuosa, la base libre NH3 está en equilibrio con su ácido débil conjugado
NH4+:

NH3 + H+ ⇆ NH4+ (Rx. 4)

y de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch,

pH = pKa + log ([NH3]/[NH4+]) (1)

El pK de esta reacción (es decir, el pH al cual las concentraciones de NH3 y NH4+ son
iguales, [NH3] = [NH4+]), es de ~9.25 a 25 ºC y de ~9.0 a 37 ºC60,61. La conversión entre NH3
y NH4+ es extremadamente rápida: la constante de protonación del NH3 es 4,3 x 1010 M-1.s-1,
con un tiempo de relajación de ~12 µs62. A pH fisiológico (~7,1-7,4), el equilibrio de la

reacción NH3 + H+ ⇆ NH4+ (con un pK de ~9,25 a 25 ºC) se halla desplazado hacia la

10
formación de NH4+, de tal manera que la [NH4+] excede a la [NH3] en ~100 veces. En estas
circunstancias, un influjo de NH3 que exceda en ~1% al influjo de NH4+ bastará para inducir
una alcalinización intracelular, resultante de la protonación del NH3 en el interior de las
células. La consecuente formación de NH4+ implica una ganancia neta de osmolitos, es decir,
partículas osmóticamente activas. La magnitud de esta acumulación puede estimarse si se
conoce la concentración extracelular de NH3/NH4+, el pH intracelular y el pH extracelular:

[NH4+]i = [NH4+]o x 10 pHo – pHi (2)

La acumulación intracelular de osmolitos favorece el influjo osmótico de agua y por tanto,

el aumento en el volumen acuoso de las células.

Los cambios de pHi resultantes de la exposición de las células a medios conteniendo

NH3/NH4+, así como los mecanismos que les subyacen, se conocen con gran detalle. En con-
traste, los mecanismos y la cinética del aumento de volumen neuronal y glial durante episo-
dios de hiperamonemia (ver sección 1.6), o durante la exposición experimental al par
NH3/NH4+, se desconocen. Más aún, la posibilidad de que la acumulación de NH4+ contribuya
al aumento del volumen acuoso de neuronas y células gliales, y que estos cambios a escala
unitaria subyazcan al edema cerebral que acompaña a las hiperamonemias, no ha sido, extra-
ñamente, considerada. Una de las hipótesis planteadas en este trabajo sostiene que la acumula-
ción de NH4+, en conjunto con otros factores (entre ellos un probable aumento en la concentra-
ción de glutamina), es responsable del aumento inicial de volumen observado en células
nerviosas expuestas al par NH3/NH4+.
Experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio permitieron identificar, por
vez primera y en “tiempo real”, la ocurrencia de cambios paralelos de volumen y de pHi en
células nerviosas individuales expuestas al par NH3/NH4+63-65. En el presente trabajo se expone
una caracterización detallada de estas respuestas y se exploran los mecanismos que les
subyacen.

11
1.3.1 Modelo teórico de los cambios de volumen celular acuoso y de pH intracelular
inducidos por la exposición a NH3/NH4+. Cuando una célula animal es expuesta a una
solución que contiene NH3/NH4+, bajo la forma de NH4Cl (cloruro de amonio), por ejemplo, la
base neutra NH3, liposoluble, ingresa rápidamente a la célula (flecha 1, Fig. 3, izq.) y se asocia
con un protón, formando NH4+. La caída resultante en la concentración de protones libres
ocasiona un incremento en el pHi, que se conoce como "carga alcalina" (segmento 1→2, trazo
de pHi). Esta alcalinización ocurre a expensas de una ganancia de partículas osmóticamente
activas (NH4+), que de acuerdo con nuestra hipótesis, contribuiría al aumento inicial de
volumen celular acuoso observado durante la exposición de las células a NH3/NH4+ (véase el
trazo de volumen celular acuoso, VCA, en la Fig. 3). La ocurrencia de cambios en el VCA
ante la exposición a NH3/NH4+ fue propuesta hace muchos años por Jacobs (1940)50, a partir
de consideraciones teóricas y experimentos en lo que observó que soluciones conteniendo
NH3/NH4+ producen hemólisis en suspensiones de eritrocitos. No obstante su importancia
biofísica y fisiopatológica, estos cambios en el VCA no habían sido estudiados hasta el
presente.

12
 Tras la exposición al par NH3/NH4+, la fase de alcalinización intracelular inicial se prolon-
gará, teóricamente, hasta que el NH3 alcance un estado de equilibrio (es decir, hasta que
[NH3]i = [NH3]o), lográndose así un nuevo estado estacionario en el pHi, alcalino con respecto
al pHi previo. La magnitud y la tasa de incremento del pHi dependen, al menos, de cinco
factores66: 1) ambos parámetros están inversamente relacionados con el poder de tampona-
miento celular (β; véase Sección 1.4); 2) la magnitud del cambio será mayor cuanto menor sea
el pHi inicial. Esto se debe a que, en estas condiciones, el pHi se aparta más del pK del
NH3/NH4+, y existe una mayor disponibilidad de protones para formar NH4+; 3) la magnitud
del cambio alcalino es función de la concentración de NH3; 4) La tasa y la magnitud del
aumento del pHi serán menores cuanto mayor sea la permeabilidad relativa de la membrana
plasmática para el NH4+, pues la entrada de este catión tiende a acidificar el interior celular; 5)
ambos parámetros se verán disminuidos y aún invertidos de signo, en células provistas de
mecanismos activos de transporte de cargas ácidas, cuya acción contrarrestaría, en grado
diverso, los efectos alcalinizantes del influjo de NH3.

En el presente trabajo se hipotetiza que si el aumento inicial de volumen se debe a una

acumulación rápida de NH4+, como resultado de la entrada de NH3, su magnitud debería
depender asimismo de β, del pHi inicial, y de la [NH3]o. En células con una alta permeabilidad
al NH4+, la magnitud del aumento debería además depender de la [NH4+]o.

A la alcalinización inicial mediada por el influjo de NH3 le sigue, por lo común, una fase
de descenso lento y gradual del pHi (Fig. 3, trazo de pHi). Esta fase, conocida comúnmente
como “acidificación del plateau,” puede resultar, en parte, de la activación de mecanismos de
regulación del pHi (ej: intercambiador Cl-/HCO3-), pero está determinada básicamente por la

Figura 3. Modelo hipotético de los cambios inducidos por el par NH3/NH4+ en el volumen celular acuoso
y en el pHi. Cuando una célula es expuesta a una solución conteniendo NH4Cl se observa una alcalinización
inicial, que se acompaña de un aumento del volumen celular (VCA) y una despolarización de la membrana
celular (parte derecha, trazos de pHi, VCA y Em, respectivamente). Los cambios de pHi y VCA resultan del
influjo pasivo de NH3 y la formación subsecuente de NH4+ en el interior de las células (flechas 1 y 2,
respectivamente, en el esquema de la izquierda). En el esquema de la célula (parte izquierda de la figura) se
ilustran los sistemas de transporte que pueden mediar la entrada directa de NH4+ a las células (etiquetados
con el número 3), así como los principales sistemas de transporte de ácidos y bases que podrían activarse por
cambios en el pHi y que en su operar, también producen cambios en el VCA (etiquetados con el número 5).

13
continua acumulación intracelular de protones provenientes de la entrada y posterior
disociación del NH4+. Como consecuencia de este proceso, la [NH3]i supera ligeramente a la
[NH3]o, originán-dose un gradiente que favorece el eflujo del NH3. Cada molécula de NH3 que
sale de la célula determina una acumulación neta de un protón intracelular. De este modo se
establece un circuito dinámico en el que el NH4+ entra y el NH3 sale de las células (Fig. 3,
flechas 3 →2 →1 →4). El influjo y el eflujo netos de NH4+ y NH3 respectivamente,
determinan la acumulación continua de NH4+ en el citosol, favoreciendo la entrada osmótica
de agua con el consecuente aumento del volumen celular. La formación de NH4+ se verá más
favorecida cuanto más ácida se torne la célula.
No obstante la acumulación progresiva de partículas osmóticamente activas (NH4+ y
probablemente un anión acompañante, necesario para mantener la electroneutralidad), en
paralelo con la acidificación del plateau las células disminuyen de volumen. Esta respuesta
osmótica indica que el eflujo neto de osmolitos y agua durante este período contrarresta y
supera a los influjos correspondientes. Dado que esta respuesta reguladora ocurre en un medio
isosmótico, en este trabajo se la denominará disminución reguladora del volumen isosmótica
(DRVi), para diferenciarla de la DRV, que es la respuesta osmótica comúnmente estudiada
ante la exposición de células a un medio hiposmótico. Uno de los objetivos del presente trabajo
es estudiar la cinética y los mecanismos de la DRVi.

1.3.2 Vías de transporte de NH4+ a través de la membrana plasmática. La identificación, por

homología de secuencia, de proteínas que transportan NH4+ con alta afinidad en levaduras
(Mep) y plantas (Amt) condujo a la caracterización de una familia de proteínas transportadoras
de NH4+67,68, representada en el hombre por las proteínas Rh de los antígenos sanguíneos69,70.
Aún cuando faltan pruebas definitivas, recientemente se postuló que estas proteínas (v.g.
RhCG y RhBG) podrían mediar el transporte específico de NH4+ en los túbulos renales20,71. En
éstos últimos se identificó, además, un intercambiador selectivo de NH4+/K+72. Con la posible
excepción de estos sistemas, no se conocen mecanismos específicos del transporte de NH4+ en
los vertebrados. Este ión comparte con el K+ ciertas propiedades fisicoquímicas; por ejemplo,
ambos tienen un radio iónico hidratado y un coeficiente de difusión similares. Es por esto que,
en diversos tipos de células animales, el transporte de NH4+ a través de las membranas ocurre,

14
con preferencia, a través de canales o transportadores acoplados que median el transporte de
K+ (ver Fig. 3). Dada la importancia del par NH3/NH4+ en el equilibrio ácido-base de los
organismos, el transporte de NH4+ se estudió, básicamente, en los diferentes segmentos que
conforman los túbulos renales (Fig. 2B). Entre las vías que median el transporte de NH4+ en el
epitelio renal y en otros tipos celulares se cuentan: 1) canales de K+58,73; 2) canales catiónicos
no selectivos74; 3) el intercambiador de Na+/H+(NH4+)75; 4) el triple cotransportador de
Na+,K+(NH4+),2Cl-58,73,76,77 y 5) la Na+/K+(NH4+) ATPasa 73,76.

1.4 Regulación del pH intracelular y su relación con el volumen celular. Las actividades
metabólicas de las células eucariotas se desarrollan en un medio interno que presenta un pH
óptimo y controlado. La actividad de enzimas claves del metabolismo celular, la estabilidad
del citoesqueleto, la conductancia de ciertos canales iónicos y los niveles de algunas moléculas
de transducción de señales, por ejemplo, dependen críticamente del pH intracelular78-81. El ión
H+ puede considerarse, de hecho, como un “segundo mensajero” más, de mucha importancia,
entre aquellos que participan en la señalización y el metabolismo celular81-85. Con relación al
pH que presentan, en condiciones normales, el plasma y el medio extracelular (pHe), los
valores de pHi registrados en la mayoría de las células in vivo e in vitro (generalmente entre
7.0-7.4) son más altos de lo que cabría esperar si existiese una distribución pasiva de H+ a
través de la membrana plasmática. Esto se debe a que, en condiciones fisiológicas, el pHi es
regulado de manera activa a través de mecanismos de transporte que median la expulsión de
equivalentes ácidos, ó la incorporación de equivalentes básicos, alcalinizando el interior
celular. Estos sistemas, que mantienen al pH fuera de equilibrio termodinámico, incluyen
canales y bombas de protones (H+-ATPasas), intercambiadores iónicos (v.g. K+/H+, Na+/H+,
Cl-/HCO3-) y cotransportadores (Na+-HCO3-)81,86.
A nivel organísmico, el control primario del pH tiene lugar en los pulmones (o en estructu-
ras análogas, dependiendo de la especie animal), lugar donde se regula, a través de la respira-
ción, la presión parcial de CO2 de la sangre. Los riñones, asimismo, contribuyen de manera
importante al equilibrio ácido-base al controlar, principalmente, la generación y la eliminación
de NH4+ y HCO3-. A nivel celular, la regulación y el mantenimiento del pHi dependen, por otro
lado, de la capacidad de las células de amortiguar los cambios de pHi. Este poder ó capacidad

15
de tamponamiento del pHi (“buffering power”) está en parte determinado por la presencia de
aniones intracelulares capaces de unirse a protones libres, y “adsorber”, ó neutralizar, de este
modo, cambios eventuales del pHi87. A la capacidad de tamponamiento del pHi contribuye
también la presencia de HCO3- en las células, el cual se combina con H+ formando ácido car-
bónico, que es a su vez convertido en CO2 y H2O a través de una reacción reversible catalizada
por la enzima anhidrasa carbónica. Así, en la práctica es posible distinguir dos sistemas inde-
pendientes pero aditivos de tamponamiento del pHi: a) un sistema de tamponamiento “intrín-
seco” (βI), que no incluye los efectos del tampón CO2/HCO3-, y comprende tanto a los proce-
sos fisicoquímicos que afectan a las bases y los ácidos intracelulares, como a aquellos deriva-
dos de procesos metabólicos y de las propiedades específicas de los organelos celulares, y b)
un sistema de tamponamiento dependiente de la presencia de CO2/HCO3- (βCO2)88. La suma de
las capacidades de tamponamiento parciales (βI + βCO2) da lugar al poder de tamponamiento
‘total’ de las células (βT). La mayoría de los diseños experimentales (incluyendo aquellos que
conforman el presente trabajo) incluyen la medición del pHi en ausencia virtual de CO2/HCO3-
usando, generalmente, tampones como el TRIS o el HEPES. Los resultados obtenidos en estos
casos deben ser interpretados con cautela al tratar de correlacionarlos con lo que ocurre en el
organismo vivo, en donde el tampón βCO2 influye de manera importante en las respuestas de
pHi.

Existe una relación estrecha entre el volumen celular y el pHi que queda manifiesta al
evaluar la actividad de ciertos sistemas de transporte, como los intercambiadores Na+/H+ y Cl-
/HCO3-, tanto durante perturbaciones osmóticas como ante cambios del pHi. La activación de
estos mecanismos altera el balance intracelular de equivalentes ácidos y básicos, así como las
concentraciones de Na+ y Cl- dentro de las células, afectando de este modo el volumen y el pH
celular89-91. Más aún, la actividad de numerosos canales iónicos, entre ellos algunos de K+,
Na+ y Ca2+, está modulada por el pH80,92,93, por lo que la composición iónica y la osmolaridad
intracelular pueden variar como consecuencia de las variaciones en el pH intra o extracelular.
En el sistema nervioso, el pH de las neuronas, las células gliales y el espacio extracelular
está sujeto a cambios transitorios debidos a la actividad neuronal mediada por neurotransmiso-
res u hormonas94,95. Los cambios patológicos en el pH cerebral son comunes, por otro lado, en

16
condiciones de isquemia, anoxia, hipoxia y epilepsia96,97. En estos casos, la activación de
mecanismos reguladores del pHi, especialmente de los intercambiadores Na+/H+ y Cl-/HCO3-,
puede contribuir al establecimiento de edema98.
Hasta el momento no existen medidas simultáneas del pHi y del volumen acuoso celular
que permitan correlacionar el curso temporal e investigar los mecanismos específicos que
median los cambios producidos en uno y otro parámetro durante fenómenos fisiológicos ó
patológicos. La técnica experimental presentada en el presente trabajo permite tales medicio-
nes, y constituye por lo tanto una herramienta valiosa para estudiar estos aspectos básicos de la
fisiología celular.

1.5 Homeostasis del volumen en células neurales. El cerebro de los vertebrados superiores
difiere notablemente de los órganos periféricos en cuanto a las propiedades físicas y dinámicas
que gobiernan la homeostasis del volumen celular. Dado que el cerebro se encuentra contenido
en un estuche óseo rígido, su volumen total debe permanecer constante99,100. Esta imposición
física implica que, en el tejido nervioso, las alteraciones del volumen intra o extracelular
deban ser acompañadas de cambios compensatorios recíprocos en los fluidos que lo irrigan y
lo drenan, es decir la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR). En circunstancias extremas,
los aumentos de la presión intracraneal a consecuencia de aumentos en el volumen cerebral
(edema), ó de alteraciones hemodinámicas en el sistema cerebrovascular, conducen a un
desplazamiento caudal del parénquima nervioso a través del foramen magnum que puede
ocasionar la muerte por paro cardio-respiratorio101. Si bien la actividad neuroendócrina, repre-
sentada por la acción de hormonas como la vasopresina y el factor natriurético auricular, y de
modo general, la función renal, regulan de manera eficiente el equilibrio osmótico sistémico y
cerebral, es a través del transporte regulado de agua y solutos en la barrera hematoencefálica
(BHE), donde se ejerce el control primario del balance osmótico entre los compartimientos
cerebrales en que se distribuye el volumen acuoso cerebral (sangre, LCR, espacios intra y
extracelular). En situaciones de desequilibrio osmótico del plasma, el ajuste inicial del volu-
men cerebral acuoso es amortiguado pasivamente por la BHE, mediante los gradientes osmóti-
cos inmediatos generados en el lumen capilar y el espacio perivascular, que distribuyen el

17
flujo de agua a través de la misma y previenen correcciones desmedidas del volumen
celular102,103.
En condiciones fisiológicas, las neuronas enfrentan un riesgo potencial e importante de
sufrir un desbalance osmótico a raíz de los continuos trasvases de solutos y agua a través de
sus membranas, que resultan de la actividad eléctrica y de la formación y el consumo metabó-
lico de solutos orgánicos. Este riesgo se acentúa porque las neuronas poseen un cociente volu-
men/superficie bajo y porque el espacio extracelular, en el sistema nervioso central, es caracte-
rísticamente restringido. Durante la actividad eléctrica, sináptica o axónica, por ejemplo, el
balance iónico entre los medios intra y extracelular, y por lo tanto el volumen celular, se ven
alterados a causa de los fenomenos de despolarización y repolarización neuronal104-106. Se cree
que los astrocitos actúan, tanto en este caso, como a nivel de la BHE y en general, durante
otros procesos que alteran el balance hidrosmótico cerebral, como amortiguadores (“buffers”)
qué, al modificar su volumen, restablecen y preservan el equilibrio osmótico en el entorno
neuronal107. De acuerdo con esta hipótesis, el K+ que se acumula en el espacio extracelular tras
la repolarización neuronal es captado por los astrocitos y distribuido por la red astrocitaria a
traves de uniones comunicantes (“gap junctions”). De esta manera, los efectos sobre la excita-
bilidad y el volumen que resultarían en células individuales a causa de un aumento en el K+
externo, se “disipan” a lo largo del sincicio astroglial.

1.6 Alteraciones del volumen celular en el sistema nervioso central producidas por
hiperamonemia. Uno de los ejemplos más relevantes de alteración osmótica que pueden
sufrir las células cerebrales durante ciertos procesos patológicos lo constituye el aumento del
volumen celular provocado por la presencia de niveles incrementados de amoníaco (NH3) y
amonio (NH4+) en la sangre. Esta condición, conocida como hiperamonemia, se observa con
frecuencia en varios trastornos crónicos o agudos de la función hepática tales como la hepatitis
viral aguda, el sindrome de Reye, la enfermedad de Wilson, o algunas reacciones tóxicas
frente a ciertos fármacos, como el acetaminofén108.
La encefalopatía hepática (EH) es un sindrome neurosiquiátrico complejo que caracteriza a
los transtornos hepáticos agudos aunque puede presentarse, ocasionalmente, durante disfun-
ciones crónicas del hígado109-112. La EH resultante de transtornos crónicos de la función hepá-

18
tica presenta un desarrollo lento, caracterizado por alteraciones del sueño y cambios en la
personalidad. En estadios avanzados, la EH puede desembocar en la muerte por coma hepático
y se observa una disfunción astroglial generalizada, caracterizada por cambios morfológicos
(astrocitosis de tipo II) y metabólicos113. La EH derivada de fallas hepáticas agudas, por el
contrario, presenta un curso rápido y tras la aparición de sígnos característicos (agitación
psicomotora, convulsiones, etc.) puede derivar en estupor y coma en el transcurso de horas o
días109. El desarrollo de edema cerebral eminentemente citotóxico* es característico de los
estadíos avanzados de esta EH 114,115. La opinión generalizada indica, como se verá en mayor
detalle en los párrafos siguientes, que el aumento de volumen del cerebro es debido a un
edema predominantemente astroglial116-118.
La alta tasa de mortalidad de los transtornos hepáticos agudos resulta principalmente de la
hipertension intracraneal generada por el edema cerebral masivo, que puede culminar con la
herniación del tallo cerebral. Si bien, como se dijo, la hiperamonemia acompaña tanto a los
transtornos hepáticos crónicos como a los agudos, el edema cerebral como factor de mortali-
dad es preponderante en estos últimos. Esta circunstancia podría deberse a que las células,
constituidas en tejidos y órganos, no son completamente capaces de adaptarse a, ó revertir,
cambios súbitos en el equilibrio osmótico intra y extracelular.

1.6.1 Fisiopatología del edema cerebral inducido por NH3/NH4+. Investigaciones recientes
demuestran que los niveles sanguíneos de NH3/NH4+ se correlacionan significativamente con
la gravedad de la encefalopatía hepática119-121 y con la intensidad del edema cerebral33. La Fig.
4 muestra el resultado de uno de estos estudios, en donde se observa que la concentración
arterial de NH3/NH4+ está significativamente aumentada en pacientes con herniación cerebral
causada por edema33. Consistente con esta observación, otros estudios han demostrado que la
incorporación neta de NH3/NH4+ al cerebro aumenta durante los transtornos hepáticos, tanto
crónicos como agudos122,123. Esto podría deberse a un aumento en la permeabilidad de la BHE

*
Según su origen, el edema cerebral se divide en dos categorías: citotóxico, cuando resulta de un incremento
patológico en el contenido de solutos intracelulares, ó vasogénico, cuando se produce como consecuencia de un
aumento en la osmolalidad del líquido extracelular126x. Diversos trastornos cerebrales, como traumatismos,
hipoxia ó isquemia, resultan por lo común en un edema citotóxico; en esta última categoría se ubica el edema
observado en condiciones hiperamonémicas. Algunos ejemplos del edema vasogénico están dados por las hiper-
natremias agudas y las disfunciones renales con uremia, que conducen a cambios en la osmolalidad del plasma.

19
al NH3/NH4+124, a un aumento en el flujo sanguíneo cerebral125 y a episodios de alcalosis
respiratoria, que aparecen con frecuencia asociados al coma hepático y determinan un aumen-
to en la concentración relativa de NH3 en la sangre126. Mientras que en los transtornos crónicos
del hígado la relación cerebro/sangre de NH3/NH4+ puede alcanzar valores de 3 a 4, durante
las fallas hepáticas agudas dicho valor puede llegar a ser de 833,127. En animales con anastomo-
sis portocava (un modelo experimental de insufi-
ciencia hepática crónica) a los que se les indujo, a
través de la inyección de sales de amonio, un coma
hepático, los niveles de amonio total registrados en
el cerebro fueron de 2-5 mM128,129,149.
Si bien estas evidencias permiten suponer un
papel importante del NH3/NH4+ en la patogénesis
del edema cerebral inducido por hiperamonemia,
los mecanismos específicos que median la apari-
ción de dicho edema no han sido esclarecidos. Las
investigaciones en torno a este tema sugieren que el
mismo tiene una etiología multifactorial; altera-
+
Figura 4. Concentración total de NH3/NH4
en el plasma arterial de pacientes con falla ciones bioenergéticas y metabólicas, cambios en la
hepática aguda. La [NH3/NH4+] arterial fue excitabilidad neuronal y variaciones en el pHi, en-
significativamente mayor en pacientes que
desarrollaron hernia cerebral (HC) que en tre otros factores, han sido ponderados por diversas
aquellos que no presentaron esta condición (No
HC). Los círculos verdes representan los va- investigaciones113,130-134.
lores registrados en pacientes que recibieron
transplante hepático. A semejanza del edema cerebral precipitado
Modificado de Clemmesen y col., Hepatology
29: 648-653, 1999. por isquemia, el edema concurrente con la EH está
asociado con alteraciones en el sistema de neuro-
transmisión mediado por glutamato, siendo común en ambos casos la sobreactivación de
receptores glutamatérgicos de tipo NMDA, el aumento en la concentración de Ca2+ intrace-
lular, la disfunción mitocondrial y el estress oxidativo133-137.
La hipótesis más aceptada en torno a los mecanismos que median el desarrollo del edema
cerebral relacionado con hiperamonemia sostiene que éste se debe a la acumulación intracelu-
lar de glutamina, secundaria a un aumento en los niveles cerebrales de amonio. De acuerdo
con esta hipótesis, dicha acumulación determina un influjo osmótico de agua, que da lugar a

20
un aumento del volumen celular138†. Según observaciones en tejido cerebral post mortem116,139
y en cultivos de células in vitro140, dicha acumulación tendría lugar predominantemente en
astrocitos. Las bases de esta “hipótesis glutaminérgica” estan dadas por estudios que indican
que la aplicación de sulfoximetionina (MSO), una sustancia que inhibe de modo irreversible a
la GS, previene ó atenúa el aumento del volumen astroglial en diversos modelos experimenta-
les in vitro141,142 e in vivo143-145. No se ha demostrado, sin embargo, que exista una correlación
temporal entre la acumulación de glutamina y el desarrollo del edema cerebral. Asimismo,
otras observaciones ponen en duda la robustez de esta hipótesis:
i) en animales hiperamonémicos se observó que el edema cerebral que persiste tras el trata-
miento con MSO es mayor al que se esperaría de acuerdo con la disminución observada en los
niveles cerebrales de glutamina146.
ii) en dos estudios realizados en animales hiperamonémicos no se detectaron cambios
significativos en los niveles de glutamina cerebral147,148, en tanto que en ratas con anastomosis
portocava se observó de hecho una disminución en la actividad de la GS en diversas estructu-
ras del cerebro149-151.
iii) en astrocitos en cultivo, la exposición aguda al NH3/NH4+ no afecta la actividad de la
GS; más aún, tras la aplicación prolongada de NH3/NH4+, la actividad de esta enzima disminu-
ye significativamente153.
iv) aún cuando persiste un aumento en la concentración intracelular de glutamina, el
aumento del volumen observado en astrocitos en cultivo tratados con 5 mM de NH4Cl (por 12-
24 hs) se previene al inhibir la “transición de la permeabilidad mitocondrial” (TPM)154. Este
fenómeno, observado durante episodios de isquemia cerebral y otros trastornos, consiste en la
apertura de un poro de alta conductancia en la membrana interna de la mitocondria, que
permite el paso de sustancias de peso molecular inferior a 1.500 Dalton. La apertura de este
“poro de transición” causa disfunción mitocondrial, lo cual determina el cese de la producción
de ATP, al tiempo que se generan radicales libres con efectos deletéreos sobre las células. La
TPM se observa en cultivos primarios de astrocitos expuestos a NH4Cl155, se inhibe con MSO
†
Dado que se requiere de una molécula de Glu para formar una molécula de Gln, de no mediar cambios en la
tasa de síntesis de Glu se esperaría que las concentraciones de ambos osmolitos cambien en proporción inversa,
y no ocurran por lo tanto alteraciones en el equilibrio osmótico del cerebro. En animales hiperamonémicos se
observó, sin embargo, que la disminución en los niveles de Glu cerebral es menor a la que cabría esperar de
acuerdo con el aumento en la concentración de Gln. Esto podría deberse a una estimulación paralela de la
síntesis de Glu (por ejemplo, a través de reacciones de transaminación) mediada por el NH3/NH4+152.

21
y puede inducirse aumentando la concentración de glutamina en el medio de cultivo156. Estas
observaciones sugieren que el aumento del volumen astroglial no se debe a los efectos osmó-
ticos de la glutamina, sino antes bien a las consecuencias de la TPM sobre el balance energé-
tico celular157. Los autores de estos estudios plantean que esto último causa un desajuste en los
mecanismos que controlan el volumen celular.
No obstante, debido a la importancia que reviste la síntesis de glutamina en la detoxifica-
ción de NH3/NH4+ en el cerebro, y considerando su rápida tasa de síntesis (t1/2 ≤ 3 s27, es facti-
ble que la acumulación de glutamina en astrocitos contribuya, en efecto, al edema cerebral
precipitado por hiperamonemia. Aún en ausencia de un aumento en la síntesis de glutamina es
posible, como se propuso, que a concentraciones elevadas el par NH3/NH4+ inhiba el eflujo de
este aminoácido hacia el espacio extracelular, lo cual contribuiría a su acumulación y al
aumento de volumen de las células158.
No hay estudios que contemplen la posibilidad de que el edema cerebral se deba a los
efectos osmóticos directos del NH4+ acumulado en el interior de las células. Esta hipótesis no
es mutuamente excluyente con la hipótesis glutaminérgica: la acumulación de NH4+ podría
ocurrir, por ejemplo, si su tasa de entrada o su velocidad de generación, a partir de la protona-
ción del NH3, excedieran su tasa de remoción a través de la GS159.

22
 Parte II

1.7 Control del volumen celular. Se cree que la capacidad de las células de regular su conte-
nido de agua y solutos frente a cambios osmóticos del medio externo representó un aconteci-
miento primordial en la evolución de la vida sobre la tierra. Incluso en ausencia de alteracio-
nes en la composición del medio externo, las células animales tienden a hincharse debido a
que sus membranas plasmáticas son permeables al agua y a pequeños solutos, pero no a las
macromoléculas que se encuentran confinadas en su interior, las cuales generan un gradiente
de presión coloidosmótica dirigido de afuera hacia adentro. A diferencia de lo que ocurre con
las células vegetales, la membrana plasmática de las células animales carece de una pared
celular rígida, por lo que cede fácilmente ante gradientes de presión osmótica. De no existir
una respuesta celular activa, el influjo constante de agua y solutos conduciría a un aumento del
volumen y a una eventual lisis celular160. A lo largo de la evolución, las células han desarro-
llado mecanismos de transporte de membrana que les permiten, a través del flujo regulado de
osmolitos y agua, mantener su volumen constante y compensar los cambios cuando éste se
desvía de su valor basal. Entre los mecanismos referidos juega un papel importante la bomba
de Na+/K+, cuya operación, a expensas de un gasto continuo de energía (ATP), contrarresta al
gradiente coloidosmótico dirigido hacia el interior de las células161,162. Además de la Na+/K+
ATPasa, una diversidad de mecanismos de transporte opera en las membranas celulares,
contribuyendo al balance general de iones y otros osmolitos entre las células y su medio
externo. Como resultado de la actividad de estos sistemas se establece un “equilibrio estacio-
nario”, conocido como "equilibrio Doble de Donnan"161,163, definido por la oposición entre el
influjo pasivo de solutos y la expulsión activa de los mismos, con los subsecuentes flujos
osmóticos de agua. Como consecuencia de este equilibrio, en un medio isosmótico (e isotóni-
co), como el que predomina en los organismos animales de manera normal, la suma de los
gradientes osmóticos dirigidos hacia adentro y hacia afuera de la célula es cero (véase recua-
dro I). El volumen celular se mantendrá constante, por lo tanto, siempre y cuando la cantidad
de soluto y agua que entra a la célula sea igual a la que sale, de tal manera que los flujos netos
sean nulos.

23
 I
Osmolaridad y tonicidad
Al predecir el cambio que ejercerá una solución dada sobre el volumen celular, debe considerarse
no sólo la osmolaridad relativa de ésta con respecto a la osmolaridad intracelular, sino también la
permeabilidad relativa de la membrana plasmática a los solutos presentes en la solución
considerada. Tal permeabilidad dependerá de los coeficientes de reflexión de los solutos en solu-
ción. El concepto de tonicidad hace referencia a la capacidad que presentan las soluciones de
producir cambios, o no, sobre el volumen de las células en contacto con ellas, independientemen-
te de su osmolaridad. Así, hay soluciones que pueden ser isosmolares con una solución control
pero anisosmóticas con respecto a su efecto sobre el volumen celular. El ejemplo clásico es una
solución isosmolar de urea, que no obstante, es hipotónica. En términos prácticos, la respuesta
celular observada define la tonicidad de una solución: esta última será isotónica, si el volumen
celular no cambia, y anisotónica, si el volumen celular se altera. Si lo que se observa es un
aumento de volumen celular, se dice que la solución es hipotónica; si el efecto es una disminu-
ción en el volumen de la célula, la solución es hipertónica. Una solución isosmótica puede ser a
la vez hipotónica (como en el ejemplo de la urea), si contiene solutos que atraviesan fácilmente la
membrana de las células, aumentando la presión osmótica en el interior celular y provocando un
aumento de volumen; este es el caso de las soluciones con NH4Cl utilizadas en la mayoría de los
experimentos que se describen en el presente trabajo.

En condiciones fisiológicas, el control y el mantenimiento efectivo de la osmolaridad de

los fluidos corporales se ejerce a través de la función renal, modulada por la acción de hormo-
nas segregadas por estructuras neuroendócrinas en el sistema nervioso central164-166. Si bien en
los organismos animales algunas células estan expuestas normalmente a cambios pronuncia-
dos en la osmolaridad extracelular, -v.g.. epitelios transportadores, células renales y eritroci-
tos-, en condiciones fisiológicas, el balance entre agua y sales en el plasma, el citoplasma y el
líquido extracelular se mantiene constante167. La regulación y el mantenimiento del volumen
celular dependen de la actividad coordinada de múltiples mecanismos y funciones celulares,
que van desde los fenómenos de electrodifusión pasiva a través de canales iónicos y el
transporte acoplado de iones a través de la membrana, hasta la regulación a nivel genético de
la síntesis de enzimas y transportadores relacionados a su vez con la síntesis y/o acumulación
de osmolitos orgánicos168-170. En estos procesos intervienen diversas moléculas de señaliza-
ción intracelular, que transmiten los estímulos osmóticos y modulan las respuestas de osmore-
gulación de las células171,172. Una variedad de estados patológicos en el hombre guarda rela-
ción con el desajuste o la disrupción de los mecanismos que regulan la composición iónica,

24
orgánica, y el contenido de agua del citosol173-178. El estudio de los fenómenos osmóticos
reviste por lo tanto un interés doble, relacionado con la fisiología básica de las células, por un
lado, y con las consecuencias patofisiológicas que supone la alteración de los mecanismos de
regulación del volumen celular, por el otro.

1.7.1. Estrategias para el estudio de los procesos de regulación del volumen celular. La
mayoría de las investigaciones en torno a los fenómenos de regulación del volumen celular se
llevan a cabo exponiendo las células a soluciones anisosmolares (y anisosmóticas), es decir a
medios que presentan concentraciones de solutos osmóticamente activos diferentes a las que
se encuentran en el plasma en condiciones normales179.
Si bien las estrategias que se valen del uso de medios “anisosmóticos” han sido útiles para
identificar mecanismos de regulación del volumen celular, las condiciones experimentales
empleadas en estos estudios difieren notablemente de las de los organismos vivos en condicio-
nes fisiológicas y aún patológicas pues, como se mencionó, la composición del medio extrace-
lular, tanto en circunstancias normales, así como en diversas patologías, se mantiene dentro de
un estrecho rango de tonicidad fuera del cual se compromete la vida misma del organismo.
No obstante su relevancia fisiopatológica, es poco lo que se conoce acerca de los
mecanismos de regulación del volumen celular en condiciones isosmóticas. La naturaleza de
los cambios de volumen producidos en uno y otro caso es diferente: el hinchamiento celular
que sigue a la exposición de las células a un medio hiposmótico – e hipotónico – resulta de
una entrada de agua que produce una dilución de los solutos intracelulares; un aumento del
volumen celular en un medio isosmótico resulta, por el contrario, de un incremento primario
en los solutos intracelulares, seguido necesariamente de una entrada osmótica de agua. La
corrección del volumen celular, por tanto, puede implicar, en uno y otro caso, mecanismos y
estrategias diferentes (véase sección 1.7.2). Al ser expuestas a medios ligeramente anisos-
móticos casi todas las células animales se hinchan o se encogen comportándose, inicialmente,
como osmómetros ideales, es decir, siguiendo la ley de van’t Hoff (ver recuadro II). Cuando el
grado de anisosmolaridad de las soluciones es relativamente alto, y el cambio de volumen
alcanza una cierta magnitud, las células activan mecanismos de regulación (no lineales). Estos

25
 II
Presión y flujo osmótico
El movimiento de agua a través de las membranas biológicas está determinado principalmente por
el fenómeno de la ósmosis, que describe el flujo de agua que ocurre desde una solución más diluida
hacia otra más concentrada, contenidas en compartimentos separados por una membrana semiper-
meable, es decir impermeable a los solutos y permeable al agua. En estas condiciones, el flujo de
agua puede contrarrestarse aplicando una presión hidrostática al compartimento que contiene la
solución más concentrada; la presión necesaria para abolir el flujo de agua es la presión osmótica.
Suponiendo que las soluciones a cada lado de la membrana estén relativamente diluidas, y que
ésta sea totalmente impermeable a los solutos, la presión osmótica se define operacionalmente por
la ecuación de van`t Hoff:

π = (Pi − Pe) = RT∆Cs (2)

donde π denota la presión osmótica, equivalente a la diferencia de presión hidrostática entre los dos
compartimentos (Pi − Pe), expresada en atmósferas, R es la constante de los gases, T es la tempera-
tura absoluta y ∆Cs es la diferencia de concentración del soluto entre los dos compartimentos, expre-
sada en moles/l.
La ecuación de van`t Hoff provee una buena aproximación a la presión osmótica de las solucio-
nes biológicas –v.g. líquidos intra y extracelulares de vertebrados o invertebrados terrestres o de
agua dulce- que en general se hallan relativamente diluidas. En la estimación de la presión osmótica
de soluciones más concentradas, sin embargo, es necesario incluir un factor de corrección empírico,
el coeficiente osmótico molar (φ’). Éste contempla, para diversas concentraciones de un soluto
dado, las interacciones intermoleculares soluto-soluto, soluto-solvente y solvente-solvente, que des-
vían a las soluciones del comportamiento osmótico ideal predicho por la ecuación de van`t Hoff. El
coeficiente osmótico molar queda integrado en dicha ecuación de la siguiente manera:

π = φ’RT∆Cs (3)

que al considerar la molalidad (m) de las soluciones se expresa más comúnmente como:

π = φRT∆m (4)

en donde φ es el coeficiente osmótico molal, y ∆m es la diferencia de molalidad de las soluciones.

En las soluciones mixtas, que contienen dos ó más especies de solutos, como los fluidos
biológicos, pueden existir sin embargo interacciones moleculares adicionales que no están conside-
radas en los coeficientes osmóticos. Las presiones osmóticas predichas para soluciones mixtas,
basadas en los coeficientes osmóticos disponibles de los solutos que las componen, son por tanto
aproximaciones, que pueden no reflejar de manera exacta las presiones osmóticas reales180.

últimos comprenden, primariamente, canales iónicos y otros sistemas de transporte localizados

en la membrana plasmática celular, entre ellos sistemas de transporte primario (como la
bomba de Na+/K+) y secundario (cotransportadores e intercambiadores) cuya activación
permite o facilita la entrada ó la salida, a través de la membrana, de partículas osmóticamente

26
activas (iones y ciertos osmolitos orgánicos). Como resultado de estos procesos, que se
acompañan de los flujos osmóticos de agua correspondientes, el volumen celular tiende a
“corregirse”, es decir tiende a regresar a su valor inicial160. El proceso de regulación que sigue
a aumentos de volumen en un medio hiposmótico – e hipotónico – se denomina "disminución
reguladora del volumen" y se abrevia: DRV. El proceso opuesto, tendiente a restablecer el
volumen celular tras una disminución producida en un medio hiperosmótico – e hipertónico –,
se conoce como "aumento regulador del volumen", ó ARV. De manera análoga, en este trabajo
los términos DRVi y ARVi se utilizan para designar, respectivamente, a los procesos de
regulación que ocurren frente a aumentos y disminuciones del volumen celular en medios
isosmóticos.

1.7.2 Cambios en el volumen celular acuoso en medios isosmóticos. En medios isosmóticos,

es decir aquellos que presentan una osmolaridad igual a la del líquido extracelular, cualquier
entrada o salida de soluto a las células que no sea compensada por una salida o una entrada
concomitante y equivalente de sustancias osmóticamente activas producirá, respectivamente,
un aumento o una disminución de volumen en el volumen celular (Fig. 5). Como ejemplo de
aumentos de volumen en un medio isos-
mótico podemos citar: la incorporación
celular de nutrientes181,182, la acción de
ciertas hormonas183,184 y la entrada neta
de iones a consecuencia de una despola-
rización sostenida de la membrana plas-
mática104-106,185, eventos todos que ejem-
plifican la ocurrencia de aumentos del
volumen celular en ausencia de cambios
en la osmolaridad extracelular.

Figura 5. Cambios en el volumen celular acuoso resultantes de alteraciones no compensadas en la tasa de

transporte de solutos a través de la membrana plasmática. El VCA se mantendrá constante cuando la tasa de
influjo y la tasa de eflujo de solutos sean iguales (C). Un aumento primario en la tasa de influjo (A), así como
una disminución en la tasa de eflujo de solutos (B), que no sean compensadas conducirán a un aumento del
VCA. De manera análoga, una reducción primaria en la tasa de influjo (D) así como un aumento primario en la
tasa de eflujo de solutos (E) conducirán a una disminución del VCA.

27
 Como ejemplo de disminución de volumen en un medio isosmótico puede mencionarse,
como caso notable, la acción de neurotransmisores como el GABA en algunas neuronas186 o
cualquier evento que culmine con un aumento en la concentración de Ca2+ libre intracelular
([Ca2+]i), que a su vez dispararía conductancias al K+ y al Cl- con la consecuente salida no
compensada de solutos y agua187,188. Los astrocitos y las neuronas son especialmente suscepti-
bles a sufrir cambios de volumen en diversas patologías, como los traumas cerebrales, la
isquemia, los trastornos epilépticos y hepáticos175,189,190. El aumento de volumen en astrocitos
expuestos experimentalmente al ácido láctico (un modelo de edema cerebral post-isquémico,
en relación con una acidosis orgánica) constituye otro ejemplo de alteración del volumen
celular en condiciones isosmóticas. Por ser un ácido débil, el ácido láctico penetra la membra-
na plasmática y se acumula en el interior celular. Esta acumulación causa acidosis intracelular
que dispara un aumento en la actividad del intercambiador Na+/H+, lo cual a su vez resulta en
un aumento del volumen, que se suma al producido por la acumulación del propio lactato191.
Se piensa que, en términos generales, la activación de fenómenos reguladores del volumen
celular en condiciones isosmóticas guarda una relación estrecha con los cambios en la fuerza
iónica intracelular y en la actividad termodinámica de especies iónicas específicas – especial-
mente la actividad del cloruro intracelular, αCl-i – que ocurren característicamente ante cam-
bios de volumen mediados por estímulos isosmóticos ó hiperosmóticos192. Mientras que la
salida de agua en medios hiperosmóticos favorece la concentración de sales, la disminución de
volumen en medio isosmótico se debe a la salida de sales y la consecuente salida osmótica de
agua. En estos cambios resalta la reducción en la αCl-i, dado que la actividad (o la concentra-
ción) relativa del Cl- puede regular la actividad del NKCC, el cotransportador de Na+,K+,2Cl-,
que ha sido postulado, aunque sin pruebas experimentales directas y definitivas, como uno de
los mediadores principales del ARV en muchos tipos celulares193. Algunos estudios muestran
asimismo que cambios en la fuerza iónica intracelular modulan la activación del VSOAC, un
canal aniónico sensible a aumentos del volumen que media, en un vasto número de tipos
celulares, la salida de Cl- y osmolitos orgánicos observada durante los procesos de DRV194,195 .

1.7.3 Elementos celulares que intervienen en las respuestas de osmoregulación. La regulación

del volumen celular, tanto en condiciones isosmóticas como anisosmóticas, requiere de tres

28
elementos celulares básicos: un sensor, que detecta los cambios de volumen; un efector, que
lleva a cabo la corrección de los mismos, y un sistema de señales o segundos mensajeros
intracelulares, que vinculan al sensor con el efector, activando una respuesta apropiada196,197.
Aunque esta categorización es válida para definir teóricamente las instancias y componentes
de la respuesta osmoreguladora, es importante destacar sin embargo que una distinción
puntual entre estos elementos no siempre es plausible; los canales activados por tensión de la
membrana, por ejemplo, poseen características comunes a los tres elementos162.

Las sustancias y mecanismos involucrados en las respuestas de osmoregulación han sido

estudiados en una amplia variedad de organismos, que van desde los protozoos198-201, las algas
y los hongos202-206, hasta las plantas y los animales170,207-212. Una visión de conjunto sobre
estos estudios revela dos conclusiones importantes: a) existe una multiplicidad de mecanismos
que pueden intervenir en los procesos de osmoregulación; b) en ciertos casos, la naturaleza
del cambio de volumen, antes que la magnitud del mismo, determina o no la activación de
unos u otros mecanismos reguladores.

1.7.3.1 Mecanismos de detección de los cambios de volumen. Mientras que en las bacterias,
las levaduras y otros microrganismos se han descubierto ciertas moléculas “osmosensoras”, así
como algunos componentes de las vías de transducción implicadas en la adaptación celular
frente a alteraciones osmóticas172,206,213,214, la naturaleza del sensor de volumen en los organis-
mos pluricelulares aun no ha sido esclarecida. Existen varias teorías al respecto, las cuales
invocan, de manera distintiva, efectos del volumen sobre la tensión de la membrana, la arqui-
tectura del citoesqueleto ó la concentración citoplasmática de iones y/o macromoléculas215-217.

La activación de mecanismos reguladores del volumen celular tras aumentos o disminu-

ciones del mismo está relacionada estrechamente con la noción de un “umbral” de detección
del cambio de volumen (“volume set point”). Dicho umbral representa un estado particular
(un nivel crítico de aumento o disminución) del volumen celular, que presupone la activación
de un mecanismo sensor que detecta los cambios de volumen y los transduce en una respuesta
efectora que corrige el volumen aberrante. Ciertos estudios muestran, sin embargo, que el
“umbral” de volumen no es necesariamente fijo, ó estático; en algunos tipos celulares, por

29
ejemplo, la presencia en el citoplasma de agentes como el Mg2+ o la urea desplaza el umbral
de detección de los cambios de volumen, de manera tal que las respuestas reguladoras celula-
res frente a los cambios osmóticos ocurren ante estímulos de una magnitud mayor – o menor –
que la requerida previamente para desencadenar tales respuestas218,219. Algunos estudios sugie-
ren, por otra parte, la existencia de múltiples umbrales de volumen, en relación con la ocurren-
cia de cambios graduales o súbitos en el volumen celular y con la activación diferencial de
vías efectoras de la respuesta220. Dichos estudios demuestran que ciertas células mantienen un
volumen constante al ser expuestas a soluciones en las cuales la osmolaridad aumenta, o se
reduce, lenta y gradualmente. Estas maniobras ponen además de manifiesto la activación se-
cuencial de diversos mecanismos de regulación (algunos de ellos activados ante cambios en la
osmolaridad menores del 3%), conforme el gradiente osmótico se acentúa. Este fenómeno,
denominado "regulación isovolumétrica"221, que ha sido descrito inicialmente en células rena-
les221-223 y posteriormente en cardiomiocitos224, células gliales225 y neuronas226, probablemente
refleja más fielmente la realidad de la homeostasis del volumen celular en los organismos, ya
que los cambios en la osmolaridad extracelular en estos últimos ocurren, por regla general,
lentamente.

Dado que los cambios en el volumen celular reflejan tanto movimientos de agua como
dilución o concentración de iones y macromoléculas (osmolitos en general) en el interior
celular, cabe preguntarse: ¿qué “trata” de preservar la célula, su volumen, o su composición
iónica y macromolecular?218 Existen dos hipótesis principales, aunque no mutuamente exclu-
yentes, acerca de los mecanismos de detección-transducción de los cambios en el volumen
celular: una sostiene que la señal proviene de eventos mecánicos tales como un estiramiento o
contracción de la membrana celular, o del rearreglo de estructuras internas (v.g. citoesquele-
to); esta es la hipótesis mecánica. La otra hipótesis propone que la señal se efectúa a través de
cambios en la concentración de uno o más factores citosólicos tales como ciertos iones, solu-
tos orgánicos o macromoléculas (v.g. proteinas). En esto se sustenta la hipótesis química.
Dando apoyo a la hipótesis mecánica, ciertos canales iónicos mecano-sensibles han sido
implicados tanto en la detección de los cambios de volumen como en la generación de las
respuestas efectoras, en varios tipos celulares incluyendo neuronas y células gliales215,227,228.
Numerosos estudios sugieren asimismo un papel importante del citoesqueleto en las respuestas

30
de regulación del volumen celular, si bien no se tiene una idea clara de los mecanismos y
procesos implicados229. La disrupción de los filamentos de actina con citocalasina, por ejem-
plo, no afecta en la mayoría de los casos el desarrollo de la DRV, mientras que en otros la
bloquea o incluso la potencia, dependiendo del tipo celular230,231.
La hipótesis química incorpora los conceptos de "apiñamiento" y confinamiento macromo-
lecular (“macromolecular crowding”), cuyo grado depende del volumen acuoso celular. De
acuerdo con esta hipótesis, la cinética y el equilibrio de las enzimas presentes en el espacio
intracelular puede alterarse de manera significativa por cambios pequeños en la concentración
(intracelular) de macromoléculas inertes en su entorno inmediato. Por ejemplo, se estimó que
un cambio del 10% en la concentración de proteínas intracelulares puede conducir a cambios
de hasta un orden de magnitud en la actividad termodinámica de moléculas con función regu-
ladora. Entre los sustratos de estas últimas se encuentran proteínas que forman canales iónicos
o transportadores232-236. El apoyo a esta hipótesis viene principalmente de estudios realizados
en "fantasmas" de eritrocitos y células musculares de percebes, en las cuales la adición o
perfusión de distintos solutos modifica el apiñamiento macromolecular y con él, la actividad
de los sistemas de transporte involucrados en la respuesta osmoreguladora219,237. Si bien las
consideraciones teóricas y las pruebas experimentales en torno a este modelo son válidas,
hasta el presente no se han identificado las moléculas de señalización que median los fenóme-
nos descritos, y el mismo no ha sido verificado en células intactas.

1.7.3.2. Transducción intracelular de los estímulos osmóticos. En los últimos años, numerosas
investigaciones se han encaminado a identificar y caracterizar funcionalmente a los mensaje-
ros intracelulares que median las señales osmóticas y modulan, en consecuencia, las respuestas
de ajuste del volumen celular. Iones como el Ca2+, el Mg2+, diversas cinasas y fosfatasas, pro-
teínas G, fosfoinosítidos, prostaglandinas, etc., y eventos tales como rearreglos del citoesque-
leto, entre otros factores, han sido señalados como componentes centrales de las vías de trans-
ducción que conectan los cambios del volumen con las respuestas de regulación en diversos
tipos celulares171,172,238-241. En muchas células se ha descrito un aumento en la [Ca2+]i tras
incrementos del volumen en medio hiposmótico, principalmente. La lista de células en las que
esto ocurre incluye neuronas, astrocitos, y células de neuroblastoma187,197,242. En la mayoría de
los casos, sin embargo, no se demostró fehacientemente un papel directo del Ca2+i en los

31
fenómenos de osmoregulación187. Más aún, en células de neuroblastoma NG108-15 y N1E-
115, por ejemplo, se demostró de manera directa que la [Ca2+]i se incrementa durante aumen-
tos del volumen en medio hiposmótico, pero que dicho incremento no es necesario para que
ocurra la DRV197.

1.7.3.3. Mecanismos efectores de la regulación del volumen celular. Ante cambios osmóticos
agudos, la difusión o el transporte mediado de iones (principalmente K+, Cl- y Na+) a través de
la membrana, que determina el flujo concomitante de agua, constituye la respuesta de regula-
ción primaria del volumen en numerosos tipos celulares168. La salida ó acumulación de ciertos
osmolitos orgánicos acompaña en ocasiones a la fase inicial de la respuesta reguladora.
Conforme las alteraciones osmóticas a las que se sujeta a las células adquieren un carácter
crónico, la concentración intracelular de osmolitos orgánicos (“compatibles”, desde el punto
de vista termodinámico, con la función enzimática celular) se ajusta en consecuencia; la regu-
lación génica de enzimas intermediarias en la síntesis de estas sustancias, que incluyen polial-
coholes, aminoácidos, azúcares, metilaminas y urea, ó de sus transportadores específicos,
participa esencialmente de este proceso169,243-246. El transporte iónico es un proceso rápido, que
media en general correcciones inmediatas del volumen celular; la internalización, secreción,
síntesis o degradación de osmolitos orgánicos representa, en muchos casos, una respuesta
adaptativa, a largo plazo, frente a desafíos osmóticos prolongados. Los mecanismos de induc-
ción génica activados en respuesta a condiciones de anisosmolaridad crónica en células de
vertebrados superiores no han sido elucidados.

1.7.4 DRV y ARV: paradigmas experimentales en el estudio de los fenómenos de osmore-

gulación. El conocimiento actual sobre los agentes y los mecanismos que median la regulación
del volumen celular proviene básicamente de estudios de la DRV y el ARV, que son, como
hemos visto, respuestas en medios anisosmóticos. A continuación se consideran someramente
las estrategias de osmoregulación más comúnmente observadas usando este paradigma experi-
mental.

1.7.4.1 Disminución reguladora del volumen, DRV. La activación de conductancias al K+ y al

Cl- por canales independientes (concomitantemente al eflujo osmótico de agua) constituye una

32
 estrategia común de restauración del volumen celular en respuesta a hinchamientos en medios
hiposmóticos. Este fenómeno se ha descrito en numerosos tipos celulares, incluyendo astroci-
tos247, neuronas248,249 y células de neuroblastoma250,251,258,314 (ver recuadro III). Las oscilacio-
nes en el potencial de membrana que resultan de la activación primaria de canales de K+ ó Cl-
sensibles al volumen determinan el flujo simultáneo de estos iones, de manera que el proceso
general es electroneutro168,252,253. Durante la DRV, un eflujo adicional de KCl puede ocurrir
además a través del cotransporte acoplado de K+-Cl-; este es un fenómeno común en ciertas
células como los eritrocitos86,254. La salida de osmolitos orgánicos, que acompaña con frecuen-
cia a estos procesos durante la DRV in vitro, cobra especial importancia en células como las
renales y los astrocitos, durante cambios de volumen en el organismo sano ó enfermo. En la
Fig. 6 se ilustran los mecanismos básicos que median la DRV y el ARV en diferentes tipos de
células.

Figura 6. Mecanismos de transporte que intervienen en la disminución reguladora del volumen (DRV) y
en el aumento regulador del volumen (ARV) tras las exposición a medios anisosmóticos. Tras aumentos
del volumen celular en medio hiposmótico, la DRV en numerosos tipos celulares está determinada comúnmente
por la salida conductiva de Cl- y K+, por el transporte acoplado de estos iones, en ciertos casos, y por el eflujo
de osmolitos orgánicos, Osm(-) (v.g.: taurina). Entre los procesos que pueden contribuir al ARV que sigue a
reducciones del volumen en medio hiperosmótico se encuentran el cotransporte de Na+,K+,2Cl-, el intercambio,
funcionalmente acoplado, de Na+/H+ y de Cl-/HCO3- y la internalización de osmolitos orgánicos. Si el estímulo
hiperosmótico se prolonga en el tiempo, la síntesis de osmolitos orgánicos, o de sus proteínas transportadoras,
contribuye al aumento de la osmolaridad interna de las células. La activación de las vías de transporte
mencionadas determina flujos netos de agua (salientes, en la DRV, y entrantes, durante el ARV) que resultan en
una corrección del volumen celular.

33
 III
Estudio de la DRV en células N1E-115
Dado que el presente trabajo se realizó en células de neuroblastoma N1E-115, es conveniente
revisar someramente los estudios realizados en estas células utilizando el paradigma anisomótico.
La magnitud y la cinética de la DRV se midieron con calceína en nuestro laboratorio, como parte
de la validación del método de fluorescencia para cuantificar cambios en el volumen celular
acuoso188. En un estudio posterior se demostró que el aumento de volumen en medio hiposmótico
se acompaña de un aumento en la [Ca2+]i, que no es sin embargo necesario para desencadenar la
DRV197. Tres estudios, además de los mencionados, evaluaron la DRV en estas células250,251,258. Las
observaciones fueron realizadas en células aparentemente indiferenciadas (sin neuritas) y el
volumen celular se estimó a través de técnicas morfométricas. Registros realizados con la técnica
de “patch clamp” señalan que tras aumentos del volumen celular en medio hiposmótico se
incrementa la actividad de canales catiónicos no selectivos activados por la tensión de la membrana
(SACs, del inglés “stretch-activated cation channels”), lo cual determina una despolarización de la
membrana plasmática. Este fenómeno es seguido por la activación de canales de K+ (KDR) y de un
canal aniónico de alta conductancia, a través de los cuales se postula que ocurre la DRV250. En un
estudio posterior se analizaron los efectos de diversos inhibidores del transporte iónico a través de
la membrana sobre la DRV. Los resultados muestran que ésta se bloquea por inhibidores de
canales de K+ (20 mM TEA) o de canales aniónicos (10 µM DIDS). La aplicación de gadolinio
(10-20 µM), un inhibidor no específico de SACs, induce un bloqueo de magnitud variable de la
DRV. Este proceso no se ve afectado, por el contrario, durante la aplicación de ouabaina (15-250
µM), ni por la inhibición del cotransportador NKCC (100 µM bumetanida) o del intercambiador
Cl-/HCO3- (500 µM SITS)251.
Finalmente, en un estudio más reciente se observó que la DRV en células N1E-115 se bloquea
con TEA (10 mM); DIDS (250 µM); 4-aminopiridina (5 mM), un inhibidor de canales de K+ y con
ácido niflúmico (50 µM), un inhibidor de canales aniónicos. En el estudio referido la bumetanida
(10 µM) y la furosemida (un inhibidor inespecífico de los cotransportadores KCC y NKCC; 500
µM) bloquearon parcialmente la DRV258.

1.7.4.2 Aumento regulador del volumen, ARV. A diferencia de la DRV, que se observa en la
mayoría de los tipos celulares estudiados, la recuperación del volumen celular tras estímulos
hiperosmóticos es un fenómeno menos generalizado. Sin embargo, en algunas células que no
muestran ARV al ser expuestas a medios hiperosmóticos, es posible inducir este proceso some-
tiéndolas primero a un aumento de volumen hiposmótico, seguido de una recuperación en
medio isosmótico. Dado que las células pierden osmolitos durante la DRV en medio hiposmó-
tico, la solución isosmótica es ahora “hiperosmótica” con respecto al interior celular, por lo
cual las células disminuyen de volumen, mostrando a continuación un ARV180,196. Las causas
por las cuales muchas células no desarrollan ARV ante estímulos hiperosmóticos y sí lo hacen
tras sufrir un aumento de volumen hiposmótico no son claras. Es probable que los cambios en

34
la fuerza iónica ó en el contenido general de osmolitos intracelulares, que ocurren distintiva-
mente en uno y otro caso, influyan en la capacidad - ó determinen la “necesidad” - de respuesta
de las células. En términos generales, el ARV procede a través de una ganancia neta de KCl,
resultante de una entrada de NaCl, ó NaCl y KCl (el Na+ que ingresa es intercambiado por K+ a
través de la Na+/K+ATPasa, lo cual resulta en una ganancia neta de K+). A diferencia de la
DRV, diversos estudios coinciden en señalar que el ARV se desarrolla principalmente a través
de la activación de sistemas de transporte acoplado de iones. Entre estos últimos se ha postu-
lado principalmente al cotransportador de Na+-K+-2Cl-193,255 y al intercambiador de Na+/H+, a
menudo activado en forma paralela con el intercambiador Cl-/HCO3-256,257. En muchos casos,
sin embargo, las evidencias a favor de estos mecanismos son incompletas. En diversos tipos
celulares, como por ejemplo células de neuroblastoma Neuro-2a, se describió además la activa-
ción de un canal catiónico no selectivo (denominado NSC), tras la exposición a medios hiper-
tónicos259. Sin embargo, estos estudios no confirmaron la relevancia de este mecanismo en el
ARV.
Como ya se mencionó, en condiciones de hiperosmolaridad crónica, la inducción génica de
enzimas intermediarias en la síntesis de osmolitos orgánicos, o de sus transportadores de mem-
brana, cumple un papel fundamental en la restauración del volumen y en la adaptación al
medio externo en diversos tipos de células260 (Fig. 6).

35
2. OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo es contribuir al conocimiento de los mecanismos que
relacionan al pH intracelular con el volumen celular acuoso en neuronas. En particular, se
estudia la respuesta osmótica de células nerviosas mantenidas in vitro ante la exposición a
medios isosmóticos conteniendo amoníaco y amonio (NH3/NH4+). Además de las implicacio-
nes biofísicas, este estudio es relevante para entender aspectos celulares y moleculares de la
toxicidad del NH3/NH4+ producida ante aumentos patológicos de su concentración en el plas-
ma, como aquellos que ocurren en las hiperamonemias que siguen a la falla hepática aguda.

Los objetivos específicos son:

1. Caracterizar cuantitativamente los cambios en el volumen celular acuoso y en el pH intrace-

lular mediados por el par NH3/NH4+ en células individuales de neuroblastoma N1E-115, utili-
zando marcadores intracelulares y microscopía de fluorescencia.

2. Determinar la contribución relativa de las especies individuales NH3 y NH4+ a los cambios
de volumen y pH intracelular.

3. Poner a prueba la hipótesis de que la acumulación intracelular de NH4+ es responsable del

aumento del volumen celular inicial, tras la exposición de las células al par NH3/NH4+.

4. Identificar las vías de transporte de solutos que participan en la regulación del volumen
celular tras el aumento inicial mediado por el par NH3/NH4+.

5. Identificar las vías de transporte que median el influjo de NH4+ a las células.

36
3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Células. Los experimentos se realizaron en células de neuroblastoma N1E-115, provenien-

tes de un clon de células C-1300261, derivadas de neuronas de ganglios simpáticos de ratón.
Las mismas fueron donadas a nuestro laboratorio por el Dr. Marshall Nirenberg (National
Institutes of Health, USA). Una vez diferenciadas, las células N1E-115 expresan característi-
cas neuronales262,263. Las propiedades eléctricas de estas células, así como sus transportadores
de membrana, canales iónicos, receptores, etc., se han estudiado extensivamente264-278. Asimis-
mo, estas células han sido objeto de estudio en fenómenos de osmoregulación por parte de
nuestro equipo de trabajo64,65,188,197 y de otros grupos de investigación250,251,258. Por estas
razones, y por la facilidad con la que pueden cultivarse bajo condiciones controladas, constitu-
yen un modelo ideal para estudios como el presente.
Una vez diferenciadas, las células N1E-115 en cultivo muestran un alto grado de
pleomorfismo. Para nuestros experimentos de fluorescencia se seleccionaron células aisladas;
con un soma pequeño o mediano (aproximadamente 25 a 40 µm de diámetro) y diferenciadas,
esto es, caracterizadas por la presencia de una o más proyecciones neuríticas de extensión
igual o superior al diámetro del soma (Fig. 8; Pág. 44). Se excluyeron, entre otras que no se
correspondían con este criterio, aquellas con una morfología esférica y sin neuritas (propia de
células no diferenciadas). También se excluyeron del registro las células que mostraron, tras
la carga con el indicador fluorescente, una fluorescencia ya fuera excesiva ó muy baja.

3.2. Cultivo celular. Las células se conservaron en viales (Nalgene, USA) herméticamente
cerrados con una cubierta de crioflex (Nunc, USA), congeladas en nitrógeno líquido, hasta el
momento de su siembra inicial. El mantenimiento y la resiembra celular se realizaron en
frascos de cultivo de 25 cm2 (Corning, USA). La composición del medio de mantenimiento fue
la siguiente: 90% DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; Gibco, USA) suplementado
con 1% HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; Gibco, USA), 1% glutamina (2 mM)
(Gibco, USA) y 10% suero fetal bovino (SFB, HyClone, USA). Para ser utilizadas en los
experimentos, las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro
(Bellco Glass, Inc., USA) previamente tratados con poly-lisina D (Becton Dickinson, USA),

37
en cajas de Petri de plástico de 35 mm de diámetro (Becton Dickinson, USA). Alrededor de 4
a 24 horas después de esta siembra, realizada en medio de mantenimiento, éste se reemplazó
por medio de diferenciación, que se renovó cada 2 días. El medio de diferenciación tuvo la
siguiente composición: 98% DMEM suplementado con 1% HAT, 1% glutamina (2 mM), 1
mM teofilina (Sigma, USA) y 2% SFB, y como agente diferenciador adicional se agregó 5
µM/ml de prostaglandina E-1279 (PGE-1; Sigma, USA). Las células se incubaron a 37º C en
una atmósfera húmeda de 5% CO2 / 95% aire. No se añadieron antibióticos en la preparación
de los medios de cultivo o durante el proceso de mantenimiento y diferenciación celular. Los
experimentos se realizaron en células cultivadas que habían sido incubadas durante 3 a 7 días
en medio de diferenciación.

3.3 Soluciones experimentales. La solución de Krebs tuvo la siguiente composición (en mM):
NaCl, 130; KCl, 5,5; CaCl2, 2,5; MgCl2, 1,25; HEPES, 20; glucosa, 10. El pH se ajustó a 7,3
con NaOH 1M y fue igual en todas las soluciones experimentales, exceptuando aquellas que
se prepararon con [NH3] ó [NH4+] constantes (ver más abajo). En la solución de Krebs, así
como en todas las soluciones isosmóticas utilizadas en este trabajo, la osmolaridad se ajustó a
312 ± 2 mOsm/KgH2O a través de la adición de sucrosa. Esta osmolaridad es similar a la del
medio de cultivo de mantenimiento de las células. La solución isosmótica control (ISO) tuvo
una composición idéntica a la solución de Krebs, excepto que la concentración de NaCl se
redujo a 120 mM. Las soluciones anisosmóticas (± 10%) utilizadas para calibrar la respuesta
de volumen celular al inicio de cada experimento de fluorescencia tuvieron la misma composi-
ción iónica de la ISO, y su osmolaridad se ajustó con sucrosa. Las soluciones conteniendo
NH4Cl se prepararon a partir de la ISO control; el NH4Cl se agregó en reemplazo de cantida-
des equimolares de NaCl y la osmolaridad final fue similar a la de la solución ISO control
(312 ± 2 mOsm/KgH20). En las soluciones en que las concentraciones de NH3 ó NH4+ se
mantuvieron constantes, variando de manera independiente la concentración de la especie res-
tante, el pH se ajustó a los valores deseados (Tabla I) y la osmolaridad fue también de ~312
mOsm. La [NH4+] de las soluciones está dada por: BT x 10-pH/10-pK + 10-pH, en donde la base
total BT = [NH3]+[NH4+] y el pK = 9,25, a 25 ºC. Las soluciones con una [NH3] constante

38
(0,23 mM) y diferentes [NH4+] (4,77; 9,77; 19,77 y 29,77 mM) se prepararon a partir de solu-
ciones conteniendo 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl, siendo la [NH3] idéntica a la presente en una
solución con 20 mM NH4Cl a pH 7,3. Las soluciones con una [NH4+] constante (10 mM) y
diversas [NH3] (0,05; 0,11; 0,22 y 0,33 mM) se prepararon a partir de soluciones conteniendo
10,05; 10,11; 10,22 y 10,33 mM de NH4Cl respectivamente, siendo las concentraciones de
NH3 en estos casos iguales a las presentes en soluciones con 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl a
pH 7,3, respectivamente (Tabla I). Para obtener las concentraciones de NH3 y NH4+ deseadas,
en todas y cada una de estas soluciones el pH se ajustó de acuerdo con la ecuación de
Henderson-Hasselbalch: pH = pK + log {[NH3]/[NH4+]}.

Tabla I. Soluciones experimentales con concentraciones constantes de NH3 ó NH4+.

[NH3]o = 0,23 mM [NH4+]o = 10 mM
[NH4+]o TB [NH3]o TB
pHo pK = 9,25 (25 ºC) pHo
(mM) (mM) (mM) (mM)
7,91 4.77 5 7 0,05 10,05
+
7,61 9.77 10 pH = pK + log {[NH3]/[NH4 ]} 7,3 0,11 10,11
7,31 19.77 20 7,6 0,22 10,22
7,13 29.77 30 Osm ≈ 312 mOsm 7,77 0,33 10,33

3.3.1 Sustitución de iones. En la preparación de la solución isosmótica basal libre de Cl- (ISO
Cero Cl-) se emplearon sales de gluconato en reemplazo equimolar de las sales de Cl- presentes
en la solución ISO control. En las soluciones con NH3/NH4+ libres de Cl- se agregó gluconato
de amonio (20 mM, preparado a partir de NH4OH y ácido glucónico), en reemplazo equimolar
de gluconato de Na+ de la solución ISO Cero Cl-. El pH de estas soluciones se ajustó a 7.3 con
ácido glucónico. En las soluciones isosmóticas en que se eliminó el Na+, éste se sustituyó mol
por mol por N-Metil-D-Glucamonio (NMDG+), utilizando para ello la sustitución del NaCl
por cloruro de N-Metil-D-Glucamina. El pH de estas soluciones se ajustó a 7.3 con N-Metil-
D-Glucamina. En las soluciones conteniendo NH4Cl 20 mM en las que se omitió el Na+ la
concentración de cloruro de NMDG se redujo en 20 mM. En las soluciones isosmóticas libres
de Ca2+ el CaCl2 fue reemplazado por cantidades equimolares de MgCl2 y se agregó 1 mM de

39
ácido etilenglicol-tetracético (EGTA), un agente quelante de Ca2+, para neutralizar la activi-
dad del Ca2+ residual.
Los reactivos utilizados en la preparación de todas las soluciones provinieron de Sigma,
USA.

3.3.2 Bloqueadores de canales y transportadores. Los agentes farmacológicos empleados en

el presente trabajo se agregaron, en cada caso, a soluciones ISO control de prueba y a solucio-
nes experimentales con NH4Cl. Estas sustancias fueron: bario (BaCl2; 1 mM), agregado a las
soluciones en reemplazo equimolar de NaCl; TEA (cloruro de tetraetilamonio; 10 mM), disuel-
to directamente en las soluciones en reemplazo equimolar de NaCl; gadolinio (GdCl3; 100
µM), disuelto directamente en las soluciones; NPPB (ácido-5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-
benzóico; 10 µM), tomado a partir de una solución madre (133 mM) en DMSO (concentración
final de DMSO en las soluciones experimentales < 0,01%); DIDS (2,2'-disulfonato-disodio-
4,4'-diisotiocianatostilbene; 100 µM), disuelto en KHCO3 0,1M, pH 8 y furosemida (1 mM),
disuelta en metanol (concentración final de metanol en las soluciones experimentales <
0,01%). Estas sustancias se compraron a Sigma, USA.

3.4 Fundamentos de la técnica de microscopía de fuorescencia para la medición del

volumen celular. Las técnicas de registro fluorométrico empleadas en el presente trabajo para
la estimación de los cambios dinámicos del volumen celular acuoso en celulas individuales,
fueron desarrolladas y validadas en nuestro laboratorio188,197,280-282. El principio básico en que
se fundan es que los cambios relativos en el volumen celular acuoso (VCA) pueden calcularse
introduciendo un marcador fluorescente impermeable (m) en las células y midiendo los
cambios en su concentración (Fig. 7). Si el contenido intracelular (cantidad de masa) del
marcador (Qm) permanece constante a lo largo de las perturbaciones osmóticas inducidas
experimentalmente, los cambios fraccionales en su concentración (Cm) reflejarán cambios en
el VCA, de acuerdo con la ecuación incluida en la Fig. 7. Así, toda vez que el volumen acuo-
so de la célula cambie, la concentración del marcador fluorescente cambiará en proporción
inversa, y en tanto la relación entre la intensidad de la fluorescencia (F), y la concentración
intracelular del marcador (c) permanezcan dentro del rango lineal, la fluorescencia provenien-

40
te de la zona celular de registro (ver más adelante) será directamente proporcional a la
concentración del fluoróforo. La fluorescencia emitida puede describirse cuantitativamente a
través de una expresión simplificada de la Ley exponencial de Beer-Lambert:

F = 2.3 ф r εcd (5)

donde F es la intensidad de la fluorescencia (cuando la luz de excitación es constante), ф es la

eficiencia cuántica del fluoróforo, r es una constante que representa factores instrumentales
ópticos, ε es el coeficiente de extinción, c la concentración del fluoróforo y d es el espesor del
especimen.

El marcador “ideal” de volumen

celular debe estar confinado al espacio
acuoso citosólico y debe distribuirse de
manera homogénea dentro de este
compartimento; no debe ser transpor-
tado a través de la membrana plasmá-
tica, ni penetrar otros compartimentos
intracelulares a través de las membra-
nas internas; debe ser además química-
mente estable (no ser sintetizado ni
metabolizado por la célula), insensible
a los iones nativos, y debe permanecer
diluido en el espacio acuoso de la cé-
lula, sin unirse a estructuras intracelu-
lares. Por último, el marcador ideal no

Figura 7. Fundamento teórico para estimar cambios en el volumen celular acuoso (VCA) a partir del
registro de los cambios en la concentración intracelular de marcadores fluorescentes. Suponiendo que el
contenido intracelular del marcador permanece constante, los cambios fraccionales en su concentración son
proporcionales a los cambios en el VCA: un aumento de este último producirá una dilución del marcador y
una disminución en los niveles de fluorescencia; una reducción del VCA resultará, por el contrario, en una
concentración del marcador y en un aumento en la señal fluorescente.

41
debe ser tóxico y no debe interferir con los mecanismos que participan en el mantenimiento y
la regulación del volumen. No existe, hasta el momento, un marcador que reúna todas estas
condiciones. A través del estudio de las propiedades espectrales y del comportamiento
intracelular de ciertos colorantes, sin embargo, el trabajo desarrollado en nuestro laboratorio
permitió validar el uso de tres marcadores fluorescentes, con propiedades espectrales
distintivas y diferentes sensibilidades iónicas, para estimar cambios en el VCA en células
individuales. Estos marcadores son: 1) la calceína, que permite medir cambios en el VCA,
independientemente de cambios en la concentración de iones nativos intracelulares, como
Ca2+, Mg2+ y H+, dentro de rangos fisiológicos y experimentales; 2) el fura-2, utilizado para
medir, simultáneamente, cambios en la [Ca2+]i y el VCA en una misma célula, y 3) el BCECF
(2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-6-carboxifluoresceina), que permite medir, en la misma célula,
cambios paralelos en el pHi y en el VCA.
Los cambios en el VCA estimados con calceína188,280 se infieren a partir del registro
obtenido de la excitación de este marcador en el punto máximo (487 nm) de su espectro de
excitación o en un punto cercano al mismo (~490 nm). Los cambios en el VCA estimados con
fura-2 y BCECF se calculan a partir de la excitación de los mismos en sus puntos isosbésticos
(PIs) respectivos, es decir en la región de su espectro de excitación que es insensible a
cambios en la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) ó de H+ (pHi), respectivamente, pero
que es sensible a cambios en la concentración del colorante. En nuestro laboratorio hemos
determinado que los PIs del fura-2 y del BCECF, in vivo, están centrados en 358 y 438 nm
respectivamente64,282. El fura-2 es óptimamente sensible a cambios en la [Ca2+]i cuando se
excita a 380 nm, y el BCECF lo es al pHi cuando se excita a 495 nm; los valores de [Ca2+]i y
pHi se obtienen a partir del cociente entre los registros de fluorescencia derivados de las
longitudes de onda sensibles a la [Ca2+]i ó al pHi, en cada caso, y los valores obtenidos de la
excitación de estos colorantes en sus PIs (es decir 380/340 nm y 495/438 nm, respectiva-
mente). En años recientes se publicaron varias investigaciones en las que se empleó al BCECF
como marcador simultáneo del pHi y del volumen celular283-286. Sin embargo, en dichos
trabajos la técnica no se validó, y los cambios en el volumen celular no fueron cuantificados.
La validación general de este método, incluyendo un análisis extensivo de las posibles relacio-
nes de interferencia entre las señales fluorescentes, fue presentada recientemente en un trabajo
de Tesis282.

42
3.5 Carga de las células con indicadores fluorescentes. Los experimentos se realizaron a
temperatura ambiente (21-25ºC) en células tomadas entre los pasajes 16-27 de replicación y
cultivadas de 3 a 7 días en medio de diferenciación. Por cada experimento un cubreobjetos con
células se retiró de su caja de Petri de cultivo y se montó en una cámara de Leiden; tras lavar
las células con solución de Krebs, la cámara se colocó sobre un soporte circular adosado a la
platina de un microscopio invertido de epi-fluorescencia (Diaphot-TMD, Nikon, Japón). A
través de la observación con microscopía de fase se seleccionan una o varias células (depen-
diendo del sistema de registro utilizado; ver a continuación), en las cuales se mide la fluores-
cencia endógena (autofluorescencia), que será sustraída posteriormente de los registros de
fluorescencia experimentales; en estas células se controla luego la evolución de la carga del
indicador fluorescente. En el sistema de fluorometría que emplea un monocromador y una
cámara digital (ver más abajo) los valores de autofluorescencia celular no difieren de la señal
que se obtiene, en ausencia de colorantes, fuera de las células; en este caso la fluorescencia
extracelular “de fondo” se registra a lo largo de todo el experimento, y estos valores se sustra-
en finalmente de los registros de fluorescencia correspondientes a cada medida experimental.
En todos los casos las células se incuban en solución de Krebs con los derivados esterificados
(AM, éster acetoximetilico) del BCECF (5-7 µM) ó de la calceína (2-4 µM) (ambos prove-
nientes de Molecular Probes, Eugene, OR, USA), tomados de una solución stock (BCECF 10
mM, calceína ~6,2 mM) en DMSO. La concentración final de DMSO en la solución de carga
es < 0,01%. La molécula AM conjugada con los distintos fluorocromos es altamente hidrofó-
bica (liposoluble) y por tanto permea fácilmente a través de la membrana plasmática. Una vez
en el interior celular, las esterasas endógenas hidrolizan al enlace éster dejando a la molécula
en su forma ácida, cargada, y por ende impermeante. La hidrólisis del éster también restituye
las propiedades fluorescentes del indicador, que no muestra en su forma esterificada. La
evolución de la carga de los indicadores se controla registrando continuamente su fluorescen-
cia intracelular. Una vez alcanzados los niveles de fluorescencia deseados (entre 400-1200
unidades arbitrarias de fluorescencia, ~40 minutos de incubación), se realizan 3 lavados de la
preparación con solución de Krebs y las células se dejan equilibrar durante 1 hora en esta
solución. Al término de esta incubación la cámara se perfunde durante unos minutos con
solución de Krebs, y a través del registro fluorométrico se evalúa la estabilidad de los niveles

43
de fluorescencia celular. En función de esto último se realiza, si es necesario, una nueva
selección de las células que serán registradas, tras lo cual se procede al inicio del registro
experimental. Las soluciones experimentales se perfunden a una tasa de ~6,6 ml/min.; el 90%
del fluido de la cámara en el punto de registro se recambia en ~13 seg (n = 3).

3.6 Registro de las señales fluorescentes.

Area de registro celular. Una vez concluido el proceso de carga del indicador fluorescente, los
cambios en su concentración intracelular se registran en una pequeña región del soma de cada
una de las células (Fig. 8). Esta región circular abarca un 3-10% -típicamente unos 120 µm2-
del área celular y está delimi-
tada por una apertura circular
(mecánica o digital) a partir de
la cual se registra la fluorescen-
cia en el plano focal de la ima-
gen microscópica, como se
muestra en la Fig. 9. El plano
focal y la dispersión de luz por
arriba y por abajo del plano
focal quedan circunscritos den-
tro de los límites celulares,
espacio donde se registran los
Figura 8. Localización del área celular de registro de las señales
fluorescentes. Fotomicrografía de células N1E-115 diferenciadas y cambios en la concentración de
cargadas con BCECF, vistas con microscopía de contraste de fase e
los indicadores. La fluorescen-
iluminación de epifluorescencia. Los círculos centrados sobre las
células indican el área típica de registro de las señales fluorescentes. cia se extenderá hacia arriba y
hacia abajo del plano focal dependiendo de la profundidad de foco del objetivo, la cual está
determinada, entre otros factores, por la apertura numérica (A.N.) y la magnificación del
mismo. Para un objetivo de 40X y A.N. = 1.3, como el que se utilizó en estos experimentos, la
profundidad de campo será de < 2 µm en una sola dirección en el eje z. Quiere decir que hay
un elemento óptico tridimensional, específicamente un doble cono de volumen de fluorescen-
cia de aproximadamente 4 µm de longitud total (Fig. 9).

44
La morfología y la amplitud de los registros dependen críticamente del tamaño y de la posi-
ción de la apertura circular. La apertura ideal, así
como el sitio de registro, han sido ampliamente Z o+ DF

1000
explorados en nuestro laboratorio como parte de DF =
7nAMT
+
2nA2

la validación de la técnica282. En el presente traba- Z = Plano focal

nA = Apertura numérica
jo las mismas se ajustaron para disminuir, en lo M T = Magnificación total
= Longitud de onda
posible, eventuales distorsiones en el registro y Z o - DF

obtener una relación señal/ruido óptima.

1000
Figura 9. Factores determinantes de la profundidad nA = 0,16
nA = 0,4
de foco del objetivo del microscopio. Parte superior: la 100
nA = 0,5
nA = 0,95
fluorescencia registrada en el eje z (profundidad) está nA = 1,3

DF ( m)
determinada por la profundidad de foco del objetivo 10
(DF), que es inversamente proporcional a la apertura
numérica del objetivo y a la magnificación del objetivo.
1
Hacia arriba y hacia abajo del plano focal (Zo) la luz se
dispersa formando dos conos invertidos. Parte inferior:
.1
relación entre la profundidad de foco y la magnificación 1 10 100 1000
MAGNIFICACION TOTAL
total, para objetivos con diferentes aperturas numéricas.

Equipamiento. En el presente trabajo se utilizaron dos sistemas de registro de fluorescencia.

En ambos se utilizó un microscopio invertido de epi-fluorescencia (Diaphot-TMD, Nikon,
Japón) y un objetivo 40x/A.N 1.3 de inmersión en aceite (C-Fluor, Nikon, Japón).
En la Fig. 10 se muestra un esquema del equipo utilizado en los primeros experimentos del
presente trabajo (ej: experimentos de reemplazo de Na+ y Cl- externos; concentraciones fijas de
NH3 ó NH4+). En la segunda etapa del proyecto se adquirió un equipo nuevo, con mejores
especificaciones técnicas, basado en una cámara digital enfriada y un programa de computación
para imágenes que permitió hacer registros de varias células de manera simultá-nea (Fig. 11).
El funcionamiento y los elementos constitutivos principales del equipo de la Fig. 10 se resumen
a continuación: la luz de excitación proveniente de un arco de xenón de 150 W pasa a través de
un filtro de agua (para reducir la radiación infrarroja) y es luego divi-dida por un partidor de
rayo. Cada haz de luz pasa por un obturador electrónico de alta velo-cidad (UniBlitz D122,
Vincent Associates, USA) controlado por computadora. Acoplado a cada obturador se
encuentra un disco que contiene filtros de excitación (Omega, USA), que pueden
intercambiarse para delimitar los distintos espectros de excitación para cada indicador

45
fluorescente. Para excitar al BCECF, el haz de luz 1 pasa por un filtro de 495 ± 10 nm,
mientras que el haz 2 lo hace por uno centrado en 440 ± 10 nm (para registrar en el punto
isosbéstico). La calceína (un indicador que tiene un solo máximo de excitación) se excita
empleando un filtro de 495 ± 10 nm. Tras atravesar estos filtros los haces de luz se recombi-
nan por medio de un haz bifurcado de fibras ópticas de silicato. El haz combinado es colima-
do y acoplado al epi-iluminador del microscopio. Para reducir la fotodecoloración de los indi-
cadores y el daño fotodinámico de las células, la intensidad de la luz de excitación es atenuada
utilizando filtros de densidad neutral (generalmente se obtiene un 10-15% de transmisión
final). La apertura del diafragma de campo se cierra para limitar la iluminación a una sola
célula y la excitación del colorante se realiza cada 5 segundos, a través de la apertura y cierre
automático de los obturadores electrónicos; el tiempo de adquisición de la señal fluorescente
es de 130 ms en cada exposición. Un espejo dicromático (515 nm) y un filtro de emisión (535
± 13 nm) (ambos de Omega, USA) se situan en el portafiltros del microscopio, ubicado por

Figura 10. Diagrama esquemático de la vía óptica y del equipamiento utilizado en los experimentos
de microespectrofluorometría. Ver detalles en el texto principal.

46
debajo de los objetivos. La luz emitida pasa a través de una lente de acoplamiento 1x unida a
un diafragma accesorio (Microflex PFX, Nikon, Japón) que contiene una serie de aperturas
circulares de distinto diámetro (0,1-10 mm) que se utilizan para definir el tamaño de la zona
de registro de la señal. Esta última pasa por la apertura seleccionada y es medida con un foto-
multiplicador (Oriel Corporation, USA), digitalizada con un conversor A/D y finalmente
expuesta y almacenada en una computadora, utilizando un programa informático (RFLUO)
desarrollado en nuestro laboratorio, para este propósito, por el Dr. William Crowe.

Figura 11. Diagrama esquemático de la vía óptica y del equipamiento utilizado en los experimentos de
videomicroscopia de fluorescencia. Ver detalles en el texto principal.

En el equipo esquematizado en la Fig. 11, la fuente de luz consistió en un arco de xenón

de 75 W, mientras que los filtros de excitación, al igual que los obturadores electrónicos, se
reemplazaron por un monocromador (Optoscan, Cairn, UK), que permite controlar el ancho
de la banda de excitación para cada longitud de onda con una apertura mínima de hasta ± 2
nm. Con este sistema, el BCECF se excitó a 495 ± 2 a 5 nm y a 438 ± 3 a 7 nm, y la calceína

47
a 487 ± 2 a 4 nm; se registró cada 5 s, y el tiempo de excitación en cada exposición fue de 60-
100 ms. El haz de fibra óptica bifurcada se reemplazó por una fibra líquida, y el fotomultipli-
cador por una cámara digital (ORCA-ER C4742-95, Hamamatsu, Japón) cuyo ruido de
captura (read-out noise) es muy bajo (7-8 e) a una frecuencia de muestreo por pixel de 1
MHz. Este equipo se opera por medio de un programa informático comercial de adquisición
de datos (Metafluor 4.6r3, Universal Imaging, USA), con el cual se definen además las zonas
de registro celular y los tiempos de exposición para cada longitud de onda. El análisis de los
registros de fluorescencia se realiza posteriormente a través del programa de computación
Sigma Plot V.2.0 ó 2001 (Jandel Co., USA). Para las pruebas estadísticas se utilizó Microsoft
Excel 97-SR2 (Microsoft Co., USA).

3.7 Calibración osmótica de las células y conversión de la señal fluorescente en unidades

de volumen celular acuoso relativo. Para calibrar la respuesta osmótica de las células y
estimar los cambios en el VCA relativo producidos durante los diferentes tratamientos
experimentales utilizados, la fluorescencia relativa obtenida de la excitación del BCECF
(~440 nm) o de la calceína (~490 nm) se expresa como el cociente Fo/Ft, donde Fo es la fluo-
rescencia inicial, medida en estado estacionario, de una región celular delimitada por una
apertura circular determinada, en presencia de una solución ISO, con una presión osmótica
extracelular πo, y Ft es el valor de la fluorescencia (máxima ó mínima) cuando ésta alcanza un
nuevo estado estacionario, registrada a partir de la misma región circular, durante la exposi-
ción de la célula a una solución con una presión osmótica πt. Los pulsos de calibración, efec-
tuados al inicio de cada experimento, consisten en la aplicación secuencial de soluciones
ligeramente anisosmóticas (~342 y ~280 mOsm/KgH2O, es decir nominalmente 10% hiper e
hiposmolares, respectivamente, con respecto a la solución ISO), durante ~7 min., separadas
por un intervalo similar en solución ISO (Fig. 12A). En este rango de osmolaridades, por lo
general, no se disparan respuestas reguladoras y por lo tanto los cambios de volumen caen
dentro de una relación lineal, la cual una vez sustraida la fluorescencia de fondo corresponde
a las predicciones de la ecuación de van’t Hoff , como puede observarse en la Fig. 12.

48
 La representación en Fig. 12
104 A 1.15
B
un eje de coordenadas 1.10
102

Ft/F0 (%)
1.05
de la recíproca de los

Vt/V0
100 1.00
cambios en la fluores- 98
0.95
5 min 0.90 5 min
cencia (Fo/Ft) en res- 96 0.85

puesta a los pulsos de

1.06 1.4
calibración, en función C D
1.2
1.02
de la recíproca de la

Vt/Vo
F0/Ft

1.0
presión osmótica relati- 0.98
0.8
va del medio (πο/πt),
0.94 0.6
0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
resulta, efectivamente, π 0/π t π 0 /π t
en una relación lineal
Figura 12. Calibración de la respuesta osmótica de las células N1E-115.
que indica la correspon- A) Registro de los cambios en la fluorescencia producidos por dos pulsos de
~7 min de duración con soluciones anisosmóticas de osmolaridad nominal =
dencia entre cambios en 10% hiper y 10% hiposmótica (omolaridad medida: 9.1% hiper y 12% hipos-
la fluorescencia y cam- mótica) en células cargadas con BCECF, el cual fue excitado a 438 ± nm. B)
Cambios en el VCA (Vt/V0) derivados de la conversión del registro de fluores-
bios en la concentra- cencia mostrado en A. C) Cociente de la fluorescencia basal (z) sobre la fluo-
rescencia máxima (z) y mínima (z) registrados en presencia de las soluciones
ción intracelular del in- de calibración anisosmóticas, graficados en función de la recíproca de la
osmolaridad externa. D) Valores de VCA relativo, Vt/Vo, correspondientes a
dicador, reflejando a la los cocientes de fluorescencia graficados en C, en función de la recíproca de
la osmolaridad externa.
vez cambios en el VCA
(Fig. 12C). La pendiente de una regresión trazada sobre estos puntos arroja un valor menor
que 1, que es el esperado para un sistema con un comportamiento osmótico ideal, según la
ecuación:

Fo/Ft = πο/πt (6)

Esta desviación del comportamiento ideal se debe a la presencia de colorante unido a

componentes citosólicos (ej: proteínas) o “atrapado” dentro de organelos intracelulares. Esta
fracción del colorante se comporta como si fuera insensible a cambios en la osmolaridad
externa. Para convertir los cambios de fluorescencia en valores que expresen los cambios
efectivos de volumen celular acuoso, la fluorescencia de esta fracción de colorante “de fondo”

49
(“Fbkg,” ó fluorescencia “background”) debe ser estimada y sustraída de la flourescencia total.
En células N1E-115 cargadas con colorantes fluorescentes (BCECF, calceína) la Fbkg se deter-
minó a través de la permeabilización selectiva de la membrana plasmática utilizando la alfa-
toxina de Staphylococcus aureus188. Esta toxina tiene la peculiaridad de abrir poros en la
membrana plasmática, que permiten la salida del colorante disuelto en el agua citosólica pero
no de aquél unido a proteínas u otros componentes de alto peso molecular. Tras la liberación
del colorante disuelto en el citosol a través de este procedimiento, la fluorescencia remanente
representa la Fbkg. Se ha demostrado que esta última corresponde al valor en la intersección
con el eje y de una recta trazada sobre una grafica de Fo/Ft vs. πο/πt (Fig. 12C), por lo que
dicho valor se adopta como Fbkg 280. Los cambios normalizados del VCA (Vt/Vo) se calculan a
partir de la siguiente ecuación:

[(Fo/Ft) - Fbkg] / (1 - Fbkg) = Vt/Vo (7)

La Fig. 12B muestra los cambios relativos en el VCA correspondientes a los registros de fluo-
rescencia durante los pulsos de calibración (Fig. 12A), tras aplicar la ecuación (7). El análisis
de los datos de fluorescencia se realiza en cada célula de manera individual, y una gráfica de
Vt/Vo versus πο/πt, que incluye los valores provenientes de los pulsos de calibración mencio-
nados, se construye para cada célula registrada. Cada célula presenta, así, sus valores particu-
lares de calibración osmótica (Fig. 12D). Como predice la teoría, una vez hecha la corrección
de Fbkg, los datos se ajustan a una línea recta que pasa por el origen (Fig. 12D), lo que implica
que las células siguen un comportamiento osmótico ideal (van’t Hoff), según la Eq. (6). Esto
es posible porque las soluciones ligeramente anisosmóticas con las que se realiza la calibra-
ción no disparan respuestas reguladoras del volumen.

3.8 Protocolo experimental. El protocolo experimental básico para el estudio de las respues-
tas de volumen y pH celular en el presente trabajo, tanto en presencia de diversos fármacos,
como al emplear sustitución de iones, consistió en exponer las células a un primer pulso
(control) con una solución de NH4Cl durante ~7 min., y tras un intervalo de 30-60 min en
solución ISO, someterlas a un segundo pulso (experimental) con una solución de NH3/NH4+

50
(NH4Cl, excepto cuando se sustituyó el Cl-) cuya concentración fue igual a la del primer pulso
y que contuvo el agente farmacológico de prueba, o bien presentó una composición iónica
específica (por ej., sustitución de Cl- por gluconato). Con anterioridad a este pulso, y tras su
remoción, se aplicó una solución ISO similar a la del pulso experimental, pero sin NH3/NH4+.
Los valores resultantes del análisis de la respuesta inicial (control) se utilizan como referentes
para cotejar los cambios producidos durante la aplicación del segundo pulso, conteniendo el
tratamiento experimental (X). A continuación se esquematiza la secuencia general de desarro-
llo de los experimentos:

ISO → NH4Cl → ISO → ISO-X → NH3/NH4+-X → ISO-X → ISO

(Control) ---------- (Experimental)-----------.

3.9 Evidencia de que los cambios de fluorescencia producidos por el par NH3/NH4+ no
son espurios. Uno de los problemas potenciales que presentan los marcadores fluorescentes es
la posible interferencia por algún com-
2.0 10 min
ponente intracelular exógeno o endó- 1.9

geno que pudiera producir cambios en 1.8

F1/F2

1.7
la intensidad de la fluorescencia que
1.6
podrían interpretarse como cambios en 1.5

la dilución del colorante atribuibles a 1.3

cambios en el volumen celular acuoso. 1.2

Vt/V0

1.1
Para confirmar que los cambios del
1.0
VCA observados durante la aplicación 0.9

de NH3/NH4+ no son producto de tales 0.8

hiper 10 %

artefactos de técnica evaluamos, ISO

hipo 10 % 20 mM NH4Cl

Figura 13. Respuesta osmométrica de las células durante la exposición al par NH3-NH4+. Trazo superior:
Registro del cociente entre los valores de fluorescencia sensibles (F1) e insensibles (F2) al pHi, que denota los
cambios en el pHi. Trazo inferior: cambios en el VCA. El registro se realizó en una célula cargada con BCECF
y expuesta a pulsos con soluciones hiper e hiposmóticas (10%), aplicadas secuencialmente, según se indica,
antes y durante la perfusión con una solución de 20 mM de NH4Cl.

51
variando la osmolaridad de las soluciones de NH4Cl, la posible relación entre los cambios de
pHi y la respuesta osmótica de las células. En la Fig. 13 (Pág. anterior) se muestra uno de estos
experimentos, en el que pueden apreciarse varias cosas: i) Es posible contrarrestar el aumento
de volumen producido por el acúmulo de un osmolito interno (ej: NH4+) por la aplicación de
una solución hiperosmótica. ii) Es posible potenciar el aumento de volumen producido por el
NH3/NH4+ aplicando una solución hiposmótica. iii) La aplicación de soluciones ligeramente
anisosmóticas, antes y durante el pulso de NH3/NH4+, no afecta el curso característico del pHi.
Esto prueba que los cambios observados en el VCA ante la aplicación NH3/NH4+ son reales e
independientes de posibles fenómenos de interferencia (“cross talk”) entre el PI y la longitud
de onda sensible al pH, es decir, 495 nm. iv) La fluorescencia “de fondo” (Fbkg) no se modifica
durante la exposición de las células al par NH3/NH4+, por lo que es válido realizar el análisis
de estas respuestas utilizando un mismo valor de Fbkg.

3.10 Corrección de la deriva y análisis de las señales fluorescentes. Las señales fluores-
centes para cada longitud de onda decaen en intensidad con el tiempo. Esta deriva puede
resultar daño fotodinámico ó fuga del colorante del interior celular. Cuando la deriva no es
lineal el experimento se elimina. Cuando es lineal (mayoría de los casos), se corrige trazando
una regresión lineal hacia la señal basal y multiplicando el valor de la pendiente obtenida por
el tiempo correspondiente a cada medida experimental. Los valores de deriva calculados
punto a punto son entonces sustraídos de los valores de fluorescencia originales, obteniéndose
el trazo de fluorescencia corregido. Este procedimiento es válido en el curso temporal de
nuestros experimentos, pues la fluorescencia decae linealmente en función del tiempo.

3.10.1 Análisis de los cambios en el VCA. Los parámetros medidos en la respuesta de volu-
men celular acuoso típica inducida por NH3/NH4+ se ilustran en la Fig. 14. La magnitud de la
DRVi (Fig. 14, f) se calculó a los 4 minutos de iniciada la respuesta de regulación utilizando
la siguiente fórmula:
  picoVo −1 − reg  
Vt   Vt 

% DRVi =     Vo  
x 100 (8)
  pico Vt −1  
  Vo  

52
en donde los términos ‘pico
Vt/Vo’ y ‘reg Vt/Vo’ repre-
sentan el pico máximo del
VCA (Fig. 15, a) y la frac-
ción del volumen regulado
(Fig. 14, f), respectivamen-
te. La magnitud de la DRVi
se expresa como porcentaje
de volumen regulado, medi-
do a los 4 min de iniciado
este proceso, y denota la
Figura 14. Nomenclatura usada para denotar los componentes de
recuperación del volumen la respuesta de VCA producida por un pulso de NH4Cl. El esquema
representa una respuesta celular típica. Las variables cuantificadas en
hacia su valor inicial, V0, torno a los cambios del VCA fueron: (a) magnitud relativa del aumento
máximo (pico) de volumen (%); (b) tasa inicial del aumento de volumen
tras alcanzarse el aumento (%/min); (c) tiempo al pico de volumen (en segundos); (d) duración del
pico máximo de volumen (en segundos); (e) tasa inicial de la disminu-
máximo inicial del VCA (Vt ción reguladora del volumen en medio isosmótico (DRVi; %/min); (f)
magnitud de la DRVi a los 4 min de su inicio (%); (g) VCA tras 4 min
= 100%). De este modo, un
del comienzo de la DRVi (%); (h) tiempo al pico de disminución de
%DRVi = 0 señala la ausen- volumen (en segundos); (i) magnitud de la disminución de volumen (%);
(j) tasa inicial del aumento regulador del volumen en medio isosmótico
cia del fenómeno regulador, (ARVi; %/min).

mientras que un % DRVi = 100 indica una recuperación completa del volumen celular.
Utilizando los términos de la Fig. 14, el %DRVi se define como [(a − g) / a ] x 100.

3.10.2 Análisis de los cambios en el pHi. En la Fig. 15 se representan los cambios típicos que
se observan en el pHi de las células N1E-115 cargadas con BCECF al ser expuestas a pulsos
con NH3/NH4+ y se definen los puntos de registro referenciales para cotejar la respuesta
celular ante los distintos tratamientos experimentales.

La comparación entre las medias de los parámetros de VCA y pHi correspondientes a los
pulsos control y experimental con NH3/NH4+ se realizó a través de la Prueba t de 2 colas para
medidas independientes, y el límite de significación establecido fue p<0,05 (excepto para
algunas variables, según se refiere en la sección 4.3 de Resultados). Todas las medidas, referi-
das tanto al VCA como al pHi, se expresan como Medias ± error estandar de la media (EEM).

53
 Fig. 9 Figura 15. Nomenclatura para el
análisis de los cambios en el pHi en
células N1E-115 expuestas al par
NH3/NH4+. Se midieron: el pHi basal (t
= 0); el pHi alcanzado durante el pico
alcalino (t=1); el pHi inmediatamente
previo a la remoción del pulso de
NH3/NH4+ (t=2); el pHi al pico acídico
(t=3), y el pHi tras su recuperación y
estabilización (t=4). La tasa de acidifi-
cación del plateau (t=1→ t=2) se cal-
culó trazando una regresión lineal
sobre los valores de pHi registrados
durante los primeros 2-3 min de este
proceso. A través de este método los
valores se ajustaron con un alto grado
de correlación.

3.11 Calibración del pHi. La calibración de las señales fluorescentes para su posterior con-
versión a valores de pHi se realizó, al término de cada experimento, a través de la aplicación
secuencial de pulsos de breve duración (2-3 min c/u) con soluciones isosmóticas con diferen-
tes pHs (5,8, 6,2, 6,6, 7,0, 7,4, 7,8, 8,2 y 8,6; Fig. 16A), conteniendo una alta [K+] (125 mM)
y 5 µM de nigericina (Sigma, USA), de acuerdo con la técnica descripta por Boyarsky y cola-
boradores287-289. La nigericina es un iónoforo selectivo al K+ y al H+, que se incorpora a la
membrana plasmática haciéndola permeable a estas dos cationes, de tal manera que el pHi se
equilibra con el pH externo en cada pulso de calibración. Esta substancia (de Sigma, USA) se
utilizó a partir de una solución madre (10 mM) disuelta en etanol.

El pHi se calculó a partir del cociente de los valores de fluorescencia obtenidos tras la
excitación alternativa a 495 y 440 nm (ó 495 y 438 nm, según el sistema empleado) a lo largo
del experimento; los promedios de los valores obtenidos en la “cola” de cada pulso de calibra-
ción (una vez que la señal logra estabilizarse; Fig.16A) se utilizan para construir, a través de
un programa informático (NFIT 1.1, University of Texas, USA), una curva de pH y obtener
los parámetros que se utilizarán para convertir los cocientes referidos a valores de pHi (Fig.
16B).

54
 2.4
soluciones de calibración alto K+ / nigericina 5µM
pH 8.6
2.2
pH 8.2
2.0

1.8 pH 7.8

1.6
495 / 440

pH 7.4
1.4

495 / 440
1.2 pH 7.0

1.0
pH 6.6
0.8
pH 6.2
0.6

0.4
pH 5.8 A
110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 pHi B
tiempo (min)

Figura 16. Calibración del pHi. A) Registro experimental, en una célula individual, del cociente de las
señales de fluorescencia derivadas de la excitación del BCECF a 495 y 440 nm al aplicar soluciones isos-
móticas con distintos pHs, conteniendo 125 mM de K+ y 5 µM de nigericina. B) Curva de calibración del pHi
obtenida a partir de los datos mostrados en (A).

El pHi se calcula por medio de la siguiente ecuación:

CFt − CFmin
pH i = pK a + log (9)
CFmax − CFt

donde pKa es el pK del BCECF (=7,0) y CF es el cociente de fluorescencias (i.e. 495/438 nm):
CFt, a cualquier punto experimental
CFmin, al valor de calibración más ácido
CFmax, al valor de calibración más alcalino

3.12 Criterio de selección de las células para el análisis de los cambios en el VCA y en el
pHi. Para el análisis cuantitativo de los cambios en el VCA y el pHi se seleccionaron, entre las
células registradas durante los experimentos que conforman este trabajo, aquellas que reunie-
ron las siguientes condiciones: 1) pHi basal entre 6,8 y 7,4 al comienzo del pulso control con
NH3/NH4+; 2) evidencia de DRVi durante el pulso control con NH4Cl; 3) ausencia de fluctua-
ciones ó “ruido” excesivo en el registro de fluorescencia. Se excluyeron asimismo del análisis
aquellas células en que no fue posible obtener la curva de calibración del pHi al finalizar el
experimento.

55
3.13 Ventajas y desventajas de las técnicas fluorescentes. Las técnicas fluorescentes pre-
sentan ciertas ventajas sobre otros métodos de determinación del volumen celular en células
individuales, por cuanto: a) no son invasivas; los indicadores fluorescentes o “fluoróforos”
pueden introducirse al interior celular sin disrupción de la membrana plasmática, conjugándo-
los con un grupo éster hidrolizable. Esto último los hace altamente hidrofóbicos y por ende
permeantes; b) los registros de fluorescencia pueden calibrarse con soluciones experimentales
para obtener medidas de volumen relativo, de tal manera que cada célula sirve como si fuese
su propio “osmómetro” ; c) son especialmente adecuadas para estudiar células individuales, a
diferencia de otros métodos, que proveen estimaciones de cambios de volumen en poblacio-
nes celulares, que pueden no ser homogéneas, o no responder sincrónicamente a las alteracio-
nes osmóticas; d) pueden medir cambios de volumen en células de morfología compleja, inde-
pendientemente de cambios en la forma de éstas; e) poseen una resolución temporal (≥ 0.1
Hz) y una sensibilidad (~1%) muy superiores a las de otras técnicas existentes.
Entre las desventajas comunes a todos los indicadores fluorescentes del volumen celular se
encuentran: a) la unión o confinamiento a estructuras u organelos celulares; b) el daño foto-
dinámico; c) la posible fuga del colorante; en el caso de la calceína, por ejemplo, por la acción
de la glicoproteína P; d) la alteración de la señal por movimientos o cambios de forma de las
células, en el caso de los indicadores que tienen solo ún máximo de excitación y uno de
emisión. Entre las desventajas asociadas al uso del BCECF (así como a otros fluoróforos) se
cuentan: a) cambios en la intensidad de la fluorescencia debidos a la microviscosidad del
medio; b) cambios intracelulares en la sensibilidad espectral del indicador (posibilidad descar-
tada en base a estudios hechos con BCECF en nuestro laboratorio, para el rango de pHi explo-
rado)64,282; c) sensibilidad a sustancias exógenas, como el NPPB, o endógenas, como ciertos
metales pesados que producen “apagamiento” (quenching) de la señal fluorescente, lo cual
afecta especialmente al PI y conduce a lecturas erróneas del VCA. A este respecto, experi-
mentos efectuados en nuestro laboratorio permitieron estimar la magnitud del cambio en la
fluorescencia del BCECF en presencia de diversas concentraciones de NPPB. Dichos estudios
determinaron que las concentraciones de NPPB usadas en nuestros experimentos (10 µM) no
producen alteraciones en la fluorescencia.

56
3.14 Detección de la enzima glutamina sintetasa por el método de Western Blot. La
detección con anticuerpos de la enzima glutamina sintetasa en células N1E-115 y NG-108
(neuroblastoma x glioma) se llevó a cabo según el procedimiento descrito en la Ref. 290. Se
utilizó el anticuerpo primario policlonal (cabra) anti glutamina sintetasa (Santa Cruz Biotech-
nologies, USA, Cat. Nº sc-6640) en una dilución 1:800. La detección de este anticuerpo se
realizó con un anticuerpo secundario (burro anti cabra) conjugado con peroxidasa de rábano
(Sta. Cruz, Cat. Nº sc-2020), en una dilución de trabajo de 1:30.000.

57
4. RESULTADOS

4.1 Cambios paralelos en el volumen celular acuoso y en el pH intracelular producidos

por el par amonio/amoníaco en células de neuroblastoma. La Fig. 17 muestra los registros
simultáneos de los cambios en el volumen celular acuoso relativo (Vt/V0; trazo negro superior)
y en el pH intracelular (pHi; trazo inferior) en una célula (N1E-115) expuesta a un pulso (20
min de duración) con una solución isosmótica conteniendo 20 mM de NH4Cl. Se observan los
cambios esperados en el pHi: alcalización inicial (1p); fase de acidificación del plateau (2p);
acidificación “de rebote” (3p) y recuperación de la acidificación (4p). Simultáneamente con
estos cambios en el pHi, se observaron cambios en el VCA que consistieron en: un aumento
inicial del volumen (1v), seguido de una disminución reguladora (2v o DRVi). Al eliminar el
pulso de NH4Cl y regresar a la solución isosmótica se observó una disminución transitoria del
VCA (3v), seguida de una fase de recuperación (4v ó ARVi). Para caracterizar las respuestas
descritas se realizaron experimentos similares al ilustrado en la Fig. 17, en los que el pulso de
NH4Cl (20 mM) se aplicó durante ~7 min. En 61 células N1E-115 que llenaron los criterios de
selección descritos en la sección 3.12 de Materiales y Métodos se encontró que: 1) el aumento
máximo promedio del VCA (1v) fue de 18,5 ± 1,1%. El volumen aumentó a una tasa inicial de
372 ± 19 % min y el pico máximo se alcanzó en 38 ± 2 s. Las células permanecieron hincha-
das en este valor máximo durante 75 ± 7 s y a continuación mostraron DRVi. Esta respuesta
reguladora ocurrió a una tasa inicial de –7,3 ± 0,9 %/min, que fue calculada aplicando una
regresión lineal sobre los datos de VCA registrados durante los primeros ~2 min a partir de su
inicio. El porcentaje de volumen regulado (%DRVi) calculado a los 4 min de iniciado el fenó-
meno regulador fue de 26,3 ± 2%, valor expresado en relación con el valor del aumento
máximo inicial del VCA normalizado, esto es, considerado como del 100% (ver Fig. 14,
sección 3.10.1, Materiales y Métodos). Tras la remoción del pulso de NH4Cl el VCA se redujo
(3v) por debajo del volumen basal inicial, alcanzando un mínimo promedio de -7,4 ± 0,6 % (n
= 56). Esta disminución del VCA se completó en un tiempo de 92 ± 9 s, medido entre el ins-
tante en el que se eliminó el pulso de NH4Cl y aquél en que se alcanzó el valor mínimo. Esta
fase fue seguida de una recuperación parcial, a veces total, del volumen inicial (ARVi ó fase
4v). Las fases 3v y 4v se caracterizaron por su variabilidad. Así, una vez terminado el pulso

58
de NH4Cl, en 5 de las 61 células estudiadas el volumen simplemente retornó a su valor inicial,
en el que permaneció estable por varios minutos, o bien se estabilizó ligeramente por encima
del volumen basal. La tasa inicial del ARVi fue de 13 ± 1,9 %/min, y pudo medirse en 54
células.

40 1.3 1.28
7.4
1.24
[NH4 ]i (mM)

35 2v 1.2
7.2 1.20

Vt/V0
30 pHi 1.16
+

1.1
7.0
25 1v 1.12

Vt/V0
1.0 6.8
1.08
20 0 10 20 30 40 50 60 70
1.04
3v tiempo (s)
1.00
4v 0.96
7.4
0.92
2p
7.2 0.88

1p 5 min
7.0
pHi
6.8
3p
6.6 4p

6.4

6.2
NH4Cl 20 mM
solución isosmótica (ISO)

Figura 17. Cambios paralelos en el VCA y en el pHi inducidos por 20 mM de NH4Cl en una célula N1E-
115 cargada con BCECF. En los cambios de volumen celular acuoso, (Vt/Vo, trazo negro superior) y de pHi
(trazo negro inferior) que ocurren ante la aplicación y remoción de NH4Cl se distinguen típicamente 4 fases,
que siguen un curso paralelo: ante la exposición a NH4Cl las células responden con un aumento rápido de pHi
(1p), debido a la entrada de NH3 y su protonación en el citosol. El pico de pHi antecede, en unos pocos segun-
dos, al pico de aumento del volumen acuoso [(1v); Inserto]. Después de alcanzarse los valores máximos respec-
tivos, tiene lugar una fase de acidificación gradual del citosol (2p), determinada por el influjo de NH4+ y su
disociación intracelular, dando lugar a la formación de NH3 e H+. Concomitantemente con esta fase, se obser-
va una disminución reguladora del volumen (DRVi; 2v). Al retirar el pulso de NH4Cl el pHi disminuye rápida-
mente (3p), alcanza un mínimo (ácido con respecto al pHi previo al pulso) y a continuación se recupera gra-
dualmente (4p). Paralelamente, la célula se encoge (3v), desarrollándose a continuación un aumento regulador
del volumen (ARVi; 4v) que tiende a restablecer el volumen inicial. Dado que, aún tras la alcalinización inicial,
el pHi « pK de la reacción NH3+H+ ⇌ NH4+, se favorece la formación y continua acumulación de NH4+ en el
interior celular. La [NH4+]i en función del tiempo, calculada con la ecuación 10 (Pág. 61) para éstas células,
se muestra con un trazo verde, superpuesto al trazo de Vt/Vo. Con un trazo rojo se expresa el cambio teórico del
volumen celular en función del tiempo, si la célula no mostrara DRVi. Estos valores se calcularon con la ecua-
ción 11 (Pág. 62), tomando en cuenta el aumento en la osmolaridad intracelular debido a la acumulación de
NH4+ y un hipotético anión acompañante (principio de electroneutralidad macroscópica). Aquí puede verse que
el aumen-to inicial del VCA es sensiblemente mayor que el aumento predicho a través de estos cálculos.

59
 Cambios semejantes en el VCA, pero de magnitud inferior, se observaron al exponer las
células a concentraciones de 0,5 y 1 mM de NH4Cl (Fig. 18), más próximas a las encontradas
1.08 en condiciones fisiopatológicas
1.06 (ver sección 1.6.1 de la Introduc-
1.04 10 min ción). Cambios de VCA similares
Vt/V0

1.02
a los observados en células car-
1.00
0.98
gadas con BCECF ocurrieron tam-
0.96 bién en células cargadas con cal-
0,5 mM 1 mM
ISO
NH4Cl NH4Cl ceína, un indicador insensible al

Figura 18. Cambios en el VCA registrados en células cargadas pHi y con propiedades espectrales
con BCECF y expuestas a pulsos de 0,5 y 1 mM de NH4Cl. Los distintas a las del BCECF (Fig.
registros provienen de células diferentes. Las características gene-
rales de la respuesta fueron semejantes a las observadas ante 19).
concentraciones más altas de NH4Cl.

1.25
En cuanto a los cambios en el pHi, en las 61
1.20
1.15 células se obtuvieron los siguientes resultados:
Vt/V0

1.10 5 min pHi basal (pHi t=0, véase Fig. 15, Materiales y
1.05
Métodos) de 7,08 ± 0,02. Ante la exposición del
1.00
0.95 pulso de NH4Cl el pHi promedio alcanzó un valor
0.90
20 mM máximo (pHi t=1, correspondiente a la fase 1p en
ISO
NH4Cl
la Fig. 17) de 7,49 ± 0,02. Estos valores repre-
Figura 19. Cambios en el VCA registrados en sentan un incremento del pHi (∆pHi) de 0,41 ±
una célula cargada con calceína y expuesta a
un pulso de 20 mM de NH4Cl. Los cambios en 0,01 unidades de pH (u.pH). En consonancia con
el VCA, así como su cinética, fueron comparables
a los registrados en células cargadas con las predicciones teóricas (ver sección 1.3.1,
BCECF.
Introducción), mientras más ácido fue el pHi
basal inicial, mayor fue el ∆pHi (observación no ilustrada). Tras la alcalinización inicial, la
acidificación intracelular subsiguiente (fase 2p) ocurrió con una tasa inicial (dpHi/dt) de -0,024
± 0,001 u.pH/min, calculada a partir de una regresión lineal (r > 0,9) ajustada a los valores de
pHi registrados durante los 2 ó 3 minutos que siguieron al pico alcalino. La disminución del
pHi durante el plateau de acidificación tuvo un curso temporal exponencial decreciente, que
tendió a hacerse asintótico hacia el final del pulso de NH3/NH4+. Inmediatamente antes de

60
finalizar dicho pulso el pHi (pHi t=2) fue de 7,35 ± 0,02, lo cual representa una disminución de
~0.14 u.pH (en 7 min) con respecto al valor del pico alcalino inicial (pHt=1). La remoción del
NH4Cl resultó en una acidificación rápida y pronunciada (fase 3p), que llevó al pHi a un valor
mínimo (pHi t=3) de 6,74 ± 0,02, es decir ~0,34 u.pH por debajo del pHi inicial, registrado en
condiciones basales. Luego tuvo lugar una fase de recuperación (fase 4p) que se desarrolló a
una tasa inicial de 0,02 ± 0,002 u.pH/min. Tras ~30 min de iniciado el lavado con la solución
control (ISO), el pHi (pHi t=4) alcanzó un valor de 6,96 ± 0,06. Esta recuperación incompleta
del pHi después de la aplicación de un pulso de NH4Cl (20 mM) se presentó prácticamente en
todos los casos y ha sido descrita en muchos otros tipos celulares. Es decir, las células se van
acidificando conforme transcurre el tiempo de experimentación y esta acidificación se poten-
cia con la exposición y remoción repetida del NH4Cl, de tal manera que después de cada pulso
el pHi se recupera, pero el nuevo estado estacionario se alcanza a valores más ácidos que los
iniciales.

4.1.1 ¿Es posible explicar el aumento inicial del VCA por la acumulación intracelular de
NH4+? Como vimos en la sección 1.3.1 de la Introducción, la exposición de las células a una
solución conteniendo NH3/NH4+ resulta en el influjo rápido del gas NH3 que en el interior
celular se protona, generando NH4+ en concentraciones del orden milimolar que, por ende,
pueden ejercer efectos osmóticos significativos, cuya magnitud no ha sido determinada hasta
el momento. La primera pregunta que surge de las observaciones descritas es si la fase inicial
de aumento de volumen (1v) puede explicarse simplemente por la acumulación de NH4+ y un
co-ión cargado negativamente, que sería necesario para preservar la condición de electroneu-
tralidad macroscópica del interior celular. A partir de los valores de pHi registrados durante el
plateau de acidificación (2p) al aplicar un pulso de NH4Cl, usando la ecuación de Henderson-
Hasselbalch (Ec. 1, Introducción), es posible calcular la [NH4+]i que corresponde a cada valor
de pHi medido:

[NH4+]i = [NH4+]o x 10 pHo – pHi (10)

donde [NH4+]o es la concentración extracelular de NH4+, que para una solución 20 mM de

61
NH4Cl a 25ºC es de 19,77 mM (pK =9.25; pHo = 7.3). La [NH4+]i en función del tiempo se
muestra, para la célula ilustrada en la Fig. 17, con un trazo verde sobre el registro del VCA. A
su vez, conociendo la [NH4+]i para cada instante “t” y el valor inicial de la osmolaridad
intracelular (ver abajo), es posible estimar el cambio de volumen relativo (Vt/Vo) que teórica-
mente produciría la acumulación de NH4+ y un anión acompañante, en ausencia de respuestas
reguladoras del volumen:

Vt (mosm/kgH 2 0i ) t = t
= (11)
V0 (mosm/kgH 2 0i )t = 0

Los cambios en el VCA predichos de este modo para cada instante se ilustran en la Fig. 17
(trazo rojo). La predicción del VCA durante su fase de ascenso inicial no puede realizarse
dado que el sistema no ha alcanzado la condición de equilibrio, es decir aquella en la que
[NH3]i = [NH3]o. Esta es una condición requerida para estimar la [NH4+]i utilizando la teoría
de Henderson-Halselbalch. Por otra parte, dado que el aumento de volumen producido por el
par NH3/NH4+ determina la dilución de los solutos intracelulares, el cálculo de la [NH4+]i debe
corregirse en función de los cambios efectivos observados en el VCA. Esta corrección se
realizó multiplicando la [NH4+]i calculada para cada instante por los valores correspondientes
(es decir, coincidentes en el tiempo) del VCA. Tras esta corrección, la [NH4+]i estimada en las
61 células durante el pico máximo de aumento del volumen fue de 16,8 ± 0,9 mM. En ese
momento, el aumento medio en la osmolaridad intracelular debido a la acumulación de NH4+ y
de un hipotético co-ión monovalente debió ser, por tanto, de 16,8 × 2 = ~33,6 mosm/Kg H2O.
Si aceptamos, en virtud de la estabilidad previa del registro del VCA en solución ISO, que las
células están en equilibrio osmótico, es decir, que la osmolaridad intracelular al comienzo del
pulso es igual a la extracelular (311,4 ± 0,2 mosm/KgH2O; n = 61), el aumento referido en la
osmolaridad intracelular induciría un aumento máximo en el VCA de ~11% (Eq. 11), mientras
que el observado experimentalmente es de ~18%. Para explicar el aumento máximo de volu-
men observado (~18%) se requeriría de un incremento en la osmolaridad intracelular de ~57,6
mosm/KgH2O, que es ~1,7 veces mayor que el incremento calculado a partir de la [NH4+]i.
Dicho de otra manera, el aumento en la concentración de NH4+ y un anión monovalente

62
explicaría un ~58% del aumento del volumen inicial observado (1v), lo cual sugiere que el
NH4+ no es el único osmolito intracelular que se acumula rápidamente, dando lugar al aumento
referido del VCA. En la Fig. 20 se grafican los
40
valores observados del aumento máximo del 35

VCA max (%)

30
VCA (círculos negros) en función de la
25
[NH4+]i, calculada para el aumento máximo de 20
15
pHi (pHi t=1), en las 61 células. La correlación 10
entre estas variables es alta (coeficiente de 5
0
correlación de Pearson, R = 0,8) y es estadís- 5 10 15 20 25 30 35

ticamente significativa (p << 0,001), lo cual [NH4+] (mM)

i

sugiere que la acumulación intracelular de
NH4+, si bien es insuficiente para explicar la
totalidad del aumento de volumen inicial
observado, es un determinante importante del
mismo. En la misma figura se grafica el
aumento teórico del VCA (círculos blancos) en
función de la [NH4+]i, según se explicó más arriba. Puede apreciarse la diferencia entre los
valores teóricos y los observados, con las implicaciones que ya se mencionaron.
Figura 20. Aumento máximo observado (z) y
predicho (○) del VCA, en función de la
[NH4+]i. Datos de 61 células expuestas a 20 mM
de NH4Cl. Ordenada: valores del pico máximo del
VCA. Abscisa: [NH4+]i calculada durante el pico
máximo de pHi. Los datos del pico máximo
observado (z) se ajustaron con un polinomio de
segundo grado. Este ajuste tiene solamente un
valor descriptivo.

40
35
Otra de las hipótesis planteadas en este traba-
VCA max (%)

30
jo postula que si el aumento inicial del VCA en
25
20 células expuestas al par NH3/NH4+ se debe a la
15
10 acumulación intracelular de NH4+, la amplitud
5
del aumento inicial del VCA debe ser mayor
0
6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 cuanto menor es el pHi inicial de las células. Esto
pHi t=0 se debe a que, a pHis más ácidos, la [H+]i es más
Figura 21. Aumento máximo del VCA en elevada y la formación de NH4+ (derivada de la
función del pHi basal. Las células fueron
expuestas a un pulso de NH4Cl (20 mM). protonación de NH3) se ve incrementada. En la
Fig. 21 se grafica la amplitud inicial del aumento de VCA producido por 20 mM de NH4Cl en
función del pHi basal, en las 61 células. Una regresión lineal ajustada a los datos muestra que
existe, en efecto, una correlación significativa entre estas variables (R = -0,85; p << 0,0001).

63
4.1.2 El volumen celular cambia en función de la concentración externa de NH4Cl. Si los
cambios de volumen y pHi que resultan de la exposición de las células al par NH3/NH4+ se
debiesen a la entrada de NH3 ó NH4+, ó de ambas especies, la amplitud de los mismos debería
variar con la concentración externa del par NH3/NH4+. Con el objeto de probar esta hipótesis,
así como de ampliar nuestras observaciones acerca de la relación entre el VCA observado y el
predicho, se realizaron experimentos 1.4 (13)
A
encaminados a obtener “curvas dosis-

VCA max (Vt/V0)

1.3 (10)

respuesta” aplicando a las células pul- (11)

1.2
sos isosmóticos de soluciones conte- (15)

niendo diferentes concentraciones de 1.1 (11)

(9)

NH4Cl (en mM): 0,5; 1; 5; 10; 20 y 30.

1.0
En cada experimento, el orden de los 0 5 10 15 20 25 30
[NH4Cl]o (mM)
pulsos de distinta concentración fue
0.7
aleatorio, para descartar posibles efec- B
0.6
tos acumulativos o de interacción entre 0.5
25
las distintas dosis. Los pulsos tuvieron ∆pHi 0.4 20

[NH4+]i (mM)
0.3
una duración de ~2 min y estuvieron 15
0.2 10
separados por lavados de entre 15 y 30
0.1 5
minutos con solución ISO basal. En la 0.0 0

Fig. 22 se muestra la relación entre el 0 5 10 15 20 25 30

[NH4Cl]o (mM)
pico máximo del VCA observado
(círculos negros) y el predicho (círcu- Figura 22. Cambios en el VCA y en el pHi en función de la
concentración externa de NH4Cl. Células cargadas con
los blancos) en función de las concen- BCECF fueron expuestas a pulsos con soluciones conteniendo
0,5, 1, 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl aplicados de manera
traciones externas de NH4Cl. La Fig. aleatoria. A) Valores del pico máximo de VCA observado (z)
y predicho (○), graficados en función de la [NH4Cl]o. B)
22B muestra la amplitud del cambio Cambio inicial de pHi (∆pHi) (z) y de la [NH4+]i (○) en
función de la concentración externa de NH4Cl.
inicial del pHi (∆pHi) registrada para
cada [NH4Cl], así como la [NH4+]i correspondiente al pico alcalino en cada caso. El análisis de
la gráfica mostrada en la Fig. 22A indica que para [NH4Cl]o ≥ 5 mM el aumento predicho del
VCA explica entre 37 y 48% del aumento observado, mientras que para [NH4Cl]o de 0,5 y 1
mM los valores predichos explican, respectivamente, sólo 23 y 30% de los picos observados.

64
4.1.3 Efectos diferenciales del NH3 y el NH4+ sobre el VCA y el pHi. Dado que en las
soluciones de NH4Cl coexisten el NH3 y el NH4+, que son un gas y un ión, respectivamente,
con propiedades físicoquímicas y de permeación distintas, cabe preguntarse ¿qué determina
los cambios de volumen, el NH3, el NH4+ ó ambas especies? Con el objeto de contestar a esta
pregunta se diseñaron los experimentos que se describen a continuación y que se basan en los
siguientes razonamientos. En primer lugar, la rápida alcalinización intracelular que se observa
en células N1E-115 expuestas al NH4Cl indica que éstas, como la mayoría de las células
estudiadas hasta el momento, son más permeables al NH3 que al NH4+. Segundo, dado que el

pK de la reacción NH3 + H+ ⇆ NH4+ es de 9,25 a 25ºC, para valores de pHi iniciales como los
observados en nuestros experimentos (entre ~6,8 – 7,4), el equilibrio de esta reacción favore-
ce, en unos dos órdenes de magnitud, la formación del ion NH4+. Si la permeabilidad de la
membrana plasmática al NH3 fuese, además, significativamente mayor que al NH4+, y la
acumulación de este ion a consecuencia de la protonación del NH3 entrante guardase relación
directa con la magnitud del aumento inicial de volumen, este último debería de variar ostensi-
blemente con la concentración externa de NH3 y no con la del NH4+. Para evaluar esta hipóte-
sis se realizaron experimentos empleando soluciones con NH4Cl en las cuales se varió la
[NH3] manteniendo constante la [NH4+] y viceversa. Esto se logró a través del ajuste del pH de
las soluciones siguiendo el procedimiento descrito en la sección 3.3 (Tabla I) de Materiales y
Métodos. Los experimentos se realizaron en células cargadas con BCECF, a las que se aplica-
ron de dos a cuatro pulsos de soluciones conteniendo distintas concentraciones de las especies
en cuestión. Cada pulso duró ~6 minutos y las soluciones se presentaron de manera aleatoria.

La Fig. 23A (Pág. siguiente) muestra los cambios en el VCA registrados en una misma cé-
lula tras la aplicación de dos pulsos consecutivos (P1 y P2) de NH4Cl en los que la [NH4+]o se
mantuvo constante (10 mM), mientras que la [NH3]o se incrementó de 0,05 mM en P1 a 0,22
mM en P2. Puede observarse que el aumento de volumen es marcadamente mayor en P2 que en
P1. La Fig. 23B muestra, en otra célula, los efectos sobre el VCA producidos por dos pulsos de
NH4Cl en los que ahora la [NH3]o permaneció constante (0,23 mM), disminuyendo la [NH4+]o
de 19,77 mM en P1 a 4,77 mM en P2. Puede observarse que, no obstante la diferencia en las
concentraciones externas de NH4+ en P1 y P2, la amplitud del aumento de volumen fue similar
en ambos pulsos. En todos los experimentos la osmolaridad de las soluciones fue la misma.

65
 [NH4+]o Constante = 10 mM
A Figura 23. Efectos de la
concentración externa de
[NH3]o = 0,05 mM [NH3]o = 0,22 mM NH3 y NH4+ sobre el VCA.
1.5
1.4 Registro de los cambios en el
1.3 P1 P2 VCA en dos células expues-
Vt/V0

1.2 tas a dos pulsos de NH4Cl

1.1 5 min (P1 y P2) en los que se man-
1.0 tuvo constante el NH4+ (A) o
0.9 el NH3 (B). Las concentra-
0.8 ciones relativas de cada es-
10.05 mM 10.22 mM
NH4Cl NH4Cl pecie se ajustaron alterando
Iso el pH de las soluciones, se-
pH 7.0 pH 7.3 pH 7.6
gún se indica para cada pul-
so, manteniendo la osmolari-
[NH3]o Constante = 0.23 mM
B dad constante.

1.5 [NH4+]o = 19,77 mM [NH4+]o = 4,77 mM

1.4
1.3 P1 P2
Vt/V0

1.2 La Fig. 24 reúne los

1.1
1.0 datos de una serie de
0.9
0.8 experimentos como los
20 mM 5 mM

Iso
NH4Cl NH4Cl descritos y ejemplifica-
pH 7.3 pH 7.91
dos en la Fig. 23. En (A)
aparece graficada la amplitud del pico máximo de volumen en función de la [NH3]o, cuando la
[NH4+]o se mantuvo constante (10 mM). Nótese que 1.6
A [NH4+]o = 10 mM
VCA max (Vt/V0)

1.5
la amplitud del pico inicial del VCA aumenta con la
1.4
[NH3]o. La gráfica en (B) muestra la amplitud del 1.3

pico máximo de volumen en función de la [NH4+]o 1.2

1.1 n = 16
cuando la [NH3]o se mantuvo constante (0,23 mM). 1.0
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
Nótese la insensibilidad relativa de la respuesta ante [NH3]o (mM)
+
diferentes [NH4 ].
1.6
B [NH3]o = 0,23 mM
1.5
VCA max (Vt/V0)

1.4
Figura 24. Efectos diferenciales del NH3 1.3
y el NH4+ sobre la amplitud del aumento
inicial del VCA. Amplitud del pico máximo 1.2
de VCA en función de A) la [NH3]o, 1.1 n = 17
manteniendo la [NH4+]o constante (10 mM) 1.0
y B) la [NH4+]o, manteniendo la [NH3]o 0 5 10 15 20 25 30 35
constante (0.23 mM). [NH4+]o (mM)

66
 Los cambios en el pHi registrados simultáneamente con los cambios en el VCA mostrados
en la Fig. 23 se muestran en la Fig. 25. Como era predecible, de acuerdo con la hipótesis
expuesta, lo que sucede con el pHi es similar a lo que ocurre con el VCA, esto es, que la
amplitud de la alcalinización ini- [NH4+]o Constante = 10 mM
A
cial depende principalmente de [NH3]o = 0,22 mM
7.6 [NH3]o = 0,05 mM
la [NH3]o (Fig. 25A) y no de la 7.4
7.2 P1 P2
+ 5 min
[NH4 ]o (Fig. 25B). En la Fig. pHi 7.0
6.8
25B se aprecia, además, que 6.6
6.4
aunque la amplitud de las res- 10.05 mM 10.22 mM
NH4Cl NH4Cl
Iso
puestas de pHi fue similar en pH 7.0 pH 7.3

ambos pulsos, la pendiente de la [NH3]o Constante = 0.23 mM

B
acidificación del plateau fue 7.4 [NH4+]o = 19,77 mM [NH4+]o = 4,77 mM

más pronunciada en P1, en don- 7.2

P1 P2
pHi 7.0
de la [NH4+]o fue mayor. Esta 6.8
6.6
observación es consistente con
6.4
20 mM 5 mM
la hipótesis de que la entrada de NH4Cl NH4Cl
Iso
pH 7.3 pH 7.91
NH4+, siguiendo su gradiente de
Figura 25. Efectos de la concentración externa de NH3 y NH4+
concentración, y su ulterior sobre el pHi. A) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos
consecutivos con [NH4+]o constantes (10 mM) y [NH3]o variables.
disociación en H+ y NH3 en el B) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos consecutivos
interior celular determina, en con [NH3]o constantes (0,23 mM) y [NH4+]o variables.

parte, la pendiente de acidificación del plateau. Puede verse además que la caída del pHi tras
la remoción del NH4Cl es más marcada en P1 que en P2. Esto sugiere que la acumulación
intracelular de NH4+ fue mayor en P1 que en P2, de tal manera que ante la remoción de los
respectivos pulsos de NH4Cl, se generaron más protones intracelulares en P1 que en P2.

En la Fig. 26 (Pág. siguiente) se grafica la amplitud de los incrementos iniciales del pHi
(∆pHi) registrados en estos experimentos, en función de: A) la [NH4+]o manteniendo constante
la [NH3] y B) en función de la [NH3]o, manteniendo constante la [NH4+]. Puede notarse que
cuando la [NH4+]o es constante (Fig. 26B), el ∆pHi aumenta de manera lineal con la [NH3]o, lo
cual está de acuerdo con la hipótesis de que la difusión pasiva de la base neutra NH3 es el
determinante primario del cambio inicial del pHi ante la exposición al NH4Cl.

67
 0.6
[NH ] = 0,23 mM (6)
(4) 3o 0.024 (6)
[NH3]o = 0.23 mM
(4)

dpH/dt (u.pH/min)
0.5
(3) 0.020
∆ pHi

(4)

0.4 0.016 (3)

(4)
A
0.012
0.3
0 5 10 15 20 25 30 35
+
0.008
[NH4 ]

_
o (mM)
0.004
0.8 (4) 0 5 10 15 20 25 30
[NH +] = 10 mM
0.7 4 o +
[NH4 ]o (mM)
0.6 (4)
∆ pHi

0.5 Figura 27. Tasa de acidificación intracelular (fase 2p)

(3)
0.4 en función de la [NH4+]o. Ordenada: tasa inicial de
(3) acidificación intracelular (-dpHi/dt). Absisa: concentra-
0.3 B ción de NH4+ externo. La [NH3]o se mantuvo constante
0.2 (0,23 mM).
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
[NH3] (mM)
o

Figura 26. Incremento inicial del pHi, (∆pHi) en células expuestas a pulsos con concentraciones fijas ó
variables de NH3 y NH4+. A). ∆pHi en función de diversas [NH4+]o, manteniendo constante la [NH3]o. B)
∆pHi en función de [NH3]o variables, manteniendo constante la [NH4+]o. La relación entre el ∆pHi y la [NH3]o
(en presencia de 10 mM de NH4+o) puede describirse empíricamente por medio de la relación: ∆pHi ≊ [NH3]o
x 1,38 + 0,22.

Por otro lado, el efecto del influjo de NH4+ sobre el pHi se manifiesta en la relación
ilustrada en la Fig. 27, en la que se grafica la tasa inicial de la acidificación intracelular
(plateau; fase 2p), en función de la [NH4+]o, cuando la [NH3]o fue constante.

4.2 Estimación del flujo y de la permeabilidad al NH3. El flujo de NH3 a través de la

membrana plasmatica de las células N1E-115 expuestas a pulsos de NH4Cl, se calculó a partir
de la tasa inicial de aumento del pHi (dpHi/dt), registrada en los experimentos de dosis-
respuesta (sección 4.1.2; Fig. 22). Dado un pK de ~9,25 para el par NH3/NH4+, a pHsi ~7,
como los registrados para las células de los experimentos mencionados, menos de un 1% de
los iones NH4+ que ingresen a las células liberarán sus protones. En estas condiciones, es de

68
 esperar que la entrada directa de NH4+ tras la exposición súbita al NH3/NH4+ no incida signifi-
cativamente sobre el cambio inicial del pHi, el cual estará determinado, principalmente, por la
difusión pasiva del NH3. El flujo del NH3 a través de la membrana plasmática está dado por la
siguiente ecuación:

JNH3 = V/S x βi x dpHi/dt (12)

donde V/S es el cociente entre el volumen y la superficie celular‡, βI es la capacidad o poder de

tamponamiento intrínseco intracelular (véase sección 1.4, Introducción), expresado en
mM/u.pHi, y dpHi/dt es la tasa inicial de aumento 55
50

βΙ (mM / u.pHi)
del pHi, calculada a partir de la pendiente obteni-
45
da de una regresión lineal de los valores de pHi en 40
35
función del tiempo. βI se define como
30
∆[NH4+]i/∆pHi y fue calculado a partir de la 25
20
amplitud de la acidificación registrada tras la 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2

remoción de pulsos breves de 0,5, 1 ó 5 mM de pHi

NH4Cl (tomados de los experimentos de dosis- Figura 28. Capacidad de tamponamiento
intrínseco (βΙ) del pHi. Los valores de βI, se
respuesta) en los cuales el pHi recuperó su valor calcularon a partir del cambio de pHi regis-
trado ya sea ante la remoción de pulsos bre-
inicial, ó bien del ∆pHi registrado tras la remo- ves de NH4Cl (○) o ante la eliminación de
NH4Cl en ausencia de Na+ (z).
ción de pulsos con 20 mM NH4Cl en ausencia de
Na+ externo (el método quizá más apropiado, ya que aquí la magnitud de la acidificación
intracelular no se ve limitada ó reducida por la actividad del intercambiador Na+/H+291. En la
Fig. 28 se muestran los valores calculados para βI en función del pHi, este último expresado
como el valor de pHi intermedio entre el pHi previo a la remoción del pulso de NH4Cl (pHi t =2)
y el pHi mínimo, acídico, alcanzado tras su eliminación (pHi t=3). Con círculos blancos se
representan los datos provenientes de los experimentos con pulsos breves de NH4Cl, y con
círculos negros aquellos obtenidos de los experimentos en ausencia de Na+ externo.

‡
Los valores de volumen y superficie se calcularon a partir del radio celular medido sobre microfotografías
(tomadas de diversos experimentos) de células N1E-115 diferenciadas, considerando a las células como hemies-
feras. Esta aproximación arrojó un radio celular de ~16 µm, y una relación V/S ≈ 3,6 µm (n = 26).

69
 Tal como se observa en otros tipos celulares, puede verse que βI varía inversamente con el
pHi291-293. La pendiente de los datos graficados en la Fig. 28 tuvo un valor de -39,8 mM/u.pHi.

80

70
En la Fig. 29 se grafica el flujo de
60

JNH3 (µmol / cm2. s)

NH3 en función de la [NH3]o. En el grá-
50
fico inserto se presentan las medidas
40
correspondientes a las concentraciones 25
m = PNH3 = 3,8 x 10-5 cm/seg
30
más bajas de NH3 (correspondientes a 20

15
20
las concentraciones más bajas de 10

10 5
NH4Cl: 0,5 – 5 mM). La pendiente de la 0
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
0
recta trazada sobre estos valores (Inserto
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
Fig. 29), corresponde a la permeabilidad [NH3]o (µmol/cm )
3

de la membrana al NH3 (PNH3), estimada

Figura 29. Tasa inicial de influjo de NH3 (JNH3) en
-3 función de su concentración externa. En el gráfico inserto
en 3,8 x 10 cm/s.
se muestran, ampliados, los valores correspondientes a
pulsos con 0,5, 1 y 5 mM de NH4Cl.

En la Tabla III se presentan los valores de dpHi/dt, JNH3 y PNH3, estos últimos en µm/s,
calculados para distintas concentraciones externas de NH3/NH4+.

Tabla III. dpHi/dt, JNH3 y PNH3 en células expuestas a diferentes concentraciones de NH4Cl.

[NH4Cl]o dpHi/dt JNH3 PNH3

(mM) (u.pHi/min) (mmol/cm2.s) (µm/s) N
0,5 0,13 ± 0,01 2,8 x 10-8 ± 1,9 x 10-9 50,6 ± 3,5 9
1 0,28 ± 0,02 6 x 10-8 ± 3,5 x 10-9 53,9 ± 3,2 9
5 1,08 ± 0,05 2,3 x 10-7 ± 1,1 x 10-8 40,6 ± 1,9 10
10 1,7 ± 0,12 3,6 x 10-7 ± 1,8 x 10-8 32,9 ± 1,6 7
20 2,84 ± 0,19 4,8 x 10-7 ± 1,7 x 10-8 21,8 ± 0,8 10
30 3,49 ± 0,12 7 x 10-7 ± 3,4 x 10-8 21 ± 1 11
Los valores se expresan como Medias ± E.E.M.

70
 Puede verse que la permeabilidad aparente al NH3 disminuye a medida que aumenta la
[NH4Cl]o, lo cual permite inferir que, conforme se incrementa la concentración relativa de
NH3/NH4+ externos, el aumento inicial del pHi se ve contrarrestado por la entrada de NH4+ a las
células. Por ello, a menos que se bloquee la entrada de NH4+ a las células, las medidas de PNH3
son confiables sólo para concentraciones de NH4Cl en el rango bajo, como las que se muestran
en el inserto de la Fig. 29.
1.3

1.2
10 min
1.1

Vt/V0
1.0

4.3 Reproducibilidad de la res- 0.9

0.8
puesta celular a los pulsos de 7.22

0.7 7.18

NH3/NH4+. El estudio de la repro-

pHi
7.14
7.3
7.10 P1
ducibilidad en el tiempo de la res- 7.2
7.06 P2
7.1
puesta de VCA y pHi ante estímu- 7.0
pHi

6.9
los repetidos es necesario para vali-
6.8
dar los efectos de tratamientos ex- 6.7
6.6
perimentales, tales como la substitu- * *
*NH4Cl 20 mM
ISO

ción de iones y la aplicación de

Figura 30. Exposición a dos pulsos consecutivos de 20 mM
fármacos inhibidores. En términos de NH4Cl en una célula cargada con BCECF. Trazo superior:
registro del VCA. Trazo inferior: registro del pHi. La duración de
generales, tanto la forma como la los pulsos fue de 7 min y el intervalo entre ambos fue de ~30 min
durante los cuales la células se perfundieron con solución isos-
cinética de los cambios en el VCA y mótica control (ISO). La tasa de acidificación tras el pico alcali-
en el pHi en respuesta a soluciones no fue típicamente más pronunciada en P1 que en P2 (Inserto).
con NH3/NH4+ fueron comparables, aunque se observó cierta variabilidad, tanto en una misma
célula como entre células. Para estudiar la reproducibilidad de las respuestas ante exposiciones
sucesivas al NH3/NH4+ y establecer la validez del análisis comparativo frente a los diversos
tratamientos experimentales (ver sección 3.8, Materiales y Métodos), se realizaron experi-
mentos exponiendo células cargadas con BCECF a dos pulsos idénticos (P1 y P2), cada uno de
7 minutos de duración, con una solución isosmótica conteniendo 20 mM de NH4Cl. El inter-
valo de tiempo entre los dos pulsos fue de ~30 min., durante los cuales las células se perfun-
dieron con la solución ISO control. La Fig. 30 muestra un ejemplo de estos registros en una
célula sometida a este protocolo experimental.

71
 Puede observarse que los cambios en el VCA y el pHi en uno y otro pulso fueron similares.
Sin embargo, el análisis estadístico de las respuestas, utilizando la prueba t de dos colas para
datos apareados reveló diferencias significativas (p<0,05) en 3 de los 10 parámetros cuanti-
ficados para el VCA (Tabla IV). Estos tres parámetros, cuya descripción gráfica se muestra en
la Fig. 14 (Materiales y Métodos) fueron: el pico máximo de aumento del VCA, ‘a’, que fue
mayor en P2 que en P1; la tasa de aumento inicial del VCA, ‘b’, que fue menor en P2 que en P1,
y el tiempo de permanencia en el pico máximo, ‘d’, que fue mayor en P1 que en P2. Es impor-
tante resaltar que tras quitar el pulso de NH4Cl, el curso temporal del ARVi (Fig. 14, ‘j’) fue
muy variable, tanto en P1 como en P2. En términos generales, el ARVi fue más lento en P2. En
algunos casos la recuperación del volumen no fue completa, ó no ocurrió. Sin embargo, en los
casos en los que pudo medirse, las diferencias no fueron significativas.
Atendiendo a las diferencias encontradas para las respuestas de VCA en P1 y P2, el análisis
de los experimentos subsiguientes que se
0.6
P1
muestran en este trabajo se realizó utilizan-
0.5 * P2
∆ pHi

do la prueba t de dos colas, reduciéndose el

0.4
límite de confianza, α, a 0,01 para los pará- A
0.3
metros a, b, y d. 6.8 6.9 7.0 7.1 pHi
(t=0)
-0.015
**
dpH/dt (upH/min)

En cuanto a los cambios de pHi, éstos -0.020

P1
fueron similares en P1 y P2, en lo que respec- -0.025

B P2
ta a sus características generales, morfológi- -0.030

cas y cinéticas (Fig. 30, trazo inferior). Sin Figura 31. Amplitud del aumento inicial y tasa de
acidificación del pHi ante la aplicación de dos
embargo, existieron también diferencias pulsos consecutivos (P1 y P2) de 20 mM de NH4Cl.
estadísticamente significativas entre uno y A) Aumento inicial del pHi (∆pHi). B) tasa inicial de
acidificación intracelular (dpHi/dt). Ambos paráme-
otro pulso. Estas fueron: la amplitud inicial tros se grafican en función del pHi basal registrado
antes de cada pulso. *p < 0,5; **p < 0,01; n = 15
del cambio de pHi (∆pHi, fase 1p, Fig. 17) para cada medida. Barras:E.E.M..

que fue mayor en P2 que en P1, y la tasa de acidificación intracelular (fase 2p, Fig. 17) que fue
menor en P2 que en P1. Estas diferencias se ilustran en la Fig. 31.

72
Tabla IV. Cambios en el VCA y el pHi tras la aplicación de dos pulsos sucesivos de NH4Cl.
20 mM NH4Cl

Variable 1er Pulso 2do Pulso

a, pico máximo de aumento del VCA (%) 24 ± 1,2 26 ± 1,5 p < 0,05

b, tasa de aumento inicial del VCA, (%/min) 522 ± 15 487 ± 18 p < 0,05

c, tiempo al valor máximo del VCA, (s) 30 ± 4 25 ± 2 N.S.

d, tiempo estable del VCA en el pico máximo (s) 133 ± 14 87 ± 12 p < 0,05

e, tasa inicial de la DRVi, (%/min) -5,4 ± 0,5 -4,8 ± 0,8 N.S.

f, VCA regulado a 4 min. de iniciada la DRVi (%) 21,5 ± 1,8* 22,9 ± 2,9 N.S.

g, VCA a los 4 min de iniciada la DRVi, (%) 78,5 ± 1,8* 77,1 ± 2,9 N.S.

h, tiempo al pico de disminución del VCA, (s) 60 ± 13 63 ± 6 N.S.

i, disminución máxima del VCA, (%) 9,8 ± 0,9 8,7 ± 1,2* N.S.

j, tasa inicial del ARVi, (%/min) 10,6 ± 2** 6,4 ± 3** N.S.

pHi t=0 7,0 ± 0,02 6,85 ± 0,03

pHi t=1 7,43 ± 0,04 7,31 ± 0,04

∆pH [pHi (t=1) – pHi (t=0)] 0,43 ± 0,03 0,46 ± 0,03 p < 0,05

pHi t=2 7,28 ± 0,03 7,19 ± 0,03

pHi t=3 6,71 ± 0,03 6,61 ± 0,03

pHi t=4 6,9 ± 0,03 6,75 ± 0,03

Tasa de acidificación (u.pHi/min) -0,025 ± 0,003 -0,02 ± 0,001 p < 0,01

[NH4+]i al pico de VCA (mM) 19 ± 1,5 25,5 ± 2,7

Aumento de volumen predicho (%) 12,2 ± 1 16,4 ± 2

Volumen explicado (%)# 52,9 ± 5,7 69,3 ± 13

Los valores se expresan como Medias ± E.E.M., prueba t para muestras apareadas. n = 15,
excepto *n = 14; **n = 13. N.S., no significativo. #Porcentaje del aumento inicial del VCA
(a) que puede explicarse por la acumulación intracelular de NH4+ y un anión.

Las diferencias observadas en el ∆pHi están determinadas por el valor del pHi antes de
cada pulso. Reflejando la recuperación incompleta del pHi que ocurre tras la aplicación de un
pulso de NH4Cl, el pHi previo a la aplicación de P2 fue ~0,15 u.pH menor que el registrado

73
antes de aplicar el P1 (7,0 ± 0,02). En estas condiciones la mayor disponibilidad de protones
intracelulares produce un ∆pHi mayor, como lo predice la teoría (sección 1.3.1, Introducción).
En cuanto a las diferencias encontradas en la tasa de acidificación del plateau, las mismas
pueden atribuirse a que el pico alcalino fue mayor en P1 que en P2: a medida que el pHi se
acerca al pK de la reacción NH3 + H+ → NH4+, mayor es el gradiente electroquímico del NH4+
dirigido hacia el interior celular.
Dadas estas diferencias entre los cambios de pHi en P1 y en P2, el límite de confianza
establecido para evaluar los posibles efectos de los tratamientos experimentales sobre el ∆pHi,
se estableció en α = 0,01, mientras que para la pendiente de acidificación del plateau fue α =
0,005, empleándose la prueba t de dos colas para datos apareados.

En líneas generales, el análisis comparativo de las respuestas intraexperimentales sugiere

que la variación entre respuestas sucesivas al NH3/NH4+ en células individuales es más bien
constante, y que la comparación de las mismas es, en principio, plausible. Por consiguiente, el
protocolo experimental de “dobles pulsos”, descrito en la sección 3.8 de Materiales y Méto-
dos, se utilizó, para explorar el efecto de diversos tratamientos experimentales sobre las
respuestas producidas por NH3/NH4+.

4.4 Otros posibles factores determinantes del aumento inicial del volumen celular acuoso
en células N1E-115 expuestas al NH3/NH4+. De acuerdo con nuestros cálculos teóricos, la
acumulación intracelular de NH4+ y un anión acompañante puede explicar ~60% del aumento
del VCA que se observa en células expuestas a 20 mM de NH4Cl (sección 4.1.1). Esto indica
que existe un 40% de aumento (equivalente a un incremento en la osmolaridad intracelular de
~24 mmol/KgH2O) que debe resultar de la acumulación intracelular de uno ó más osmolitos,
además de los dos mencionados. Esta acumulación adicional de osmolitos podría ocurrir, en
principio, a través de los siguientes procesos:
a) la síntesis de glutamina
b) el influjo neto de iones extracelulares (v.g. Cl- y/o Na+)

En las siguientes secciones se exploran estas posibilidades.

74
4.4.1 Síntesis y acumulación de glutamina. Muchas investigaciones proponen que el aumento
en la concentración cerebral de glutamina, un fenómeno común en diversos trastornos hiper-
amonémicos129,294-296, es la causa principal del edema cerebral que se observa, con frecuencia,
en estas condiciones118,297. La glutamina se sintetiza en el citosol a partir de NH3 y glutamato,
en una reacción catalizada por la enzima glutamina sintetasa (GS; Rx.1, Introducción), que
está localizada principalmente en los astrocitos. Diversos estudios señalan que la inhibición de
la GS con sulfoximetionina (MSO) previene ó atenúa el edema cerebral asociado con hipera-
monemia143,144,146. En estas observaciones se basa la “hipótesis glutaminérgica” del edema
cerebral secundario a hiperamonemia, que se expuso en la Introducción (sección 1.6.1).
Pruebas preliminares realizadas en nues-
tro laboratorio usando la técnica de Western
Blot indican que esta enzima se expresa en
células N1E-115 indiferenciadas, es decir,
que no han desarrollado propiedades y estruc-
turas neuronales específicas; Fig. 32). En
células N1E-115 diferenciadas (ver Fig. 8,
Materiales y Métodos) son aparentes, sin em-
bargo, una disminución en los niveles de GS
y un ligero desplazamiento en el peso mole- Figura 32. Detección de la enzima glutamina
sintetasa en células NG-108 y N1E-115 por
cular de la enzima (Fig. 32). La GS se expre- “Western Blot.” La expresión de GS se detectó en
células indiferenciadas de ambas líneas celulares
sa además en células de neuroblastoma-glio-
cultivadas en presencia de L-glutamina (+). En
ma NG-108, indiferenciadas y diferenciadas, células diferenciadas, y en presencia de este ami-
noácido, la expresión de GS se detectó en células
que expresan características tanto neuronales NG-108, mientras que en células N1E-115 se obser-
vó una banda más tenue y con un peso molecular
como gliales. En ambos tipos celulares la ligeramente mayor al de un monómero de la enzi-
ma. En ausencia de L-glutamina (-) la expresión de
expresión de la GS se vio abolida cuando las GS se abolió, tanto en células diferenciadas (NG-
108) como indiferenciadas (N1E-115 y NG-108). La
células se cultivaron en medio sin glutamina
expresión de GS en las N1E-115 diferenciadas aún
(Fig. 32). Aún cuando hacen falta experimen- no ha sido evaluada en esta última condición. El
registro es representativo de tres experimentos.
tos adicionales para determinar los posibles
cambios cuantitativos en la expresión de la GS conforme avanza la diferenciación celular, así
como los cambios que en apariencia ocurren en su peso molecular, se evaluó si la síntesis y
acumulación de glutamina, inducida por el NH3/NH4+ en células N1E-115 diferenciadas,

75
podría explicar la diferencia entre el aumento observado y el aumento teórico del volumen
celular. Si este fuera el caso, el bloqueo de la síntesis de glutamina, como consecuencia de la
inhibición de la GS, debería resultar en respuestas al NH4Cl de menor amplitud que las obser-
vadas en los experimentos control. Para evaluar esta hipótesis, se sometió a las células a un
pulso control con NH4Cl (20 mM), aplicándose luego (durante 20-60 min) una solución ISO
conteniendo 1, 3 ó 5 mM de MSO. A continuación se aplicó un segundo pulso de NH4Cl (20
mM) conteniendo MSO a concentraciones iguales a las de la solución isosmótica. En 7 de los
15 experimentos, realizados en células individuales, no fue posible calibrar el pHi debido a
que las células murieron pocos minutos después de finalizado el pulso de NH4Cl-MSO. Esto
se observó con mayor frecuencia en células tratadas con 5 mM de MSO, lo cual sugiere que
este inhibidor ejerce efectos citotóxicos a estas concentraciones. En las células en las que pudo
estimarse el pHi, el MSO no afectó de manera aparente a esta variable. En la Fig. 33 se
muestran los efectos que tuvieron dosis distintas de MSO sobre el aumento máximo del VCA
producido por 20 mM de NH4Cl. El aumento del VCA se expresa como porcentaje de los
valores control (considerados como del 100%). Los efectos del MSO, a distintas concentra-
ciones, fueron muy variables. El aumento inicial del VCA fue significativamente menor al
control sólo en células tratadas con 1 mM de MSO. Sin embargo, en estas últimas el porcen-
taje de aumento del VCA atribuible a la acumulación intracelular de NH4+ más un anión
(como se explicó en la sección 4.1.1) fue menor al 100% (77,7%, versus 54,9% para el pulso
control (n=3). Esto sugiere que, aún cuando la síntesis de glutamina estuviese inhibida, duran-
te la exposición a NH3/NH4+ otros osmolitos,
160 (4)
aparte del NH4+ y un anión acompañante, se
140 Control = 100%
(% de respuesta control)

(6) acumulan en las células y contribuyen al

120 (5)
aumento del VCA.
100
VCA max

80 * Figura 33. Efectos del MSO sobre el aumento

inicial del VCA en células expuestas a 20 mM de
60 NH4Cl. Se muestra el porcentaje de aumento del VCA
40 con respecto al control (100%) en células tratadas con
20 mM de NH4Cl en presencia de 1, 3 y 5 mM de MSO.
20 El tiempo de incubación en MSO, antes del pulso de
NH4Cl, no se correlacionó con los efectos posteriores
0 de esta sustancia sobre el VCA. Barras: EEM. Líneas
1mM 3mM 5mM de puntos: EEM del control. *p<0,05. Entre paréntesis
MSO se indica el número de observaciones.

76
 Los cambios en la concentración intracelular de glutamina se estudiaron, además, por
cromatografía líquida (HPLC) en células N1E-115 diferenciadas y expuestas a un pulso de
NH4Cl. También en estos experimentos la variabilidad observada fue muy grande y no pudie-
ron extraerse resultados concluyentes. Así, son necesarios más experimentos para comprobar,
de modo fehaciente, que la síntesis de glutamina contribuye al aumento del VCA que ocurre al
exponer células N1E-115 al par NH3/NH4+.

4.4.2 Influjo neto de iones. La acumulación intracelular de NH4+ que ocurre durante la exposi-
ción de las células al par NH3/NH4+ induce cambios osmóticos y eléctricos que pueden alterar
el flujo de iones a través de la membrana plasmática. Este flujo puede verse alterado, además,
por los cambios que ocurren en forma paralela en el pHi. En estas circunstancias, el influjo de
iones tales como el Na+ o el Cl- podría contribuir al aumento inicial del VCA, lo cual explica-
ría al menos una parte de la diferencia hallada entre los valores observados y predichos de
dicho aumento. Para evaluar esta hipótesis, las células fueron expuestas a un pulso inicial con
una solución isosmótica conteniendo NH4Cl (20 mM) con un complemento iónico normal
(control), y a un pulso posterior (pulso de prueba) con una solución conteniendo idéntica con-
centración de NH3/NH4+ en la cual el Cl- ó el Na+ fueron reemplazados, respectivamente, por
cantidades equimolares de gluconato y de n-metil-d-glucamonio (NMDG+), iones supuesta-
mente impermeantes a través de la membrana plasmática.

Efectos de la remoción de Cl- y Na+ externos sobre el volumen 6

Fig. 34 5 m in
basal. En la generalidad de los casos, la perfusión inicial con una 3

solución ISO nominalmente libre de Cl- ó Na+ indujo un descenso 0

-3
moderado y transitorio de la señal fluorescente, que puede inter-
∆VCA (%)

-6 Cero Cl-
pretarse como un aumento del VCA (Fig. 34). En ausencia de Cl- 6
este aumento fue rápido y estuvo seguido de una disminución del 3

volumen, mientras que en ausencia de Na+ el aumento fue más 0

-3
lento, observándose a continuación una recuperación del volumen +
-6
Cero Na
basal. ISO

77
4.4.2.1 Substitución del Cl- externo por gluconato. Los cálculos del aumento teórico del volu-
men ante la exposición de las células al NH3/NH4+ contemplan, concomitantemente al aumen-
to en la [NH4+]i, un aumento paralelo y equivalente en la concentración intracelular de un
anión, de acuerdo con el principio de electroneutralidad macroscópica. El anión en cuestión
puede provenir del medio externo (exógeno), o del interno (endógeno). El Cl- es el anión inor-
gánico extracelular más abundante, tanto en los líquidos biológicos como en nuestras solucio-
nes experimentales. Por lo tanto, un influjo de Cl- ante la exposición al NH3/NH4+ podría con-
tribuir al aumento en la osmolaridad intracelular y consecuentemente al aumento del volumen
celular. Para evaluar esta hipótesis las células se expusieron a soluciones nominalmente libres
de Cl- conteniendo 5 ó 20 mM de gluconato de NH4+. Se analizaron 8 células para sendas
concentraciones. Antes de aplicar estos pulsos, las células se perfundieron con solución ISO -
Cero Cl- durante 5 min (para el caso de los pulsos con 5
Control = 100%
120
(8)
(8) mM de gluconato de NH4+), o durante ~15 min (para los
110
(% de respuesta control)

100 pulsos con 20 mM de gluconato de NH4+). En la Fig. 35

90
80 se grafican los valores del aumento inicial del VCA
VCA max

70
60 registrados ante estos tratamientos, como porcentajes de
50
40 la respuesta control (100 ± E.E.M. %). Para los pulsos de
30
20 5 mM de gluconato de NH4+ el aumento del VCA fue
10
0 similar al control. La respuesta para los pulsos de 20
1 5 mM 20 mM
2
+
gluconato de NH4 mM de gluconato de NH4+ mostró una disminución me-

Figura 35. Aumento máximo del VCA en células

dia del ~17 %. Sin embargo, la variabilidad
+
expuestas a 5 o 20 mM de gluconato de NH4 . Para de la respuesta control fue tal, que tampoco
cada concentración, el aumento promedio del VCA se
representa como porcentaje del aumento medido para en estos casos la diferencia entre las medias
cada control (100%). Barras: EEM. Con líneas de pun-
tos se indica el EEM (%) para cada control. Entre fue estadísticamente significativa.
paréntesis se indica el número de observaciones.

En la Fig. 36 se muestra el registro del VCA en una célula expuesta a 20 mM de gluconato

de NH4+. En este último grupo de experimentos, la proporción de aumento del volumen que
pudo explicarse en función de la acumulación intracelular de NH4+ más un anión acompañante
fue de ~80% para el pulso control y de ~93% para el pulso aplicado en ausencia de Cl- exter-
no. Quiere decir que aún en ausencia de influjo de Cl- debe existir una acumulación intracelu-

78
lar de uno ó más aniones que representa ~46% del aumento del VCA (es decir, la mitad de
93%). La otra mitad puede explicarse por la acumulación de NH4+. En otra serie de experi-
mentos se observó que el aumento
1.2
inicial del VCA no se reduce de
10 min
1.1
manera evidente al eliminar el Cl-

Vt/V0
~30 s antes de la aplicación del pul- 1.0

so conteniendo 20 mM de glucona- 0.9

+
to de NH4 (Fig. 37). Por lo tanto, Cero Cl
-
ISO * **
parece improbable que el influjo de *NH4Cl 20 mM **gluconato NH4+ 20 mM
Cl- sea un determinante importante Figura 36. Cambios en el VCA en una célula expuesta a
-
del aumento del VCA producido NH4Cl en ausencia nominal de Cl externo. Registro de una
célula expuesta a un pulso control con NH4Cl (20 mM) y a un
por el NH3/NH4+. En contraste, pulso con gluconato- de NH4 (20 mM), precedido por la aplica-
+

ción de ISO-Cero Cl . La célula se cargó con BCECF.

estos resultados sugieren que la
actividad del Cl- intracelular, tras la remoción del Cl-, podría influir en la magnitud del
aumento de volumen mediado por NH3/NH4+. Aunque es necesario aumentar la “n” de los
experimentos de remoción del Cl- externo, un mayor conocimiento del papel que juega el Cl-
en la respuesta de las células al NH3/NH4+ requerirá de experimentos adicionales, en los que se
midan, por ejemplo, el potencial de membrana y los cambios en la [Cl-]i.

600 +
gluconato NH4 20 mM
Fluorescencia (u.a.)

hiper (10%)
hipo (10%) NH4Cl 20 mM -
ISO-Cero Cl ISO

550

ISO ISO ISO

500
0 50 100 150
tiempo (min)
Figura 37. Registro de la fluorescencia (en el punto isosbéstico) en una célula cargada con BCECF y
expuesta a un pulso control con NH4Cl y a uno de prueba con gluconato de NH4+. El Cl- externo se eliminó
de la solución ISO control ~30 s antes de la aplicación del pulso de prueba (gluconato de NH4+ sin Cl-). Ante
este último pulso, la disminución en la fluorescencia (que denota un aumento en el VCA) fue similar a la
disminución observada durante el pulso control, lo cual indica que el VCA varió de manera semejante en
ambos pulsos. Los pulsos de calibración (±10% anisosmóticos) se muestran a modo de referencia.

79
4.4.2.2 Sustitución de Na+ externo por n-metil-d-glucamonio. El influjo de Na+ a través de
canales voltaje-dependientes, o de canales catiónicos no selectivos activados por la tensión de
la membrana (“stretch-activated channels”; SACs), como consecuencia de una despolariza-
ción o del aumento del VCA, respectivamente, podría ser uno de los mecanismos que contri-
buirían al aumento inicial del VCA ante la exposición de las células al NH3/NH4+. Para eva-
luar esta hipótesis se realizaron experimentos sustituyendo al Na+ de las soluciones experi-
mentales por el catión impermeante NMDG+. En 5 células cargadas con BCECF el aumento
promedio de VCA ante la aplicación de 20 mM de NH4Cl en ausencia de Na+ externo fue 14%
menor que el control, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. Sin embargo,
dado que al aplicar pulsos consecutivos de NH4Cl el aumento del VCA es generalmente mayor
durante el segundo pulso, la disminución del pico de volumen observada en ausencia de Na+
podría significar que el Na+ contribuye, si bien modestamente, al aumento del VCA. La
proporción del aumento explicado en función de la acumulación intracelular de NH4+ y un
anión acompañante fue de ~65% para el pulso control y de ~94% para el pulso experimental,
en ausencia de Na+ externo. Al igual que en los experimentos en los que se reemplazó el Cl-,
es necesario aumentar el número de la muestra y medir otras variables afectadas por la
remoción de Na+ externo (Em; [Na+]i) para establecer la contribución definitiva de este ión al
aumento del VCA producido por el NH3/NH4+.

Efectos de la sustitución de Cl- y Na+ externos sobre el pHi. La Fig. 38 muestra los cambios de
pHi registrados durante la exposición de las células a soluciones isosmóticas con 20 mM de
NH4Cl (control) y a un pulso de prueba conteniendo 20 mM de NH3/NH4+ en los que se reem-
plazó el Cl- (trazo superior), ó el Na+ (trazo inferior) por gluconato y NMDG+ respectivamen-
te.

a) Remoción del Cl- externo. La eliminación del Cl- en la solución ISO, antes de aplicar el
pulso de gluconato de NH4+ produjo una alcalinización gradual del citosol (Fig. 36A). La
amplitud de este incremento de pHi, medida tras ~15 min. de perfusión con ISO Cero Cl- e
inmediatamente antes de la aplicación del pulso con gluconato de NH4+, fue de 0,15 ± 0,04
u.pH (n = 8). Al aplicar esta última solución el ∆pHi (fase 1p) promedio fue menor que el

80
control, pero la diferencia no fue 7.4

significativa (p = 0,051). Tanto la 7.2

7.0 10 min
tasa de acidificación (fase 2p), en pHi
6.8
presencia continua de gluconato de
6.6
NH4+, como la magnitud de la caída 6.4 A
-
Cero Cl
del pHi tras su remoción (fase 3p), ISO * **
*NH4Cl 20 mM **gluconato NH4+ 20 mM
fueron similares al control. La tasa
7.4
inicial de recuperación del pHi (fase 7.2
7.0 10 min
4p) tampoco se vió afectada en tér- 6.8
pHi
6.6
minos estadísticos.
6.4
6.2
6.0
Cero Na
+ B
+
b) Remoción del Na externo. La ISO * *
*NH4Cl 20 mM
aplicación de la solución ISO – Cero
Figura 38. Efectos de la sustitución de los iones extracelula-
Na+ indujo una acidificación gradual res Cl- y Na+ sobre los cambios de pHi producidos por
NH3/NH4+. Las células se cargaron con BCECF y se expusieron
del citosol (Fig. 38B), que puede a un pulso inicial (control) con NH4Cl (20 mM) tras el cual se
aplicó (A) un pulso con 20 mM de gluconato de NH + (Cero Cl-)
atribuirse claramente a la inhibición ó (B) un pulso con NH Cl (20 mM) en el que el Na+4 se sustituyó
4
+ +
del intercambiador Na /H , descrito por NMDG+ (Cero Na+). Antes de cada pulso de prueba las célu-
las se perfundieron con solución ISO deprivada de Cl- ó Na+.
en estas células266. La cinética de
esta acidificación mostró, para diferentes células, una apreciable variabilidad. Esta observa-
ción, ilustrada en la Fig. 39, sugiere que la actividad de este sistema de transporte en células
diferentes es heterogénea. A los ~15 min de eliminarse el Na+ externo, la acidificación media

7.50
alcanzó una amplitud de 0,16 ±
7.25 0,07 u.pH (n = 5). En este nue-
10 min
7.00
pHi
vo estado basal, tal como lo
6.75

6.50
predice la teoría, el ∆pHi indu-
6.25 Na
+
0-Na
+ cido por la aplicación de 20
6.00
mM de NH4Cl fue mayor al

Figura 39. Efectos de la remoción del Na+ externo sobre el pHi. control, aunque esta diferencia
Se muestran, superpuestos, los registros del pHi en 3 células
no fue estadísticamente signifi-
expuestas a dos pulsos de NH4Cl (20 mM) aplicados en presencia
(líneas delgadas) y en ausencia (líneas gruesas) de Na+ externo. cativa.

81
La tasa de acidificación del plateau (fase 2p) durante este pulso fue, en promedio, mayor que
la del control, pero tampoco en este caso la diferencia resultó estadísticamente significativa.
Al eliminar la solución de NH4Cl libre de Na+, la amplitud de la acidificación intracelular fue
más pronunciada que la del pulso control. En esta instancia la recuperación del pHi (y del
VCA; fenómeno no ilustrado) se vio notablemente inhibida, tornándose evidente, como se
aprecia en las Figs. 38B y 39, tras la reincorporación del Na+ a la solución ISO control.

4.5 Factores determinantes de la disminución reguladora del volumen en células expues-

tas a soluciones isosmóticas conteniendo NH3/NH4+. Como se describió más arriba (sección
4.1; Fig.17, trazo de VCA), durante la exposición de las células a soluciones con NH3/NH4+, la
fase de expansión inicial del volumen (1v) es seguida de una fase de disminución reguladora
(2v), que por ocurrir en condiciones isosmóticas denominamos DRVi. A continuación se eva-
lúan algunos de los posibles factores determinantes de este proceso.

1.2
5 min 4.5.1 Cambios en la tensión mecánica de la
1.1
membrana celular. Si la capacidad de regu-
Vt/V0

1.0 lar el volumen celular fuese consecuencia de

0.9 cambios en la tensión aplicada a la membra-

0.8 na por la expansión o la reducción del volu-

hipo 11.1% hiper 11.4%
men, se esperaría que expansiones (o reduc-
7.8
ciones) del volumen, cuantitativamente simi-

7.2
lares, pero inducidas por medios diferentes,
pHi
fuesen seguidas de respuestas reguladoras
6.6
semejantes. En la Fig. 40 se muestran regis-
tros del VCA (trazos superiores) y del pHi
6.0
NH4Cl 20mM
(trazos inferiores) en una célula expuesta
ISO

Figura 40. Cambios en el VCA y en el pHi en una célula expuesta a soluciones anisosmóticas (± ~11%) y
a un pulso isosmótico con 20 mM de NH4Cl. Trazo superior: registro de los cambios en el VCA. Trazo
inferior: registro de los cambios en el pHi. Los cambios inducidos por los distintos tratamientos se muestran
superpuestos para facilitar su comparación. Nótese la ausencia de respuesta reguladora del volumen para las
soluciones anisosmóticas.

82
a soluciones anisosmóticas (trazos grises) y a una solución isosmótica conteniendo 20 mM de
NH4Cl (trazos negros). Puede observarse que la amplitud inicial de los cambios del VCA ante
la exposición a medios hipo- e hiperosmóticos fue similar a la producida por la aplicación y la
remoción de la solución con NH4Cl. Sin embargo, la regulación del volumen sólo ocurrió ante
el pulso de NH4Cl. En la misma figura puede observarse que el tratamiento con NH3/NH4+
indujo los cambios característicos en el pHi, mientras que las soluciones ligeramente anisos-
móticas no produjeron cambios en éste. Estos resultados demuestran que los cambios en la
tensión de la membrana plasmática per se no son suficientes para disparar la respuesta regula-
dora del volumen en células N1E-115. Sin embargo no invalidan la posibilidad de que los
cambios en la tensión de la membrana, en conjunción con otros producidos por el NH3/NH4+
(ej: cambios en el pHi), pudieran explicar la respuesta reguladora.

4.5.1.1 Efectos de la inhibición de canales no selectivos a cationes, activados por aumentos en

la tensión de membrana plasmática, sobre la DRVi. La activación de canales activados por
estiramiento mecánico de la membrana plasmática (SACs) se describió en células N1E-115
tras aumentos relativamente grandes del volumen, producidos por estímulos hiposmóticos de
~40%250 (ver recuadro III, sección 1.7.4.1, Introducción). De acuerdo con ese estudio, la
entrada de cationes vía
1.14
SACs causa una despola- 5 min
1.10
Vt/V0

1.06
rización que conduce a la
1.02
activación de conductan- 0.98
- +
cias al Cl y al K , a tra- 0.94
ISO *** ***
vés de las cuales ocurre la ***NH4Cl 5 mM GdCl3 100 µM

DRV. Para evaluar el pa-
pel de los SACs en la
DRVi que ocurre al expo-
ner células N1E-115 al
Figura 41. Efectos de la inhibición farmacológica de SACs sobre los
cambios de VCA producidos por NH3/NH4+. Tras la aplicación de un
pulso control con NH4Cl (5 mM), la célula (cargada con BCECF) se
perfundió con solución ISO conteniendo GdCl3 (100 µM). Luego se aplicó
un pulso de prueba con NH4Cl (5 mM) conteniendo idéntica concentración
de GdCl3. Nótese el bloqueo de la DRVi durante el pulso de prueba.

NH3/NH4+ se aplicaron pulsos con NH4Cl (5 o 20 mM) conteniendo 100 µM de gadolinio

(GdCl3). El ión Gd3+ inhibe, si bien con baja selectividad, la apertura de SACs en diversos
tipos celulares298,299. La Fig. 41 muestra los cambios en el VCA en una célula expuesta a una
solución con 5 mM de NH4Cl y 100 µM de GdCl3.

83
La incorporación del GdCl3 en la solución ISO control, ~5 min antes del pulso de prueba,
produjo un ligero aumento en el volumen basal (4,3 ± 0,8%; n = 15). Al aplicar el pulso de
NH4Cl en presencia de GdCl3, se observó el bloqueo de la DRVi. En células expuestas tanto a
5 como a 20 mM de NH4Cl, el aumento inicial del VCA en presencia de Gd3+ fue similar al
GdCl3 100 µM
control (datos no mostrados). En contraste, ante una y otra
(9)
100
concentración de NH4Cl, el Gd3+ inhibió de manera parcial ó
% de inhibición de la DRVi

90
** ( 6)
80 ** completa la DRVi. En la Fig. 42 se representa la magnitud
70
60 de esta inhibición, en relación con el porcentaje de DRVi
50 medido en condiciones control (100%), para las dos concen-
40
30 traciones de NH4Cl estudiadas.
20
10 Figura 42. Inhibición de la DRVi en células expuestas a NH4Cl (5 ó
0 20 mM) en presencia de Gd3+. Se representa el porcentaje de inhibi-
1 5 mM 20 2mM ción de la DRVi con respecto a los valores control (DRVi = 100%).
NH4Cl Barras: EEM. **p<0,01. Entre paréntesis se indica el número de
observaciones.

4.5.2 Magnitud de la expansión inicial: relación entre la amplitud del aumento inicial del VCA
y la DRVi. Cuando las células N1E-115 son expuestas a soluciones hiposmóticas, la respuesta
reguladora (DRV) se observa, por lo general, tras aumentos del volumen superiores a ~25%.
Un trabajo previo hecho en nuestro laboratorio muestra que en soluciones hiposmóticas que
producen expansiones relativamente grandes, por arriba del 25%, la tasa inicial de la DRV está
relacionada con la magnitud del aumento inicial de volumen, de tal manera que a mayores
expansiones mayor es la tasa de regulación197. Cabe preguntarse, por lo tanto, si la regulación
del VCA tras aumentos isosmóticos como los producidos por el par NH3/NH4+, se relaciona de
igual manera con la magnitud de la expansión inicial del volumen. Si esto es así, es posible
que durante aumentos de volumen, tanto en medios hiposmóticos como isosmóticos, la detec-
ción y corrección subsecuente de tales cambios ocurra a través de mecanismos comunes. Esto
es importante ya que la naturaleza de los cambios de volumen es diferente en uno y otro caso:
en el medio hiposmótico el aumento de volumen está generado por un influjo inicial de agua,
mientras que en las soluciones isosmóticas primero hay un aumento de la osmolaridad intra-
celular, seguido del influjo de agua. En la Fig. 43 se grafican: A) el porcentaje de volumen
regulado (DRVi, parámetro f, Fig. 14) y B) la tasa inicial de la DRVi (dVCA/dt;

84
parámetro e, Fig. 14), en función del aumento 50
máximo del VCA (parámetro a, Fig. 14) en 58
R = -0.46
n = 58
A
40

células§. Puede verse que tanto la magnitud

DRVi (%)
30

porcentual del VCA regulado (A) como la velo- 20

cidad inicial de la DRVi (B) se relacionaron 10

inversamente con el aumento máximo inicial del 0

5 10 15 20 25 30 35 40
VCA. Es decir, la DRVi ocurrió en general más
VCA max (%)
rápidamente, y alcanzó, tras 4 min de iniciada, 5 10 15 20 25 30 35 40

dVCA/dt - DRVi (%/min)

0
una magnitud mayor en células que sufrieron un
aumento inicial del volumen menor. En ambos -5

casos la correlación fue estadísticamente signifi- -10

cativa (p<0,001 en A; p<0,05 en B). Estos resul- -15

tados sugieren que las células responden al
aumento de volumen de manera diferente, según
éste resulte de la acumulación primaria de NH4+
(y otros osmolitos), o de un influjo de agua
secundario a una disminución en la osmolalidad
extracelular. A continuación se exploran otros
factores que podrían afectar la regulación del
volumen en estas células.
R = 0.28
n = 58
B
-20
Figura 43. Relación entre la DRVi y la
magnitud del aumento inicial del VCA. Datos
provenientes de células cargadas con BCECF y
expuestas a 20 mM de NH4Cl. El porcentaje de
VCA regulado a los 4 min de iniciada la DRVi
(A) y la tasa inicial de la DRVi (B) se grafican en
función del aumento inicial del VCA.

4.5.3 Alteraciones osmóticas resultantes del influjo de NH4+. Al considerar la observación

precedente resulta lógico presumir que la regulación del VCA observada en nuestros experi-
mentos con NH4Cl guarda relación con los efectos, directos o indirectos, del par NH3/NH4+
sobre los mecanismos o procesos que median la detección, la transducción y/o la corrección de
los cambios de volumen en las células. Específicamente, podemos postular que la magnitud y
la cinética de la respuesta osmoreguladora pueden estar relacionadas con la magnitud del
influjo de NH4+ y/o de su acumulación intracelular a causa de la protonación del NH3. Este
fenómeno favorece, como se mencionó, un aumento en la osmolaridad intracelular y afecta

§
En las gráficas que muestran la correlación entre los diversos parámetros del VCA y el pHi se eliminaron aque-
llos datos que se apartaron en más de 2 desviaciones estandar de la media poblacional. Por eso, el número de
observaciones en estas gráficas es < 61, el número total de células caracterizadas.

85
además diversos parámetros fisiológicos, entre ellos el pHi, la fuerza iónica, el potencial eléc-
50 trico y, de manera previsible, el metabolismo
40
A celular. En la Fig. 44 se grafican la magnitud de la
DRVi (%)

30 DRVi (A) y la tasa inicial de la DRVi, dVCA/dt (B)

20
en función de la tasa de acumulación intracelular
10 R = -0.13
n = 58 concomitante de NH4+, dNH4+i/dt, estimada a par-
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 tir de las pendientes del pHi (fase 2p) medidas en
+
d[NH4 ]i/dt (mM/min)
cada célula. La correlación entre las variables de
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
0 DRVi examinadas y la tasa de acumulación intra-
dVCA/dt - DRVi (%/min)

-5 celular de NH4+ no fue significativa.

-10 Por otro lado, es posible que la regulación
-15 del VCA esté determinada por la magnitud de la
R = -0.12
-20
B n = 57 acumulación inicial de NH4+ (u otros osmolitos)
Figura 44. Relación entre la DRVi y la tasa durante el aumento inicial del VCA y no por la
inicial de acumulación intracelular de NH4+.
Células cargadas con BCECF se expusieron a tasa de acumulación subsecuente de los mismos.
un pulso de 20 mM de NH4Cl. El porcentaje del
En la Fig. 45 se grafica el porcentaje del VCA
VCA regulado a los 4 min de iniciada la DRVi
(A) y la tasa inicial de la DRVi (B) se grafican regulado (DRVi), a los 4 min de exposición a 20
en función de la tasa inicial de acumulación
intracelular de NH4+ (d[NH4+]i/dt). mM de NH4Cl, en función de la [NH4+]i calculada
al momento del pico máximo de aumento del pHi. Puede verse que existe una correlación
negativa, débil pero significativa (p<0,01), entre la magnitud de la DRVi y la [NH4+]i inicial.
Es decir, la amplitud de la DRVi tiende a ser
60
mayor cuanto menor es la [NH4+]i calculada al 50
R = -0.36
n = 58
pico de aumento del VCA. Esto podría significar,
DRVi (%)

40

en principio, que la acumulación intracelular de 30

20
NH4+ inhibe la regulación del volumen. Es posi-
10
ble, sin embargo, que estas variables no estén 0
5 10 15 20 25 30 35
relacionadas causalmente, sino que la correlación
[NH4+]i (mM)
descrita refleje efectos del pHi (a partir del cual
Figura 45. Magnitud de la DRVi en función de
se estima la [NH4+]i) sobre los mecanismos de la concentración intracelular de NH4+ medida al
pico de la alcalinización (pHit=1). La magnitud de
regulación del volumen celular. A continuación la DRVi tiende a ser menor cuando la acumula-
ción inicial de NH4+i es más alta.
se evalúa esta posibilidad.

86
4.5.4 Cambios en el pH intracelular. Las variacio- 60
R = 0.54 A
50
nes en el pH intra y/o extracelular modulan la n = 58

DRVi (%)
40
actividad de numerosos canales iónicos y sistemas
30
de transporte de solutos a través de la membrana 20

(Ver sección 1.4 de la Introducción). Por lo tanto, 10

0
es válido suponer que la DRVi observada durante 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4

la exposición a NH4Cl pueda estar influenciada pHi t=0

60
por los cambios paralelos que ocurren en el pHi. R = 0.36 B
50 n = 58
En la Fig. 46 se grafica la magnitud de la DRVi 40

DRVi (%)
en función del pHi basal, previo a la exposición a 30

20 mM de NH4Cl (A), y del pHi registrado tras su 20

10
aplicación, durante el pico alcalino (B). En ambos
0
casos puede verse que la magnitud de la DRVi es 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
pHi t=1
mayor a pHs alcalinos, siendo la correlación sig-
Figura 46. Magnitud de la DRVi en función
nificativa en ambas instancias [p<0,0001 (A); del pHi. Se grafica el porcentaje de DRVi medi-
do a los 4 min de iniciada la regulación, en fun-
p<0,01 (B)]. ción de: A) el pHi basal (previo al pulso de 20
mM de NH4Cl; pHi t=0) y B) el pHi registrado al
En la Fig. 47 se grafica la tasa inicial de la
pico alcalino (tras la aplicación de NH4Cl; pHi
DRVi, dVCA/dt en función de la tasa de acidifica- t=1), en células cargadas con BCECF.

ción del plateau, -dpHi/dt (fase 2p), registrada concomitantemente. La correlación entre estas
variables también fue significativa (p < 0,005).
dpHi/dt (u.pHi/min)
-0.01 -0.02 -0.03 -0.04 -0.05
En términos generales, estos resultados
dVCA/dt - DRVi (%/min)

0
muestran que los parámetros que definen la
-4 DRVi se correlacionaron de manera más marca-
da con los valores absolutos (pHi basal y pHi al
-8
pico) y cinéticos (dpHi/dt) del pHi, que lo que lo
R = 0.38
-12
n = 55 hicieron con la acumulación inicial y la tasa de
influjo de NH4+. En síntesis, estas observacio-
Figura 47. Tasa inicial de la DRVi nes indican que cuanto más alcalino es el pHi
(dVCA/dt) en función de la tasa de acidifi-
cación del plateau (dpHi/dt). La correlación inicial, menor es el aumento del VCA pro-
entre estas variables, calculada a través de una
regresión lineal simple, fue débil pero signifi- ducido por el NH3/NH4+, menor la acumula-
cativa (p<0,005). ción inicial de NH4+i y mayores la tasa y la

87
magnitud de la DRVi. Si bien estas observaciones permiten suponer un papel modulador del
pHi sobre la DRVi observada en células expuestas a NH3/NH4+ en medios isosmóticos, son
necesarias más observaciones experimentales para concluir que estos efectos están relacio-
nados causalmente.

4.5.5 Posible eflujo electrodifusional de Cl- y K+ durante la DRVi. En un vasto número de

tipos celulares, la inducción experimental de un aumento de volumen en medio hiposmótico
(≥40%) resulta en una DRV que se desarrolla principalmente a través del eflujo pasivo, neto,
de Cl- y K+. Para estudiar la posible participación de flujos iónicos a través de vías electro-
difusionales (canales de Cl- y de K+) en la DRVi que se observa en células N1E-115 expuestas
a NH3/NH4+, se realizaron experimentos incorporando inhibidores farmácológicos de estas
vías de transporte a soluciones conteniendo 5 ó 20 mM de NH4Cl**. La participación de cana-
les aniónicos en la DRVi se evaluó mediante la aplicación de NPPB (10 µM), un potente
inhibidor de conductancias al Cl-300. La participación de canales de K+ en la DRVi se estudió
utilizando el ión Ba2+ (como BaCl2, 1 mM), un inhibidor de amplio espectro de esta clase de
canales. En la Fig. 48 se muestran registros representativos de los cambios del VCA obser-
vados en células expuestas a 5 mM de NH4Cl ante cada uno de estos tratamientos. En células
expuestas ya sea a 5 ó a 20 mM de NH4Cl, la magnitud del aumento inicial del VCA en
presencia de NPPB fue similar al control. En contraste, como se muestra en la Fig. 49, ante
ambas concentraciones de NH4Cl la DRVi subsiguiente se vio fuertemente inhibida. Más aún,
en algunos casos, como el ilustrado en la Fig. 50, la DRVi se invirtió. La exposición a pulsos
con 5 mM de NH4Cl en presencia de Ba2+ indujo una reducción de ~26% en el aumento inicial
del volumen, con respecto al control (p<0,05). Ante este tratamiento, la DRVi mostró
asimismo una inhibición significativa de ~46% (p<0,05). Estos resultados se muestran en la
Fig. 51.

**
Los resultados que se muestran provienen de una serie acotada de experimentos y representan observaciones
iniciales que deben ser ampliadas y profundizadas aumentando el número de observaciones y evaluando otros
inhibidores. El número de células analizadas, es decir aquellas en que la respuesta de volumen y pHi se cuanti-
ficó, fue, en todos los tratamientos experimentales, bastante inferior al número de células registradas. Sin
embargo, en aquellas células que no fueron analizadas, ya sea porque no pudo calibrarse el pHi al terminar el
experimento, o porque la deriva de la señal de fluorescencia que denota los cambios en el VCA fue tal que
impidió un análisis preciso de los datos, los efectos observados fueron, la mayoría de las veces, consistentes con
los resultados presentados.

88
 1.12

1.06 5 min
Vt/V0

1.00 NPPB 10 µM
(11)
110

% de inhibición de la DRVi
( 8)
0.94
100 ***
***
ISO *** *** 90
***NH4Cl 5 mM NPPB 10 µM
80
1.12 70
60
1.08
5 min 50
1.04
Vt/V0

40
1.00 30
0.96 20
10
0.92
0
ISO *** *** 2 5 mM 20 1mM
***NH4Cl 5 mM Ba
2+
1 mM
NH4Cl

Figura 48. Efectos de la inhibición independiente de Figura 49. Inhibición de la DRVi en

conductancias al Cl- y al K+ sobre los cambios de VCA células expuestas a NH4Cl (5 ó 20 mM)
producidos por el NH4Cl. Tras la aplicación de un pulso en presencia de NPPB. Se representa el
control con NH4Cl (5 mM), se aplicó un pulso de prueba porcentaje de inhibición de la DRVi con
con idéntica concentración de NH4Cl conteniendo 10 µM respecto a los valores control (DRVi =
de NPPB (trazo superior), un inhibidor de canales anióni- 100%). Barras:EEM. ***p<0,001. Entre
cos, ó 1 mM de BaCl2 (trazo inferior), un inhibidor gene- paréntesis se indica el número de obser-
ral de canales de K+. Ambas sustancias tuvieron efectos vaciones.
inhibitorios sobre la DRVi.
100
aumento VCA
90
DRVi
80
% de inhibición

70 (6)

1.18
NPPB 10 µM
Control
60
50
*
(6)
40
1.12
30 *
3 min
Vt/V0

20
1.06
10
0
1.00 Ba2+ 1 mM

0.94
NH4Cl 20 mM
iso
Figura 50. Cambios en el VCA en una célula
expuesta a NH4Cl (20 mM) en ausencia (Control)
y en presencia de NPPB (10 µM). Puede obser-
varse la inversión de la DRVi durante el pulso de
NH4Cl conteniendo NPPB.
Figura 51. Inhibición del aumento inicial
del VCA y de la DRVi en células expuestas
a 5 mM de NH4Cl en presencia de Ba2+.
Los valores expresan el porcentaje de inhibi-
ción con respecto al valor control (=100%)
medido para cada parámetro. * p < 0,05.
Entre paréntesis se indica el número de
observaciones.

89
4.5.5.1 Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl- y al K+ sobre el pHi. En la Fig. 52A
se ilustran los cambios de pHi registrados en una célula expuesta a 20 mM de NH4Cl en
ausencia (control) y en presencia de NPPB (10 µM). En la mayoría de las células registradas,
la incorporación del NPPB a la solución control (ISO) produjo una acidificación moderada del
citosol. En presencia del NPPB el ∆pHi inducido por el NH4Cl (5 ó 20 mM) no difirió del
control. Sin embargo, la tasa de
7.6
A acidificación del plateau fue signi-
7.4
10 min ficativamente mayor al control
pHi 7.2
(p<0,05) en células expuestas a 20
7.0
mM de NH4Cl pero no en células
6.8
expuestas a 5 mM de NH4Cl. Los
ISO * *
*NH4Cl 20 mM NPPB 10 µM efectos del NPPB sobre el pHi son
7.4 0.4 consistentes con la entrada de este
7.3
0.3
0.2 B ácido a las células y su posteror
∆pHi 0.1
5 min
7.2 0.0
-0.1 10 min disociación, resultante en un
pHi 7.1 -0.2
+
7.0 aumento en la [H ]i. Reflejando
6.9
este aumento aparente en la per-
6.8
ISO ** ** meabilidad de la membrana plas-
** NH4Cl 5 mM Ba
2+
1 mM
mática a H+, en células expuestas
Figura 52. Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl- a 20 mM de NH4Cl y NPPB la
(NPPB) y al K+ (Ba2+) sobre los cambios de pHi producidos por
NH4Cl. A) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos con tasa inicial de la fase de ascenso
NH4Cl (20 mM) en ausencia (control) y en presencia de NPPB (10
del pHi (1,75 ± 0,09 u.pH/min) fue
µM). B) Cambios en el pHi ante la aplicación de pulsos con NH4Cl
(5 mM) en ausencia (control) y en presencia de BaCl2 (1 mM). Los significativamente menor al con-
pulsos de prueba (en presencia de NPPB ó Ba2+) estuvieron prece-
didos por la aplicación (durante ~5 min) de soluciones ISO conte- trol (2,32 ± 0,13; p < 0,001; n=8).
niendo estos inhibidores. Inserto: Se muestran, superpuestos, los
cambios de pHi (expresados como ∆pHi) para el pulso control y el En la Fig. 52B se ilustran los
experimental (1 mM Ba2+). Puede verse que el ∆pHi fue mayor y la
tasa de acidificación del plateau fue menor al control durante el
cambios de pHi registrados en una
pulso con Ba2+. célula expuesta a NH4Cl (5 mM)
en ausencia (control) y en presencia de Ba2+ (1 mM). La incorporación de BaCl2 a la solución
ISO control no indujo cambios en el pHi basal, durante el intervalo de tiempo (~5 min) que
precedió al pulso de NH4Cl (5 mM). Al aplicar este último, el aumento inicial del pHi fue
significativamente mayor, y la tasa de acidificación del plateau significativamente menor, que

90
los valores control. Estos efectos son consistentes con una probable inhibición del influjo de
NH4+ a través de canales de K+. Las diferencias señaladas se ilustran en la sección siguiente
(Fig. 53).
0.28
Control ****
0.26 BaCl2 1 mM

0.24
4.6 Posibles vías de transporte del NH4+.

∆pHi
0.22
a) Canales de K+. Numerosos estudios en células
0.20
de mamíferos indican que el NH4+ puede atrave-
0.18
sar la membrana plasmática a través de canales 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80
pHi
+ 2+ (t=0)
de K . Los resultados obtenidos al emplear Ba -0.005

dpH/dt (u.pH/min)
son consistentes con esta hipótesis. Ante la
-0.010 ***
aplicación de NH4Cl (5 mM) en presencia de
Ba2+ (1 mM) se observó que: n=7
-0.015

Figura 53. Efectos del Ba2+ sobre la amplitud

i) El ∆pHi fue significativamente mayor al
del aumento inicial del pHi (∆pHi) y sobre la
control (p<0,0001; Fig. 53), lo cual se esperaría tasa de acidificación del plateau en células
expuestas a NH4Cl (5 mM). Los valores control
+
si el influjo de NH4 en esta instancia se viera (○) y experimentales [en presencia de Ba2+, (●)]
se expresan en función del pHi basal previo a
atenuado. cada pulso. Barras horizontales: EEM. del pHi
basal. Barras verticales: EEM. de las variables
ii) La acidificación del plateau se redujo dependientes correspondientes. ***p < 0,001;
**** p < 0,0001.
significativamente (Fig. 53), aún en células que
al ser expuestas a NH4Cl alcanzaron un pico alcalino similar o superior al registrado durante el
pulso control (ver Fig. 52B, Inserto). Esto es consistente con la inhibición del influjo de NH4+.
iii) La tasa inicial de alcalinización intracelular fue significativamente mayor al control,
(Fig. 54) lo cual es consistente con una reducción en el 1.2 ( 7)
+ +
influjo concomitante de H (NH4 ) en esta fase.
1.0 ***
dpHi/dt (u.pHi/min)

0.8 ( 7)

0.6

Figura 54. Efectos del Ba2+ sobre la tasa de ascenso del pHi en 0.4
células expuestas a NH4Cl (5 mM). La tasa inicial de aumento del
0.2
pHi (dpHi/dt) se calculó a partir de una regresión lineal ajustada a
los datos correspondientes a la fase de ascenso inicial del pHi (1p).
0.0
*** p<0,001. Entre paréntesis se indica el número de observaciones. Control Ba2+

91
 b) Posible influjo de NH4+ a través del cotransportador de Na+,K+,2Cl-. El transporte de NH4+
a través del triple cotransportador de Na+,K+, 2Cl- (NKCC) ocurre, de manera importante, en
ciertos segmentos de los túbulos renales. (Fig. 2C, Introducción). Para evaluar si el transporte

0.46 de NH4+ en células N1E-115 tiene lugar a través

**** Control
0.44 Bumetanida 10 µM del NKCC, se realizaron experimentos en los que
0.42 las células fueron expuestas a un pulso control
∆pHi
0.40 con NH4Cl (20 mM) y a un pulso de prueba con
0.38 idéntica concentración de NH4Cl al que se agre-
0.36 gó 10 µM de bumetanida, un inhibidor de este
6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95 pH
i cotransportador. En presencia de bumetanida,
(t=0)
dpH/dt (u.pH/min)

-0.014
tanto la tasa inicial de la alcalinización intracelu-
-0.018
*** lar, como el ∆pHi, fueron significativamente
-0.022 mayores que los valores control. La tasa de
n = 11
-0.026 acidificación del plateau, por el contrario, fue
significativamente menor que
Figura 55. Efectos de la bumetanida sobre la amplitud del aumento
inicial del pHi (∆pHi) y sobre la tasa inicial de acidificación del el control. Estos efectos, que
plateau en células expuestas a NH4Cl. Los valores control (○) y
experimentales [en presencia de bumetanida, (●)] se expresan en fun- se ilustran en las Figs. 55 y 56,
ción del pHi basal previo a cada pulso. Barras horizontales: EEM del sugieren que parte del influjo
pHi basal. Barras verticales: EEM de las variables dependientes.
de NH4+ que tiene lugar en
presencia de NH3/NH4+ ocurre a través del NKCC. A partir de estas evidencias preliminares,
son necesarios experimentos adicionales para determinar en qué medida contribuyen al trans-
porte de NH4+ los canales de K+ y el cotransportador NKCC.

3.0 Figura 56. Efectos de la bumetanida sobre la

(15) (15) (11) tasa de alcalinización intracelular en células
dpHi/dt (u.pHi/min)

2.5 (11) * expuestas a NH4Cl (5 mM). La tasa de aumento

del pHi (dpHi/dt) se calculó a partir de una regre-
2.0
sión lineal ajustada sobre los datos correspon-
1.5 dientes a la fase de ascenso inicial del pHi (1p),
ante la exposición al NH4Cl. A modo de compara-
1.0 ción, se ilustran los valores respectivos registrados
durante la aplicación de pulsos dobles (P1 y P2)
0.5 con 20 mM de NH4Cl. Barras: EEM. * p < 0,05.
0.0 Entre paréntesis se indica el número de observa-
P1 P2 Control Bum 10 µM ciones.

92
5. DISCUSION

En el presente trabajo se demuestra que la exposición de células neurales en cultivo al par

amoníaco-amonio (NH3/NH4+) induce, además de las alteraciones previstas en el pHi, cambios
definidos en el VCA. Estos cambios se midieron empleando una técnica fluorométrica, refina-
da y validada en nuestro laboratorio, basada en las propiedades bioquímicas y espectrales
características del BCECF, que permiten la medición simultánea del VCA y del pHi a partir
del registro de cambios en la fluorescencia de este indicador, en puntos definidos de su espec-
tro de excitación64,280,282,283; sección 3.4, Materiales y Métodos). La validez de las observacio-
nes aquí descritas depende de la confiabilidad de la técnica usada. Por ello, antes de discutir la
cinética y los mecanismos de los cambios en el VCA y el pHi, así como su importancia biofísi-
ca y fisiopatológica, se considera brevemente la confiabilidad del método.

5.1 El método mide cambios fidedignos en el pHi y en el volumen celular acuoso de célu-
las individuales. Varias pruebas experimentales indican que los cambios en el VCA observa-
dos al exponer a las células al NH3-NH4+ son reales, es decir, no son artefactos del método.
Estas pruebas son: 1) los cambios en el pH, tanto in vivo (intracelular) como in vitro, no alteran
la fluorescencia del BCECF en el punto isosbéstico (438 nm), a partir del cual se infieren los
cambios en el VCA. Es decir, no hay interferencia entre las señales indicadores del VCA y del
pHi; 2) los cambios en el VCA pueden reproducirse con otros indicadores fluorescentes que
tienen propiedades distintas a las del BCECF (ej.: la calceína); 3) la dirección de los cambios
en el VCA puede reproducirse midiendo el diámetro de las células con microscopia de contras-
te interferencial; 4) el aumento del VCA producido por NH4Cl puede contrarrestarse, de mane-
ra predecible cuantitativamente, aumentando la osmolaridad del medio externo; 5) la aplica-
ción de pulsos de calibración anisosmóticos produce cambios en el VCA que siguen la Ley de
van't Hoff.

5.2 Cambios de pH y volumen en células expuestas al par conjugado amoníaco / amonio.

Los cambios en que se observan en el pHi y en el VCA en células de neuroblastoma N1E-115

93
expuestas a pulsos de 7 a 20 minutos de duración con una solución isosmótica conteniendo
NH4Cl presentan cuatro fases características, que proceden de forma casi paralela y que com-
prenden (Fig. 17): 1) un aumento rápido del VCA (1v) y del pHi (1p); 2) una disminución gra-
dual en ambas variables [DRVi (2v) y acidificación del plateau (2p)]; 3) una disminución del
VCA (3v) y del pHi (3p) al terminar el pulso de NH4Cl; 4) un aumento regulador del volumen
(ARVi; 4v) y una recuperación gradual del pHi (4p). Las fases 4v y 4p presentan un curso más
variable que las otras y culminan, con frecuencia, en una recuperación incompleta del VCA y
del pHi.

Los mecanismos subyacentes a los cambios de pHi mediados por la base débil NH3 y su
ácido débil conjugado, NH4+, se conocen desde mucho tiempo atrás50: tras la exposición al par
NH3/NH4+ el gas NH3 difunde rápidamente al interior celular, donde se une a protones libres
(H+), reduciendo la concentración intracelular efectiva de éstos y alcalinizando, en consecuen-
cia, al citosol. Esta alcalinización procederá hasta que el NH3 se equilibre a través de la
membrana, es decir hasta que su concentración externa sea igual a la intracelular. Tras esta
alcalinización y en presencia continua de NH3/NH4+ en la solución externa, el curso subsi-
guiente del pHi dependerá de la permeabilidad de la membrana plasmática al NH4+, tal y como
lo demostraron Boron y DeWeer (1976)51, en un estudio clásico realizado en el axón gigante
del calamar: en células impermeables al NH4+ y en ausencia de mecanismos reguladores del
pHi, este último se mantendrá constante (dpHi/dt = 0). Por el contrario, si las células además de
ser permeables al NH3 lo son al NH4+, tendrá lugar una acidificación relativa del citosol
(acidificación del plateau ó fase 2p) como consecuencia de la entrada de NH4+ y su ulterior
disociación en NH3 y H+.

A partir de observaciones experimentales y principios teóricos, ya a comienzos del siglo

XX se propuso que las sales de amonio deben producir cambios en el volumen celular (ver Ref.
50). Estos cambios deben resultar de la acumulación intracelular de NH4+, como consecuencia
de la protonación del NH3 que ingresa inicialmente a las células: la acumulación de NH4+
implica una ganancia neta de osmolitos que determina un aumento en la osmolaridad intracelu-
lar, la cual conduce, a su vez, al influjo osmótico de agua y al aumento del volumen celular. La
magnitud y el curso temporal de los cambios de VCA producidos por el NH3/NH4+ no habían

94
sido estudiados hasta el presente, no obstante su importancia biofísica y clínica. En lo que
respecta a los aspectos biofísicos, la exposición de células a un pulso de NH4Cl es una manio-
bra comúnmente usada para alterar de manera controlada y predecible el pHi y estudiar los
mecanismos subyacentes a su regulación66,88. Desde el punto de vista clínico, su importancia
está ligada a la fisiopatología del edema cerebral asociado con hiperamonemias agudas, como
las que caracterizan a los cuadros de encefalopatía hepática resultantes de fallas agudas del
hígado108.

5.2.1 La permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 y al NH4+ determina la cinética de

los cambios de pHi y VCA. La alcalinización inicial observada en células N1E-115 expuestas al
par NH3-NH4+ indica que éstas son significativamente más permeables al NH3 que al NH4+.
Los resultados de los experimentos en los que se modificaron las concentraciones relativas de
NH3 y NH4+ en las soluciones de NH4Cl (sección 4.1.1) son consistentes con esta hipótesis.
Estos experimentos muestran que la magnitud del cambio inicial del pHi, así como la del
aumento del VCA, dependen de la [NH3]o y no de la [NH4+]o. Dado que el NH3 es un gas, y
como tal no afecta la osmolaridad interna de las células, la correlación positiva entre la [NH3]o
y la magnitud del aumento del VCA es consistente con la hipótesis de que la acumulación de
NH4+, resultante del influjo de NH3, es un determinante importante del aumento de volumen.
El cálculo de la permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 (PNH3) en nuestras células
arrojó un valor de ~38 µm/s. (sección 4.2, Resultados). Este valor es tan sólo una aproxima-
ción, dado que en su estimación no se considera la compleja geometría de estas células al
calcular la relación volumen/superficie celular. No obstante, el valor obtenido para PNH3 se
encuentra dentro del rango de los descritos para otras células de mamíferos56. A modo de
comparación, la PNH3 estimada para las células N1E-115 es ligeramente superior a la PNH3 cal-
culada para la barrera hematoencefálica del perro301 y del hombre302, esto es, ~22 µm/s.
Al igual que otras células, las N1E-115 son permeables al NH4+, tal como lo indica la acidi-
ficación del plateau que resulta, al menos en parte, del influjo gradual de NH4+48,51,88,303.
Consistente con esta hipótesis es el hecho de que la tasa de acidificación del plateau (-dpHi/dt)
se acentúe conforme aumenta la [NH4+]o cuando la [NH3] se mantiene constante, como se
muestra en la Fig. 27, sección 4.1.3.

95
 La acumulación intracelular de NH4+ durante la fase de acidificación del plateau guarda
relación, además, con la magnitud de la acidificación “de rebote” que ocurre al retirar el pulso
de NH4Cl (Fig. 25): en células que acumularon más NH4+, la disociación de este ión en NH3 +
H+ resulta en una “carga ácida” intracelular más marcada, debido a que tras el eflujo del gas
NH3 la [H+]i remanente es más pronunciada. Además de estas evidencias, las medidas cinéticas
de los cambios de pHi indican que, ante la exposición al NH3/NH4+, el influjo de NH4+ ocurre
también durante la fase de alcalinización inicial, como lo sugiere el carácter no lineal de la
relación entre el flujo de NH3 (JNH3) y la [NH3]o para las concentraciones más altas de NH4Cl
(Fig. 29, sección 4.2, Resultados). En esta relación, la Ley de Fick parece cumplirse sólo para

[NH3] ≲ 0,10 µmol/cm3. A concentraciones mayores de NH3, la desviación aparente de la Ley

de Fick puede deberse tanto a la entrada de NH4+, como a la activación de mecanismos de
regulación de pHi, (v.g. el intercambiador Cl-/HCO3-), fenómenos que tenderían a reducir la
amplitud del ∆pHi inicial a partir del cuál se cuantifica JNH3††. En otras palabras, si las células
fuesen impermeables al NH4+ se esperaría que JNH3 y [NH3]o guardasen una relación lineal para
todo el rango de concentraciones de NH3 exploradas, reflejando la difusión pasiva de NH3.
Además de la evidencia discutida, hay otra observación que permite suponer que ocurre un
influjo de NH4+ durante la fase inicial de aumento del pHi. A un pHi basal promedio de 7,08,
como el registrado en las 61 células estudiadas, le corresponde un poder de tamponamiento
intrínseco (βi) de ~25 mM/u.pH (Fig. 28, sección 4.2, Resultados). Esto implica que es
necesaria una acumulación intracelular neta de ~2,5 mM de un equivalente ácido (v.g. NH4+) o
básico, para producir un cambio de pHi de 0,1 u.pH. El ∆pHi promedio registrado ante la
aplicación de 20 mM de NH4Cl fue de 0,41 u.pH, valor que requeriría, de acuerdo con el
cálculo anterior, una acumulación de ~10,25 mM de NH4+. La acumulación promedio de NH4+
estimada al pico alcalino fue, sin embargo, de 16,8 mM, valor que debió producir un ∆pHi de
~0,56 u.pH. La discrepancia entre el valor observado y el valor predicho del cambio de pHi
puede explicarse, al menos en parte, por el influjo directo del NH4+, que contrarresta la
alcalinización mediada por el NH3 y contribuye a la vez a aumentar el poder de tamponamiento

intracelular, al incorporar a las células equivalentes ácidos (el sistema NH3 + H+ ⇄ NH4+

††
En las observaciones descritas en el presente trabajo es posible que el intercambiador aniónico haya jugado,
si acaso, un papel menor, dado que los experimentos se hicieron en ausencia virtual de HCO3-.

96
constituye, en sí mismo, un factor adicional (extrínseco) de tamponamiento del pH). Final-
mente, en los experimentos en presencia de Ba2+, un inhibidor no selectivo de canales de K+, se
observó un ∆pHi de mayor amplitud, así como un bloqueo de la acidificación del plateau, que
son consistentes con la hipótesis de que el NH4+ permea a través de canales de K+ (Fig. 53).
Las posibles vías de influjo del NH4+ se discuten más adelante, en la sección 5.4.

5.2.1.1 Gradiente electroquímico y permeabilidad de la membrana celular al NH4+. En las 61

células en las que se caracterizaron los cambios en el pHi y en el VCA mediados por NH4Cl
(20 mM), la [NH4+]i calculada durante el pico máximo de aumento del VCA fue de 16,8 mM.
Siendo la concentración externa de NH4+ de ~19,78 mM, el potencial de equilibrio del NH4+ en
el pico de la alcalinización es:

ENH4+ = RT/zF x ln [NH4+]o/[NH4+]i ≅ 4,2 mV

donde RT/zF = 25,7 mV a 25ºC. Suponiendo un potencial de reposo para las células N1E-115
de ~ -46 mV (datos preliminares, no mostrados; véase también Ref. 277, la [NH4+]i requerida
para que este catión se equilibre a través de la membrana celular externa debería ser:

[NH4+]i = [NH4+]o x e (-zEmF/RT) ≅ 119 mM

De estos cálculos se concluye que el gradiente electroquímico del NH4+ es ~ 50 mV y está

dirigido hacia adentro de las células, favoreciendo marcadamente el influjo de este ión.

La permeabilidad de las células N1E-115 al NH4+ se manifiesta, como se dijo, en la acidifi-

cación gradual del citosol que tiene lugar tras la alcalinización inicial inducida por el
NH3/NH4+. Para pulsos de 20 mM de NH3-NH4+ esta acidificación proseguirá, en teoría, hasta
que la [NH4+]i alcance un valor de ~119 mM, ó en otras palabras, hasta que el potencial de
membrana, Em, sea igual al potencial de equilibrio del NH4+, ENH4+304. En términos generales,
el cálculo teórico indica que para un Em ≈ -60 mV, el equilibrio electroquímico del NH4+ se
alcanzará cuando la [NH4+]i sea ~10 veces más alta que la [NH4+]o.

97
 La tasa de flujo inicial de NH4+ (calculada para los primeros ~2 min de la acidificación del
plateau) fue de ~5 x 10-9 mmol/cm2 × s. Esta tasa fue ligeramente superior a la tasa de
producción de protones, medida durante el mismo lapso, que fue de ~1,4 x 10-9 mmol/cm2 ×
s‡‡. Esta diferencia se explica porque dentro del rango de pHi registrado durante los
experimentos, no todo el NH4+ que ingresa a las células se disocia en NH3 + H+305, de tal
manera que el flujo de NH4+ (JNH4+) no es cuantitativamente igual a la tasa de producción de
protones (JH+). En relación con esto hay que tener en cuenta, además, que la tasa de
acidificación del plateau no expresa solamente velocidad con que se generan H+ a partir del
influjo de NH4+, sino que refleja también la actividad de mecanismos de regulación del pHi que
expulsan equivalentes básicos del interior celular51. A partir de la tasa de flujo de NH4+ calcu-
lada, la permeabilidad de la membrana plasmática al NH4+ se estimó en ~2,5 x 10-7 cm/s. Este
valor es ~4 órdenes de magnitud menor que la PNH3 calculada en estas mismas células, y entre
2 y 4 órdenes de magnitud menor que la permeabilidad al NH4+ medida en diversos segmentos
de los túbulos renales14,306.

5.3 Factores determinantes del aumento del VCA mediado por el par NH3/NH4+. En
ausencia de cambios en la osmolaridad extracelular, cualquier variación en el VCA debe
resultar de un cambio primario en la concentración de osmolitos intracelulares. En el presente
trabajo se demuestra que en las células expuestas a 20 mM de NH4Cl, alrededor de un tercio
del aumento inicial del VCA puede atribuirse a la acumulación de NH4+ (osmóticamente
activo), secundaria al influjo de NH3 (osmóticamente inactivo). Si, en virtud del principio de
electroneutralidad macroscópica, a esta acumulación le acompaña un incremento similar en la
concentración intracelular de un anión (de procedencia exógena o endógena), quedaría por
explicar sólo un tercio de dicho aumento. La naturaleza del anión que se acumula con el NH4+
así como la de los osmolitos responsables de la fracción del aumento de volumen restante se
discuten a continuación.
‡‡
El flujo de NH4+ (JNH4+) se calculó como d[NH4+]i/dt x Vol/Area. Dado que el valor de d[NH4+]i/dt representa
la acumulación neta de NH4+ en las células, los efectos del potencial de membrana y del poder de tamponamien-
to intrínseco del pHi (βΙ) sobre la acumulación intracelular de NH4+ están englobados en la determinación de
este flujo. La tasa de producción de H+ (JH+) se calculó como dpHi/dt x βI x Vol/Area, donde βI = 10 mM/u.pHi
(valor obtenido por interpolación de los datos mostrados en la Fig. 28 para un pHi = 7,49, tal el valor promedio
del pico alcalino tras la aplicación de NH4Cl).

98
5.3.1 Acumulación intracelular de NH4+ y un anión acompañante. En las 61 células caracteri-
zadas, la concentración intracelular de NH4+ calculada al momento en que alcanzó el pico
máximo del VCA ante el pulso de 20 mM de NH4Cl, fue de 16,8 mM. Suponiendo que ocurre
un incremento concomitante y equivalente en la concentración de un anión monovalente, como
requiere el principio de electroneutralidad macroscópica del interior celular, la ganancia neta
de osmolitos en el citoplasma debió ser de ~ 33,4 mosm/KgH2O. De este modo, a partir de su
valor inicial de ~311 mosm/KgH2O, la osmolaridad intracelular aumentaría entonces a ~344
mosm/KgH2O, es decir un ~10,7%. Este sería por lo tanto el porcentaje de incremento predicho
para el volumen celular acuoso relativo, siempre y cuando las células exhibiesen un comporta-
miento osmométrico perfecto, y no se disparasen mecanismos de regulación. Sin embargo, el
aumento máximo observado del VCA en las 61 células fue 1,7 veces mayor (~18%) que el
predicho. En conclusión, el aumento observado del volumen no puede explicarse en su totali-
dad por la acumulación exclusiva de NH4+i y un co-ión negativo, por lo que otros osmolitos
(sumando una concentración de ~24 mM) deben acumularse asimismo en el interior de las
células. Estos osmolitos podrían ser exógenos (ej: Na+ extracelular) ó endógenos, como la
glutamina. El aumento máximo del volumen ante la aplicación de NH3/NH4+ se alcanza en ~38
s. Tanto el transporte electrodifusional de iones como la síntesis de glutamina son procesos
suficientemente rápidos como para contribuir al aumento del VCA durante este lapso. Otro
factor que podría contribuir al aumento del VCA, y que no fue evaluado en este trabajo, es la
degradación de macromoléculas (v.g. glucogenólisis) en el interior celular. A continuación se
discute la posible influencia de la síntesis y acumulación de glutamina, y posteriormente los
efectos de la sustitución de los iones Cl- y Na+ extracelulares, sobre el aumento del volumen
celular mediado por el par NH3/NH4+.

5.3.2 Síntesis y acumulación de glutamina. Como se mencionó en la sección 1.6.1 de la Intro-

ducción, la acumulación intracelular de glutamina es considerada por muchos como el determi-
nante principal del aumento de volumen que se observa en células gliales en condiciones de
hiperamonemia. Sin embargo, la hipótesis de que esta acumulación conduce a un aumento en
el volumen celular, determinante de la aparición de un edema, aún no ha sido claramente
demostrada o refutada. Las pruebas de detección con anticuerpos (Western Blot) realizadas en
nuestro laboratorio indican que la enzima GS se expresa en células N1E-115 indiferenciadas

99
aunque parece estar disminuida o ausente en células diferenciadas (Fig. 30, sección 4.4.1). Sin
embargo, estos resultados son preliminares y deben repetirse con controles que aseguren que la
concentración de proteínas es la misma en cada muestra. Estas determinaciones se están reali-
zando actualmente en el laboratorio.

Por otro lado, si aceptamos que “el ciclo de la glutamina” (esquematizado en la Fig. 2,
Introducción) representa una compartamentalización funcional efectiva de la conversión de
glutamato en glutamina, y viceversa, en tipos celulares definidos (neuronas y astrocitos), la
presencia de GS en neuronas maduras podría considerarse como un fenómeno residual, sin
relevancia fisiológica. No sabemos si la GS se expresa en neuroblastos, pero la literatura coin-
cide en señalar que la expresión de GS en neuronas adultas es baja o ausente. En células N1E-
115 diferenciadas, la inhibición tentativa de la síntesis de glutamina con sulfoximetionina
(MSO; 1-3-5 mM), una sustancia que inhibe de modo irreversible la GS, ejerció un efecto
inhibitorio aparente sobre el aumento del VCA mediado por NH3/NH4+ a la concentración más
baja (1 mM). Sin embargo, a concentraciones mayores de MSO (3 y 5 mM), los efectos sobre
el VCA fueron indistinguibles del control (Fig. 31). La ausencia de un bloqueo dosis-
dependiente a las concentraciones más altas de MSO sugiere que la reducción observada en el
aumento del VCA ante 1 mM de MSO no tiene relevancia biológica, y se debe probablemente
a la variabilidad propia de un registro limitado de datos, como el que se analizó. Estos
resultados son consistentes con la aparentemente pobre expresión de GS en celulas N1E-115
diferenciadas. En otra serie de experimentos hemos medido, mediante cromatografía liquida
de alta presión (HPLC), la concentración intracelular de glutamina a diversos intervalos
durante la aplicación de pulsos de NH4Cl (20 mM). Estos resultados, que no se incluyeron en
este trabajo y que se realizaron en poblaciones de células en su mayoría diferenciadas, han
mostrado, en ocasiones, un aumento en los niveles de glutamina intracelular, a la vez que una
disminución en los niveles endógenos de glutamato, ~30 s después de la aplicación de
NH4Cl.§§ Sin embargo, esta observación no pudo ser reproducida consistentemente, y tras
varios experimentos, la variabilidad de los datos no permitió extraer resultados concluyentes.

§§
En este caso particular, la contribución de la glutamina al aumento del VCA debió ser, a lo sumo, marginal,
ya que los niveles de glutamato disminuyeron de modo concomitante, limitandose de este modo el cambio neto en
la osmolaridad intracelular.

100
 En síntesis, los experimentos con MSO no permiten concluir de manera categórica que la
glutamina sea el osmolito responsable de la fracción de aumento del VCA que no puede expli-
carse por la acumulación de NH4+ y un anión acompañante en estas células. Estos experimen-
tos deben repetirse en células N1E-115 indiferenciadas, así como en células de neuroblasto-
ma/glioma NG-108, en las cuales la expresión de GS es evidente (Fig. 32).

5.3.3 Influjo de Cl- y Na+.

a) Sustitución del Cl- externo por gluconato. Ante la exposición a soluciones con NH4Cl el
influjo de Cl- podría contribuir, a un mismo tiempo, al restablecimiento de la electroneutralidad
del citosol y a un aumento en la osmolaridad intracelular. Si bien esta hipótesis es, en principio,
atractiva, carecemos de información precisa que nos permita estructurarla de modo más formal.
Por ejemplo, no sabemos cual es la actividad del Cl- intracelular, y cual es la magnitud y la
dirección de su gradiente electroquímico en las células usadas como modelo. Los experimentos
en los que se sustituyó el Cl- externo se condujeron por tanto para obtener información preli-
minar, empírica, sobre la posible participación de este anión en el aumento de volumen media-
do por el NH3/NH4+. Como se aprecia en los resultados (sección 4.4.2), los efectos de la
sustitución de Cl- externo por el anión gluconato en las soluciones de NH3/NH4+ fueron muy
variables, especialmente cuando el Cl- se eliminó por más de 10 min antes de aplicar dichas
soluciones. Sin embargo, la comparación estadística del aumento de VCA producido en estas y
en otras condiciones [v.g. ante períodos más cortos (30 s – 5 min) de remoción del Cl- en la
solución control] no mostró diferencias significativas con respecto al aumento observado en el
pulso control. Estos resultados sugieren que el influjo de Cl- no juega un papel importante en el
aumento del VCA producido por el NH3/NH4+. Por otra parte, si bien la variabilidad observada
en el aumento del VCA en estos experimentos podría señalar la existencia de diferencias bio-
químicas ó funcionales entre células distintas, es posible también que la magnitud de dicho
aumento se relacione con la actividad remanente del Cl-i y con el valor del potencial de mem-
brana al aplicar el pulso de NH3-NH4+.
Dado que el Cl- extracelular no parece contribuir de modo importante al aumento del VCA,
podemos especular que al menos una parte del NH4+ que se forma ó que ingresa a las células se
combina con cargas negativas intracelulares “fijas”, es decir cargas negativas en las macromo-
léculas. Si esto fuera cierto, la diferencia entre el volumen observado y el volumen predicho

101
sería aún mayor que la estimada, ya que la interacción con cargas fijas, si bien cumple con la
electroneutralidad, no contribuye a aumentar la presión osmótica intracelular. Esto se debe a
que una macromolécula que contenga múltiples cargas negativas contribuirá, de hecho, como
una sola partícula osmóticamente activa.
Es importante resaltar que la variabilidad de los resultados de los experimentos en los que
el Cl- externo se sustituyó por gluconato debe evaluarse teniendo en cuenta que este último
anión no solo sustituye al Cl-, sino que además “quela” al Ca2+ extracelular, por lo que se
necesita repetir estos experimentos bajo condiciones controladas. La participación del Cl- en
los cambios de VCA mediados por NH3/NH4+ podrá evaluarse mejor en experimentos con
marcadores fluorescentes como el MEQ, que permiten medir cambios en la [Cl-]i307.

b) Sustitución de Na+ por NMDG+. Es posible que un influjo neto de Na+ contribuya al aumen-
to del VCA que ocurre al exponer las células al par NH3/NH4+. Dicho influjo podría resultar
tanto de la activación de canales de Na+ voltaje-dependientes, como de la apertura de canales
catiónicos no selectivos, sensibles al estiramiento de la membrana, como consecuencia, respec-
tivamente, de la despolarización y del aumento de volumen producidos por NH3/NH4+. El
reemplazo del Na+ externo por el catión impermeante NMDG+ en las soluciones de NH4Cl
produjo una disminución moderada en la amplitud inicial del aumento del VCA. Sin embargo,
ésta fue significativa en células cargadas con calceína, pero no en aquellas conteniendo
BCECF. La discrepancia entre estos grupos se debe, probablemente, al tamaño reducido de las
muestras. Claramente se necesitan más experimentos para llegar a conclusiones definitivas con
respecto al papel del Na+ en el aumento del VCA. Además de los experimentos de sustitución
iónica, la utilización de marcadores intracelulares sensibles a cambios en la [Na+]i permitirá
estudiar la contribución de este catión al aumento referido del VCA.

5.3.3.1 Cambios en el pHi basal inducidos por la remoción del Cl- o del Na+ externos. Al susti-
uir el Cl- de la solución ISO control y reemplazarlo con gluconato se observó, en la mayoría de
las células, una alcalinización gradual del citosol. Este efecto podría atribuirse, en principio, a
la acumulación intracelular de HCO3-, resultante de la inhibición del intercambiador Cl-/HCO3-.
Sin embargo, dado que los experimentos se realizaron en ausencia nominal de HCO3-, esta

102
hipótesis no parece factible. Más aún, la incorporación de DIDS (100 µM), un inhibidor del
intercambiador Cl-/HCO3-, a la solución control, no produjo alcalinización del citosol (observa-
ción no mostrada). Las causas de dicha alcalinización no son claras.
Por otra parte, la acidificación del pHi observada al reemplazar el Na+ con NMDG+ en la
solución ISO control, así como el bloqueo de la regulación del pHi tras la remoción del pulso
de NH4Cl-Cero Na+, puede adscribirse a la inhibición del intercambiador Na+/H+266.

5.4 Factores determinantes de la DRVi en células expuestas a soluciones conteniendo

NH3/NH4+. El aumento inicial del VCA producido por el NH3/NH4+ es seguido de una fase de
disminución reguladora (DRVi) que tiende a restablecer el volumen inicial de las células (Fig.
17, sección 4.1). De acuerdo con la hipótesis del presente trabajo, esta respuesta reguladora del
volumen en un medio isosmótico, está determinada por la salida de osmolitos y agua, y ocurre
paralelamente a la acumulación gradual de NH4+ en el interior celular (Fig. 17). La ocurrencia
de la DRVi indica que, durante esta fase, las células pierden más osmolitos que los que ganan
por la acumulación de NH4+ (y otros osmolitos que supuestamente lo acompañan). Para las 61
células caracterizadas con pulsos de 20 mM de NH4Cl el aumento inicial promedio del VCA
fue de ~18%, equivalente a un aumento en la osmolaridad intracelular de ~57,6 mosm/KgH2O.
Dado que la tasa inicial de la DRVi fue de -7,3%/min, un cálculo aproximado indica que el
eflujo neto de osmolitos ocurrió con una tasa inicial de ~4,2 mM/min. Por otro lado, la tasa de
acumulación de NH4+, estimada a partir de los valores de pHi registrados durante la acidifica-
ción del plateau, fue de 0,84 ± 0,04 mM/min. Esto indica que la tasa de inicial de salida de
osmolitos fue ~5 veces mayor que la tasa de acumulación. A continuación se evalúan algunos
mecanismos que podrían mediar la DRVi.

5.4.1 Cambios en la tensión de la membrana plasmática. En la sección 4.5.1 se demuestra que

las células regulan activamente su volumen tras aumentos o disminuciones provocados por
estímulos isosmóticos, como la exposición y remoción de NH3/NH4+, pero no lo hacen tras
cambios de volumen de amplitud similar provocados por una reducción o un aumento en la
osmolaridad del medio externo (Fig. 40). Más aún, la DRVi y el ARVi se presentan ante

103
cambios pequeños (<5%) del volumen, como los producidos por concentraciones bajas (0,5 ó 1
mM) de NH4Cl, lo cual constituye una evidencia clara de que la regulación del volumen, den-
tro del rango de expansiones y disminuciones explorado (<20%), no es consecuencia de la
mera expansión ó contracción de las células. La DRVi y el ARVi deben, por lo tanto, resultar
de otras acciones del NH3/NH4+.

5.4.1.1 Activación de canales catiónicos activados por aumentos en la tensión de la

membrana. La apertura de canales catiónicos no selectivos, activados por aumentos en la ten-
sión de la membrana (SACs) contribuye al desarrollo de la DRV que ocurre en células N1E-
115 tras aumentos del volumen (40% o más) en medio hiposmótico250. Nuestros resultados
muestran que la DRVi durante la aplicación de NH3/NH4+ se inhibe marcadamente en presen-
cia de Gd3+, un inhibidor de SACs (sección 4.5.1.1, Figs. 41 y 42). Ante la apertura de estas
vías, la dirección del flujo de las corrientes generadas y la identidad de los iones transportados
dependerán de los gradientes electroquímicos de los cationes implicados (Na+, K+ y Ca2+) y de
la selectividad relativa de los canales a éstos. Tras aumentos del VCA como los producidos
por el NH3/NH4+, el bloqueo de la DRVi podría resultar de una restricción o reducción en el
eflujo de iones a través de SACs, ó alternativamente, de la inhibición de un influjo inicial de
cationes (v.g. Na+ ó Ca2+), que podría activar otras conductancias (v.g. de K+ o Cl-)313.
Tras su incorporación a la solución ISO control, el Gd3+ indujo además un aumento en el
volumen basal de las células (Fig. 41). Esta observación sugiere que el Gd3+ afecta la actividad
de una ó más vías de transporte con actividad basal en estas células, distintas probablemente
de los SACs, si atendemos al mecanismo que media la activación de estos últimos, es decir un
aumento en la tensión de la membrana plasmática. Alternativamente, es posible que los cam-
bios en la fluorescencia basal producidos por el Gd3+ sean un artefacto producido por “apaga-
miento” (quenching) de la fluorescencia del BCECF, suponiendo que el Gd3+ permea las
células. Sin embargo, aún en este caso, la inhibición observada de la DRVi debió ser real, ya
que el supuesto apagamiento de la fluorescencia no debería modificar la cinética de los cam-
bios de volumen. Cabe señalar, por otro lado, que los efectos del Gd3+ son inespecíficos. Así,
por ejemplo, a la concentración empleada (100 µM) es probable que el Gd3+ haya inhibido
corrientes de Ca2+308,309. A este respecto, es interesante señalar que otro catión de la serie de
los lantánidos, el La3+ (10 µM), inhibe fuertemente dichas corrientes en células N1E-115267.

104
 El papel de los SACs en el aumento y la disminución reguladora del volumen observados
tras la aplicación de NH3/NH4+ podrá investigarse con inhibidores más específicos de estos
canales, tales como la toxina GsMTx-4310.

5.4.1.2 Expansión inicial del volumen. Como vimos más arriba, la mera expansión del volumen
celular no basta, bajo ciertas condiciones, para desencadenar una respuesta de regulación. No
obstante, ante aumentos de volumen de magnitud suficiente, esta respuesta ocurre independien-
temente de la causa primaria que ocasionó la expansión. En estos casos es válido preguntarse
¿en qué medida la magnitud de la expansión inicial del volumen afecta la velocidad y la mag-
nitud del proceso regulador? La respuesta a esta pregunta debería permitir distinguir si la DRV
(o la DRVi) es consecuencia de alteraciones en las propiedades viscoelásticas de las células
(que determinarían un ajuste de tipo “mecánico”, es decir proporcional al grado de perturba-
ción original en la estructura celular), o si por el contrario, las respuestas reguladoras guardan
relación con factores no estructurales, de carácter más dinámico, como los cambios en la
concentración intracelular de uno ó más osmolitos. Las correlaciones mostradas en la Fig. 43
muestran que, a diferencia de lo que se observa ante aumentos de volumen en medio hiposmó-
tico, la tasa inicial y la magnitud de la DRVi son mayores cuanto menor es el aumento del
VCA. Esto podría significar que tras aumentos primarios en la concentración intracelular de
osmolitos (v.g. NH4+), las células responden de manera más efectiva cuando el aumento de
volumen es pequeño (y por ende, puede decirse más fisiológico), siendo probablemente, en
estos casos, “más sencillo” de contrarrestar. A este respecto, una observación general que no se
explicitó en los resultados, pero que puede apreciarse en los registros de VCA, es que la DRVi
fue proporcionalmente mayor ante la exposición a 5 que a 20 mM de NH4Cl. Esto ocurrió aún
en células en las que la aplicación de una u otra concentración de NH4Cl indujo aumentos de
volumen similares, lo cual sugiere que la DRVi es más “eficiente” cuando el estímulo primario
es poco severo. En contraste, el hecho de que la DRV en medio hiposmótico sea mayor ante
aumentos mayores del VCA sugiere que los mecanismos implicados en esta respuesta son
distintos de aquellos que median la DRVi tras aumentos producidos por el NH3/NH4+.

5.4.2 Efectos osmóticos del NH4+. La Fig. 44 indica que la DRVi es relativamente indepen-
diente de la tasa de acumulación concomitante de NH4+. En otras palabras, la acumulación

105
gradual de osmolitos no incide, dentro de los límites que definen nuestras condiciones experi-
mentales, sobre la cinética de la DRVi que procede de manera simultánea. Esto sugiere que,
tras su puesta en marcha, la DRVi es un proceso relativamente autónomo, que no se ve
afectado por variaciones concurrentes (en este caso modestas) de la osmolaridad intracelular.
En la Fig. 45 se observa, por contraste, que la magnitud de la acumulación inicial de NH4+ se
correlaciona inversamente con la DRVi. Esta correlación es consistente con aquella otra obser-
vada entre el aumento máximo del VCA y la DRVi. Es decir, en células en las que inicial-
mente se acumuló más NH4+, el aumento de VCA fue mayor (Fig. 20) y la DRVi fue menor.
En ausencia de más pruebas experimentales, es difícil discernir si la reducción de la DRVi se
debe a efectos derivados de la acumulación de NH4+ o a la magnitud del aumento inicial del
VCA per se. La dificultad es aún mayor dado que ambas variables están correlacionadas entre
sí y las dos varían, a su vez, con el pHi.

5.4.3 Posible influencia del pHi sobre la DRVi. El análisis de las 61 células expuestas a pulsos
de 20 mM de NH4Cl mostró que la DRVi fue más pronunciada cuanto más alcalino era el pHi
basal (antes de la exposición al pulso de NH4Cl), como se observa en la Fig. 46A. La
correlación que se observa entre el pHi basal y la DRVi es consistente con las correlaciones
descritas anteriormente. Esto se resume, de manera simplificada, en la siguiente tabla:

pHi basal [NH4+]i ∆VCA DRVi

   
   

En esta tabla se muestra que, en términos generales, a un pHi inicial ácido, la exposición a
NH3/NH4+ induce una acumulación mayor de NH4+ y un aumento mayor del VCA, mientras
que la DRVi es menor. A pHs intracelulares alcalinos, por el contrario, puede verse que las
magnitudes respectivas se invierten.

En la Fig. 47 se observa que la tasa de acidificación del plateau, proceso paralelo a la

DRVi, se correlacionó asimismo significativamente con la tasa de la DRVi. Dado que, como
vimos más arriba, la tasa de acumulación de NH4+ no mostró una correlación significativa con

106
la DRVi, podemos suponer que la DRVi guarda relación con los cambios en el pHi, antes que
con los efectos de la acumulación progresiva del NH4+. Las variaciones en el pHi podrían, por
ejemplo, afectar la conductancia a traves de ciertos canales de K+ como los TWIK, TASK ó
TREK311. En células de Erlich hinchadas en medio hiposmótico se observó, por ejemplo, que la
inducción de un aumento de pHi determina un aumento en una corriente de K+ que resulta a su
vez en una potenciación de la DRV312. Los autores definen a esta corriente, mediada probable-
mente por TASK-2, como “sensible al volumen”, puesto que aumenta ante incrementos del
volumen celular. Aunque nuestros resultados sugieren que el pHi afecta la regulación del volu-
men en células N1E-115, se requieren estudios exhaustivos para esclarecer la posible relación
entre el pHi y la DRVi en nuestro modelo experimental.

5.4.4 Activación de vías electrodifusionales (canales iónicos) durante la DRVi.

a) Canales no selectivos a cationes activados por estiramiento de la membrana plasmática.

Ya vimos que en células expuestas a NH4Cl, el Gd3+ bloqueó marcadamente la DRVi. La única
manera por la cual la DRVi podría efectuarse a través de SACs, es mediante la salida de K+,
que es el único catión presente en concentraciones suficientemente altas en las células. Sin
embargo, dado que la DRVi se inhibe críticamente ante el bloqueo de canales aniónicos, es
probable que los SACs no constituyan una vía efectora directa de la DRVi, sino antes bien, que
su apertura tras aumentos del VCA sea un disparador del fenómeno regulador. Esto podría
ocurrir si la apertura de SACs favoreciese, tal como se observó ante aumentos hiposmóticos del
volumen en estas células, una despolarización que activase conductancias al Cl- y al K+ 250
.
Una manera sencilla de probar esta hipótesis es aplicando Gd3+ una vez que la DRVi ha
comenzado. La apertura de SACs podría determinar asimismo un influjo de Ca2+, que mediaría
la activación de cierto tipo de canales de K+ y quizás de Cl-, efectores de la DRVi313,314,242.

b) Canales aniónicos. La incorporación de NPPB (10 µM) a las soluciones de NH4Cl (5 y

20 mM) resultó en una marcada inhibición de la DRVi. Este hallazgo sugiere que el eflujo de
aniones (Cl- y ciertos aniones orgánicos) por vías electrodifusionales, contribuye de manera
importante a la generación de la DRVi. Más aún, en ocasiones, el NPPB indujo una inversión
de la iDRV, es decir una fase adicional de aumento del volumen, tras la expansión inicial. Esta

107
inversión de la DRVi sugiere la acumulación de aniones en el interior celular que se añadiría a
la ganancia de osmolitos (NH4+ y otros) que ocurre continuamente durante la exposición al
NH4Cl.

El NPPB podría estar inhibiendo la actividad del canal VSOAC (del inglés "volume-
sensitive organic osmolyte-anion channel"), estudiado en estas células315 y que se ha propuesto
como mediador importante de la DRV hiposmótica en muchos tipos celulares (253Okada). Sin
embargo, un estudio previo realizado en células N1E-115 sugiere que los canales aniónicos que
se abren tras aumentos hiposmóticos del volumen son activados por el voltaje de transmem-
brana250, propiedad que no exhiben los canales VSOAC. Además de su acción bloqueante
sobre las conductancias aniónicas, el NPPB tuvo efectos en el pHi (sección 4.5.5.1). Por ejem-
plo, produjo una acidificación basal, que ha sido descrita en otras células316 y, ante la aplica-
ción de NH4Cl, una disminución en la tasa de alcalinización inicial y un aumento en la pen-
diente de acidificación del plateau (Fig. 52A), que indican que la membrana plasmática de las
células es permeable al NPPB, que es un ácido***. Más aún, se ha demostrado que el NPPB
puede incorporarse a las membranas celulares y actuar como un protonóforo317. En virtud de
esto, es de suponer que el NPPB tiene consecuencias osmóticas, dado que al acentuarse la tasa
de acidificación del plateau, la tasa de acumulación intracelular de NH4+ debe acentuarse
concomitantemente. Si esta acumulación fuese suficientemente aguda, la DRVi podría verse
atenuada, inhibida, o incluso, como se vió en ocasiones, invertida. Si bien la tasa de acumula-
ción de NH4+ en células tratadas con NH4Cl (20 mM) y NPPB fue, en efecto, significativamen-
te mayor al control (1,35 ± 0,2 vs. 0,5 ± 0,03 mM/min, respectivamente; p<0,001), la acumula-
ción de NH4+ durante el pulso de prueba (con NPPB) debió inducir un aumento de volumen a
una tasa de ~0,4 %/min. Dado que la tasa inicial de la DRVi (en el pulso control) fue ~10 veces
más rápida (-3,6 %/min) la acumulación de NH4+ calculada resulta insuficiente, por sí misma,
para afectar de manera notable la DRVi. En otras palabras, de no mediar una inhibición efecti-
va y simultánea del eflujo de osmolitos, es poco probable que la acumulación de NH4+ (e
incluso un co-ión) haya bastado, por sí sola, para abolir o invertir el proceso regulador. En el
estudio arriba mencionado se demuestra, además, que el NPPB induce una caída en los niveles
***
En experimentos preliminares observamos que la incorporación a la solución ISO control de ácido nifúmi-
cο (100 µM) y tamoxifén (10 µM), sustancias que se emplean comúnmente para inhibir canales de Cl-, resulta en
una disminución y un aumento, respectivamente, en el pHi.

108
de ATP de las células, como resultado de la disrupción del metabolismo mitocondrial. En
células N1E-115 se demostró, recientemente, que la activación del VSOAC, disminuye cuando
se reduce el contenido intracelular de ATP315. Si en nuestros experimentos el NPPB hubiese
causado una reducción en el ATP celular, podemos suponer además que la actividad de la
bomba de Na+/K+ pudo haberse comprometido, lo cual podría conducir a un aumento adicional
del volumen celular. En conclusión, la inhibición de la DRVi en presencia de NPPB no puede
adscribirse exclusivamente al bloqueo específico de conductancias aniónicas. Es de esperar que
un conocimiento mayor de los mecanismos que median el eflujo de aniones durante la DRVi
resulte de la caracterización farmacológica y el análisis molecular de sus vías transportadoras.

c) Canales de K+. La salida conductiva de K+ a través de canales dependientes de voltaje (v.g.

KDR) contribuye a la DRV que sigue a aumentos del volumen en medio hiposmótico, tanto en
células N1E-115251,258, como en otros tipos celulares168. Al ser expuestas a 5 mM de NH4Cl en
presencia de 1 mM de Ba2+, las células N1E-115 mostraron una inhibición de ~46% en la mag-
nitud del volumen regulado (Figs. 48 y 51). Esta inhibición sugiere que el eflujo de K+ contri-
buye, en nuestras condiciones experimentales, a la respuesta osmoreguladora de las células.
Este eflujo podría ocurrir por canales de K+ dependientes de voltaje, activados por la despolari-
zación de la membrana250 producida por el NH4Cl y magnificada, a su vez, por el Ba2+.
A la concentración usada, el Ba2+ inhibe en estas células canales de K+ activados por Ca2+
(denominados indistintamente BK ó Maxi-K+)274 y probablemente inhiba la corriente “M” de
K+, mediada al parecer por canales KCNQ318,319. Ambos canales han sido propuestos como
mediadores de la DRV en medio hiposmótico242,320, 321.
Dado que la salida electrodifusiva de K+ parece contribuir a la DRVi, ante el bloqueo de
este eflujo se esperaría que el aumento inicial del VCA mediado por NH3/NH4+ fuera sensible-
mente mayor al que ocurre en condiciones control. Sin embargo, en presencia de Ba2+ el
aumento referido fue menor que el control. Con base en los efectos que el Ba2+ tuvo sobre el
pHi, es posible que la reducción en el pico del VCA se deba a la inhibición del influjo de NH4+
(ver sección 5.5).

109
5.5. Probables vías de influjo del NH4+. Con la posible excepción del intercambiador
K+/NH4+, propuesto en los túbulos colectores de la médula renal72, y de las proteinas Rh69, no
se han descubierto sistemas de transporte específicos del NH4+ en células de vertebrados supe-
riores. En contraste, numerosos estudios en donde se evalúa la permeabilidad de canales ióni-
cos y transportadores acoplados muestran que este ión puede atravesar la membrana plasmática
a través de vías comunes al K+319,322,323. La incorporación de Ba2+ (1 mM), un inhibidor general
de canales de K+, a las soluciones de NH4Cl (5 mM) indujo cambios en el pHi consistentes con
una inhibición del influjo de NH4+ (sección 4.5.5.1 y 4.6). Específicamente, ante la aplicación
NH3/NH4+, la magnitud ∆pHi y la tasa de alcalinización fueron significativamente mayores que
el control, mientras que la tasa de acidificación del plateau fue menor (Figs. 53 y 54). El Ba2+
inhibe el transporte de NH4+ en preparaciones del segmento grueso ascendente (SGA) del asa
de Henle77 y en cultivos de astrocitos de ratón58. Mientras que en el SGA la vía que media el
transporte de NH4+ sensible al Ba2+ aún no ha sido determinada, en los astrocitos se sugirió que
ésta podría estar representada por canales de K+ rectificadores de entrada (Kir).

Efectos similares, pero de magnitud inferior a los observados en presencia de Ba2+, se

observaron en presencia de bumetanida (10 µM), un inhibidor del cotransporte de Na+,K+,2Cl+
(NKCC) y de K+,Cl+ (KCC), lo cual sugiere que en células N1E-115 el NH4+ puede cruzar la
membrana a través de estas vías de transporte mediado. La entrada de iones a través de NKCC
debió haberse inhibido, asimismo, al eliminar el Cl- ó el Na+ de las soluciones externas durante
los experimentos de sustitución iónica. En estos casos, sin embargo, los cambios en el pHi
asociados con estos procedimientos no permiten identificar ó aislar los efectos específicos de
dicha inhibición.
La participación del NKCC en el transporte transtubular de NH4+ en los riñones está bien
documentada76,324 (Fig. 2, Introducción), pero un papel similar del NKCC no se había descrito
en neuronas, ni en otras células del sistema nervioso.

5.6 Posibles implicaciones fisiopatológicas. La vasta mayoría de los estudios realizados en

torno a la patogénesis de la encefalopatía hepática coinciden en señalar a la acumulación de

110
NH3/NH4+ en el cerebro como causa de los múltiples transtornos (metabólicos, energéticos y
funcionales) asociados con esta condición. Muchos de estos efectos son, en buena parte,
directos y afectan primariamente la función neuronal (v.g. despolarización; inhibición del po-
tencial inhibitorio postsináptico; activación de receptores NMDA). Otros efectos, como la de-
pleción energética y el edema celular (derivados, respectivamente, de la disfunción mitocon-
drial y del aumento en la síntesis de glutamina), parecen ser por el contrario consecuencia
indirecta de dicha acumulación, y se supone afectan principalmente a los astrocitos. En este
trabajo se demuestra que el NH3/NH4+ ejerce efectos osmóticos directos sobre células de origen
neuronal. Estos cambios, definidos por un aumento inicial del volumen acuoso celular, seguido
de una recuperación parcial, ocurren ante concentraciones externas de NH3/NH4+ similares a
las medidas en el cerebro de animales con hiperamonemia crónica ó aguda (1-5 mM). Aún
cuando no podemos concluir que estos cambios, observados en neuronas aisladas, in vitro,
reproducen las alteraciones del volumen celular que ocurren en condiciones de hiperamonemia
en el cerebro de los organismos, los mismos demuestran que el volumen neuronal puede alte-
rarse de manera significativa como consecuencia de la acumulación intracelular de NH4+. A
partir de esta observación básica, es factible que el aumento del volumen neuronal, con las
implicaciones funcionales que esto representa, constituya un evento aún no reconocido en la
serie de alteraciones patológicas producidas por aumentos agudos en la concentración cerebral
de NH3/NH4+.

111
6. CONCLUSIONES

1) Se estudiaron los cambios de volumen celular acuoso (VCA) y de pH intracelular (pHi) que

ocurren en células neurales, cargadas con el indicador fluorescente BCECF, al exponerlas

transitoriamente a soluciones isosmóticas conteniendo NH3 y NH4+. Para medir

simultáneamente el VCA y el pHi, en células individuales, se utilizó una técnica

microespectrofluorométrica de imágenes. Los cambios en el VCA se midieron en el punto

isosbético intracelular del indicador (438nm), que es insensible al pHi y sensible a cambios en

la dilución intracelular del indicador. Los cambios simultáneos en el pHi se midieron a partir

del cociente de fluorescencia 495/438. Los experimentos se realizaron en células diferenciadas

de neuroblastoma (N1E-115).

2) La exposición a NH3/NH4+, produce una alcalinización intracelular rápida seguida de un

aumento del VCA. La magnitud de esta alcalinización y del aumento del VCA depende de la

concentración externa de NH3, y no de NH4+. La alcalinización inicial resulta del influjo de

NH3, que en el interior celular se protona formando NH4+, un catión osmóticamente activo. La

permeabilidad aparente de la membrana plasmática al NH3 excede en aproximadamente cuatro

órdenes de magnitud a la permeabilidad estimada para el NH4+.

3) Aproximadamente el 60% del aumento inicial del volumen puede explicarse por la

acumulación intracelular de NH4+ y de un co-ión negativo, necesario para preservar la

electroneutralidad macroscópica. La magnitud del aumento de volumen celular se relaciona

inversamente con el valor del pH intracelular previo a la aplicación de NH3/NH4+. La

112
proporción restante de dicho aumento (40%) se debe a la acumulación intracelular de otros

osmolitos hasta ahora no identificados. Se descartó la posibilidad de que estos últimos fueran

glutamina, Na+ o Cl-.

4) La fase de acidificación del plateau que sigue al aumento inicial del pHi se debe

principalmente a la entrada pasiva de NH4+. El influjo de NH4+ tiene lugar, al menos en parte,

a través de canales de K+ y del triple cotransportador de Na+,K+,2Cl-, como lo sugiere el

bloqueo parcial de la acidificación del plateau con Ba2+ y bumetanida, respectivamente.

5) La disminución reguladora del volumen que ocurre tras el aumento inicial del volumen

celular se bloquea con Gd3+, un inhibidor inespecífico de canales catiónicos activados por

aumentos en la tensión de la membrana plasmática, y con NPPB, un inhibidor de canales

aniónicos. El bloqueo parcial de este proceso regulador por el Ba2+ sugiere que en el mismo

participan también canales de K+. La cinética de la regulación del volumen parece estar

modulada por los cambios en el pH intracelular.

6) Los resultados se discuten tanto en su significado biofísico como fisiopatológico. El sistema

in vitro desarrollado en este trabajo se propone como un modelo adecuado para estudiar, a

escala celular, la fisiopatología de los cambios de volumen y de pHi en el tejido nervioso ante

crisis hiperamonémicas como las que ocurren en la falla hepática aguda.

113
7. PERSPECTIVAS

En la presente investigación se presenta, a través del registro simultáneo de los cambios en

el volumen celular acuoso y el pHi, una caracterización inicial del edema citotóxico mediado
por amoníaco y amonio en células de origen neural. Dado que las variaciones en el VCA y en
el pHi pueden considerarse, en buena medida, como la expresión “visible” de un conjunto de
mecanismos y procesos celulares funcionalmente integrados, la metodología presentada consti-
tuye, a nuestro parecer, un valioso acercamiento integral a fenómenos complejos de la fisiolo-
gía celular. Nuestro paradigma experimental, es decir el edema celular citotóxico, así como las
técnicas de fluorescencia empleadas para su estudio, permiten abordar aspectos básicos de la
fisiopatología de la encefalopatía hepática y otras enfermedades neurodegenerativas, ofrecien-
do amplias perspectivas de desarrollo y profundización:

1) En primer lugar, creemos que es necesario estudiar la respuesta celular ante estímulos
más parecidos a los que enfrentan las células en el organismo. Sería adecuado, en relación con
nuestro modelo de edema celular, investigar con mayor detalle los efectos de concentraciones
bajas de NH3/NH4+, en el rango de 0,2 - 5 mM. De interés, también, será evaluar la respuesta
de las células al variar la velocidad de perfusión con sales de amonio, ya que es posible que los
mecanismos reguladores del VCA muestren una activación diferencial, dependiendo de la
velocidad del cambio de volumen. Esta variable parece controlar, por caso, la activación del
canal VSOAC, tal como sugiere un trabajo realizado en células N1E-115315. En este sentido, la
puesta a punto de un protocolo que permita incrementar gradualmente la concentración de
NH3/NH4+ en la solución de perfusión hará posible investigar el fenómeno de “regulación iso-
volumétrica” descrito en la sección 1.7.3.1 de la Introducción221, que reviste, en teoría, una
considerable importancia fisiológica.
2) Un aspecto importante que aún resta investigar es la posible influencia del Ca2+ en las
respuestas de VCA y pHi en células expuestas a NH3/NH4+. La remoción del Ca2+ externo
durante pulsos con NH4Cl permitirá confirmar resultados preliminares, no incluidos en este
trabajo, que sugieren que el influjo de Ca2+ es necesario para que tenga lugar la DRVi. Las
variaciones dinámicas en la [Ca2+]i serán investigadas, en paralelo con los cambios de volu-
men celular, empleando el indicador fluorescente Fura-2.

114
 3) La identificación de las vías electrodifusionales que median la DRVi y el influjo de
NH4+ requerirá la utilización de inhibidores farmacológicos más específicos así como técnicas
de biología molecular. Por ejemplo, la participación de canales de K+ activados por voltaje
podrá evaluarse mediante diversas toxinas tales como la rAgitoxina-2, la margatoxina y ciertas
dendrotoxinas, que tienen una selectividad diferencial. La activación de SACs, aparentemente
necesaria para que tenga lugar la DRVi tras la exposición a NH3/NH4+, podrá confirmarse
utilizando la toxina GsMTx-4310, un inhibidor específico de estos canales. La participación de
canales aniónicos en los cambios del VCA caracterizados en este estudio será reexaminada
farmacológicamente con otros inhibidores (v.g. dideoxiforscolina, acido niflumico, etc.). Sin
embargo, dado que no se conocen inhibidores selectivos de estos canales, es probable que la
identificación definitiva de estas vías demande la utilización de técnicas de biología molecular.
Para evaluar si el aumento del VCA está influenciado por la síntesis y acumulación de
intermediarios resultantes de la conversión metabólica del NH3/NH4+ (v.g. aspartato), se inves-
tigarán los efectos de la inhibición de aminotransferasas, aplicando aminooxiacetato.

4) La medición de los cambios en el potencial de membrana ante la exposición de las célu-

las al NH3/NH4+ permitirá comprender mejor los cambios en el flujo iónico resultantes de este
tratamiento y elaborar hipótesis con mayor poder predictivo. Para esto, intentaremos medir el
potencial de membrana con marcadores fluorescentes como el di-8-ANEPPS277, 325.

5) Los efectos aparentes del pHi sobre la disminución reguladora del volumen podrán
estudiarse más a fondo induciendo cambios controlados en el pHi y observando a continuación
el curso de la DRV(i) ante aumentos del VCA en medio hiposmótico ó isosmótico.

6) Finalmente, será de gran interés estudiar los efectos del NH3/NH4+ sobre el VCA y el
pHi en cultivos primarios de astrocitos, los cuales revisten, de acuerdo con el conocimiento
actual, una relevancia fisiológica mayor (o al menos más directa) con relación al edema
cerebral asociado con hiperamonemia. En este modelo, que puede expandirse y abarcar co-
cultivos de neuronas y astrocitos, será posible estudiar la correlación temporal entre la
acumulación intracelular de glutamina y el aumento del volumen astroglial.

115
8. REFERENCIAS

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