Ao de la inversin para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA

UNIDAD I

PRCTICA N01 DOCENTE CURSO ESTUDIANTES

: Curva de calibracin de glucosa, etanol y protenias : Angel Castro : Operaciones Unitarias I :

GARCA PREZ, Carlos RIVAS SANDOVAL, Walter CICLO : VIII

Nvo. Chimbote. Octubre de 2013

CURVA DE CALIBRACION DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEINAS

INTRODUCCION: La conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de inters industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operacin de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energa resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas. La aparicin en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables delos cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicacin de balances de materia y energa. la produccin de biomasa (biomasa = concentracin de microorganismos expresada en gramos de clulas secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y energa, de nitrgeno y Oxgeno y las produccin de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y energa. Antes de proceder a considerar el sistema de anlisis propuesto, es conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre algunas regularidades observadas experimentalmente en el cultivo de microorganismos. Un aspecto tambin importante de conocer y determinar durante la cintica de crecimiento de microorganismos, es su biomasa, la cual de encontrarse en un medio de cultivo que contenga todo los nutrientes necesarios para su crecimiento, ha de permitir el incremento de ste; lo cual adems se puede determinar mediante densidad ptica con la ayuda de un espectrofotmetro, as tambin mediante el peso seco de la biomasa, en los cuales los valores tanto de las absorbancias como de los pesos deben de ser crecientes.

OBJETIVOS:
1. Elaborar curva de calibrado de DNS. 2. Elaborar curva de calibrado para protenas mediante el mtodo de Lowry.

MARCO TEORICO: Curva de calibrado La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito. Las curvas de calibracin suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal sobre la que se realiza un test estadstico de regresin para evaluar su fiabilidad. Mtodo del DNS Consiste en la reaccin generada por el extremo reductor del azcar frente el cido 3,5dinitrosalcilico y su conversin en acido 3-amino-5-nitrosalicilico y cido D-glucnico. Esta reaccin genera que el color amarillo del 3,5-dinitrosalicilico se convierta en color rojo ladrillo. Para seguir el protocolo descrito por Miller se debe conocer la composicin de DNS que est dada por fenol, bisulfito de sodio, hidrxido de sodio, sal de Rochelle y cido 3,5-dinitrosalicilico. Para generar la reaccin es necesario que la mezcla entre el reactivo y el azcar reductor se lleve a cabo mediante el calentamiento de la muestra en un choque trmico durante en el cual se procede 5 minutos en un recipiente con agua

hirviendo para permitir la apertura de la molcula en forma de anillo y dejar el extremo reductor expuesto para la reaccin. Luego se establece el choque trmico sumergiendo la muestra durante 5 minutos en hielo para detener tal reaccin y finalmente es ledo por medio de espectrofotometra a 540nm. Mtodo de Bradford para determinacin de protenas Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

MATERIALES Y MTODOS

Elaboracin de curva de calibrado para glucosa: Mtodo de DNS 1. Se aade 1 mL de reactivo DNS a cada tubo de ensayo que contiene 1 mL de muestra a analizar. 2. Mantener la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos, luego enfriar con agua helada por un tiempo de 3 minutos. 3. Aadir 5 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo, dejar reposar por 15 minutos, pasados estos, agitar hasta homogenizar la solucin obtenida. 4. Leer las muestras a una longitud de onda de 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. Determinacion de protenas por el mtodo de Lowry: 1 Colocar la muestra problema 0,05 mL, 0.95 mL de agua destilada y 0.5 mL reactivo de Lowry. 2 3 Agitar energticamente y dejar 15 minutos. Agregar 5 mL de reactivo de Folin, agitar energticamente y dejar 30 min en reposo. 4 Leer la absorbancia a 500 nm.

RESULTADOS: A. Llenar la siguiente tabla para azucares reductores por DNS Tubo Solucion estndar de glucosa Agua destilada mL (0.1 g en 50 mL) en mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.2 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1 0.9 0.8 0.7 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Concentracion g/L Blanco 0.2 0.4 0.6 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2 Absorbancia nm 0.018 0.115 0.152 0.317 0.446 0.588 0.737 0.771 0.887 1.027 540

y = 1,9442x + 0,0446 R = 0,9901 1.2 Absorbancia a 540 nm 1 0.8 0,737 0.6 0.4 0.2 0 0 0.018 0.5 1 1.5 2 2.5 Concentracin de glucosa en g/L 0,317 0,446 0,887 1,027

Grfica 1. Curva de calibrado de la concentracin de la glucosa mediante el mtodo de DNS.

B. Llenar la siguiente tabla para determinacin de protena Lowry: Tubo Solucion estndar de Agua destilada Concentracion (mg/mL) Absorbancia (500 nm)

seroalbumina (1 mg/ml) en (mL) mL 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2

Blanco 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8

0.0052 0.008 0.015 0.025 0.028 0.045

0.045

DISCUSION: Hartree (1972), las lecturas de absorbancia obtenidas en la elaboracin de la curva de

calibrado para determinacin de glucosa, se dieron de manera decreciente y de forma proporcional al contenido de glucosa en las muestras utilizadas, lo cual es validado con la grfica y el coeficiente de correlacin lineal obtenido, R = 0.9901, lo cual nos indica que el comportamiento de los puntos, relacin entre la concentracin de glucosa en las soluciones y la absorbancia tienen un comportamiento lineal, mejor dicho que a mayor concentracin de glucosa en las soluciones se obtendr mayor absorbancia.

CONCLUSION: Lo obtenido es adecuado y confiable para realizar la curva de calibrado para determinar las concentraciones de glucosa en otras soluciones, debido al coeficiente de correlacin lineal obtenido, R = 0.9969.

BIBLIOGRAFIA:

1. Alarcn Elas; A. 2010. Produccin de etanol por zymomonas mobilis. Mxico distrito federal; Mxico. Tesis de maestra. 2. Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 3. Buitrago Estrada Johana Carlina, Tenjo Camacho Dolly Giselle, 2007. Obtencion de un sustrato Fermentable de origen vegetal y su evaluacin con clulas libres de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de Grado para optar el titulo de microbilogo Industrial.