Mtodo cromognico para la identificacin y/o recuento de Enterococcus por la Tcnica de Filtracin por Membrana con el empleo del

medio m-CromoCen ENT

BioCen, cdigo 4451

El mtodo incluye una fase de identificacin y enumeracin presuntiva con el empleo del medio cromognico m-CromoCen ENT para la deteccin y enumeracin de Enterococcus en muestras de aguas. Garantiza los resultados en 18-24 h y requiere la confirmacin adicional con la prueba rpida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) y/o la prueba rpida de LAP (Leucina aminopeptidasa). Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este mtodo: Todos los tipos de aguas donde se sospeche la presencia de Enterococcus. Resumen de la aplicacin El medio basa su funcionamiento en la reaccin cromognica del sustrato 6-cloro-3-indolil-beta-Dglucopiransido (ROSA-GLU) para la deteccin de actividad glucosidasa presente en el gnero Enterococcus, permitiendo un procedimiento sencillo en el que la presencia de Enterococcus se identifica por la aparicin de colonias de color rosado claro a oscuro. En la fase confirmativa, se comprueba la presencia de Enterococcus con la prueba rpida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) y/o la prueba rpida de LAP (Leucina aminopeptidasa). La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-negativos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de los microorganismos de inters. Procedimiento El esquema general para el mtodo se presenta en el Esquema A. La recogida y preparacin de las muestras se ejecuta segn los procedimientos establecidos para la toma, transportacin y recepcin. Las muestras no deben sufrir daos o cambios en su composicin y estado. Deben transportarse en refrigeracin o en contenedores con hielo para mantener la temperatura de 1 a 4 C. En el momento de su colecta, aquellas que contienen cloro residual, deben tratarse con 1 mL de solucin al 10 % de tiosulfato de sodio por litro de muestra. Analice las muestras en el laboratorio lo antes posible. Ensaye el agua potable antes de las 30 h posteriores a su recoleccin y el agua bruta antes de las 6 h. Seleccin del tamao de la muestra Determine el tamao de la muestra teniendo en cuenta la densidad microbiana esperada. Para analizar aguas potables, limite el tamao de la muestra slo por el contenido de slidos en suspensin (turbiedad) o por el crecimiento de los microorganismos en su conjunto en el medio. Para propsitos regulatorios, el tamao oficial de la muestra es 100 mL. Un volumen ptimo de muestras debe proporcionar entre 20 y 80 colonias de Enterococcus por placa, aunque se logran mejores resultados al obtener de 20 a 60 colonias por placa y no ms de 200 UFC/placa en la superficie de la membrana filtrante. Analice el agua potable filtrando entre 1 y 100 mL, filtre volmenes ms pequeos tales como duplicados de 50 mL o porciones de cuatro rplicas de 25 mL. Analice otros tipos de aguas con mayor densidad microbiana esperada o de mayor turbiedad filtrando hasta tres volmenes diferentes (diluidos o no diluidos). Si el volumen de muestra a filtrar, es menor de 10 mL (diluida o no diluida), previo a la filtracin, aada aproximadamente 10 mL de agua para dilucin estril al embudo, o tome con una pipeta el volumen de muestra y traspselo a un frasco para diluciones estril y filtre posteriormente la dilucin completa. Dilucin de la muestra En caso de muestras en que se sospeche un alto nivel de contaminacin, prepare el agua para diluciones tamponada. Seleccione la dilucin a preparar de forma tal que el nmero total de UFC de microorganismos diana a obtener en la placa se encuentre entre 20 y 60. No mantenga las diluciones preparadas por un perodo mayor de 30 min a temperatura ambiente, para evitar la multiplicacin o muerte de los microorganismos. Volmenes de muestras recomendados a filtrar en dependencia de la fuente de agua. Para consumo humano directo o indirecto: Agua para consumo humano: 100 mL Agua de pozos, manantiales, lagos, presas y reservorios: 10-100 mL Puntos de entrada al procesamiento de agua: 0,1-10 mL Agua de ro: 0,001-1 mL Aguas recreacionales: Aguas residuales: Piscinas: 100 mL Cloradas: 0,01-1 mL Playas: 0,1-10 mL Sin clorar:0,0001-0,1 mL Procedimiento de cultivo en placas Prepare el medio m-CromoCen ENT de ser necesario. Si las placas estn preparadas con antelacin y refrigeradas, permita que stas alcancen la temperatura ambiente. Si la superficie del medio est hmeda seque las placas en la incubadora durante 30 min a 40 C. Rotule las placas adecuadamente. Utilizando la pinza flameada, coloque la membrana filtrante con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre la base

Aplicacin en muestras de aguas

porosa del filtro. Una el filtro con la base con la ayuda del cierre, teniendo en cuenta no daar la membrana. Coloque aproximadamente un volumen de 20 mL de agua para diluciones estril y fltrela previamente. Agite vigorosamente la muestra unas 25 veces y tome posteriormente en un contenedor estril el volumen de la muestra de agua y fltrela conectando la bomba de vaco. Realice otro enjuague de aproximadamente 20 mL de agua para diluciones. Al terminar estos pasos, abra la unidad de filtracin y retire la membrana filtrante con ayuda de la pinza flameada. Coloque esta membrana sobre la superficie del medio m-CromoCen ENT teniendo especial cuidado en que no queden burbujas de aire entre la membrana y el medio. Realice los enjuagues del filtro con agua para diluciones tamponada estril, antes y despus de procesar cada una de las muestras. Coloque las placas en la incubadora a temperatura de 35 2 C en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Incube por un perodo de 18 a 24 h. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar la presencia de colonias tpicas de Enterococcus o para su enumeracin. Interpretacin El crecimiento tpico de Enterococcus en el medio m-CromoCen ENT son colonias de color rosado claro a oscuro. Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias Gram-positivas. Los microorganismos Gram-negativos resultan inhibidos en el medio. Ventajas Identificacin directa. El uso de los medios de cultivo cromognicos y/o fluorognicos en los laboratorios de microbiologa dedicados al control de calidad de las aguas, introduce cambios en los criterios de identificacin de las muestras (son identificados directamente). Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos. Ms rpido. La identificacin y/o recuento de Enterococcus se realiza en un perodo mximo de 28 h. La deteccin directa de la actividad enzimtica en el medio eleva la exactitud del anlisis. Esto permite la identificacin directa (o con un mnimo de pruebas adicionales), cuyos resultados no presentan diferencia con la identificacin realizada por bioqumica tradicional.

convencionales destinados al mismo propsito para los microorganismos de inters.

Ms fcil de utilizar. Disminucin de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras. Ms preciso. Su Sensibilidad y Especificidad diagnsticas son superiores a las de los medios Ms confiable. La presencia de colonias coloreadas no permiten confusin.

Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos 1. Medio m-CromoCen ENT Composicin: Bases nutritivas-8,0 g; Mezcla cromognica-0,1 g; Acetato de talio- 0,476 g, Xilosa-10,0 g, Fosfato dipotsico-5,0 g, Dihidrgeno fosfato de potasio-1,5 g; Prpura de bromocresol-0,01 g, Agar13,0 g. 1.1 Preparacin del medio: De acuerdo a la cantidad deseada, pesar el polvo en proporcin de 38,06 g/L de agua destilada o desionizada. Ajustar el pH, de ser necesario, el cual despus de esterilizar deber encontrase en pH 7,0 0,2. Hervir hasta disolucin completa. Esterilizar en autoclave a 115 C durante 10 min. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE A TEMPERATURAS MAYORES DE 115 C. 1.2 Preparacin de las placas del Medio m-CromoCen ENT: Transfiera inmediatamente a un bao con temperatura de 44 a 47 C. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en posicin invertida en el horno a temperatura entre 35-55 C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio est seca. 2. Prueba Rpida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) 2.1 Composicin del Medio de cultivo basal para la prueba rpida PYR (Caldo Todd-Hewit): Infusin cerebro corazn-10,0 g; Peptona-20,0 g; Dextrosa-2,0 g; Cloruro de sodio-2,0 g; Fosfato de sodio-0,4 g; Carbonato de sodio-2,5 g; agua desionizada o destilada-900 mL. Composicin del suplemento: L-pirrolidonil--naftilamida-0,01 g; agua desionizada-100 mL. Composicin del Reactivo revelador: p-dimetilaminocinaldehdo-0,01 g; agua desionizada-100 mL. 2.2 Preparacin: Disolver todos los ingredientes del medio basal en 900 mL de agua desionizada. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. Enfriar hasta temperatura ambiente y aadir 100 mL del suplemento esterilizado por filtracin. Dispensar 0,2 mL de medio en tubos estriles. El medio debe tener el pH 7,8 0,2: debe ser de color amarillo y estar transparente. 2.3 Procedimiento: Con un asa estril pique una colonia de inters e inocule el Caldo PYR, incube a 35 C durante 4 h. Posteriormente, adicione una gota del reactivo revelador p-dimetilaminocincaldehdo y espere 1 min para leer la reaccin. La aparicin de un color rojo intenso tras la adicin del reactivo
2

revelador indica una prueba positiva. Si aparece un color amarillo o anaranjado, la prueba se considera negativa.
3. Prueba rpida de LAP (Leucina aminopeptidasa) Composicin: leucina--naftilamida-0,01 g; solucin salina-100 mL. 3.1 Preparacin: Aadir 0,01 g del sustrato leucina--naftilamida a 100 mL de solucin salina, esterilizar por filtracin y distribuir cantidades de 2 mL en tubos de ensayo estriles. Proteger de la luz.

3.2 Procedimiento: Prepare una suspensin densa a partir de un cultivo puro en solucin fisiolgica estril y e inocule los tubos que contienen el sustrato disuelto en solucin salina. Incube a 35-37 C durante 30 min, en aerobiosis. Adicione una gota del reactivo revelador N,N-dimetilaminocincaldehdo y deje a temperatura ambiente hasta 5 minutos. La prueba se realizar de forma alternativa si posee los discos LAP, adicionando los discos al tubo que contiene el sustrato disuelto en solucin salina. Interpretacin: -LAP Positivo: Disco y/o solucin de color rosado a rojo. -LAP Negativo: Disco y/o solucin de color amarillo o incoloro. Algunas cepas de Enterococcus, particularmente E. avium y E. raffinosus, pueden no producir LAPasa. 4. Agua para diluciones tamponada. 4.1 Solucin stock de buffer de fosfato Composicin: Dihidrgenofosfato de potasio (KH2PO4)- 34,0 g; Agua destilada-500 mL. 4.1.1 Preparacin Ajuste el pH de la solucin a 7,2 con el NaOH 1N y complete el volumen a 1000 mL con agua destilada. Esterilice en autoclave a 121C durante 15 min. 4.2 Solucin stock de MgCl2 Composicin: MgCl2 anhidro-38 g (o 81,1 g del hexahidratado); Agua destilada-1000 mL. 4.2.1 Preparacin Pesar la cantidad deseada y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Almacene en refrigeracin ambas soluciones stock despus de la esterilizacin y maniplelas aspticamente. Solucin de trabajo final (pH 7,0 0,2): Aada 1,25 mL de la solucin stock de buffer fosfato y 5 mL de la solucin stock de MgCl2 para cada litro de agua destilada preparada. Mezcle bien, dispense en contenedores apropiados (frascos graduados o frascos de Erlenmeyer para el enjuague del filtro) y esterilice en el autoclave. Almacenamiento del medio m-CromoCen ENT Mantener el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura de 2 a 8 C, protegidas de la luz. Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu Diagrama A. Diagrama de flujo para la determinacin de Enterococcus en muestras de aguas. Muestra de agua Tomar en un contenedor estril muestras con el volumen a filtrar Enjuagar del filtro con el agua para diluciones tamponada estril (20 mL) Filtrar el volumen de la muestra Realizar el enjuague posterior (20 mL) Colocar la membrana filtrante en el medio m-CromoCen ENT Incubar las placas a 35 2 C durante 18-24 horas Identificar las colonias de Enterococcus (colonias de pequeo tamao (0,5-1 mm de ), de color rosado claro a oscuro) Ejecutar, de ser necesaria, la confirmacin de las colonias sospechosas de Enterococcus con la prueba PYR y/o la prueba LAP
3