UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA

PURIFICACIN DE cc-AMILASA DE

Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

MEMORIA
Que para optar al Grado de Doctor en Ciencias Qumicas PRESENTA
2

LUIS FERNANDO BAUTISTA SANTA CRUZ Madrid, 1997

34 mi fFamifia

yafEva.

Tu este proceso afaptativo nadh es intiL lbs primeros groseros errores, as como l4sjakas rutas por orn/e la imaginacin se aventura, son necesarios, pues acaban por conucirnos al ziertailero camino, y entran, por tanto, en el xjto flng como entran en elacabao cuauro elartista lbsprimeros informes bocetos. la conquista e la nueva verd4constituye, sin d?sputa, 14 Ventura ms gratule a que puele aspirar elzombre. Los halagos e la vaniad las efrsiones el instinto, lbs caricias e la fortuna, paUteren ante elsoberanoplacer e sentir cmo brotan y recen las alas el espritu y cmo, alcomps el esfrerzo, superamos la ficultay ominamos y renufinws a la esquita naturaleza. Santiago L&amny Cajal, Los tnicos e la voluntadYlS9S).

El presente trabajo de investigacin se ha desarrollado en los laboratorios de Fisicoqumica de los Procesos Industriales del Departamento de Ingeniera Qumica de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la direccin de los Profesores Titulares J05 Aracil Mira y Mercedes Martnez Rodrguez.

AGRADECIMIENTOS El trabajo de investigacin que se expone en esta memoria se ha realizado a lo largo de los ltimos cuatro aos, aproximadamente. En el desarrollo de un trabajo de este tipo, muchas son las personas o instituciones que, de una forma u otra, se encuentran relacionadas con el mismo. Las aportaciones o influencias procedentes de cada una de ellas han servido para enriquecer y mejorar el resultado final del trabajo. Por ello, deseara expresar mi agradecimiento a las siguientes personas e instituciones:
-

A Pepe Aracil y a Mercedes Martnez porque desde que comenc a trabajar bajo su direccin, all por el curso 1989/90 (con un parntesis intermedio de tres aos), me han transmitido su experiencia y conocimientos en las materias en las que he trabajado. De ellos siempre he recibido ayuda y apoyo, tanto personal como profesional y confiaron en m para desarrollar el proyecto de investigacin que ahora concluye y que se ha convertido en la presente tesis doctoral.

A Roberto Soriano, por su ayuda y colaboracin en el trabajo diario del laboratorio y porque juntos empezamos a estudiar la adsorcin de wamilasa y juntos hemos comenzado a comprender y descubrir las peculiaridades experimentales y tericas que esconden los procesos cromatogrficos.

A Juanfran Escobedo. porque su punto de vista y consejos bioqumicos me han facilitado, en muchas ocasiones, el trabajo con las enzimas. Adems, su compaa y presencia en el laboratorio nos ha alegrado a todos muchas largas tardes de trabajo.

A Marimar Abad y M~ ngeles Fernndez, porque afrontaron problemas experimentales cuya resolucin he adoptado, habindome sido de gran utilidad en el desarrollo del presente trabajo.

A los compaeros y compaeras del laboratorio, Daniel Garca, Rafael Garca, Toms Garca y Almudena Cotern, con quien he compartido estos aos de tesis y a Geinma Vicente, Ana Renedo, Rocio Delgado, Joaqun Aguilar y Bea, que se unieron posteriormente al grupo, porque siempre han estado dispuestos a ayudar en lo que hiciera falta.

A mi hermano Jos Manuel, por compartir connigo parte de sus conocimientos acerca de las enzimas, permitindome comprenderlas un poco mejor, y por la ayuda prestada por l y su Mac para bucear por Internet y encontrar la informacin que buscaba.

A Flix, Mariajo y Amalia, del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular IV, por la ayuda prestada con la electroforesis de las muestras de a-amilasa.

Al Prof. Amador Haro por permitirme utilizar la cmara fra y algunos equipos del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular 1. Asimismo deseo expresar mi agradecimiento a Jos Luis, por su ayuda y consejos en el manejo de dichos equipos para la cristalizacin de la enzima.

A mi familia, que siempre ha estado presente y a quien debo mi educacin, que me ha apoyado para realizar los estudios que deseaba y seguir el camino que he ido trazando a lo largo de mi vida.

A mis amigos, que siempre lo han hecho, y a todos aquellos que en algdn momento me han animado y se han interesado por mi trabajo, porque aunque no se lo haya dicho, siempre lo he aaradecido y me ha servido de ayuda. A Eva Atanes, porque ha visto crecer este trabajo desde su inicio, lo ha vivido y compartido con casi tanta intensidad como yo mismo. Porque su presencia a mi lado ha sido el apoyo que nunca me ha faltado y que me ha permitido llegar hasta aqu.

Tambin quiero expresar mi sincero agradecimiento por la financiacin recibida de la Unin Europea (Proyecto BE-8 138, Programa Brite EuRam IT), DGICYT (Proyecto B1094-1508CE) y Comunidad Autnoma de Madrid (Proyecto AE00265/94), sin la que no hubiera sido posible la realizacin de este trabajo.

Ciudad Universitaria, Madrid, septiembre de 1997.

PURIFICACIN DE X-AMWA5A DE Aspergillus oyzae POR ADSORCION

NDICE

1. INTRODUCCIN 1.1.- a-AMILASA 1.1.1.- Estructura y actividad cataltica 1.1.2.- Produccin 1.1.3.- Propiedades fisicoqumicas 1.1.4.-Aplicaciones
Procesado del almidn Produccin de etanol Produccin de cerveza Produccin de jarabes azucarados y edulcorantes Panificacin

4
5

10 14 18 19
21
21

22 22

ji Produccin de azcar Detergentes Industria textil Produccin de acetona y butanol Produccin de cido lctico Biomasa microbiana 1.1.5.- Mtodos de purificacin 1.2.- PURIFICACIN DE PROTENAS .2.1.- Etapas primarias 1.2.2.- Etapas de purificacin de alto valor aftadido Interaccin hidrofbica Intercambio lnico 1.3.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 1.4.- BIBLIOGRAFA 2. TRANSFERENCIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO QUMICO EN LOS PROCESOS DE ADSORCIN 2.1.- INTRODUCCIN 2.2.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIA 2.2.1.- Transferenciade materia en la capa limite externa 2.2.2.- Transferenciade materia en el interior de los poros Difusin molecular Djfiusividad de Knudsen Dusividad en macrnporos Dijhsividad superficial 2.2.3.- Acoplamiento de mecanismos difusionales 2.2.4.- Velocidad dc adsorcin 2.3.- EQUILIBRIO DE ADSORCIN. ISOTERMAS

INDICE

23 23 23 24 24 24 24 25 26 27

29
35 40 41

53 53 54 54 55 55 56 56 57 58 59
60

PURIFICAcIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCION

iii 60
62

2.3.1.- Introduccin
2.3.2.- Isoterma lineal 2.3.3.- Isoterma no lineal Isoterma de Lan gmuir Isoterma de Freundlich Otras isotermas

62 62
63 63

2.4.- BIBLIOGRAFIA 3. MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN

3 1.-INTRODUCCIN 3.2.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO. ANALISIS DE MOMENTOS

64 67
67 69

3.2.1.- Introduccin 3.2.2.- Modelo 3.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 33.1.-Introduccin 3.32.- Modelo
Establecimiento de hiptesis Balance de materia en tajase lquida Balance de materia en una seccin radial de la partcula Condiciones de contorno e iniciales

69 69 74 74 76
76

77
77

78 78 78 79
80 80 81
81 82

3.4.- ADSORCION EN LECHO FIJO 3.4.1.-Introduccin 3.4.2.- Modelo

Establecimiento de hiptesis Balance de materia en una partcula Balance de materia en la columna Condiciones ce contorno Condiciones iniciales

Iv

INDICE

3.5.- BIBLIOGRAFA 4. CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLISIS 4.1.- CARACTERIZACIN DEL ADSORBATO 4.1. 1.- Determinacin de la cantidad de protena total Mtodo de absorbancia en ultravioleta Mtodo de Bradford

82

89
89 90 91
91

4.1.2.- Cristalizacin de u-amilasa 4.1.3.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

4.1.4.- Espectroscopia de absorcin ultravioleta 4.2.- CARACTERIZACIN DE LOS ADSORBENTES 4.2.1.- Adsorcin en fase gaseosa Area superficial (rea BET) Distribucin de tamao de poro 4.2.2.- Porosimetra de mercurio Distribucin de tamao de poro rea si perficial 4.2.3.- Absorcin de lquido 4.2.4.- Distribucin del tamao de partcula por dispersin de luz 4.3.- METODOS DE ANLISIS 4.3.1.- Absorbancia en ultravioleta 4.3.2.- Actividad de a-amilasa 4.4.- RESULTADOS Y DISCUSIN 4.4.1< Caracterizacin del adsorbato Cantidad de protena Espectroscopa ultravioleta Electro/oresis en gel de poliacrilamida 4.4.2.- Caracterizacin de los adsorbentes

92 92 94 94 95
96

96 97 97

98
99 99 100 101 101 102 102 102
103

105 106

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus or

zae POR ADSoRCIoN

Adsorcin en fase gaseosa Porosimetra de mercurio Absorcin de lquido Tamao de partcula por dispersin de luz 4.5.- BIBLIOGRAFIA 5. EXPERIMENTAL 5.1.- PREPARACIN DE LOS ADSORBENTES 5.2.- CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) 5.2.1. Materiales 5.2.2.- Equipo experimental 5.2.3.- Relleno y preparacin de las columnas de HPLC 5.2.4.- Desarrollo de un experimento 5.2.5.- Experimentos previos Adsorbentes
pH

106 107
109

109 110 113 113 114 115 115 116 117 117 118 118 118 119 119 120 120 120 120 121 122 123 123 123

Fuerza inica Coticen tracin de adsorbaro Tamao de partcula Caudal Temperatura Volumen de inyeccin Reversibilidad 5.2.6.- Condiciones de operacin 5.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 5.3.1.- Materiales 5.3.2.- Equipo experimental Sistema de adsorcin

vi

INDICE

Sistema termosttico Sistema de agitacin Sistema de recirculacin Espectrofotmerro ultravioleta Medidor de pH 5.3.3.- Desarrollo de un experimento 5.3.4.- Experimentos previos pHyfuerza inica Velocidad de agitacin Concentracin inicial Tamao de pan(cula Volumen de disolucin Masa de adsorbente
5.3.5.- Condiciones de operacin

123 123 124 124 124 125 125 126 126 126 127 127 127 127 28 129 129 129 130 130
30

54.- ADSORCIN EN LECHO RIO 5.4.1.- Materiales 5.4.1- Equipo experimental Mdulo de elucin Columna Mdulo de anlisis Mdulo de pH Colector de fracciones Mdulo de control 5.4.3.- Desarrollode un experimento 5.4.4.- Experimentos previos

130 131 131 132 32 133

Caudal
Concentracin inicial

PURIFICACIN DE (Y-AMLLASA DE Aspergillus wyzae POR AD5ORCIoN

vii

Tamao de partcula Dimensiones del lecho Temperatura 5.4.5.- Condiciones de operacin 5.5.- BIBLIOGRAFA 6. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

133

133
133 134 134 137

6.1.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO 6.1.1.- Planificacin de experimentos 6.1.2.- Intluencia de las variables de operacin
Clculo de la porosidad de la columna Hidrofobicidad de la resma Duolite XAD-761 Carga caracter~sica de la a-amilasa en la resma Duolite A-S68 Influencia de las variables

137 137 139

140
141

143
144

6.1.3.- Anlisis de momentos

Datos termodinmicos Datos cinticos
~

147 de equilibrio 147 155 157 157 160 168

6.2.- ISOTERMAS DE ADSORCIN

6.2.1.-Resultados experimentales 6.2.2.- Ajuste de los resultados a modelos de isotermas 6.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO

6.3.1.-Planificacin de experimentos
6.3.2.- Resultados 6.4.- ADSORCIN EN LECHO FIJO 6.4.1< Planificacin de experimentos 6.4.2< Resultados experimentales Efcto del caudal Efecto de la concentracin

168
169 174 174 176 178 180

vn

INDICE

Efecto de la temperatura Efecto del tamao de partcula Efecto de la altura de lecho 6.4.3< Estabilidad y reutilizacin de la columna 6.5< HIBLIOGRAFIA

181
i 83

185 186 188 191 191 195 199

7. MODELADO MATEMTICO
7.1< ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 7.2< ADSORCION EN LECHO FIJO 7.3< BIBLIOGRAFA

8. ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO

FIJO 8.1< ESCALADO DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO 8.2< SIMULACIN TERICA DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO 8.3< PREDICCIN TERICA DEL CAMBIO DE ESCALA 8.4< BIBLIOGRAFIA 9. RESUMEN, CONCLUSIONES Y FUTUROS TRABAJOS ANEXO A. RESOLUCIN NUMRICA DE LOS MODELOS DE ADSORCIN A.< ANALISIS DE MOMENTOS A.2< MODELO DE ADSORCION EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO A.3< MODELO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO A.4< BIBLIOGRAFIA 201 201 204 214 216 217 221 221 222 223 225

ANEXO 13. AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLISIS ESTADSTICO ANEXO C. FIGURAS C. 1< EXPERIMENTOS DE ADSORCIN EN TANQUE AGITADO
C2< EXPERIMENTOS DE ADSORCIN EN LECHO FIJO C.3< MODELADO DE LA ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO 227 237 237 242 246

PURIHCACIdN DE QL-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADsoRcIoN

ix

C.4< MODELADO DE LA ADSORCINEN LECHO FIJO NOMENCLATURA

255
265

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

ozyzae POR Afl5ORCIN

1. INTRODUCCIN
El espectacular avance que han experimentado la ingeniera gentica y la ingeniera bioqumica en las dos ltimas dcadas ha permitido el desarrollo y la aparicin de un gran nmero de productos y procesos biotecnolgicos de nueva creacin as como la sustitucin de otros, que se realizan en la actualidad por procesos convencionales. Esta situacin de rpido crecimiento contina en la actualidad gracias, en parte, al sinergismo producido por el acoplamiento de las diferentes disciplinas de la ciencia, bsica y aplicada, y la tcnica que se van sumando al desarrollo de la biotecnologa. Esta parte de la ciencia se est desarrollando en base a tres panes ltndamentales: la produccin, el control de bioprocesos y la recuperacin y purificacin del producto final. A cada una de ellas, que est en proceso de evolucin y ramificacin, se le estdn aadiendo nuevas disciplinas de la ciencia y la tcnica y otras ya establecidas que se han adaptado a las caractersticas particulares de

los procesos y los productos biotecnolgicos. La separacin y purificacin a escala industrial de una protena procedente de un caldo de
fermentacin es una etapa bsica en la biotecnologa de procesos actual, ya que, en general, representa el mayor coste de produccin. La viabilidad econmica y la competitividad de un proceso

INTRODUCCIN

biotecnolgico depende no solo de las innovaciones llevadas a cabo en la produccin gracias al avance de la biologa molecular, inmunologa. microbiologa, etc., sino tambin de la innovacin y optimacin de los procesos de purificacin (Wbeelwright, 1987). En algunos procesos

bioteenolgicos, las etapas de separacin y purificacin pueden llegar a suponer entre un 50 y un 80% de los costes de operacin. El diseo de bioprocesos, econmicamente rentables, a escala industrial para la purificacin de protenas supone la obtencin de rendimientos elevados, altos niveles de pureza y ininimizacin de costes, para lo cual es necesario realizar las siguientes acciones (Asenjo, 1990): (a) definicin de las especificaciones del producto final, (b) caracterizacin de las propiedades fisicoqumicas de la mezcla y (c) definicin de las etapas de purificacin y de las restricciones del sistema. La definicin del producto final supone el conocimiento previo de la aplicacin a la que se va a destinar. En esta etapa es necesario establecer la pureza y concentracin requerida de la protena que se va a obtener, as como los niveles permitidos para cada una de las impurezas que lo acompaan. Las especificaciones comerciales de pureza para las protenas utilizadas en medicina suelen ser mucho ms estrictas que las correspondientes a las protenas industriales. Esta situacin se hace especialmente crtica en el caso de la produccin de vacunas, de las que es imprescindible eliminar trazas de determinadas impurezas a fin de evitar posibles reacciones inmunognicas indeseadas. El conocimiento de las propiedades fisicoqumicas del caldo de fermentacin y de los componentes que lo integran es ttndamental para el diseo del proceso de purificacin. Es necesario determinar la cantidad y tipo de impurezas presentes, concentracin del producto, lugar de localizacin (citoplasmtica, periplsmica, extracelular, cuernos de inclusin), caractersticas tisicoquimicas (punto isoelctrico, masa molecular, carga, hidrofobicidad

) y estabilidad del mismo.

Este ltimo aspecto puede influir y determinar el tipo de operacin unitaria adecuada para la purificacin o discriminar las que no son viables para el mantenimiento de la actividad cataltica propia de la protena que se persigue purificar. Una vez realizadas las dos primeras etapas (a) y (b), es necesario definir las operaciones de separacin que se incluirn en el proceso. Como primera aproximacin se pueden aplicar una serie de reglas heursticas para la seleccin de estas etapas (Wheelwright, 1987: Asenjo y Patrick, 1990): (1) Seleccionar etapas de separacin que se basen en diferentes propiedades fsicas. qumicas o bioqumicas. Un proceso de purificacin suele ser ms efectivo si cada una de las etapas que lo forman se basa en una propiedad diferente de los componentes que se desean separar Por ejemplo, una operacin de ultrafiltracin seguida de cromatografa de intercambio inico o de afinidad.

PURIFICACIN DE a-AMILAs.xDEAspergillus oryzae POR ADSORCIN

(u) Elegir procesos de purificacin que maximicen las diferencias entre las propiedades
del producto y las impurezas.

Es conveniente conocer las propiedades fisicoqumicas de los componentes de la

mezcla con objeto de establecer en cual de ellos difieren ms el producto y el resto de

sustancias no deseadas que lo acompaan. (iii) Separar las principales impurezas lo antes posible.
Esto generaimente supone una reduccin de la cantidad total de material que se va a

procesar, elevando la concentracin del producto. Esta situacin implica varias ventajas de forma conjunta; en primer lugar la reduccin de la corriente que se alimente a las posteriores etapas disminuye el tiempo de procesado as como los costes de operacin asociados a las mismas; en segundo lugar, en el proceso de eliminacin de la impureza mayoritaria se suelen eliminar tambin otras con propiedades similares. (iv) Realizar la etapa ms cara o compleja al final. A lo largo de un proceso de purificacin, el volumen o la masa de material para procesar disminuye a medida que se desarrolla cada una de las etapas que lo componen. Los costes de produccin aumentan proporcionalmente a la cantidad procesada por lo que es aconsejable utilizar operaciones de alto coste, como la cromatografa de atiidad, cuando esta cantidad es lo menor posible. Desde el punto de vista tcnico, hay operaciones de separacin ms adecuadas para tratar los elevados volmenes que existen al inicio del proceso. (vi) Utilizar una etapa de alta resolucin lo antes posible.
Esta regla implica el diseo de procesos de purificacin con el menor nmero de etapas posible y, por tanto, una importante reduccin de costes. Por ejemplo, en un proceso constituido por diez etapas en serie, en la que cada una de ellas tenga un rendimiento del 90%, el rendimiento final en el producto de inters ser menor del 35% (como muestra la figura 1.1). Dentro de las etapas de alta resolucin destacan, por su versatilidad y facilidad de escalado, las tcnicas cromatogrficas. Existen diversos tipos diferentes de cromatografa dependiendo del mecanismo de interaccin y retencin del adsorbato por parte de la fase estacionaria (como se describe en el apartado 1.2), como son la cromatografa de interaccin hidrofbica y en fase reversa. de intercambio inico, de afinidad, fltracin en gel, etc.

Para utilizar de una forma eficaz los mtodos de purificacin a escala industrial es necesario un profundo conocimiento del comportamiento dinmico del proceso. Una forma adecuada de expresar dicho comportamiento es mediante el uso de modelos matemticos fenomenolgicos~. Estos

INTRODIJCCIN

expresan la evolucin temporal de las variables dependientes del proceso de purificacin (concentracin de salida, pureza,
...)

en ffincin de las propiedades fisicoqumicas y condiciones de

operacin del mismo. Los modelos matemticos se proponen a partir de una serie de hiptesis basadas en la observacin experimental del sistema objeto de estudio y encuentran su utilidad en el desan-ollo (le diseo del proceso de purificacin as como en la simulacin y optimacin de sus diferentes etapas. Esto ltimo es de gran importancia debido a la considerable contribucin de las etapas de separacin-purificacin en el coste global de produccin, pudiendo alcanzar hasta el 80 % del mismo para el caso de determinadas protenas teraputicas (Kenney, 1990). La optimacin de aquellas, de la forma ms rigurosa posible, es fundamental para la rentabilizacin y viabilidad de cualquier proceso biotecnolgico integrado. loo
SO
.0

a o,
o

60 40

E 5
4>

20

o
0 1 2 3 4 5 6 7 5 9 10 II 12 Nmero de Etapas

Figura

1.1: Rendimiento obtenido en un proceso de separacinpurificacin en funcin de la eficacia de cada etapa.

1.1.- ct-AMILASA
La a-amilasa (1,4-a-D-glican glicanohidrolasa; EC 3.2.1.1) es una enzima que cataliza la hidrlisis de los enlaces ~-.4-glicosidicos del almidn, quedando como productos de reaccin poli- y oligosacridos de diferente longitud, a-dextrinas y el disacrido maltosa. La a-amilasa es una enzima presente en prcticamente todos los organismos vivos (Raimbaud el al., 1989; Vihinen y Mantsla, 1989). Se han identificado y estudiado a-amilasas desde clulas procariotas de Los gneros <Bacillus, Streptomvces, Acromonas, Escherichia, Saccharomycopsvs, Strepococcus,
...)

y encamotas (Aspergillus, Succharomyces, Mucor, Candida, Rhizopus

...).

hasta

plantas superiores (maz, trigo, cebada,

artrpodos (Drosophila) y mamferos (cerdos, ratones.

ratas, humanos), posiblemente por ser un mecanismo qumico general para la obtencin de glucosa para el metabolismo energtico de estos organismos.

PURIFICACIN DE a-AMWASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

1.1.1.- Estructura y actividad eatal<tica

La a-amilasa de Aspergillus oryzae es una metaloproteina formada por una cadena polipeptdica que consta de 478 residuos. La estructura primaria se ha determinado mediante secuenciacin directa de la cadena polipeptdica (Toda et al., 1982) y tambin por deduccin a partir de la secuencia de nucleotdica del gen que codifica para la protena (Tada et al., 1989). La molcula puede contener hasta 10 iones Ca2~, aunque slamente uno de ellos no es disociable, siendo esencial para mantener la actividad cataltica y para estabilizar la estructura tridimensional de la protena (Vallee et al., 1959).

Tabla 1.1: Aminocidos que forman la a-amilasa de A. oryzae. Composicin (AP

Amino cido
basado en la secuencia de aminocidos

Composicin (B)* Diferencia basado en la secuencia de (A-fi)

nucledtidos

Alanina Arginina Asparragina cido Asprtico Cisteina Glutamina cido glutmico Glicina Histidina Isoleucina Leucina
Lisina

37

37

o
0

lo
26 44 lo 18

lo
26
41

o
3

9
19 12

12
41 6

41
.7

o
l
-2

27 34 20
9
14

29
34 20 9 14

o o

Metionina Fenilalanina Prolina Serma Treonina Triptfano Tirosina Valina

o
o

21 37 40 9
34 29

20
36 40 10 34 30
478

o
1

o
1

Total

478

Las diferencias encontradas entre las secuencias de aminocidos obtenidas por ambos mtodos (una adicin, una supresin y diez sustituciones) no afectan a ningn residuo perteneciente al centro activo, pudiendo deberse a variacin entre las cepas utilizadas para cada uno de los estudios

Toda eta1., 1982. lada eral.,

1989.

INTRODUCCIN

(Tada eta!., 1989). La estructura secundaria y terciaria de la a-amilasa de A. oryzae se ha estudiado en profundidad mediante difraccin de rayos X (Matsuura et al., 1979; Matsuura et al., 1980; Matsuura et al., 1984; Boel el al., 1990; Swift et al., 1991). La molcula es un elipsoide cuyas dimensiones se han calculado en 80 x 45 x 35

A.

La estructura se pliega formando dos dominios principales, amino

terminal (residuos 1 al 380) y carboxilo terminal (residuos 384 al 478). El primero de ellos est constituido a su vez por dos subdominios, denominados A y B. El A (residuos 1 al 121 y 177 al 380) consta de una estructura supersecundaria de barril (a/(3)8 en la que existen ocho a-hlices rodeando a ocho lminas [3,en su mayora paralelas, que forman el barril. Este tipo de estructura se ha identificado en otros 16 tipos de protenas, todas ellas con funcin cataltica (Farber y Petsko, 1990). Asimismo, parece ser una estructura bsica en la mayora de las cz-antilasas de diferentes orgenes, incluso en aquellas con baja homologa en estructura primaria. De estudios indirectos (MacOregor y Svensson. 1989; Raimbaud et al., 1989) se desprende la conservacin de este dominio que es tambin observado en otras -amilasas cuya estructura tridimensional se ha determinado en especies tan alejadas como Aspergillus niger y cerdo (Brady et al., 1991; Qian et al., 1993).
Dominio A

Dominio

C
Dominio

Figura 1.2: Esquema de la disposicin de las estructuras de a-hlice (O) y lminas g (O) que forman los dominios A, 3 y C. Los extremos amino terminal y carboxilo terminal vienen sealados por N y C respectivamente (Fuente:

Matsuura el al., 1984). El pequeo subdomiio B (residuos 122 al 176) se localiza a partir del bucle siguiente a La tercera lmina ~ hasta la tercera a-hlice del subdominio A. Consta de tres hojas

I~

antipaxalelas, as

como de una regin de estructura ms irregular formada por bucles dc interconexin. El dominio carboxilo terminal, C, (residuos 384 al 478) pliega ocho estructuras de lmina j~

PURIFICAcIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

2TAA) y se han representado grficamente mediante el programa RasMac Molecular Graphics, Machintosh version 2.5 ( R. Sayle, 1994). La a-amilasa es una exoenzima que cataliza la escisin, al azar, de los enlaces a-D-1,4

internos de las largas cadenas de polisacridos de que se compone el almidn. El almidn, la forma principal de almacenamiento de hidratos de carbono en las plantas, es un polmero de a-D-glucosa
que existe como mezcla de dos formas: amilosa y amilopectina. La primera es un polmero prcticamente lineal en el que las subunidades de glucosa se encuentran unidas por enlace a-D-l,4, llegando a alcanzar tamaos cuya masa molecular se encuentra alrededor de 300000. La amilopectina es un poimero ramificado cuya masa molecular puede oscilar entre 1.5
3.0

lOt consistiendo en

cadenas lineales formadas por subunidades de glucosa unidas entre si por enlace a-D-l,4 y ramificaciones dc 20 a 30 subunidades unidas a la cadena lineal por enlaces a-D-1,6. El almidn procedente de los cereales consiste, aproximadamente, en un 20 - 30% de amilosa y un 80 amilopectina.
o GiuIBfi - 70%

de

Asp2fl\.< Hs 210
Ilisiz? Tr83

Lys209

VaI2

3.....
.4sp 297jt

jiij

1,74

H~s 296

-9
Arg344

G~u35

A> p

340

Figura 1.5: Representacin del modelo de unin al sustrato y catlisis de la

cz-amilasa de A. oryzae mostrando los residuos de aminocidos implicados en dicho mecanismo. Las lneas discontinuas representan posibles puentes de hidrgeno entre la enzima y el sustrato (Fuente: Matsuura et al., 1984). El modelo de unin al sustrato (Matsuura et al., 1984) supone una conformacin curvada de la amilosa en la que intervienen siete subunidades contiguas de glucosa que se acoplan al centro cataltico de la enzima mediante enlace con 19 de sus aminocidos, dos delos cuales (Asp-297 y Glu23(J) son los que intervienen directamente en la rotura de un nico enlace glcosdico que existe entre

lo

INTRODUCCIN

las subunidades de glucosa en posicia 4 y 5. La mayora, sino todas, las protenas secretadas por hongos filamentosos se encuentran

glicosiladas. En particular, la a-amiasa de A. o,zae contiene una sola cadena de oligosacrido unida a un residuo de asparragina (Asn-197). Se han propuesto diferentes estructuras (Yamagucl et al., 1971; Minobe et al., 1979) constando todas ellas de varias subunidades de manosa unidas a la
protena a travs de dos restos de N-acetil glucosamina.

Man ~Man Man Man~ Figura 1.6: Esquema de la estructura del oligosacrido de la a-amilasa de A. oryzae, donde Man y GIcNAc representan, respectivamente, subunidades de D-manosa y de N-acetilglucosamina (Minobe et al., 1979). Man

GlcNAc

GtcNAe

CD

1.1.2.- Produccin La a-amilasa procedente de A. oryzae fue la primera enzima microbiana producida a escala industrial y comercializada (Takamine, 1894). El producto obtenido se denomin Takadiastasa y su produccin se realizaba mediante cultivo en superficie (denominado semislido). Las ventajas de los cultivos sumergidos radican en la mayor facilidad de medir, controlar y modificar los factores y parmetros que influyen en el proceso (pH, temperatura, transferencia de oxgeno, composicin del substrato,
...)

(Frost y Moss, 1987).

Debido a la gran importancia econmica e industrial de los procesos de fermentacin en los

que se produce a-amilasa, hay una casi total falta de informacin acerca de las condiciones de
crecimiento y produccin de los microorganismos desarrolladas por las compaas productoras. Sin

embargo existen bastantes estudios a escala de laboratorio y planta piloto sobre la influencia de las condiciones de operacin en las que se desarrolla la fermentacin de los diversos microorganismos
productores de a-amilasa. En la actualidad el A. oryzae es el microorganismo ms ampliamente utilizado como fuente productora de a-amilasa de origen fngico. En la literatura se encuentran numerosos estudios en los que se investiga la influencia de las condiciones experimentales en el crecimiento del microorganismo y en la produccin de a-amilasa, as como de los diferentes tipos de operacin en los que se

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oyzae POR

ADSORCIN

11

desarrollan las fermentaciones.

En condiciones similares de operacin y para medios de cultivo con diferente composicin, la

produccin de a-anilasa por A. oryzae se ve favorecida en fermentaciones realizadas mediante cultivo sumergido agitado frente a aquellas desarrolladas en cultivos lquidos sin agitacin (Kundu y Das, 1970). Diferentes autores, por otra parte, obtienen menores niveles de produccin utilizando cultivos sumergidos que los alcanzados con cultivos sobre substrato slido en salvado de trigo o granos de

arroz (Meyrath y Bayer, 1980; Nakadai y Nasuno, 1988). Este ltimo tipo de fermentacin se ha usado tradicionalmente en Japn para producir el preparado enzimtico koji. Respecto a la influencia de la fuente de carbono, se ha encontrado que para cultivos de A. oryzae en operacin continua, la maltosa induce a la produccin de a-amilasa entre un 50 y un 70%
ms eficazmente que la glucosa (Carsen, 1994). Otros estudios sealan, tras la maltosa y en orden decreciente de eficacia, el a-metil-D-glicsido y el almidn como inductores de la sntesis de aamilasa (Yakubi et al., 1977). Sin embargo, el almidn produce mayores niveles de la enzima que la maltosa, dextrinas y otros azcares simples cuando se utiliza como fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo (Malik y Chaudhary, 1977). Experimentos llevados a cabo en sistemas continuos y semicontinuos (Carsen, 1994) indican que. en el caso del A. oryzae, el crecimiento celular est relacionado, casi linealmente, con la

produccin de a-amilasa. De esta forma, la actividad enzimtica producida disminuye al hacerlo la

velocidad especfica de crecimiento. Por otro lado, la operacin en continuo conduce a producciones de a-aniilasa mayores que la operacin mediante fermentaciones en semicontinuo. Junto a los estudios correspondientes a la produccin de a-amilasa por A. oryzae, existen

otros relativos a otras a-ainilasas Iiingicas. Jarniewicz y Wlodarczyk (1978) seleccionaron una cepa de A. niger y desarrollaron un medio de cultivo basado en destilados procedentes de patata
suplementado con almidn, obteniendo niveles altos de produccin de a-amilasa durante la fermentacin. Tambin se han estudiado los parmetros de escalado en fermentadores agitados y aireados para este mismo microorganismo (Ghildyal et al., 1980). El hongo comestible Calvatia

gigantea produce tambin elevadas cantidades de a-amilasa en cultivos discontinuos (Kekos y

Macris, 1983) a una temperatura de 25 0C, teniendo la enzima obtenida de este organismo caractersticas y propiedades muy similares a la procedente de A. niger. Debido a la mayor termoestabilidad que las procedentes de hongos filamentosos, las aamilasas de origen bacteriano ocupan un lugar importante en la industria, siendo ms adecuadas que aquellas para determinadas aplicaciones. El Bacillus subtilis fue la primera especie bacteriana utilizada para producir a-amilasa. El cultivo lquido en superficie, utilizado en un principio, dio paso,

12

INTRODUCCIN

postenormente, a la generalizacin del cultivo sumergido aireado de este y otros microorganismos productores de enzimas amilolticas. Las diferentes a-amilasas procedentes de distintas especies generan una amplia variedad de distribuciones de oligosac&idos como productos finales de la hidrlisis del almidn. La a-anilasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens produce maltohexosa como componente mayoritario mientras el Bacillus licheniformis da, principalmente, maltopentosa y maltosa. La glucosa es obtenida solamente como producto minoritario (Norman, 1981). Se ha observado que la fermentacin de 8. amyloliquefaciens en operacin semicontinua produce un 60% ms de actividad amiloltica que en operacin discontinua cuando se trabaja a altas concentraciones de substrato que actan como inhibidor del crecimiento o cuando se generan cepas mutantes menos eficaces durante el proceso fermentativo (Yoo et al., 1988). La seleccin de cepas mutantes de baja productividad de a-amilasa tambin se ha demostrado en fermentaciones en

continuo de 5 subtilis (Fenc y Pazarova, 1982). En el citado estudio se comprueba que el uso de
medios de cultivo en condiciones de limitacin de nutrientes se favorece la seleccin de mutantes de baja productividad. Sin embargo, cuando se cultiva en medios ms complejos y ricos en nutrientes, la produccin de enzimas extracelulares no es una desventaja y se promueve la seleccin de cepas superproductoras.

En fermentaciones sumergidas y aireadas de B. licheniformis en rgimen discontinuo se ha

demostrado que la utilizacin de glucosa como sustrato en lugar de almidn, aumenta la produccin de a-amilasa. Paralelamente, la viscosidad del caldo de cultivo se reduce y desaparece el problema de la esterilizacin del almidn, causa frecuente de contaminacin del medio durante las primeras horas del proceso (Tonkova et al., 1993). Anlogamente al comportamiento de la fermentacin de A. oryzae para producir a-amilasa, la sntesis de la enzima aumenta proporcionalmente con la velocidad especfica de crecimiento en el caso de cultivos continuos de 8. licheniformis (Frost y Moss, 1987). Mediante fermentaciones

realizadas en operacin semicontinua se alcanzan similares niveles de actividad enzimtica que

aquellos obtenidos en continuo, sin embargo, en el primer caso, la concentracin de a-amilasa en el medio es mas elevada (Pazarova eta!.. 1984). La produccin de a-amilasa se encuentra reprimida por glucosa e inducida por los fragmentos procedentes de la degradacin del almidn. En la fermentacin de II. lichen~formis. los mayores rendimientos en a-amilasa se obtienen utilizando glucgeno y maltotetraosa, mostrndose tambin eficaz con maltotriosa y maltopentosa. Sin embargo, con disacridos como la maltosa el rendimiento se reduce al 20% dcl obtenido con glucgeno, no siendo significativa la produccin de a-amilasa

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCIN

13

mediante la utilizacin de diversos monosacridos (Salto y Yamamoto, 1975). Gracias al avance de la ingeniera gentica, se han logrado desarrollar microorganismos mediante mutacin gentica y seleccin fenotpica aadido a procesos de transferencia de genes entre diferentes especies. De este modo se logran obtener altos niveles de expresin de protenas recombinantes. En general, la produccin de este tipo de protenas se encuentra promovida en condiciones de fermentacin que perjudican la velocidad de crecimiento del microorganismo, para
alcanzar relaciones ms favorables entre la protena de inters y el resto de protenas del organismo

productor. En la fermentacin del B. subtilis, al que se le ha introducido el gen que expresa dicha protena en la bacteria termfila Bacillus stearothermophilus, la sustitucin de glucosa por almidn como fuente de carbono hace disminuir la velocidad de crecimiento de las clulas recombinantes a la vez que favorece la produccin de cz-amilasa por unidad de masa celular y aumenta el perodo de tiempo en el que se est produciendo dicha enzima (Lee y Parulekar, 1993). Una estrategia adecuada para la obtencin de a-amilasa mediante este microorganismo es la de realizar una primera etapa de fermentacin en discontinuo, en la que se favorezca el crecimiento celular, seguida de una fermentacin en semicontinuo con las condiciones apropiadas para obtener mayor actividad enzimtica. De este modo, se obtienen aumentos de produccin enzimtica de hasta el 54% respecto al cultivo desarrollado en una sola etapa en discontinuo. En fermentaciones continuas llevadas a cabo con 8. suhtilis recombinante (Wei et al., 1989), se ha comprobado que la actividad especfica de aamilasa disminuye al aumentar la velocidad de dilucin as como la velocidad especfica de

crecimiento de las clulas recombinantes.

El A. oyzae se ha utilizado tambin como microorganismo husped para expresar genes que codifican para la a-amilasa correspondientes a cepas mutantes superproductoras (Christensen et al., 1988). As, se ha conseguido elevar la concentracin de a-amilasa en el sobrenadante del medio de

fermentacin desde 1.0 mg/mI, en el caso de la cepa original deA. oyzae, hasta 12.0 mg/ml en el caso
de la cepa recombinante. En la actualidad, no slo se encuentran patentados procesos de produccin en los que se utiliza a-amilasa, recombinante o no, como catalizador de determinadas reacciones qumicas sino que tambin estn sujetos a patente los procedimientos de donacin as como los vectores de expresin

utilizados para producir enzimas recombinantes (Levin y Joyet, 1986). Ms recientemente, se ha estudiado la produccin de enzimas extracelulares mediante el uso
de clulas inmovilizadas. Se ha observado que el crecimiento de clulas a partir de esporas inmovilizada de A. niger, Penicilium funiculosum y Phanerochaete chrysosporium por atrapamiento en gel de alginato clcico produce distribuciones del microorganismo mis homogneas que la

14

INTRODUCCIN

obtenida por inmovilizacin del micelio ya crecido (Linko et al., 1988). Los valores de temperatura y pH ptimos para la produccin de a-amilasa por clulas de A. niger inmovilizadas son similares a las obtenidas para la fermentacin utilizando el micelio libre, pero la estabilidad trmica de la enzima obtenida es mayor. La fermentacin de 8. subtilis inmovilizado en gel de carrageenan en bioreactores

continuos aireados aumenta la produccin de a-amilasa en un 20% respecto al cultivo en iguales condiciones con las bacterias en suspensin (Guo et al., 1990).
Tambin se han inmovilizado diversas bacterias termfilas anaerobias en gel de alginato para la produccin de a-amilasa y pululanasa mediante fermentacin en rgimen semicontinuo a 60 0C utilizando almidn como substrato (Klingeberg et al., 1990). Los niveles de produccin de a-amilasa aumentan con la inmovilizacin, hasta doce veces, en el caso del Clostridium thermosaccharolyticum y alrededor de dos veces para una cepa de C. thermohydrosulfuricum y para Thermoanaerobacter jinnii. Las fermentaciones llevadas a cabo con otra cepa mutante de C. thermohydrosulfuricum y con Clostridium thermosulfurogenes no han mejorado los resultados obtenidos mediante el cultivo de esas especies en suspensin. Sin embargo, otros autores ponen en duda la eficacia y utilidad de las fermentaciones de microorganismos inmovilizados. Se han descrito una serie de problemas relacionados con la

produccin de a-amilasa por clulas de A. amyloliquefaciens inmovilizadas en gel de alginato clcico

(Argirakos et al.. 1992). En estos estudios se han descrito rendimientos inferiores a los alcanzados en fermentaciones tradicionales de dicha bacteria para tiempos altos de operacin. Problemas de transferencia dc materia, especialmente de oxgeno, degradacin e inactivacin celular por intibicin debida a la acumulacin de material orgnico e inorgnico en el interior de las partculas as como el crecimiento en el medio lquido de las bacterias desorbidas son posibles causas de la falta de efectividad descrita.

1.1.3.- Propiedades fisicoqumicas Las propiedades fisicoqumicas de las diferentes a-amilasas varian en un amplio intervalo dependiendo del organismo productor, indicando una importante adaptacin evolutiva a las condiciones medioambientales.

El pH ptimo para la actividad de las distintas a-amilasas oscila entre, aproximadamente, 2 y 10.5. Para la mayora de las a-amilasas producidas por microorganismos de la especie Aspergillus, este intervalo se limita a 4.5
-

6.6 (Vihinen y Mntsl, 1989). Algunas procedentes de Bacillus,

fuertemente acidlilos, pueden encontrar su pH ptimo a valores alrededor dc 2 y de otros alcaltilos a valores de pH iguales o superiores a 10, aunque para la mayor parte de las a-amilasas procedentes

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

15

de bacterias el intervalo ptimo se encuentra entre 4.5 y 6.5.

loo
<5

80 60 40 20

.3;
O <u ~0

= o

pH Figura 1.7: Efecto del pH sobre la actividad de a-anilasa de A. oryzae a 37 c (Fuente: Ficha Tcnica de Fungamyl HO, Novo
Nordisk A/S,

Bagsv~rd, Dinamarca).

La temperatura de actividad ptima de la a-amilasa producida por el hongo filamentoso A.

otyzae varia entre 35 y 55 0C, en funcin de la cepa que lo produce. La actividad hidroltica de la aamilasa procedente de bacterias del gnero Bacillus es ptima, generalmente, a valores ms altos de temperatura, llegando hasta los 100 0C en algunas cepas de B. lichenWormis (Piggott et al., 1984). loo
80
<5 <5 ~0 <5 O

60 40 20

.5 o
.1<

o
0 10 20 30 T~2C) 40 50 60 70

Figura 1.8: Efecto de la temperatura sobre la actividad de aamilasa de A. oryzae a un pH de 4.7 (Fuente: Ficha Tcnica de Fungamyl HO, Novo Nordisk A/S, Bagswrrd, Dinamarca).

En general, la mayora de las a-amilasas son estables en los intervalos fisiolgicos habituales de temperatura y pH. La estabilidad de las enzimas no solo depende de las condiciones de pH y temperatura sino, tambin, de la composicin del medio en el que se encuentren. El intervalo de pH en el que las enzimas son estables, se modifica en funcin de la temperatura y el tiempo de incubacin

16

INTRODUCCIN

en unas condiciones determinadas. En general, puede hablarse de una mayor termoestabilidad de las a-amilasa procedentes de Bucillas. Algunas cepas de 8. stearothermophilus mantienen el 100% de la actividad tras una incubacin a 70 0C durante 24 horas (Manning y Campbell, 1961; Manning et al., 1961). La a-amilasa de A. oryzae es una enzima extremadamente estable en el intervalo de pH 5
- 8,

no detectndose desactivacin, de forma significativa, tras largos perodos de tiempo en estas condiciones (Carsen, 1994). En la figura 1.9 se muestra la estabilidad de la a-ainilasa en funcin del pH a dos diferentes tiempos de incubacin.
% Actividad residual
120
100 80 66 40 20

10

11

pH
Figura 1.9: Estabilidad de la a-amilasa de A. oryzae en

Funcin del pH del medio. Incubada a 30 0C durante 30 minutos (O) y durante 14 horas (A) (Fuente: Carsen ci al., 1996). En condiciones ms extremas, ~icidas y bsicas, la enzima se desactiva en gran medida en un intervalo muy estrecho de pH. Bajo incubacin a pH cido, la inactivacin de la a-amilasa de A. oryzae sigue una cintica de primer orden, cuya constante aumenta parablicamente con la disminucin de la concentracin de protones en el medio (Cansen el al., 1996). Estos mismos estudios indican que el proceso de reactivacin de a-amilasa desactivada por cido sigue tambin una cintica de primer orden, aunque la recuperacin de actividad no es, en ningn caso, total. En la figura 1.10 se muestra el proceso de reactivacin a diferentes valores de pH. Este mecanismo de inactivacin propuesto supone la existencia de dos formas inactivas de a-amilasa, una de las cuales est en equilibrio reversible con la forma original activa cuando se aumenta el pH hasta valores neutros. La otra forma corresponde a una a-amilasa irreversiblemente inactiva (Cansen. 1994).

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

% Actividad residual

oryzae POR ADSORCIN

17

i 00

80

60

40

20

50

100

iSO

200

250

tiempo (niln)
Figura 1.10: Reactivacin de a-amilasa de A. oryzae inactivada por cido a diferentes valores de pH. Tras incubacin a pH 3.5 durante 120 minutos (desactivacin), se aument a: pH 7.5 (+), pH 6.0 (0) y pH 5.0 (X), respectivamente (reactivacin) (Fuente: Cansen et al., 1996).

Respecto a la inactivacin trmica de la a-amilasa, cuando la temperatura aumenta por encima de un cierto nivel, las enzimas en disolucin acuosa sufren un desplegamiento parcial causado por la ruptura, inducida trmicamente, del equilibrio de interacciones no covalentes que mantienen la estructura nativa de la molcula (Tomazic y Klibanov, 198&b). Esta desactivacin, que supone la prdida estructural del centro activo, es completamente reversible si la temperatura se disminuye rpidamente hasta valores de estabilidad. Para tiempos de incubacin ms prolongados, el grado de recuperacin de la actividad enzimtica no es total, lo que pone de manifiesto la existencia de un

proceso irreversible de desactivacin. La causa de este proceso se debe, probablemente, a un proceso monomolecular conformacional de formacin de estructuras terciarias incorrectas acompaado, en funcin del pH, de oxidacin de los residuos de cisteina o de deandacin de los residuos que
contienen grupos amido. La termoinactivacin irreversible puede evitarse, parcialmente, por adicin de substrato (Tomazie y Klibanov, 1988b). Este proceso se ha estudiado en a-amilasa procedente de

una bacteria mestila, 8. amyloliquefaciens, y de otra termfila, 8. stearothermophilus, siendo esta

ltima mucho ms estable debido a la existencia de puentes salinos extra entre dos o tres residuos de lisina (Tomazic y Klibanov. 1988a). En el caso de la a-amilasa de A. oryzae, se ha estudiado la inactivacin trmica cuando se

encuentra inmovilizada sobre soportes de diferente naturaleza (Ulbrich et al., 1986). Para este caso, se propone un mecanismo cualitativamente similar al mencionado anteriormente de la desactivacin
cida de esta misma enzima. En l, la enzima activa se puede convertir a una forma inactiva final y en

18

INTRODUCCIN

un intermedio inactivo que, en funcin de la evolucin de la temperatura, puede revertir tanto a la forma inactiva fmal como a la molcula de enzima activa. Otros muchos factores pueden afectar a la estabilidad de la enzima, incluyendo la pureza del preparado (Hanzawa eta!., 1986), la presencia de calcio u otros iones (Vallee et al., 1959), la adicin
de substrato y otras sustancias estabilizantes (Janecek y Balaz, 1992; De Cordt et al., 1994), la

concentracin de la disolucin (Graber y Combes, 1990). La presencia de otras protenas, como la seroalbmina bovina, acta como molcula estabilizadora, probablemente debido a que el aumento de la concentracin de protenas es ventajoso cuando existen proteasas contaminantes de la preparacin
(Carsen, 1994).

La estabilizacin estructural y mantenimiento de la actividad cataltica de la ct-amilasa por

efecto de iones Ca2~ ha sido parcialmente comentada en la descripcin de la estructura de dicha protena. La de A. o?yzae es, de todas las a-amilasa estudias, la que presenta una unin ms fuerte al

Ca2~ principal (Ka

1012

- i~

M1)

(Valee et al., 1959). Mientras que la actividad hidroltica de las

a-amilasas de otros orgenes se ve inhibida por la presencia de un agente quelante como el etiln diamino tetraacetato (EDTA). la procedente de A. oyzae mantiene prcticamente intacta la suya debido a que la unin es tan fuerte que no es capaz de eliminar el Ca2~ principal de la enzima. Por otro lado, se ha comprobado que la existencia del ion calcio protege a la a-amilasa de la accin de enzimas proteoliticas (Stein y Fiseher, 1958), indicando la formacin de una estructura ms compacta. La existencia de otros iones pueden tener tambin efecto sobre la estabilidad y actividad de la a-amilasa. As, la funcin del Ca2 puede sustituirse, aunque con menor efectividad, con otros cationes divalentes como Sr2~, Mg2~, Ha2 o Zn2~ e incluso algn cation monovalente, Na (Vihinen y Mntsla, 1989). La presencia de CF induce a un leve cambio conformacional en a-antilasa de

pncreas porcino que hace aumentar 30 veces la magnitud de la constante cintica y la constante de unin al Ca2 principal en 240 (Levitzki y Steer, 1974). Otros aniones monovalentes producen este
efecto aunque en menor medida segn aumentan sus radios inicos. El Zn2 parece jugar un papel de centro de unin en la dimerizacin de la a-amilasa procedente deS. subtilis (Valee et al.. 1959).

1.1.4.- Aplicaciones Se ha estimado que el mercado mundial de enzimas industriales, en el ao 1994, fue de unos
1.200 millones de dlares y se encuentra actualmente creciendo a un ritmo del 10% anual (Krauczyk.

1997). A nivel mundial la industria de los detergentes es la que mayor uso hace de las enzimas, con un 39% del total del mercado. A continuacin se encuentra la industria textil (14%) y la industria de procesado de almidn (12%) (Novo Nordisk, 1995).

PURIFrCACIN DE a-AMILASA DE Asperg/las oryzae POR ADSORCIN

21

de reaccin entre 6 y 42 horas a pH 4.5-6.0.

Produccin de etanol En la bibliografa se han descrito numerosos materiales que contienen almidn como materia prima para la produccin de etanol, como son el maz (Wilke a al., 1981), patatas y trigo (Maiorella et al., 1981), raz de mandioca (Lindeman y Rocchiccioli, 1979), etc.
En general, los carbohidratos procedentes de las plantas que contienen almidn no son

directamente fermentables por la mayora de las levaduras, debiendo ser previamente hidrolizados a azcares ms simples. Por ello, en primer lugar, el almidn, es hidratado y gelificado mediante molienda y calentamiento para posteriormente degradarlo a azcares fermentables mediante el uso de
enzimas amiloliticas (a-amilasa, [3-amilasa,glucoamilasa, ...). Se han descrito procesos econmicamente rentables a escala industrial para la produccin de

etanol a partir de almidn de mandioca mediante fermentacin no convencional tras la adicin de

enzimas amilolticas procedentes de hongos (Ueda et al., 1981). Tambin se utiliza la a-amilasa,

junto con otras enzimas amilolticas, como sustituto parcial de la malta en la produccin de diferentes
bebidas alcohlicas (whisky, ron, bourbon, sak, etc.). Este mismo principio se ha venido utilizando desde 1945 para producir etanol como combustible.

Produccin de cerveza De manera anloga que en la produccin de licores, la industria cervecera hace uso de la aamilasa con el fin de aumentar la cantidad de azcares fermentables para producir alcohol, reduciendo

a su vez la cantidad de carbohidratos en la composicin final de la cerveza. Tambin se aade aamilasa en determinados momentos del proceso con el objeto de disminuir la alta viscosidad, debido a la existencia de almidn gelificado, a valores razonablemente bajos (Peppler y Reed, 1987). Los
procesos tradicionales utilizan malta como fuente de almidn y protenas, as como diferentes

enzimas, entre las que se encuentran las arniloliticas. La sustitucin de esta malta por cereales no malteados junto con enzimas amilolticas y proteolticas, reduce costes de produccin y facilita la uniformidad en la calidad del producto final. Una aplicacin ms reciente de la a-ainilasa en la industria cervecera es La produccin de
cervezas con bajo contenido calrico. En condiciones normales de elaboracin, las enzimas presentes en la malta no hidrolizan por completo el almidn a azcares fermentables, quedando

aproximadamente un tercio del almidn transformado en dextrmnas no fermentables pero que aportan energa al ser metabolizadas por el organismo. La adicin de amilasas suplementarias permite la

22

INTRODUCCIN

degradacin de todo el almidn a azcares fermentables que se convertirn en alcohol y dixido de

carbono.

Produccin de jarabes azucarados y edulcorantes

Una de las aplicaciones de la ct-amilasa con mayor importancia econmica es para la industria de bebidas. Entre ellas destaca la produccin de jarabes azucarados y edulcorantes de alto contenido

en glucosa y fructosa procedentes del maz. Estos productos se utilizan como sustitutos de los jarabes de sacarosa en la industria de alimentacin y bebidas. En 1940 se patent el uso de enzimas comerciales y almidn hidrolizado en la fabricacin de jarabes de maz (Langois y Dale, 1940). La primera aplicacin industrial de una enzima inmovilizada fue la produccin en continuo de jarabes de alto contenido en fructosa mediante la accin combinada varias enzimas amiloliticas (Venkatasubramanian, 1978), dando paso al estudio de la inmovilizacin
de amilasas sobre numerosos soportes (Wykes

et al., 1971; Linko e! al., 1975; Babu y Venkatram,

1989; Siso ci al., 1990) en procesos de transformacin del almidn (licuefaccin y sacarificacin). La utilizacin de enzimas inmovilizadas en los procesos de hidrlisis del almidn frente al uso de

enzimas en disolucin tiene una serie de ventajas econmicas y tcnicas. Por un lado reduce los costes
de operacin por la posibilidad de reutilizar la enzima y por otro se consigue un mayor control de la reaccin as como una mayor estabilidad de La enzima,

Panificacin
La produccin de pan requiere la utilizacin de sustancias emulsionantes que se aaden a la mezcla de harina, agua, levadura y otros componentes y cuya funcin es la de acondicionar la masa y

suavizar la textura del pan (miga) una vez cocido. Un adecuado acondicionamiento de la masa produce un incremento en la facilidad de mezcla y procesamiento de la misma, mayor capacidad de
retencin de gases, mayor volumen y mejor textura del producto acabado.

La ct-amilasa puede ser utilizada como sustituto de los emulsionantes habitualmente utilizados
por la industria panadera (steres del cido diacetil tartrico, estearoil lactilato sdico, inonoglicridos,
...).

Para una serie de estos, un aumento en el efecto suavizador de la masa va

acompaado por una disminucin en el efecto suavizador de la miga. El uso de u-ainilasa favorece el aumento del volumen del pan una vez cocido debido a la produccin de azcares susceptibles de servir de sustrato a la levadura, prolongando la fermentacin y produciendo mayor cantidad de

alcohol y dixido de carbono. Por otro lado, reduce la fuerza de la miga debido a la hidrlisis parcial
del almidn presente en la harina que gelifica durante el proceso de coccin por lo que tambin se logra un retardo en el endurecimiento del pan (Hille, 1990).

PURiFICACIN DE a-AMILXsA DE

Aspergillus aryzae POR ADSORCIN

23

Produccin de azcar El almidn es un componente natural de la caa de azcar que se encuentra en cantidades
variables en funcin de la variedad y condiciones de crecimiento de la planta. Su presencia en cantidades altas puede crear dificultades en el proceso de reno del azcar, causando bajas velocidades de filtracin, bajos ndices de cristalizacin as como turbidez en algunas disoluciones preparadas con los azcares producidos (Namer eta!., 1987). La adicin de wamilasa permite reducir el contenido de almidn en el proceso de produccin de azucar, aumentando el rendimiento y evitando

la aparicin de los problemas citados derivados de la presencia de almidn. Detergentes La a-amilasa (junto con otras enzimas amilolticas, proteasas, celuiasas, lipasas, etc.) se
encuentra presente en la composicin de muchos de los detergentes que se comercializan, con la funcin de actuar sobre las manchas procedentes de alimentos y sustancias ricas en almidn. En 1903, Otto Rhm patent el uso de una proteasa, la tripsina pancretica, aunque su efectividad se reduca debido a la inactivacin producida por la alcalinidad del detergente en disolucin. La introduccin generalizada de las amilasas en la formulacin de los detergentes para ropa se realiz a partir de 1980 (Krauczyk, 1997). Posteriormente, la composicin enzimtica de los detergentes se ha completado

con la adicin de lipasas y celulasas. Las industrias fabrican detergentes con diferente composicin en
enzimas para cada pas o rea geogrfica en funcin de la dieta habitual de sus habitantes e incluso de las costumbres y medios de lavado. En Hispanoamrica, las amilasas se han utilizado en grandes cantidades debido a que su dieta es rica en alimentos que contienen almidn.

Industria textil
Durante el proceso de tejedura a partir de algodn o de mezclas de algodn y fibras sintticas, los hilos se exponen a una considerable tensin mecnica. Con el fin de evitar su rotura, se recubren con una sustancia adhesiva y gelatinosa. Esta sustancia, denominada agente de encolado, suele estar compuesta de almidn o de derivados de este a los que se les pueden aadir otros

polmeros como el alcohol de polivinilo, cido poliacrlico, o carboximetil celulosa. Una vez tejido es necesario eliminar por completo el recubrimiento para lo que se pueden utilizar productos qumicos fuertes como cidos, bases o agentes oxidantes. Sin embargo, desde hace aos se ha preferido el uso
de amilasas que hidrolizan el almidn totalmente sin daar la tela evitando, paralelamente, el alto nivel de contaminacin de las aguas residuales del proceso (Novo Nordisk, 1992).

24

INTRODUCCIN

Produccin de acetona y butanol El proceso Weizmann produce acetona y butanol mediante la fermentacin de azcares por el Chlostridium acetobutylicuni. Dichos azcares se obtienen tras los procesos de licuefaccin y sacarificacin por va enzimtica del almidn procedente de maz, trigo, centeno u otros cereales generando glucosa y maltosa como productos finales (Beech, 1953).

Produccin de cido lctico

La maltosa y glucosa procedente de la hidrlisis enzimtica del almidn de maz se utiliza como sustrato en la produccin de cido lctico por fermentacin mediante Lactobacillus

thermophilus o Lactobacillus amylophilus (Mashel, 1959; Nakamura y Crowell, 1979).

Biomasa microbiana El almidn y los residuos de la industria del almidn sirve como fuente de materia prima
renovable para la produccin de biomasa microbiana. A pesar de que algunas bacterias son capaces de

utilizar almidn, en la mayora de los casos es necesaria una hidrlisis previa del mismo para permitir
su metabolizacin (Busta et al., 1977).

1.1.5.- Mtodos de purificacin Muchos de los trabajos publicados sobre purificacin de a-amilasa estn orientados a la

preparacin de pequeas cantidades de enzima para su posterior caracterizacin y estudio. Esta circunstancia hace que los procedimientos utilizados se centren en la obtencin de la mxima pureza a
expensas de conseguir muy bajos rendimientos y costes unitarios muy elevados. La cristalizacin de

a-amilasa procedentes de diferentes organismos para realizar estudios estructurales mediante difraccin de rayos X es un ejemplo significativo de esta situacin (Qian et al., 1993; Brady et al., 1991; Swift eral., 1991; Ramasubbu eral., 1991; Boel et al., 1990; Buisson et al., 1987; Matsuura er
al.,

1979; Campbell, 1954; Akabori eral., 1954). El almidn entrecruzado ha sido utilizado como soporte de afinidad ya que este polmero es el

sustrato natural de la a-amilasa (Somers et a!., 1995: Zhang eta!., 1994: Rozie eta!., 1991; Somers y Vant Riet, 1990).
La extraccin en sistemas de dos lases acuosas utilizando polietiln glicol/sulfato muestra buenos resultados para la purificacin de a-amilasa procedente del caldo de la fermentacin de B.

subrilis (Schmidt a al., 1994). Procedimientos basados en estos sistemas se encuentran patentados (Ananthapadmanabhan, 1988). En ellos se utilizan polietiln glicol, polipropiln glicol, alcohol

PURIFICACIN DE ct-AM[LASA DE Aspergillus oryzae POR ADsORCIN

25

polivinlico, dextrano, politeres de silicona, etc. Relacionados con los ltimos se encuentran estudios realizados sobre la concentracin de cx-amilasa mediante la extraccin con micelas reversas (Dekker
et al., 1991).

La cromatografa de intercambio inico y de interaccin hidrofbica se han utilizado

eficazmente tambin como mtodo

de purificacin de la enzima (Geng et al., 1990; Szepesy et al.,

1990; Yamamoto et al., 1992). Todos estos estudios estn encaminados a la investigacin del mecanismo de retencin implicado o al desarrollo de mtodos preparativos para la obtencin de la enzima purificada. La informacin sobre aspectos cinticos y termodinncos as como la aplicacin de modelos matemticos que describan el comportamiento de la operacin de adsorcin de cr-amilasa
en este tipo de sistemas es muy escasa y se encuentra muy dispersa.

1.2.- PURIFICACIN DE PROTENAS

El desarrollo y comercializacin de nuevos productos a travs de la biotecnologa requiere

una adecuada coordinacin y disposicin de las operaciones unitarias con el fin de disear procesos eficaces que permitan alcanzar los objetivos especficos planteados. De forma general, los objetivos
de un proceso son los de obtener productos de alto valor aadido a partir de materias primas
relativamente baratas.

Producto

Servicios (aire)

Calor

Residuos

Residuos

Figura 1.14: Esquema de un proceso bioqumico tpico

La operacin central de un proceso biotecnolgico es la ocupada por el biorreactor, lugar donde se transforman las materia primas en productos mediante biocattisis, fennentacin o cultivo
celular (ver figura 1.14). Sin embargo, esta etapa no tendra utilidad prctica si se encontrase alsada. Es necesario realizar una preparacin y un pretratamiento adecuado a las

materias primas y una

posterior separacin y purificacin del producto o productos de valor generados en el biorreactor.

26

INTRODUCCIN Las operaciones unitarias de separacin basan su eficacia de trabajo en la explotacin de una

propiedad caracterstica diferenciadora entre el producto de inters y el resto de los componentes de la mezcla. Los efluentes de los biorreactores suelen ser complejos, formados por un gran nmero de sustancias con caractersticas similares. Esto hace necesario utilizar diferentes procedimientos en serie para lograr la purificacin final del producto de inters. En la tabla 1.2 se muestran las operaciones unitarias de separacin habituales en procesos biotecnolgicos, indicando la propiedad

diferencial en la que se basa cada uno de ellos.

Tabla 1.2: Operaciones de separacin.

Operacin

Propiedad fisicoqumica
Velocidad de sedimentacin Tamao de partcula Naturaleza intracelular Coeficiente de reparto Solubilidad hidrofbica) (interaccin electrosttica e

Centrifugacin Filtracin, Microfiltracin Homogeneizacin Extraccin en 2 fases Precipitacin Adsorcin fsica Intercambio inico Afinidad Interaccin hidrofbica Ultrafiltracin Filtracin en gel Fase reversa Electroforsis

Fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrgeno, momento dipolar. Carga elctrica Afinidad biolgica, ffincin 1-lidrofobicidad superficial Tamao molecular Tamao molecular Interacciones hidroflicas e hidrofbicas Punto isoelctrico, carga elctrica, tamao molecular, conformacin

1.2.1.- Etapas primarias

Una ver realizada la reaccin, en el efluente del biorreactor se encuentra el producto para el que se ha diseado el proceso. La misin de las etapas primarias de purificacin o etapas de recuperacin es la de concentrar el componente de inters, eliminar la mayor cantidad de subproductos y, en la medida de lo posible, reducir el volumen del efluente que ser tratado en las etapas posteriores. En el caso de fermentaciones para producir compuestos secretados al medio (extracelulares), la primera operacin ser la separacin de las clulas productoras del caldo de fermentacin. Esta

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

27

puede realizarse mediante centrifugacin o filtracin. Esta ltima pese a la mayor sencillez del equipo
utilizado, presenta la desventaja de que la compresibilidad de las clulas o del micelio depositado

sobre el filtro disminuye la permeabilidad, dificultando la operacin (Belter, 1985). La aplicacin de la filtracin tangencial aumenta el caudal de filtrado, respecto a la filtracin tradicional en condiciones equivalentes, en un factor de 100 a 1000 (Gabler, 1985). Otra alternativa atractiva la
constituye la separacin mediante el uso de membranas de fibras huecas (Tutunjian, 1985).

Previamente a la separacin de las clulas del fermentador, si el producto de inters queda en

el citoplasma, es necesaria la liberacin del mismo por ruptura de la pared celular mediante mtodos

mecnicos, lisis qumica o enzimtica, cboque osmtico, calentamiento, congelacin-descongelacin, uso de clulas mutantes con pared celular deficiente, etc. (Engler, 1985).
Una vez clariticado el medio a purificar, pueden aplicarse gran nmero de procesos que sirven para concentrar el producto de inters, generalmente bastante diluido, e ir eliminando contaminantes

principales. Entre estas etapas pueden destacarse las correspondientes a los procesos de membrana:
ultrafiltracin, smosis inversa, microfiltracin de flujo cruzado y dilisis (Fane y Radovich, 1990), que permiten la separacin en base a la diferencia en el tamao molecular de los componentes. Las separaciones llevadas a cabo en sistemas de dos fases inmiscibles permite una elevada afinidad en condiciones suaves no desnaturalizantes para las protenas (Albertsson er al., 1990). Su aplicacin a la recuperacin de protenas y cidos nucleicos es relativamente reciente, pese a ser esta una tcnica conocida y aplicada a otras sustancias desde hace tiempo. La razn es que hay pocas protenas solubles en disolventes orgnicos comunmente utilizados en la industria qumica y la

mayora de ellos produce un elevado grado de desnaturalizacin en las protenas. La sustitucin de la extraccin tradicional en dos fases, acuosa/orgnica, por dos fases acuosas inmiscibles realizadas a
partir de polmeros solubles (polipropiln glicol
-

alcohol polivinflico, metilcelulosa dextrano, etc.)

-

permite la formacin de un entorno favorable para las molculas biolgicamente activas evitando, as, su desnaturalizacin (Kula, 1985).

La precipitacin suele utilizarse en las etapas iniciales del diagrama de flujo, produciendo tanto purificacin como concentracin, aunque es esta ltima accin la que realiza de forma ms efectiva. Es una operacin tcnicamente sencilla y econmica, ya que es posible el uso de gran
nmero de agentes precipitantes, muchos de ellos de muy bajo coste y que no producen la desnaturalizacin de los productos biolgicos (Glatz, 1990).

1.2.2.- Etapas de purificacin de alto valor aadido En los casos en los que sea necesario cumplir con las exigentes especificaciones impuestas

por la industria farmacutica, cosmtica o de alimentacin, ser necesario recurrir a la aplicacin de

28

INTRODUCCIN

etapas de punficacin ms eficaces y selectivas. Las especificaciones mencionadas pueden referirse al

grado de pureza del producto, a los niveles mximos de determinados contaminantes o a ambos. Pese a la alta efectividad de separacin y purificacin que tienen los mtodos electroforticos,
su aplicacin a nivel industrial no se halla generalizada, aunque se han descrito algunos trabajos sobre el escalado de la purificacin de a-amilasa de 8. subrilis mediante autoenfoque (Dobrnsky et al., 1987). La cromatografa, es. posiblemente, la tcnica ms ampliamente difundida como etapa de alta eticacia en los procesos de purificacin utilizados en biotecnologa. La denominacin de cromatografa es muy general y engloba a todos los sistemas basados en la interaccin entre molculas disueltas en un liquido (o en un gas) con la superficie de un slido o con ligandos unidos a un slido inerte. Dentro de ella, dependiendo del mecanismo responsable de la interaccin, pueden diferenciarse numerosas tcnicas:
-

Filtracin en gel. Afinidad. Interaccin hidrofbica y fase reversa Intercambio inico.

Los sistemas cromatogrficos de filtracin en gel se basan en la diferente diflisividad que sufren las molculas de distinto tamao al atravesar una columna rellena de una matriz de porosidad determinadi En operacin normal, las molculas de mayor tamao, al no entrar en el interior de los poros del polnero de la fase estacionaria, atraviesan la columna ms rpidamente que las molculas pequeas. Esto se debe a que el paso de estas ltimas por la columna se retarda al introducirse y diliindirse por el interior de la matriz porosa de la fase estacionaria. Esta caracterstica hace que esta operacin sea adecuada y muy utilizada como procedimiento para desalar disoluciones de biopolmeros. Las fases estacionaria habituales estn basadas en polimeros como son dextrano entrecruzado, poliacrilamida o agarosa. La porosidad se produce al gelificar estas sustancias en contacto con el agua. La naturaleza de estos polimeros. hace que no sean excesivamente rgidos por lo que no permiten la utilizacin de elevados caudales de funcionamiento. Actualmente estn apareciendo nuevos soportes que palan en cierta medida este efecto negativo. Estos soportes rgidos son de vidrio modificado, slice flincionalizada o polmeros como el poli(2-hidroxi-etil metacrilato) (Yarmusli ca al.. 1985). Su utilizacin de tbrma ms generalizada a nivel industrial est condicionada por el limitado desarrollo que presenta en operacin en rgimen continuo. El trmino cromatografa de afinidad (Cuatrecasas ca al, 1968) se refiere a la interaccin bloespecfica entre dos sustancias, una en solucin y otra unida a un soporte slido. Es una herramienta muy valiosa en la purificacin de sustancias biolgicamente activas. La biomolcula se

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

29

une, generalmente de forma covalente, a un ligando unido a un soporte slido inerte. Debido a la alta bioespecificidad, mediante la cromatografa de afinidad se pueden obtener rendimientos elevados por
el ahorro de etapas previas que supone. Los soportes de afinidad suelen ser caros debido a que no son

muy verstiles en cuanto a nmero de diferentes aplicaciones posibles. Deben disearse para cada adsorbato que se quiera purificar ya que una mayor versatilidad llevar acompaada una menor bioespecificidad. Las matrices debern ser fcilmente derivatizables con el fin de poder unir el ligando adecuado para la aplicacin deseada, Las matrices utilizadas son geles de agarosa, vidrio poroso, slice. poliacrilamida, celulosa y diversos hidroxialquil metacrilatos (Yannush y Colton, 1985). Los ltimos desarrollos en cromatografa de afinidad estn enfocados al desarrollo de procesos de inmunoadsorcin. Esto suponen la unin de un antgeno a un anticuerpo inmovilizado a la matriz o viceversa, logrando as una especificidad en la adsorcin no conseguida por ningn otro procedimiento. La tcnica se hace todava ms efectiva si se utilizan anticuerpos monoclonales (l-Iorstmann, 1989). En el presente trabajo se realizar el estudio de la adsorcin de a-amilasa mediante interaccin hidrofbica e intercambio jnico. A continuacin se revisarn con mayor detalle los
aspectos tericos y experimentales correspondientes a ambos mecanismos.

Interaccin hidrofbica A principios de los aos 70 se comenzaron a utilizar fases estacionarias compuestas por ligandos ligeramente hidrofbicos, alquilaminas de diferente longitud de cadena, unidos
covalentemente a matrices inertes de gel de agarosa (Er-EI eral., 1972; Shaltiel y Er-El, 1973) con el

fin de separar y purificar protenas. El trmino Cromatografa de Interaccin Hidrofbica, HIC, fue
introducido por Hjertn (1973) para referirse a la separacin de protenas mediante las interacciones nediadas por sales que se producen entre las zonas hidrofbicas de la superficie de las mismas con

[os ligandos hidrofbicos de la fase estacionaria. Las primeras fases estacionarias diseadas especialmente para su aplicacin en HJC se desarrollaron para paliar la relativa baja eficacia de las anteriores debido a su poca resistencia tsica que no las hacan adecuadas para su uso en columnas de alta presin. Consistan en matrices siliceas con un recubrimiento polimrico de carcter hidroflico y ligandos n-butilo y fenilo (Kato el al., 1983). Ms recientemente se han desarrollado fases
estacionarias con matrices polimricas hidroflicas proporcionando, junto con una elevada resistencia

fsica, una gran estabilidad qumica que permite su utilizacin a valores extremos de pH (Cooke er al., 1990). Esta circunstancia es. sobre todo, adecuada para la regeneracin del soporte ya que la separacin o purificacin de protenas a pH altamente cido o alcalino produce, generalmente, La
desnamrafizacin de Las mismas.

30

INTRODUCCIN

A altas concentraciones salinas, los biopolimeros se unen a la fase estacionaria mediante

interacciones hidrofbicas que se atentian al disminuir la concentracin de sal en la fase mvil.

eluyndose, de esta manera, en orden creciente de su carcter hidrofbico. Esta relacin se ha

comprobado tambin para aminocidos funcionalizados (Gehas y Wetlaufer, 1990). Entre los ligandos habitualmente utilizados, los de tipo alquilico son los que producen adsorbentes ms hidrofbicos.
seguidos de los de tipo fenlico, politeres y glicoles, siendo necesarias fases mviles de mayor concentracin salina para quedar adsorbidos en estos ltimos. La cromatografa en fase reversa es una tcnica, fundamentalmente analtica, que comparte con la HIC el uso de la diferente hidrofobicidad de las molculas como propiedad que proporciona diferente selectividad y afinidad por un determinado soporte. La diferencia entre ambos tipos de adsorcin reside en el grado de interaccin protena-ligando. En el caso de cromatografa en fase reversa, la densidad superficial de los ligandos unidos a la matriz es muy elevada, por lo que la interaccin con el adsorbato es tan fuerte que es necesario aadir disolventes orgnicos a la fase mvil para disminuir la tensin superficial de la misma y permitir, as, la elucin de las biomolculas retenidas. En estas condiciones se produce la prdida de la estructura nativa de las protenas, quedando expuestos los residuos hidrofbicos del interior de la molcula, lo cual conduce a un incremento adicional en la intensidad de la interaccin. La interaccin que producen los ligandos en

HIC es ms suave debido a la mayor dispersin de los mismos, pudindose variar la fortaleza de la
interaccin hidrofbica modificando la densidad superficial de los ligandos en el soporte (Fausnaugh

eral., 1984). Debido a la menor hidrofobicidad de la fase estacionaria en HIC, en la etapa de elucin
se pueden utilizar fases mviles que no desnaturalizan apreciablemente las protenas. Tambin se ha estudiado el uso de tensioactivos de carga neta nula que, por su naturaleza, no producen efectos desnaturalizantes en la estructura de las protenas a la vez que disminuyen su retencin en columnas con adsorbentes hidrofbicos debido a un efecto competitivo entre la protena y el agente tensioactivo por los Jigandos correspondientes (Bucldey y Wetlaufer, 1989; Bucldey y Wetlaufer, 1990). Por ello, estas substancias pueden ser utilizadas como agentes moduladores de la elucin en HIC. Los fenmenos fisicoqumicos subyacentes en el mecanismo de la HIC de protenas son anlogos a los correspondientes al efecto salino por el cual la solubilidad de las protenas se reduce en
presencia de concentraciones crecientes de sales neutras. Sin embargo, a pesar de dicha analoga, este

efecto es consecuencia de las interacciones hidrofbicas protena-protena a diferencia del mecanismo de retencin en el proceso de HIC que es el resultado de las interacciones inducidas por sales entre las protenas y los centros de unin, ligeramente hidrofbicos, de la fase estacionaria.

PURIFICCIN DE ~-AMILA5A

DhAspergillus oryzae

POR ADSORCIN

31

. 4.44,avvVVVVVVVVV%NVVVVVVVVVy a-.4.44.4 VVVV VVVVV VVVVV VVVV Vv5.

9
4 ~< a jiaa a A -x .5 -5 A 7

44
<~7-~~

~ 7, ~~AA AAA~<A AAAAA AAA44 7 A AA .,V-7 a- +4 a a-a7

y

Protena
..----<5-5-9<

a44aa4-a-455
1,q

5~5

5- ,>-a 4~ AApr~ ~ 5--u> 17 Va-a-y ~7

y

7 7 -7 7

~s
> <
-

it
AAAAAAS:ta-4 Ci AL> 7..

~7> <5-

~x-~ Va->-~

<+4
V

~
1<

[3gando hidrofobia-o

,> < 7.

>5 7..

(1)
Zona hidroflsia, de a supercir dc la prolcina
7

(II)
(apa dc anauicculas de agua equncnra das en la s ipcrbcic dc la prota-ina vdd ligando.

Molcula dc agua

Figura 1.15.: Esquema del mecanismo de interaccin hidrofbica. Las molculas de agua sc estructuran alrededor de la protena en disolucin y de cada ligando (1). Las molculas de aguase eliminan de las zonas de interaccin (II). La fuerza impulsora que dirige la adsorcin mediante interacciones hidrofbicas es la ganancia de entropa del sistema (Hjertn, 1973; Fausnaugil er al., 1984). Una molcula de protena en disolucin mantiene una o varias capas de molculas de agua estructuradas alrededor de su superficie. Esta situacin es termodinmicamente inestable ya que supone una disminucin

importante de la entropa en comparacin con la de la protena sin solvatar ms la correspondiente a las molculas libres de agua (Scopes, 1987). Para que se produzca la interaccin entre las zonas no
inicas de la superficie externa de la protena y de un ligando hidrofbico del adsorbente, esta capa deber eliminarse (figura 1.15). En el proceso de interaccin, debido al aumento del desorden de la fase mvil, aumentar la entropa del sistema (AS0> 0). En estos procesos el cambio entlpico suele ser pequeo por lo que la variacin de energa libre, dada por la expresin [1.1] es negativa, ocurriendo el proceso de tbrma espontnea. AGa- =AH0 -TAS0
[1.1]

La teora solvofbica (Sinanoglu y Abdulnur, 1965; Halicioglu y Sinanoglu, 1969) describe el

efecto del disolvente en la agregacin de las zonas no inicas entre diferentes molculas de biopolimeros a partir de los cambios termodinmicos correspondientes al equilibrio de asociacin de
macromolculas en disolucin. La solubilizacin de cada molcula de biopolimero supone la creacin de una cavidad entre las molculas de disolvente. En base a ello, se ha desarrollado un modelo terico que trata de explicar y predecir la retencin de los adsorbatos en HIC (Melander y Horvth, 1977; Horvtli er al., 1977). En l se propone que la magnitud de la interaccin hidrofbica y, por tanto, de

32

INTRODUCCIN

la retencin de las molculas de adsorbato, viene determinada por un balance de energas de Van der Waals, electrostticas e hidrofbicas implicadas en la unin del adsorbato sobre los grupos funcionales de la fase estacionaria. En cromatografa, una forma adecuada de expresar la retencin de un soluto es mediante el factor de capacidad, k, que viene definido de la forma siguiente:

k= tR te ~10 [1.2] donde tR y t0 son, respectivamente, los tiempos de retencin correspondientes al adsorbato y a un soluto que no se adsorba, en iguales condiciones de operacin.

La relacin entre el factor de capacidad y los cambios termodinmicos ocurridos en HIC, de

acuerdo con el modelo citado puede expresarse como:

lnk=

--

0 + AG0 ~ 1+ lni(RT 1 ~ RT~ red.~ PV) IAG~ +AG% +AG7.,~~ +AG aaoc.

[13]

Los tres primeros trminos, AGtv, A00ee y AC0vdw, representan la variacin de energa libre neta entre la fase mvil y la estacionaria asociada con la formacin de cavidades, con los efectos electrostticos y las interacciones de Van der Waals respectivamente. Acta,, corresponde al cambio de energa libre para la asociacin ligando-adsorbato en ausencia de disolvente que lo rodee (es decir, el que correspondera a una fase gaseosa) y
AGt 1.

es la reduccin en energa libre debida a las

interacciones disolvente-ligando y disolvente-adsorbato no tenidas en cuenta en los tres primeros trminos. Los valores y y P son, respectivamente, el volumen molar medio del disolvente y la presin de operacin. El parmetro ~ es constante para cada columna y est relacionado con la concentracin de ligandos accesibles de la misma. nicamente los tres primeros trminos son dependientes de la concentracin de sal en la fase mvil (Melander er al., 1984) por lo que la ecuacin anterior, para un sistema cromatogrfico determinado, puede simplificarse de la siguiente forma:

1/e lnk= y~ RTk

+AG~~ +AOvdw)

[1.4]

donde y es un valor constante que engloba a los trminos no dependientes de la concentracin salina.
De acuerdo con la teora solvofbica, AG0cav depende linealmente de la concentracin salina en el disolvente

A00
cay,

=AAjTm+y

[1.5]

siendo AA~ la diferencia en el rea superficial del ligando y la molcula de adsorbato expuestos a la fase mvil entre los estados adsorbido y en solucin, correspondiendo al rea molecular de contacto

PURIFICACIN DE U-AMILA5A DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

33

en la unin ligando-adsorbato. El parmetro e es el incremento molal de tensin superficial de la sal, m es la concentracin molal de sal en el disolvente y y un parmetro constante. La contribucin energtica debida a interacciones electrostticas se determina a partir de la aplicacin de la teora de Debye-Hckel mediante la siguiente expresin:
B

donde ja es el momento dipolar de la protena y A, 8, C y D son valores constantes para cada adsorbato, siendo A y 8 proporcionales a la carga neta de la protena y C y D estn relacionados con el tamao molecular de la misma.
La contribucin de las fuerzas de Van der Waals, aunque de menor magnitud que las

anteriores, depende linealmente de la concentracin de sal:

AG2,~dw =vm+y representando
y

[1.7]

y y un valor constante para cada pareja sal-macromolcula y fase estacionaria.

De esta forma, la ecuacin 1.3 puede reescribirse como:

B (mi) lnk=
______

1 +c

DI.tm+

(m!)

AA,

am+vm+y

[1.8]

En el limite, para valores de la fuerza inica suficientemente elevados, el logaritmo del factor de capacidad depende linealmente de la molalidad de la sal, por lo que, definiendo el parmerro de
interaccin hidrofbica,

X, se obtiene la siguiente expresin: ln(k/k0) = Xm [1.9]

donde k0 es el factor de capacidad en ausencia de sal y el parmetro de interaccin hidrofbica viene

definido por X

= AA,c + y

Dji.

Como puede observarse, el parmetro de interaccin hidrofbica est en relacin directa con
el rea de contacto entre protena y ligando. Se ha estudiado y confirmado esta relacin para una serie de protenas (Katti el al., 1987), observndose tambin que dicho rea de contacto es directamente proporcional al rea superficial correspondiente a las zonas hidrofbicas accesibles de la superficie exterior de la molcula de protena, considerando propiedades superficiales y cargas netas constantes para cada una de ellas. De acuerdo con el desarrollo termodinmico anterior, la retencin del adsorbato aumentar

34

INTRODUCCIN

con la temperatura. Sin embargo, su influencia no ha sido completamente generalizada. Se han descrito sistemas en los que la temperatura no tiene un claro y determinante efecto positivo sobre la intensidad de la adsorcin (Hjertn, 1973). En otros casos, la dependencia de la retencin con la temperatura, aunque globalmente aumenta en un amplio margen (0-50 0C), existen intervalos en los que la iniluencia sobre la retencin es prcticamente nula (Lu er al., 1986; Wu er al., 1986), debido, posiblemente, a cambios conformacionales de la protena a diferentes temperaturas.

Como ya se ha indicado, la adsorcin por interaccin hidrofbica est inducida por la

presencia de sales disueltas. Sin embargo, no todos los iones tienen el mismo efecto sobre la

intensidad de La adsorcin de las molculas de protena sobre los ligandos hidrofbicos. La capacidad
de un ion para estructurar las molculas de agua en torno a l (efecto anticaotrpico) est en relacin directa con la fortaleza de la interaccin. Al solvatarse, los iones hacen disminuir el nmero de

molculas de disolvente (agua) disponibles en el medio, por lo cual disminuye la solubilidad de la protena y aumenta la tensin superficial de la disolucin aumentando, por tanto, la retencin del
adsorbato. El efecto de los iones descrito sigue el orden propuesto por Hofmeister (figura 1.16) para el efecto de diferentes iones en la solubilidad de las protenas (Roe, 1989) Esta propiedad se ha utilizado para optimar la separacin de mezclas de protenas con diferente comportamiento cido-base, amplio intervalo de masas moleculares y carcter hidrofbico (El Rassi er al., 1990). La inclusin de varias sales con diferente efecto sobre la interaccin hidrofbica en la elucin de la mezcla de protenas permite modular, con mayor eficacia, la retencin de cada una de ellas en sistemas de HJC.

<

Aumento efecto de interaccin hidrofbica

so., CH

3COO CF, Bf NO, CO; , 1, SCN

,

t, K~, Na~, Cs~, Li, Mg2~, Cat Ba2~ NI-Q, Rb

Aumento efecto cantrpico
5

Figura 1.16: Series de Hofmeister

En determinados casos, se ha observado que algunas sales de magnesio no producen los

resultados predichos por la teora Melander-Horvtli (Arakawa y Timasheff, 1982; Arakawa y Timasheff, 1984a; Arakawa y Timashef, 1984b). La adicin de MgSO 4 en HTC produce retenciones menores, aunque regulares, que las que les correspondera por su efecto en la tensin superficial mientras que el uso de MgGI2 produce resultados irregulares, difciles de correlacionar (Szepesy y Horvth, 1988). Como causa de esta desviacin se ha propuesto la existencia de interacciones

PURIFIcACIN DE cx-AMwAsADBAspergillus

orvzae POR ADSORCIN

35

preferenciales entre los iones salinos y la protena en disolucin (Arakawa, 1986), aunque tambin podra estar relacionado con un cambio estructural de dichaprotena (Fausnaugh y Regnier, 1986). Otro factor que puede tener importancia en la 1-lIC, por su efecto sobre las cargas elctricas de la protena y el adsorbente, es el pH. La hidrofobicidad de una protena es mxima cuando su carga neta es nula, es decir, cuando el pH del medio coincide con su punto isoelctrico. En general, la disminucin del pH hace aumentar la interaccin entre la molcula de protena y los grupos no inicos de los Ligandos hidrofbicos, especialmente los aromticos y otras estructuras con orbitales
electrnicos
it.

En este caso se ha propuesto (Scopes, 1987) que la nube de electrones se asocia a las

protenas en reas cargadas positivamente que se encuentran adyacentes a las cadenas laterales de los
residuos hidrofbicos de la cadena polipeptdica. Como al disminuir el pH aumentan las cargas

positivas y disminuyen las cargas repulsivas de signo negativo, la fuerza de la interaccin se

intensifica. Cuando se utilizan adsorbentes alifticos ms simples, especialmente si se unen mediante

un enlace que cree una carga positiva como en el caso del bromuro de ciangeno, el efecto de la disminucin del pH sobre la retencin puede darse en sentido opuesto debido a mecanismos paralelos
de intercambio inico. En el marco de la teora solvofbica, se ha descrito que, para un determinado

sistema cromatogrfico, la variacin del pH no afecta significativamente al parmetro de interaccin hidrofbica (pendiente en la ecuacin 1.9) aunque si lo hace sobre el valor de k0 (Fausnaugh y Regnier, 1986). Esto indica que la ionizacin, a pesar de que no altera la superficie hidrofbica de contacto, s modifica la intensidad de la adsorcin. Las caractersticas fisicoqumicas del adsorbente tambin son de gran importancia en el
comportamiento de la adsorcin por interaccin hidrofbica. La longitud del ligando es un factor que

afecta a la selectividad y la retencin de protenas en HIC. Para experimentos realizados con

adsorbentes producidos por unin de ligandos alquflicos de diferente longitud de cadena y, por tanto,

de diferente hidrofobicidad, los de mayor longitud mostraban una mayor retencin, a igualdad del
resto de las condiciones de operacin (Fausnaugh eral., 1984; Gooding eral., 1986). Sin embargo, la

hidrofobicidad relativa de diferentes columnas puede ser modificada mediante la utilizacin de

distintas sales (Szepesy y Rippel, 1992a; Szepesy y Rippel, 1992b).

Intercambio jnico La purificacin mediante adsorcin por intercambio jnico se basa en la retencin selectiva,
por parte del slido intercambiador de iones, de las especies qumicas implicadas debida a la diferente distribucin de carga elctrica expuesta en la superficie externa las mismas. Los aminocidos que componen las protenas contienen grupos ionizables que, en funcin de las condiciones del medio, pueden encontrarse cargados o no. Las cargas positivas se deben a los

36

INTRODUCCIN

grupos funcionales pertenecientes a las cadenas laterales de los residuos de arginina, usina e bisfidina y, en menor medida, a los grupos amino terminales. Por otro lado, las cargas negativas que portan las cadenas polipeptdicas son debidas a los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico, a los
grupos carboxilo terminales y, ms dbilmente, a los gmpos tiol de tos residuos de cisteina. En la

tabla 1.3 se muestran los valores de pK correspondientes a los grupos susceptibles de ionizacin que se encuentran en los aminocidos que componenuna protena.
Tabla .3: Valores intrnsecos de pK de los diferentes

grupos ionizables de las protenas (Creighton, 1993). Grupo lonizable a-Amino a-Carboxilo 3-Carboxilo (Asp) y-Carboxilo (Glu) 6-Guanidino (Arg) e-Amino (Lys) Imidazol (1-lis) Tiol (Cys) Fenoxi (Tyr) pK 6.8 - 8.0 3.5 - 4.3 3.9 4.0
-

4.3 - 4.5 12.0 10.4

-

11.1

6.0 - 7.0 9.0 - 9.5 10.0 - 10.3

Las interacciones electrostticas producidas entre los grupos con carga opuesta juegan un papel importante en la estructura terciaria y cuaternaria de las protenas. Dependiendo de la cantidad
relativa de aminocidos bsicos y cidos y en ncin, principalmente, de las condiciones de pH as

como de la temperatura, fuerza inica o presencia de otros compuestos, las protenas muestran una
carga neta que puede variar desde valores positivos hasta negativos. El pH al cual la carga neta es nula se denomina punto isoelctrico, pI. Debido a que la variacin del pH del medio modifica la carga neta de la protena, la capacidad del intercambiador de iones se ve tambin afectada. Las protenas tienen estructuras tridimensionales y distribuciones superficiales de carga que son caractersticas, por lo que su purificacin o separacin del medio en que se encuentran mediante adsorcin por intercambio inico puede ser una operacin muy selectiva y eficaz. Como ilustracin de la alta sensibilidad y selectividad que presenta este mecanismo, se han realizado estudios en los que se comprueba que la sustitucin de 2 residuos de aminocidos cargados en una ~-lactoglobulina hace cambiar sustancialmente su tiempo de retencin en sistemas de cromatografa lquida (Yamamoto a
al., 1987). Junto a la alta selectividad comentada. Ja cromatografa de intercambio inico presenta la

ventaja de no necesitar, en general, la utilizacin de fases mviles de naturaleza txica o

38

INTRODUCCIN

superficial de carga y la orientacin con que interaccionan adsorbato y adsorbente. Debido a estos
efectos, la capacidad de adsorcin de una resma de intercambio inico disminuye, de una forma casi lineal, al aumentar el logaritmo de la masa molecular de la protena (Seopes, 1981).

Las resinas de intercambio anidco o catinico consisten en una matriz inerte, generalmente
porosa, a la que se encuentran unidos ligandos que contienen grupos iotizables con carga positiva o negativa, respectivamente. Estos grupos funcionales se encuentran neutralizados por el

correspondiente in de signo opuesto, denominado contrajn. Mediante el mecanismo de intercambio inico, una protena con carga neta de igual signo que el contrain desplaza a uno o varios de estos, quedando unida al ligando. Las protenas en disolucin tambin tienen sus cargas neutralizadas por sus correspondientes contraiones. En la figura 1.17 se muestra, esquemticamente, el mecanismo descrito. Existe un conocimiento rdativamente escaso del mecanismo de intercambio inico en su aplicacin a pptidos y protenas (Wang, 1990) debido a una serie de factores caractersticos de este tipo de sistemas que a continuacin se sealan:
-

EJ

valor de pK de los grupos bsicos o cidos dbiles de los residuos de aminocidos

puede variar en funcin de los residuos de su entorno.

-

La estructura terciaria de las cadenas polipeptdicas puede modiuicarse al variar las

condiciones de pH. concentracin salina, temperatura o por la presencia de determinadas sustancias en el medio.
-

En los intercambiadores inicos de carcter dbil la densidad de carga y la capacidad

total de retencin puede modificarse por cambios de pH, afectando dc esta forma al

equilibrio de adsorcin.
-

En ocasiones, la unin de una biomolcula al slido adsorbente se debe a un

mecanismo mixto de intercambio inico y de interaccin hidrofbica (Heinitz el al., 1988) por lo que la afinidad adsorbene-adsorbato tiene una dependencia compleja con la concentracin salina.
-

Una protena puede cambiar su conformacin tridimensional tras la unin con la

tesina de intercambio inico u otras superficies. En estos casos las isotermas pueden variar con el tiempo de contacto, mostrando una dependencia con la historia de la concentracin en la fase adsorbida. Los tratamientos termodinmicos ms simples tienen en cuenta la carga neta de la protena como faclor principal por el cual se produce el intercambio. Sin embargo, se ha comprobado experimentalmente que, en determinados sistemas, no hay una buena correlacin entre dicha carga

PURIFICACIN DE

a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

39

neta y la retencin del adsorbato (Kopaciewicz el al., 1983). As, se ha observado que existe retencin de protenas que se encuentran en su punto isoelctrico o incluso a valores de pH inferiores en columnas de intercambio aninico. Esta adsorcin no est causada por fuerzas hidrofbicas, sino por la existencia de asimetra en la distribucin superficial de cargas que presentan las protenas a cualquier valor de pH (Drager y Regnier, 1986). De esta forma, las protenas, aunque la carga neta que soporten sea nula, pueden presentar en algunas zonas de su superficie una concentracin de grupos cargados que le comieren una densidad de carga local no nula que le permiten unirse a intercambiadores de iones adoptando la orientacin adecuada. La biomolcula, a medida que fluye a travs del adsorbente y debido al movimiento trmico, tiende a situarse en una o varias orientaciones que minimicen la energa libre en el estado adsorbido. Con objeto de comprender y describir de una forma ms completa el mecanismo de intercambio inico de macromolculas poliinicas, se introdujo el concepto de carga caractersrica (Velayudhan y Horvth, 1986). Este designa al ndmero de cargas o residuos de aminocidos (para cadenas polipeptdicas) cargados de la biomolcula que intervienen en la unin, por interaccin
electrosttica, a la superficie del adsorbente. Este valor depende de las condiciones del medio (pH,

ifierza inica, temperatura, etc.) as como de las caractersticas del adsorbente (Velayudhan y
Horvth, 1994). Existen diferentes mtodos para determinar el valor de la carga caracterstica. En primer lugar

se pueden destacar los clculos a priori basados en la mecnica estadstica. Estos requieren un
tratamiento matemtico muy complejo a la vez que un conocimiento muy completo del sistema que se

est estudiando. Esta situacin no es con la se cuenta habitualmente debido a la dificultad de describir adecuadamente el comportamiento y caractersticas de las estructuras proteicas. Por ello, se han
desarrollado procedimientos basados en datos obtenidos experimentalmente en sistemas relativamente

sencillos. Entre ellos se encuentran los basados en datos obtenidos a partir de experimentos en impulso en equipos de HPLC por elucin isocrtica (Drager y Regnier, 1986; Velayudhan y Horvth, 1986) y los que hacen uso de los valores obtenidos a partir de la isoterma de Langmuir del sistema
(Velayudhan y Horvth, 1986).

De los tratamientos experimentales anteriores, podemos generalizar una relacin lineal entre el logaritmo del factor de capacidad y el logaritmo de la concentracin salina (o fuerza inica) de la
fase mvil de la siguiente manera: log(k) = logA

.~-

4;

log[S]

[1.10]

basado en el siguiente equilibrio, no mecanstico:

40

INTRODUCCIN

z5 p+z 1 Y*z
<

11.111

donde Zs y

Zp

son las cargas netas del contrain y la carga caracterstica de la protena

respectivamente.P y 5 hacen referencia a la protena y al contrain salino. La barra sobre alguno de ellos representa que la especie correspondiente se encuentra unida al ligando de la fase estacionaria.

1.3.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO La implantacin de un proceso biotecnolgico a escala industrial requiere un profundo conocimiento de sus mecanismos y de los factores que en l influyen. Adems, para disear y optimar procesos de purificacin de forma no emprica, es necesaria la utilizacin de modelos matemticos generales que permitan describir y predecir el comportamiento del sistema. Por ello y por todo lo
anteriormente expuesto, los objetivos del presente trabajo de investigacin son los siguientes:
-

Desarrollar una metodologa que permita el diseo de procesos de purificacin de bioproductos mediante adsorcin.

Determinar y cuantificar los factores que influyen en la adsorcin de ct-amilasa de Aspergillus oryzae sobre soportes de intercambio inico e interaccin hidrofbica.

Aplicar modelos matemticos fenomenolgicos que permitan disear, simular y

optimar la operacin de adsorcin de a-amilasa sobre los soportes estudiados.

-

Determinar los parmetros cinticos y termodinmicos que caracterizan al modelo terico desarrollado para utilizar este en la operacin de diseo, simulacin y escalado del proceso de adsorcin de a-amilasa.

A continuacin se describe La metodologa y el plan de trabajo propuesto para la realizacin

de los objetivos planteados:
-

Eleccin de los adsorbentes ms adecuados y de las condiciones de operacin en las que se va a desarrollar el estudio posterior de la adsorcin de a-amilasa.

Caracterizacin fisico-quimica del adsorbato y de los adsorbentes utilizados. Estudio experimental, en forma secuencial, de la adsorcin de a-amilasa sobre los adsorbentes seleccionados mediante los siguientes procesos: (1) cromatografa de impulso en columnas de HPLC. (2) adsorcin en tanque agitado discontinuo y (3) adsorcin en lecho fijo.

Determinacin de los parmetros cinticos y termodinmicos del proceso (le

PURIFICAcIN DE a-AM [LASA DE Aspe rgillus

oryzae POR ADSORCIN

41

adsorcin de ct-amilasa mediante el ajuste de los resultados experimentales al modelo matemtico desarrollado.

1.4.- BIBLIOGRAFA
-

Akabori, S.; Ikenaka, T.; Hagihara, B. (1954). Isolation of crystalline taka-amylase A from Takadiastase Sankyo, 1 Biochem., 41(5), 577-582

Albertsson,

RA.;

Johansson, O. y Tjerneld, P. (1990). Aqueous two-phase separations en:

Separarion processes in Biotecl-znology (J.M. Asenjo Ed.), Marcel Dekker, Nueva York, 287-327.
-

Ananthapadmanabhan, K.P. y Goddard, ED. (1988). Isolation of enzymes from aqueous multiphase systems containing polymers with inverse solubility behaviour: effect of temperature, Eur. Pat. Appl., EP 262,65 1

Arakawa, T. (1986). Thermodynamic analysis of the effect of concentrated salts on protein interaction with hydrophobic and polysaccharide columns, Arcl-z. Biochem. Biophys., 248 (1),
101-105.

Arakawa, T. y Timasheff, SN. (1982). Preferential interactions of proteins with salts in concentrated solutions, Biocl-iemisrry, 21 (25), 6545-6552.

Arakawa. T. y Timasheff, SN. (1984a). Protein stabilization and destabilization by guanidinium salts, Biocliemisrry, 23 (25), 5924-5929.

Arakawa, T. y Timasheff, SN. (1984b). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts: balance between hydration and salt binding, Biochemisrry, 23 (25), 59125923.

Argirakos, O.; Thayanitliy, K. y Wase, D.A.J. (1992). Effect of immobilization on ffie production of alpha-amylase by an industrial strain of Bacillus amyloliquefaciens, .L Chem. Technol.
Biotechnol., 53 (1), 33-38.

Asenjo, JA. (1990). Selection of operations en: Separation processes in biotecl-nology (JA. Asenjo Ed.). Marcel Dekker, Nueva York, 3-16.

Asenjo, JA, y Patrick, 1. (1990). Large-seale protein purification en: Protein pur~fication
applicarions: a practical approach (ELy. Harris y 5. Angal Eds.), IRL Press, Oxford, 1-28.

Babu, P.SR. y Venkatram, T. (1989). Immobilzation of alpha-amylase and glucoamylase on a modified cellulose matrix, Indian Chem. Eng., 31(2), 49-54.

Eeech, SC. (1953). Acetone-butanol fermentations of starches, AppL Microbiol., 2, 85-95.

42

INTRODUCCIN

Belter, PA. (1985). Filtration of fermentation broths en: Compre/zensive biotechnology (vol. 2), (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxford, 347-350.

Boel, E.; Brady, L.; Brzozowski, A.M.; Derewenda, Z.S.; Dodson, 0.0.; Jensen, V.J.; Petersen,

S.B.; Swift, H.; Thim, L y Woldike, H.F. (1990). Calcium binding in alpha-amylases: An X-ray diffraction study at 2. lA resolution of two enzymes from Aspe rgillus, Biochemisrry, 29 (26),
6244-6249.
-

Brady, RL,; Brzozowski, A.M.; Derewenda, Z.S.; Dodson, E.J. y Dodson, 0.0. (1991). Solution of the structure of Aspergillus niger acid alpha-amylase by combined molecular replacement and multiple isomorphous replacement methods, Acta Crvst., B47, 527-535. Buckley, J.J. y Wetlaufer, DB. (1989). Use of the surfactant 3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammoniopropane sulfonate in hydrophobic interaction chromatography Clromaogn, 464, 61-71. of proteins, J.

Buckley,

J.J.

y Wetlaufer,

D.B. (1990). Surfactant-mediated hydrophobic interaction

1 Chrnmatogn,

chromatographyofprote~n~
-

oraiient eliitinn

518, 99-110.

Buisson, 0.; Due. E.; Payan, E. (1987). Three dimensional structure of porcine pancreatic alpha-

amylase at 2.9 A resolution. Role of calcium in structure and activity, EMBO .1.. 6 (13), 39093916
-

Busta, FE.: Schmidt. BE. yMacKay, L.L. (1977). Methodofproductionandrecovery of protein

from food wastes. LS. Patent4,018,650.

Campbell, L.L. (1954). Crystallization of alpha-amylase from a thermophilic bacterium, .1? Am. Clenz. Soc., 76(20), 5256.

Carsen, M. (1994). a-Amylase production by Aspergillus oryzae, PhD Thesis, Department of Biotechnology, Techical University of Denmark.

Carsen, M.; Nielsen, J. y Villadsen, i. (1996). Kinetic studies of acid-inactivation of u-amylase from Aspergillus o?yzae, Chem. Eng. Sci.. 51(1), 37-43.

Christensen, T.; Woeldike, H.; Boel, E.; Mortensen, S.B.; Hjortshoej, K.; Thim, L. y Hansen, MT.

(1988). High tevel expression of recombinant genes in Aspergillus o?yzae, Bio/Technology, 6

(12), 1419-1422.
-

Cooke, N.: Shieh, P. y Miller, N. (1990). High performance hydrophobic interaction chromatography of proteins. LC-GC

m.,

3(1), 8-13.

Creighton, TE. (1993), en: Proteins: siructures and molecular properries (2~ ed.), W.H. Freeman.

PURIFICACIN DR a-AMILASA DE Asperg/tus oryzae POR ADSORCIN

43

Nueva York.
-

Cuatrecasas, P.; Wilchek, M. y Anfinsen, C.B. (1968). Selective enzyme purification by affinity chromatography, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 61, 636-643.

De Cordt, 5.; Avila, 1.; Hendrickx, M. y Tobback, P. (1994). DSC and protein-based timetemperature integrators: case study of cz-amylase stabilized by polyols and/or sugar, Bioteclinol.
Bioeng., 44(7), 859-865

Dekker, M.; Koenen, HM.; Van,t Riet, K. (1991). Reversed micellar-membrane-extraction of

enzymes, Trans. IChemE, Pan C (Food Bioprod. Proc.), 69 (3), 54-58

Dobransky, T.; Polivka, L.; Hass, 1., Sova, O. y Petrvalsky, E. (1987). Purification of alphaamylase by industrial autofocusing, 1 Chromatogr., 411,486-489.
-

Drager, R.R.; Regnier, FE. (1986). Application of the stoichometric displacement model of retention to anion- exehange chromatography of nucleic acids, 1 Chromaogr., 359, 147-155.

El

Rassi, Z.; de Ocampo, LP. y Bacolod, M.D. (1990). Binary and ternary salt gradients in

hydrophobic-interaction chromatography of proteins, .1 Chromatogr., 499, 141-152.

-

Engler, C.R. (1985). Disruption of microbial cels en: Comprehensive biotechnology (vol. 2),

(M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxtbrd, 305-324.

-

Er-el, Z.; Zaidenzaig, Y. y Shaltiel, 5. (1972). Hydrocarbon coated sepharoses usedin purification
of glycogen phosphorylase, Biochem. Biophys. Res. commun., 49, 383-390.

Fane, A.G. y Radovich, J.M. (1990). Membrane systems en: Separation processes in bioechnology (3M. Asenjo Ed.), Marcel Dekker, Nueva York, 209-262.

Farber, G.K. y Petsko, G.A. (1990). me evolution of ct/~ barrel enzymes, TJBS, 15, 228-234. Fausnaugh, J.L.; Kennedy, L.A. y Regnier, FE. (1984). Comparison of hydrophobic-interaction and reversed-phase chromatography of proteins, .1? Chromaogr., 317, 141-155.

Fausnaugh, J.L. y Regnier, F.E. (1986). Solute and mobile phase contributions to retention in hydrophobic interaction chromatography of proteins, 1 Chromatogr., 359, 13 1-146.

Fenc, Z. y Pazarova, J. (1982). Production of extracellular enzymes in continuous culture,

Folia Microbiol. (Praga), 27, 340-349.

Frost, G.M. y Moss, D.A. (1987). Production of enzymes by fermentation en: Biotechnology

(vol. 7a, Enzyme technology) (JE. Kennedy Ed.), VCH Publishers, Weinheim, 65-211.
-

Gabler, F.R. (1985). Cel processing using tangential flow filtration en: Comprehensive
bioechnology (vol. 2), (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxford, 351-366.

44

INTRODUCCIN

Gehas, J. y Wetlaufer, D.B. (1990). Isocratie hydrophobic interaction of dansyl amino acids. Correlation of hydrophobicity and retention parameters, 1. Chromatogi-., 511, 123-130.

Geng, X.; Guo, L.; Chang, J. (1990). Study of te retention mechanism of proteins in hydrophobic interaction chromatography, 1 Chromatogr., 507, 1-23

Ghildyal, NP.; Prema, P.; Srikanta, 5.; Sreekantiah, K.R. y Alimed, S.Y. (1980). Studies on the
production of alpha-amylase in submerged culture, 1 Food. Sci. Technol., 17, 165-167.

Glatz, CE. (1990). Precipitation en: Separation processes in biorechnology (J.M. Asenjo Ed.),
Marcel Dekker, Nueva York, 329-356.

Gooding, DL.; Schmuck, M.N.; Nowlan, MP, y Qooding, K.M. (1986). Optimization of

preparative hydrophobic interaction chromatography purification methods, .L Chromatogr., 359,

331-337.
-

Graber, M.; Combes, D. (1990). Action pattern of alpha-arnylase from Aspergillus oryzae in concentrated media, Biotechnol. 3ioeng., 36, 12-18

Guo, Y.; Lou, F.; Peng, Z.Y.; Yuan. Z.Y. y Korus, R.A. (1990). Kinetics of growth and aamylase production of immobilized Bacillus subrilis in an airlift bioreactor, Bioechnol. Bioeng.. 35, 99- 102.

Halicioglu, T. y Sinanoglu, 0. (1969). Solvent effects on cis-trans azobenzene isomerization: a

detailed application of a theory of solvent effects on molecular association, Ann. N. Y. Atad. Sci., 158, 308-3)7.
-

Hanzawa, 5.: Odagawa, A.; Sakata, H.; Takeuchi, M. y Ichishima, E. (1986). Degradation of aamylase from Aspergillus otyzae with firmly bound proteinases at pH 3.0, Current Microbiol., 14, 235-239

Heiitz, M.L.; Kennedy, L.; Kopaciewicz, W.; Regnier, FE. (1988). Chromatography of proteins on hydrophobic interaction and ion-exchange chromatographic matrices: mobile phase contributions to selectivity, 1 Chromatogr., 443, 173-182.

filie, J.D.R. (1990). The use of enzymes in breadmaking to replace emulsifiers, Gist-brocades
B.V. Teclmnical Information.

Hjertn. 5. <1973). Sorne general aspects of hydrophobic interaction cbromatography. 1 Chromatogr., 87, 325-331.

Horstman, B.J. (1989), en: Affinity adsorption on agarose matrices, PhD. mesis. Department of Chemical Engineering, University of Cambridge.

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADsORCIN

45

Horvth, C.; Melander, W. y Molnar, 1. (1977). Liquid chromatography of ionogenic substances with nonpolar stationary phases, Anal. Chem., 49,142-154. Jarniewicz, J. y Wlodarczyk, Z. (1978). Amylolytic fangal preparations for distilleries, Acta
AIim. Po,!., 4(1), 93-105.

Kato, Y.; Kitamura, 1. y Hashimoto, T. (1983). High performance hydrophobic interaction chromatography of proteins, Ji Chromatogr., 266, 49-54. Katti, A.; Man, Y.F. y Horvth, C. (1987). Protein surface area and retention in hydrophobic interaction ehromatography, Chromatographia, 24, 646-650. Kekos, D. y Macris, B.J. (1983). Production and characterisation of amylase from Calvatea
gigantea, Appl. Environ. Microbiol., 45(3), 935-941.

Kenney, A.C. (1990). Automation in proteinpurification: the use ofexpert systems for control of processes in biotechnology en: Separation processes in biotechnology (J.M. Asenjo Ed.), Marcel Dekker, Nueva York, 603-616 Klingeberg, M.; Vorlop, K.D. y Antranikian, 0. (1990). Immobilization of anaerobie thermophilic bacteria for the production of cel-free thermostable alpha-amylases and pullulanases, Appl. Microbiol. Bioechnol., 33 (5), 494-500.
-

Kopaciewicz, MAR.,

Fausnaugh, J.; Regnier, F.E.

(1983). Retention model for high-

performance ion-exchange chromatography, J. Chromatogr., 266, 3-21.

-

Krauczyk, T. (1997). Detergent enzymes, Inform, 8(1), 6-14. Krishna, R.; Wesselingh, JA. (1997). The Maxwell-Stefan approach to mass transfer, Chem.
Eng. Sci., 52(6), 861-911

Kula, MR. (1985). Liquid-liquid extraction of biopolymers en: Conmprehensive biotechnology

(vol. 2), (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxford, 45 1-471.

-

Kundu, A.K. y Das, 5. (1970). Production of amylase in liquid culture by a strain of Aspergillus
oryzae, AppL Microbiol., 19 (4), 598-603.

Langois, D.P. y Dale, U.K. (1940). US. Patent 2,202,609.

Lee, J. y Parulekar, S.J. (1993). Enhanced production of alpha-amylase in fed-batch cultures of Bacillus Subtilis TNlO6[pAT5Y, Biotechnol. Bioeng., 42, 1142-1150.

Levin, D. y Joyet, P. (1986). Vecteurs dexpression de lalpha-amylase dans Bacillus subtils, souches obtenues et procd de prparation dalpha-amylase, Eur. Pat. Appl. EP0205371.

Levitzki, A. y Steer, ML. (1974). The allosterie activation of mammalian alpha-amylase by

46 chloride, Eur. Ji Biochem., 41(1), 171-180

-

INTRODUCCIN

Lindeman, L.R. y Rocchiccioli, C. (1979). Ethanol in Brazil: brief sumrnary of the state of Ihe industry in 1977, Bioechnol. Bioeng., 21,1107-1119.

Linko, Y.Y.; Li, OX.; Zhong, L.Ch.; Linko, 5. y Linko, P. (1988). Enzyme production by

immobilized cels, Medmods Enzymol., 137, 686-696.

-

Linko, Y.Y.; Saarmnen, P. y Linko, M. (1975). Starch conversion by soluble and immobilized alpha-amylase, Biotechnol. J3ioeng., 17, 153-165.

MaeGregor, EA. y Svensson, B. (1989). A super-seeondary structure predicted to be common to

several ct-l,4-D-glucan-cleaving enzymes, Biochem. 1., 259,145-152.

Malorella, B.L.; Wilke, C.R. y Blanch, H.W. (1981). Alcohol production and recovery, Adv.
Biochem. Eng., 20, 43-49.

Malik, M.A. y Chaudhary, MI. (1977). Effect of carbon source on te production of alphaamylase, Pak. Ji J3iochem., 10(1), 14-18.

Manning,

GB.

Campbell,

L.L.

(1961).

Thermostable

~-amylase

of

Bacillus

searohernzophilus. 1. Crystallyzation and sorne general properties, Ji Biol. Chem., 236, 29532957.

Manning, GB.; Campbell, L.L. y Foster, R.J. (1961). Thermostable cx-amylase of Bacillus
uearothermophilus. II. Physical properties and molecular weight, Ji Biol. Chem., 236, 2958-2961.
-

Mashell, 0. (1959). Production aud application of lactie acid, ini Eng. Chem., 35, 283-290. Matsuura, Y.; Kusunoki, M.; Date, W.: Harada, 5.; Bando, 5.; Tanaka, N. y Kakudo, M. (1979). Low resolution crystal structures of taka-amylase A and its complexes with inhibitors, Ji Biochem., 86 (6% 1773-1783.

Matsuura, Y.; Kusunoki, M.; Harada, W.; Tanaka, N.; Iga, Y.; Yasuoka, N.; Toda, H.; Narita, K. y Kakudo. M. (1980). Molecular structure of taka-amylase A. 1. Backbone chain folding at 3 A resolution, J. Biochem., 87, 1555-1558.

Matsuura, Y.; Kusunoki, M.; Harada, W. y Kakudo, M. (1984). Structure and possible catalytic residues of taka-amylase A, Ji Biochem., 95(3), 697-702.

Melander, W. y Horvth, C. (1977). Effect of neutral salts on te formation and dissociation of protein aggregates, Ji Solid Phase Biociem., 2(2), 141-161.

Melander, W.R.; Corradii, D. y Horvth, C. (1984). Salt-mediated retention of proteins in hydrophobic-interaction chromatographv. Application of solvophobic lheory, 1. Chromaiogr.,

PURIFICACIN DE 317, 67-85.

-

x-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

47

Meyrath, J. y Bayer, 0. (1980). Environimental factors aud cultivation techniques in fangal alphaamylase production, Proce. FEBSMeet. (md. Clin. Enzymol.), 61, 33 1-338.

Minobe, 5.: Nakajima, FI.; Itoh, N.; Funakoshi, 1. y Yamashina, 1. (1979). Structure of a major oligosaecharide of taka-amylase A, J. Biochem., 86,1851-1854.

Nakadai, T. y Nasuno, 5. (1988). Culture conditions of Aspergillus oryzae for production of enzyme preparation, Ji Fermen. Technol., 66 (5), 525-533.

Nakamura, L.K. y Crowell, C.D. (1979). Lactobacillus amylophillus: A new starch hydrolysing sp. from swine-waste corn fermentation, Dey. md. Microbiol., 20, 53 1-540.

Namer, 1.; Rivas, EM. y Beil, A. (1987). Aspectos tecnico-economicos de la produccion simultanea de alfa-amilasa y dextranasa, Revista JOIDCA, 21(2), 13-16.

Norman, BE. (1981). New developments in starch syrup tecbnology en: Enzyme and food
processing (G.G. Birch, N.; Blakebrough y K.J. Parker Eds.), Applied Science Publishers,

Londres, 15-50.
-

Novo Nordisk (1992), en: Enzimas campos de aplicacin, Novo Nordisk MS, Bagsv~rd.
-

Novo Nordisk (1995). Mayor concentracin de los negocios en el futuro, Biotimes, 3,4-5.
Peppler, H.J. y Reed, 0. (1987). Enzymes in feod and feed processing en: Bioechnology (vol, 7a

Enzyme technology) (J.F. Kennedy Ed.), VCH Publishers, Weinheim, 549-603.

-

Piggott, R.P.; Rossiter, A.; Ortlepp, SA.; Pembroke, J.T. y Ollington, J.F. (1984). Cloning on
Bacillus subtilis of an extremely thermostable a-amylase: comparison with other cloned heatstable

a-amylases, Biochem. Biophys. Res. Commun., 122 (1), 175-183.

-

Qian, M.; Haser, R. y Payan, F. (1993). Structure aud molecular model refinement of pig pancreatie alpha-amylase at 2.1 Aresolution, J. Mol. Biol., 231, 785-799.

Raimbaud. E.; Buleon, A.; Prez, 5. y Henrissat, B. (1989). Hydrophobic cluster analysis of the
primary sequences of alpha-amylases, InI. 1 Biol. Macromol., 11, 217-225.

Ramasubbu, N.; Bhandary. K.K.; Seannapieco, F.A.; Levine, Mit (1991). Crystallization and

preliminary X-ray difraction studies of human salivary a-amylase. Proeeins: Struct. Func.
Genetics, 11, 230-232
-

Roe, 5. (1989). Separation based on structure en: Protein purifkcation methods. A practical approach, (E.L.V. Harris y 5. Angal Eds.) RL Press, Oxford.

Rozie, H.; Bonte, A; Vant Riet, K; Visser, J.; Rombouts, F.M. (1991). Adsorption and

48

INTRODUCCIN

desorption characteristics of bacterial alpha-amylases on cross-linked potato starch, Biotechnol.

Appl. Biochem., 13 (2), 181-195
-

Saito, N. y Yamamoto, K. (1975). Regulatory factors affecting alpha-amylase production in

Bacillus licheniformis, Ji Bacteriol., 121 (3), 848-856.

Schmidt, AS.; Ventom, A.M. y Asenjo, JA. (1994). Partitioning and purification of a-amylase in aqueous two-phase systems, Enzyme Microbio,!. Technol., 16(2), 131-142

Scopes, R.K. (1981). Quantitative studies of ion exchange and aftiity elution chromatography of enzymes, Anal. Biochem.. 114, 8-18.

Scopes, R.K. (1987), en: Protein purification. Principies and practice (Y ed.), Springer-Verlag,
Nueva York.

Shaltiel, 5. y Er-el, Z. (1973). Hydrophobic chromatography. Use for purification of glycogen synthetase, Proc. Nra,!. Acad. Sci. USA, 70(3), 778-781.

Sinanoglu, O. y Abdulnur, 5. (1965). Effect of water and other solvents on the structure of biopolymers, Fed. Procc. Fed. Am. Soc. Exp. Bio,!., 24(2, part III), 512-523.

Siso, MIO.; Graber, M.; Condoret, J.S. y Combes, D. (1990). Effect of difftsional resistances on

the action pattern of immobilized alpha- amylase, .1? Chem. Techno,!. Biotechno,!., 48 (2), 185-200.
-

Somers, W.; Vant Riet, K. (1990). Downstream processing of alpha-amylase by aftiity

interactions, Proc. Sth Rur. Congr. Bioechnol., 2, 774-777

-

Somers, W.A.C.; Koenen, P.H.M.; Rozie, H.J.; Visser, J.; Romboust, F.M. y Vant Riet, K. (1995). Isolation of ct-amylase on crosslinked starch, Enzyme Microbiol. Techno,!., 17(1), 56-62

Stein, EA. y Fischer, EH. (1958). me resistance of alpha-amylases towards proteolytic attack, Ji Biol. Chem., 232 (2), 867-879.

Switt, H.J.; Brady, L.: Derewenda, Z.S.; Dodson, E.; Dodson, G.G.; Wrkenburg, J.P. y Wilkinson, A. (1991). Structure and molecular model refinement of Aspergillus oryzae (TAKA) alphaamylase: An application of the simulated-annealing method, Acta Cryst., B47, 535-544.

Szepesy, L. y Horvth. C. (1988). Specific salt effects in hydrophobic interaction chromatography

of proteins, Chromaographia, 26,13-18.

Szepesi, L.; Vida, L.; Toth, M.; Laszlo, E. (1990). Investigation of sorne alpha-amylases by high performance hydrophobic interaction chromatography, 1 Chromatogr., 499, 197-204

Szepesy, L. y Rippel. O. (1992a). High perforniance hydrophobic interaction chromatography of proteins. LC-GC m., 5 (11), 24-29.

PURIFICACIN DE

a-AM[LAsA DE Aspergil,!us

oryzae POR ADSORCIN

49

Szepesy, L. y Rippel, G. (1992b). Comparison and evaluation of HIC columns of different hydrophobicity, Chromaographia, 34(5-8), 391-397.

Tada, 5.; limura, Y.; Gomi, K.; Takahashi, K.; Hara, 5. y Yoshizawa, K. (1989). Cloning and nucleotide sequence of the genomic taka-amylase A gene of Aspergillus oiyzae., Agric. Rio,!.
Chem.. 53 (3), 593-599.

Takamine, J. (1894). Process of making diastatic enzyme, US. Patent 525,823. Toda, H.; Kondo, K. y Narita, K. (1982). me complete amino acid sequence oftaka-amylase A,
Proc. Japan Atad., 58 Ser. B, 208-212.

Tomazic, S.J. y Klibanov, M. (1988). Mechanisms ofirreversible thermal inactivationof Bacil/us a-amilases, Ji Rio,!. Chem., 263 (7), 3086-3091.

Tomazic, S.J. y Klibanov, M. (1988). Why is one Bacillus alpha-amylase more resistant against irreversible thermoactivation than another?, Ji Rio,!. Chem., 263 (7), 3092-3096.

Tonkova, A.; Manolov, R. y Dobreva, E. (1993). Thermostable alpha-amylase from derepressed

Baci,!lus lichenformis produced in high yields from glucose, Process Biochem., 28 (8), 539-542.

Tutunjian, RS. (1985). Ceil separations with hollow fiber membranes en: Comprehensive
bioechno,!ogy (vol. 2), (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxford, 367-381

Ueda, 5.; Zenin, C.T.; Monteiro, DA. y Park, Y.K. (1981). Production of ethanol from raw

cassava starch by non-conventional fermentation method, Biotechno,!. Bioeng., 23, 29 1-299.

-

Ulbrich, R.; Schellenberger, A. y Damerau, W. (1986). Studies on the thermal inactivation of immobilized enzymes. Bioechnol. Bioeng., 28, 511-522.

Vallee, B.L.; Stein, E.A.; Sumerwell, W.N. y Fischer, E.H. (1959). Metal content of alphaamylases of various origins, Ji Rio,!. Chem., 234(11), 2901-2905.

Velayudhan, A. y Horvth, C. (1986). On the stoichiometric model of electrostatic interaction chromatography for biopolymers, ./? Chromatogr., 367, 160-162.

Velayudhan, A. y Horvth, C. (1994). Adsorption and ion-exchange isotherms in preparative chromatography, Ji Chromatogr A, 663, 1-10.

Venkatasubramanian, K. (1978), en: Enzyme: time inerface between echnology and economies (J.P. Dansky y B. Wolnak Eds.), Marcel Dekker, Nueva York.

Vihinen, M. y Mntsdffi, P. (1989). Microbial amylolytic enzymes, Chi. Rey. Biochem. Mo,!. Rio,!., 24, 329-418.

50

INTRODUCCIN

Wang, N.H.L. (1990). Ion exehange in puritication en: Separation processes in bioechno,!ogy (JA. Asenjo Ed.). Marcel Dekker, Nueva York, 359-400.

Wei, D.; Parulekar, S.J.; Stark, B.C. y Weigand, W.A. (1989). Plasmid stability and ct-amylase

production in batch aud continuous cultures of Bacil,!us subilis TNIO6[pATS], Biotechno,!.

Bioeng., 33, 1010- 1020.
-

Wheelwright, SM. (1987). Designing downstream processes for large-seale protein purification,
JJio/Jechnology, .5, 789-793.

Wilke, C.R.; Yang, R.D.; Scamanna, AiF. y Freitas, R.P. (1981). Raw material evaluation and process development sndies for conversion of biomass to sugars and ethanol, Biotechnol.
Bioeng., 23, 163-183.

Wykes, .J.R.; Dunnil, P. y Lilly, M.D. (1971). Immobilisation of ct-amylase by attachment to

soluble support materials, Biochim. Biophys. Acta, 250, 522-529.

-

Wu, S.L.; Benedek, K. y Karger, B.L. (1986a). Thermal behavior of proteins inhigh-performance hydrophobic-interaction ctiromatography, Ji Chromaogr., 359,3-17.

Wu, S.L.: Figueroa, A. y Karger. EL. (1986b). Protein conformational effects in hydrophobic

interaction chromatography. Retention characterization and the role of mobile phase additives and
stationary phase hydrophobicity, Ji Chromaogr.,
37!, 3-27.

Yakubi, M.; Ono, N.; Hoshino, K. y Fukui, 5. (1977). Rapid induction of alpha-amylase by
nongrowing micelya of Aspergillus oryzae, Appl. Environ. Microbio,!., 34. 1

Yamaguchi, H.; Ikenaka, 1. y Matsushima, Y. (1971). me complete sequence of a glycopeptide

obtained from taka-amylase A, Ji Biochem., 70, 587-594.

Yamamoto, 5.; Nomura, M. y Sano, Y. (1987). Adsorption chromatography of proteins: determination of optimum conditions, MC/mE 1., 33 (9), 1426-1434.

Yamamoto, 5.; Nomura, M.; Sano, Y. (1992). Stepwise elution chromatography as a method for both purification and concentration of proteins, Chem. Eng. Sci., 47(1), 185-188 Yarmush, ML.: Antosen, K. y Yarmush. DM. (1985). Molecular sieve chromatography en:
Comprehensive biotechno,!ogy (vol. 2) (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxtbrd, 489-505.

Yarmusb, ML. y Colton, C.K. (1985). Aftiity clmronatography en: Comprehensive

bioteclnology (vol. 2) (M. Moo-Young Ed.) Pergamon Press, Oxford, 507-521.

Yoo. Y.J.; Cadman, T.W.: Hong,

./.

y Hatch.

R.T. (1988). Fed-batch trrnentation for the

production of alpha-amylase by Bacillus amyloliquefaciens, f3ioechno,!. Bioeng.. 31(5), 426-432.

PURIFICACIN

DE CX-AMILASA DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCIN

51

Zhang, X.Z.; Xie, 5.; Wu, X.; Jin, F. y Li, X. (1994). Purification and characterization of
thermostable c-amylase II from Badillus sp-JiS strain, Enzyme Microbiol. Technol., 16,
985-990

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE

Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

53

2. TRANSFERENCIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO QUMICO EN LOS PROCESOS DE ADSORCION

4-

2.1.- INTRODUCCIN La cantidad de protena o cualquier otro adsorbato que un adsorbente puede retener, viene determinada por el equilibrio qumico existente entre ambos. Este ltimo tambin establece la
separacin entre los diferentes componentes de una mezcla que una columna cromatogrfica es capaz de resolver. Aun siendo un factor de gran importancia en la eleccin de un adsorbente, la capacidad del mismo no es el nico a tener en cuenta. Para el diseo de procesos de adsorcin es fundamental el conocimiento de la velocidad con la que se alcanza el equilibrio entre las fases as como la velocidad de transporte de las molculas de adsorbato desde el seno del finido, en el que se encuentra, hasta los sitios de adsorcin en la superficie del adsorbente.

54

TRANSFERENcIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO

QulsuCo EN LOS PRocEsos DE ADSORCIN

La adsorcin de un soluto sobre la superficie interna de una partcula porosa de adsorbente

consta de varias etapas de transferencia de materia en serie. La velocidad relativa de cada una de ellas frente al resto determinar la etapa o etapas controlantes de la velocidad global del proceso. Dichas etapas pueden agruparse en tres procesos principales:
-

Difusin externa: la molcula de adsorbato debe difundirse desde el seno de la

disolucin hasta la superficie externa de la partcula de adsorbente a travs de la capa lmite externa que la rodea.
-

Difusin interna: el adsorbato se difunde desde la superficie externa de la pancula a

travs del interior de los poros hasta los puntos de adsorcin mediante uno o varios mecanismos difusionales que se describirn a continuacin.
-

Adsorcin: se produce el equilibrio de adsorcin propiamente dicho entre el adsorbato

y los sitios de adsorcin de la superficie interna de la partcula de adsorbente. Junto a todo ello, en el caso de trabajar en sistemas en los que el adsorbente se encuentre dispuesto como fase estacionaria en el interior de una columna, habr que tener en cuenta los posibles efectos que la dispersin axial y radial tienen sobre la velocidad de transferencia de materia.

2.2.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIA En este apartado se revisan los mecanismos de transporte que se presentan en los procesos de
adsorcin en slidos porosos. Cada uno de ellos viene determinado por las caractersticas fisicoqumicas del adsorbato y del adsorbente as como por las condiciones del medio en el que se encuentran. La fuerza impulsora de cada uno de los mecanismos define la expresin de la velocidad con la que dicho transporte se realiza. El anlisis cintico de un sistema concreto permitir conocer la

etapa o etapas controlantes de la velocidad global del proceso.

2.2.t.- Transferencia de materia en la capa lmite externa El flujo de un soluto a travs de la capa lmite externa que rodea a una partcula slida se
considera linealmente dependiente de la diferencia entre la concentracin de dicho soluto en el seno de la disolucin y en la superficie exterior de la partcula, lo cual puede expresarse mediante la relacin matemtica descrita por la ecuacin 2.1.

-h

=kf(CCKR)

[2.lj

La resistencia a dicho flujo viene caracterizada por el denominado coeficiente de transferencia de materia externo,
~.

Furusawa y Smith (1973) describen un procedimiento para

PURIFICACIN DE

U-AMILA5A DE Aspergil/us

orvzae POR ADSORCIN

55

determinar experimentalmente el valor de k1 a partir de la pendiente a tiempo cero de la curva cintica

de adsorcin. Existen diversas ecuaciones empricas para la estimacin de dicho parmetro, muchas de ellas (Wakao y Funazkri, 1978; Wilson y Geankoplis, 1966) correlacionan el nmero de Sherwood con otros nmeros adimendionales, como son el de Reynolds y Schmit. Estas, sin embargo, son de difcil aplicacin a sistemas de tanque agitado debido a la. dificultad de determinar la velocidad superficial de las partculas suspendidas (Fritz el al., 1980). Para la estimacin del coeficiente de transferencia de materia externo en sistemas de tanque agitado en fase lquida, se puede utilizar la siguiente correlacin (Geankoplis, 1983):
9

kf =

2 DAB d

+0.31

hP DAR )t

(A;i~}

[mis]

[2.2]

donde d~ es el dimetro de partcula en m, g es la viscosidad de la solucin en Pas, p es la densidad de la disolucin en kg/mt Ap es la diferencia de densidad entre las partculas y la fase fluida en
3, g 9.81 m/s2 es la constante de aceleracin de la gravedad y D,~ la difusividad molecular del kg/m

soluto en la fase fluida en m2/s.

2.2.2.- Transferencia de

materia en el interior de los poros

El transporte de materia a travs del interior de los poros de una partcula de adsorbente puede deberse a varios mecanismos difusionales, que pueden darse de forma individual o conjunta.

Difusin molecular A pesar de que el mecanismo de difusin molecular es, fundamentalmente, similar en fase gaseosa y en fase lquida, la teora que soporta esta ltima est mucho menos desarrollada. Dicho mecanismo se caracteriza porque la resistencia al flujo se produce debido a las colisiones entre las molculas de soluto que se difunden. Para la determinacin del coeficiente de difusin molecular en fase lquida existen un gran nmero de correlaciones empricas y semiempricas basadas en las ecuaciones de Nernst-Einstein y Stokes-Einstein GMvarez eta,!., 1982). Para adsorbatos no electrolitos cuya masa molecular sea inferior, aproximadamente, a 1000, la ecuacin de Wilke y Chang (1955) es una de las ms habitualmente utilizadas: 1.17 1016 (VB M D AB
=

5)

6 ~AB v4

r, [m / sj

[2.3]

donde VB es el parmetro de asociacin del disolvente (para el agua tiene un valor de 2.6, aunque otros autores recomiendan un valor de 2.26 (lvarez e al., 1982)), MB es la masa niolecular del

56

TRANSFERENCIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO

QUtNnco EN LOS PROCESOs DE ADSORCIN

disolvente, T es la temperatura en kelvin; I1B es la viscosidad del lquido en as y VA es el volumen molar del soluto a su temperatura normal de ebullicin en m3 /molkg.

Para solutos de mayor masa molecular, como es el caso de la a-amilasa, se ha usado la

correlacin de Polson (1950), basada en la ecuacin de Stokes-Einstein:

D AB =9A1W15

(MV3

[m~ , s]

[2.4]

donde MA es la masa molecular del soluto que se difunde.

Difusividad de Knudsen En sistemas gaseosos, cuando el dimetro de poro es pequeo o la presin es suficientemente
baja, puede ocurrir que las colisiones entre molculas de adsorbato y las paredes internas de los poros sean ms frecuentes que ias colisiones entre dos molculas de adsorbato. En este caso, una vez que la molcula de adsorbato ha chocado con la pared interna del poro, se adsorbe y es reemitida inmediatamente en una direccin aleatoria. Este mecanismo de transferencia de materia en el interior del poro se denomina difusin de Knudsen y el coeficiente de difusin que lo caracteriza puede ser

estimado mediante la siguiente correlacin (Ruthven, 1984): DK = 97.0 R~

1)

[m2

/s]

[2.5]

Debido a que en fase lquida el recorrido libre medio de las molculas de soluto es muy pequeo, se considera que este mecanismo no es significativo y, por tanto, no controla la velocidad de
transporte de materia.

Dfusividad en macroporos
Dependiendo del sistema adsorbato-adsorbente as como de las condiciones de operacin. pueden darse situaciones de transicin entre los diferentes mecanismos difusionales. En el caso de

gases, en la regin en la que tanto la difusin molecular como la difusin de Knudsen son
significativas, la difusividad en la fase lquida puede definirse mediante la siguiente expresin (Ruthven, 1984): 1
D

1
D

DK

12.6]

La magnitud de la difusividad de un soluto en la fase lquida del interior de los poros de un

slido es menor que la que corresponde a la ditXisividad molecular de dicho soluto en disolucin. Esto

PURIFICAClN DE tX-AMILA5A

DnAspergillus ory zae POR ADSORCIN

57

se debe a que junto a los mecanismos difusionales que se dan en el interior del poro, el flujo de materia se reduce debido a la propia estmctura y geometra porosa. Esta situacin hace que la estimacin terica del coeficiente de difusin en los poros no sea una tarea siempre posible por lo que se suele recurrir a la experimentacin para una determinacin exacta. El factor de tortuosidad, r, es el parnetro que relaciona los coeficientes de difusin en los poros y molecular de la siguiente manera: ~ D
t

[2.7]

El factor de tortuosidad varia inversamente con la porosidad de la partcula y su valor suele

estar en el intervalo 2-6. Su estimacin terica requiere una caracterizacin muy profunda y compleja de la estructura porosa por lo que habitualmente se determina experimentalmente para cada adsorbente.

El flujo a travs del lquido que llena los marroporos de una partcula esfrica se puede expresar, considerando constante la diflisividad, de acuerdo con una expresin de similar forma a la
ley de Fick:

1 aF 2 Dcl =D r2dr Ir [ dr J

[2.8]

DiJisividad superficial El flujo de adsorbato a travs de la capa de molculas adsorbidas a la superficie del adsorbente se conoce como difusividad superficial. La determinacin del valor de la difusividad superficial no puede hacerse por medidas directas ya que al ser un proceso en paralelo al flujo de adsorbato a travs del poro en la fase fluida, sera necesario eliminar la contribucin correspondiente a este ltimo (Schneider y Smith, 1968).
Estudios realizados en fase gaseosa indican que la difusividad superficial es significativa

cuando el espesor de la capa adsorbida es grande y el tamao de poro es relativamente pequeo. En

general, en estos casos, el flujo a travs de la fase fluida es fundamentalmente debido al mecanismo

de difusin de K.nudsen. Para la difusin superficial, la expresin del flujo msico debido a dicho mecanismo tiene una forma similar. En este caso la fuerza impulsora es el gradiente radial de concentracin superficial adsorbida en el interior de la partcula (ecuacin 2.9):

..

60

TRANSFERENcIA DE MATEPM Y EQUILIBRIO QUMICO EN LOS PROCESOS DI? ADSORCIN

desorcin respectivamente. Tanto la velocidad de adsorcin como la de desorcin suelen considerarse muy elevadas en

comparacin con las etapas de difusin que se dan en los procesos de adsorcin, por lo que puede considerarse que, en todo momento, la concentracin de adsorbato en el liquido del interior del poro
se encontrar en equilibrio local con la concentracin adsorbida en la superficie interna del adsorbente. De esta forma la velocidad global del proceso de adsorcin en slidos porosos viene determinada por las etapas difusionales en el interior de las partculas.

2.3.- EQUILIBRIO DE ADSORCIN. ISOTERMAS

En el presente apartado se examinar el equilibrio entre adsorbato y adsorbente as como las tbrmas de expresar el mismo, centrndose principalmente en los sistemas de adsorcin en [ase lquida.

2.3.1.- Introduccin

Las isotermas correspondientes al equilibrio de adsorcin, como su nombre indica, describen la distribucin del adsorbato entre la fase estacionaria y la fase fluida a temperatura constante. Esta ltima condicin se corresponde con la suposicin de que, en la mayora de los procesos de adsorcin en fase lquida, ni la transicin de fases ni la impulsin de la fase mvil genera efectos significativos
de transferencia de calor que invaliden la hiptesis planteada. La prctica totalidad de los desarrollos tericos relacionados con la adsorcin se han llevado a cabo en fase gaseosa por la posibilidad de conocer con mayor detalle y profundidad las interacciones y caractersticas de las dos fases presentes. La adsorcin en fase lquida ha aplicado, adaptado y, en su caso, discriminado los modelos ya existentes para poder explicar y predecir el comportamiento observado en dichos sistemas.

La forma grfica de la isoterma de adsorcin difiere en funcin del mecanismo de interaccin entre el adsorbato y el adsorbente, de las caractersticas fisicoqumicas de ambos y de las propiedades porosas del adsorbente. Una clasificacin clsica de los diferentes tipos de isotermas, atendiendo a su
forma, fue dada por Brunauer
(Brunauer

eta,!., 193S: Bninauer el ci.. 1940).

La isoterma tipo 1, identificada previamente (Langmuir, 1916; Langmuir, 1918), presenta una tbrma hiperblica y supone un mecanismo restringido a la adsorcin de una monocapa de molculas
sobre la superficie del slido. Adems, no considera inpedimentos ni interacciones entre molculas adyacentes adsorbidas. El tipo II tiene un similar comportamiento que el tipo a concentraciones de

adsorbato bajas, pero al aumentar esta se produce la adsorcin en multicapas, produciendo una forma
convexa a altas concentraciones. El tipo 111 adopta esta ltima configuracin debido a una distribucin

PURIFIcACIN DE U-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

61

de tamaos de poro muy amplia, lo que provoca un continuo llenado de los poros segn aumenta la

concentracin. Las isotermas tipo IV, semejantes a las tipo II, presentan un valor asinttico debido al
mecanismo de condensacin capilar. El tipo y se relaciona con las isotermas tipo III, presentando un lmite superior como en el caso de la isoterma tipo IV por similares razones. No todos estos tipos de isoterma, observados en adsorcin gas-slido, se han descrito en sistemas liquido-slido.

Otra clasificacin que agrupa los tipos anteriores en tres categoras (figura 2.3) es la siguiente:
-

Isotermas cncavas: adsorcin favorable. Isotermas convexas: adsorcin desfavorable. Isotermas que presentan punto de inflexin.

Favorable Pto. Inflexin Dcsfavorable

o z o
1

Concentracin en la fase fluida Figura 2.3: Clasificacin de las isotermas de adsorcin atendiendo a la forma de la curvatura. Aunque la forma de las isotermas nos da informacin sobre el proceso de adsorcin, es conveniente, a efectos prcticos, disponer de datos de equilibrio o, mejor aun, de una expresin matemtica que nos relacione la concentracin de adsorbato a cada temperatura en ambas fases. Existen en la literatura numerosas ecuaciones para tal fin, pudindose clasificar en dos grupos principales: las isotermas lineales y las no lineales. A continuacin se describen las condiciones en las que se presentan ambas, junto con las expresiones matemticas que las describen.

62

TRANSFERENCIA DE MATERIA Y EQUILIBRIO QUIMICO EN LOS PROCEsOs DE ADSORCIN

2.3.2.- Isoterma lineal

La forma ms simple de expresar el equilibrio entre las molculas de adsorbato en la fase

fluida y en la fase adsorbida es mediante una relacin lineal, denominada ley de Henry. Esta supone que la adsorcin se lleva a cabo sobre superficies homogneas a concentraciones suficientemente bajas como para considerar que cada molcula se encuentra aislada de las molculas vecinas. En estas condiciones, la isoterma puede expresarse de la siguiente forma: q = KA Qq donde q y y
KA Qq son la concentracin

[2.12]

de adsorbato en el adsorbente y en la fase lquida respectivamente

es la constante de adsorcin o de Henry.

2.3.3.- Isoterma no lineal

En determinados sistemas, o cuando la concentracin de adsorbato es suticientemente elevada, la tendencia lineal de la isoterma desaparece y es necesario disponer de expresiones que reproduzcan adecuadamente el comportamiento del equilibrio. Los modelos no lineales ms frecuentemente utilizados en sistemas lquidos son los basados en las isotermas de Langmuir y Freundlich.

Isoterma de Langmuir
El modelo terico en que se basa (Langmuir, 916: Langmuir, 1918) fue desarroiJado a partir de argumentos cinticos simples correspondientes a la adsorcin de gases. Las suposiciones sobre las que se asienta son las siguientes:
-

Las molculas se adsorben sobre un nmero determinado de sitios localizados en

Cada sitio de adsorcin acepta solamente una molcula y se disponen en forma de

posiciones fijas.
-

monocapa.
-

Todos los sitios son energticamente equivalentes No existen interacciones laterales entre molculas adsorbidas.

La velocidad de adsorcin es proporcional a la concentracin libre y a la fraccin desocupada de los sitios de adsorcin. La velocidad de desorcin es proporcional a la fraccin ocupada de dichos sitios. Ambas velocidades, en el equilibrio, son iguales. A partir de lo anterior, se puede expresar la relacin de equilibrio como:

PURIFICACIN DE a-ANULASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

63 [2.13]

bC eq
q~1
siendo

1+bC~
por molculas de adsorbato, q~ la mxima cantidad de

e la fraccin de superficie cubierta

adsorbato sobre la superficie del adsorbente y b representa la constante de equilibrio a baja concentracin (pendiente de la isoterma cuando Ceq 4 0).

Isoterma de Freundlich La desviacin observada del comportamiento predicho por la isoterma de Langmuir en diversos casos, puede ser debido a la heterogeneidad energtica de la superficie del adsorbente (Ruthven, 1984), no cumplindose una de las suposiciones de la teora de Langmuir.

Realizando la hiptesis de la existencia de una distribucin logartmica, que tiende a un valor

asinttico, de la energa de adsorcin correspondiente a los sitios de unin de la superficie del adsorbente, se llega a la siguiente expresin semiemprica:

K~

~ eq

[2.14]

donde Kf y 3 (3 < 1) son parmetros constantes para cada temperatura. Este modelo presenta la desventaja de que no predice la saturacin, de forma asinttica, del adsorbente a alta concentracin de soluto ni se reduce al comportamiento lineal a baja concentracin del mismo. Por esta razn, la utilizacin de la isoterma de Freundlich se encuentra limitada a superficies heterogneas y a un intervalo determinado de concentracin.

Otras isotermas Para poder describir adecuadamente el comportamiento de sistemas que se apartan del predicho por las isotermas descritas anteriormente, se han propuesto numerosas expresiones, algunas de las cuales se indican a continuacin. La suposicin de una heterogeneidad superficial debida a dos tipos de sitios de adsorcin

independientes no cooperativos puede expresarse mediante la isoterma bi-Langmuir (Katti et al.,

1990; Dose eta,!., 1991):

a1C,, l+b1C

+ l+b2Q

[2.15]

Otros tratamientos ms empricos son los correspondientes a la isoterma de Langmuir-

Freundlich (Bellot y Condoret, 1993):

64

TRANsFERENCIA bE MATERIA Y EQUILIBRIo QUMICO EN LOS PROCEsOs DE ADSORCIN

aC11
1 + b
U

[2.16]

o a la de Redlich-Peterson (McKay y Al Duri, 1989): aC

q = 1 + b U

[2.17]

La eleccin de cualquiera de las isotermas expuestas, o de otras muchas descritas en la bibliografa depender, principalmente, del sistema estudiado y de la profundidad con que se conozca, de los datos experimentales de que se disponga y del grado de exactitud que se quiera alcanzar.

2.4.- BIBLIOGRAFA
-

lvarez, R.; Bueno, J.L. y Andrs, Li. (1982). Coeficientes de difusin molecular en rase lquida. 1
-

Ecuaciones de prediccin y de correlacin en sistemas binarios, Ingeniera Qumica,

154, 137-155.
-

EelIot, J.C.

Condoret. J.S. (1993). Modelling of liquid chromatography equilibria, Process

Biochem., 28, 365-376.

-

Brunauer, 5.: Emmett, PH. y Teller. E. (1938). Adsorption of gases in multimolecular layers, .1 Am. Chene Soc., 60. 309-3 19.

Brunauer. 5.; Deming. LS.; Deming, W.E. y Teller, E. (1940). On a theory of the Van der Waals adsorption of gases, J. Am. Chem. Soc., 62, 1723-1732.

Dose,

EV.;

Jacobson, 8. y

Giochon, G.

(1991).

Determination of isotherms from

chromatographic peak shapes, Anal!. Chem., 63 (8), 833-839.

-

Fritz, W.; Merk, W. y Schlnder, E.U. (1980). Competitive adsorption of two dissolved organics
onto activated carbon
11.

Adsorption kinetics in batch reactors. Chem. Eng. S., 36, 731-741.

Furusawa, T. y Smith, J.M. (1973). Huid-particle and intraparticle mass transport rates in slurries, md. Eng. Cem., Fundanz., 12(2), 197-203.

(ieankoplis, Ci. (1983), en: Transport processes ami unu operations (2~ cd.), Allyn and Bacon, Hoston.

Katti, A.: Huang. J.X. y Guiochon, G. (1990). Prediction of the profiles of the elution bands of proteins in preparative liquid chromaography, 3ioted. Bioeng., 36, 288-292. Krishna, R. y Wesselingh, JA. (1997). me Maxwell-Stefan approach to mass transfer, Cliem. Eng Set., 52(6), 861-911.

PURIFICACIN DE a-AMILAsA DE Aspergilius

onzae POR ADSORCIN

65

Langmuir, 1. (1916). The constitution and fundamental properties of solids and liquids. Pan 1:
solids, 1 Am. C/em. Soc., 38, 2221-2295.

Langmuir, 1. (1918). me adsorption of gases on plane surfaces of glass, mica and platinum, 1
Am. Ozem. Soc., 40(9), 1361-1403.

McKay, O. y Al Duri, B: (1989). Prediction of multicomponent adsorption equilibrium data using empirical correlations, Chem. Eng.J., 41(1), 9-23.

Polson, A. (1950). Some aspects of diffusion in solution and a definition of a colloidal particle, .1? Phys, Co,!,!oid Chem., 54, 649-652.

Ruthven, DM. (1984), en: Principies of adsorption and adsorption processes, John Wiley & Sons,
Nueva York

Schneider. P. y Smith, J.M. (1968). Chromatographic study of surface dilfusion, AIChE J., 14
(6), 886-895

Wakao, N. y Funazkri, T. (1978). Effect of fluid dispersion coefficients on particle-to-fluid mass transfer coefficients in packed beds, Chem. Eng. Sci., 33, 1375-1384.

Wilke, C.R. y Chang, 1. (1955). Correlations of diffusion coefticients in diluted solutions, AJOtE .1., 1 (2), 264-270.

Wilson, EJ. y Ceankoplis, C.J. (1966). Liquid mass transfer at very 10w Reynolds numbers in packed beds, ~d. Eng. Clem., Fundam., 5(1), 9-14.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

67

3. MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN

3.1.- INTRODUCCIN
Los procesos de separacin basados en la cromatografa lquida o, de forma ms general, en el

equilibrio lquido/slido son muy utilizadas como etapas finales de la purificacin de productos
obtenidos mediante biotecnologa. Hasta hace pocas dcadas, los procesos biotecnolgicos, salvo determinados procesos clsicos de fermentacin (por ejemplo, produccin de cerveza y de otras bebidas), estaban reducidos a la obtencin de productos de muy alto valor aadido con producciones muy bajas. En la actualidad, estn apareciendo nuevos procesos bioteenolgicos a la vez que otros ya establecidos, que se realizan mediante procedimientos dsicos de la qumica, pasan a realizarse utilizando la biotecnologa. En este campo, actualmente, gran parte del trabajo desarrollado para pasar de la investigacin en el laboratorio a la produccin industrial se realiza mediante escalado intermedio en planta piloto con procedimientos empricos o semiempricos. El asentamiento de los principios generales de los procesos biotecnolgicos, acompaado de

68

MODELO MATEMrICO DEL PRoCEso DE ADSORCIN

la consolidacin de la tcmca necesaria para su desarrollo, hace necesario el establecimiento de modelos matemticos que permitan el diseo y simulacin de cada una de las operaciones que lo
componen. De esta forma, el desarrollo de procesos biotecnolgicos se situara en una posicin similar a la que tienen los procesos qumicos convenciona,!es, cuyos representantes ms destacados

son los pertenecientes a la industria petroqumica. La proposicin de modelos matemticos que describan el comportamiento del sistema a partir de parmetros conocidos o de fcil obtencin requiere un profundo conocimiento del proceso,
determinando las variables que influyen en el mismo as como la cuantificacin de la mencionada influencia. En el caso de la adsorcin, adems de la extensin del equilibrio entre el adsorbato y el adsorbente, es necesario conocer la velocidad de transporte del atisorbato hasta los sitios de adsorcin sobre la superficie del slido. Esto ltimo viene determinado por los mecanismos de transferencia de materia que se encuentran presentes en el proceso.

KA

KA

np
Fado! de Capacidad

KA

KA

np
DL

np DL Factor de Capacidad kr

Factor de Capacidad
Entalpia de Adsorcion Entropia de Adaercion

Figura 3.1: Parmetros cinticos y termodinmicos que se obtienen a partir de los tratamientos matemticos aplicados a cada uno de los sistemas experimentales estudiados.

En el presente trabajo se estudiar la adsorcin de wamilasa sobre adsorbentes con mecanismos de adsorcin diferentes, interaccin hidrofbica e intercambio irco. El estudio se realizar utilizando una metodologa secuencial desarrollada en anteriores trabajos por nuestro grupo de investigacin (Aracil y Martnez, 1993) mediante los siguientes sistemas experimentales:

cromatografa de impulso en HPLC, adsorcin en tanque agitado discontinuo y adsorcin en lecho fijo
(Aracil et al., 1992). Los modelos matemticos propuestos, de complejidad creciente, permitirn caracterizar el proceso de adsorcin mediante los parmetros cinticos y termodinmicos del sistema.

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

69

3.2.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO. ANLISIS DE MOMENTOS La aplicacin ms conocida, difundida y establecida de la cromatografa lquida de alta
eficacia, HPLC, es como tcnica analtica, encontrndose muy desarrollada y bien establecida para

una gran diversidad de sustancias qumicas. Sin embargo, otra aplicacin de importancia creciente, es
como mtodo de purificacin para determinados productos de alto valor aadido en la industria

farmacutica o de alimentacin, debido a la facilidad de escalar el proceso y a los altos grados de pureza que se alcanzan.

3.2.1.- Introduccin El estudio del proceso de adsorcin mediante HPLC permite obtener una valiosa informacin del sistema de una forma rpida, repetitiva, con equipos comerciales relativamente sencillos y a partir de muy pequeas cantidades de adsorbente y, sobre todo, de atisorbatos (Aracil y Martnez, 1993). Estas circunstancias hacen que sea una tcnica especialmente adecuada para productos de gran valor

aadido como son antibiticos, pptidos, protenas, hormonas, anticuemos monoclonales, etc.
Tras la aplicacin del impulso de adsorbato en la fase mvil a la entrada de la columna, la informacin de que se dispondr ser la de la curva de respuesta a la salida de la misma, es decir, la concentracin de adsorbao a la salida en funcin del tiempo. Estos datos, junto con los correspondientes a las condiciones de operacin y caractersticas del sistema (caudal, temperatura,

tamao y porosidad de las partculas y de la columna) permitirn la aplicacin del mtodo de los
momentos, como se describe en el siguiente apaado, con el fin de obtener los parmetros cinticos y de equilibrio que caracterizan al sistema.

3.2.2.- Modelo El anlisis de la respuesta de un sistema cromatogrMico ante la introduccin de una

perturbacin en impulso o en escaln ha sido ampliamente utilizada y estudiada con el fin de extraer
informacin acerca de los factores que afectan al proceso de adsorcin as como para conocer y

discriminar los diferentes mecanismos de transferencia de materia que tienen lugar.

Los desarrollos iniciales relacionaban [os parmetros estadsticos caractersticos de las curvas de respuesta o las curvas de distribucin del efluente en las columnas cromatogrlicas con las variables de operacin y los parmetros cinticos del sistema estudiado. Las primeras contribuciones tericas consideraron la dispersin axial como el mecanismo cintico principal responsable de la transferencia de materia (Lapidus y Amundson, 1952; Klinkenberg y Sjenitzer, 1956). La inclusin de otro parmetro causante del comportamiento no ideal,

70

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN

el coeficiente de transferencia de materia externo (Van Deemter el a,!., 1956), permiti una explicacin y una prediccin ms exacta del comportamiento cromatogrfico. Levenspiel y Smith (1957) determinaron el coeficiente de dispersin axial a partir de la caracterizacin de la curva normalizada de respuesta a un impulso mediante el uso del nmero adimensionaj de Peclet. Para la resolucin de las ecuaciones correspondientes al balance de materia en la columna se han utilizado, entre otras tcnicas, la transformacin al dominio de Laplace. La inversin de la solucin para obtener una expresin analtica en el dominio del tiempo es complicada o, en la mayora de Los casos, inviable. Es factible, sin embargo, la obtencin de expresiones para los momentos cromatogrficos a partir de la solucin en el dominio de Laplace. Estas expresiones relacionan los parmetros cinticos y termodinmicos propuestos en el modelo resuelto (Van der Laan, 1957) con la definicin estadstica de los momentos de una curva de distribucin. A continuacin se muestran las expresiones a partir de las cuales se calculan el primer momento (pi) y el segundo momento central (&):

J
II

tC(t) dt 13.1]

JC(t) dt

a-

J
=

(t

gV

C(t) dt 3.2]

C(t) dt

donde C(t) es la concentracin a la salida de la columna. A partir de la metodologa anterior y en base al establecimiento de los balances de materia en la columna y en una partcula. Kubin (1695a; 1965b) y Kucera (1965) desarrollaron el ntodo de los momentos para un modelo en el que las resistencias a la transferencia de materia son la dispersin axial a lo largo del eje de la columna, la difusin a travs de la capa limite que rodea a las partculas de adsorbente y la difusin de las molculas de adsorbato en el interior de las mismas hasta unirse a los sitios de adsorcin. Los parmetros cinticos que caracterizan los citados mecanismos de transporte son, respectivamente, los coeficientes de dispersin axial, DL, de transferencia de materia externa. k1, y de difusin en los poros, D~. Un modelo ms general, que incluye la difusin del adsorbato a travs de slidos con estructuras porosas bidispersas, fue desarrollado por Haynes y Sarma (1973). De esta forma se obtienen expresiones para los momentos de las curvas de respuesta que explican adecuadamente la mayora de los sistemas cromatogrficos. -Previamente se habfan propuesto modelos que incluan difusin en macro- y microporos aunque slo consideraban que la

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

71

adsorcin se produca en los microporos (Hashimoto y Smith, 1973).

Shah y Ruthven (1977) modificaron ligeramente el modelo de Haynes y Sarma refiriendo las
difusividades en micro- y macroporos en base al volumen del cristal y al rea superficial libre respectivamente. De esta forma, el anlisis de momentos se realiza a partir de las siguientes expresiones:

[3.3]

donde L es la longitud de la columna, y la velocidad intersticial de la fase mvil y k es una constante de equilibrio aparente que puede expresarse a partir de la constante del equilibrio de adsorcin, KA, como se indica a continuacin:

s~ + (1

E~, ) KA

[3.4]

La porosidad externa del lecho (referida al espacio interparticular) y la interna de las partculas (referida al volumen total ocupado por los poros) vienen representadas por E y respectivamente. La relacin entre el segundo momento y los parmetros cinticos que caracterizan el sistema puede expresarse mediante la ecuacin 3.5:
~,

d+9C.~i[+CY~

KAI
+Clfl(

~M~iiC j[ i R )(
1E
E

cP)KAI2

+
[3.5]
+

ED PP

+ (

~ KAj

5p

15

L y

~j(1)K

siendo R el radio de las partculas, r, el radio de los cristales que forman cada partcula y 0. el coetkiente de difusin intracrisualino. Relacionando las expresiones correspondientes al primer y segundo momento central, se obtiene:

112

O vL

Etc

1E

R
3kf 15 kD 0

15s~D~

jC

(1s)k

13.6]
-

El trmino que tiene en cuenta la resistencia a la transferencia de materia en el interior del

72

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN

cristal adquiere importancia en el caso de adsorbentes o catalizadores formados por agregados o compactacin de cristales, situacin habitual cuando se trabaja, por ejemplo, con zeolitas. Sin embargo, puede eliminarse cuando el slido utilizado carece de microporos. Por otra parte, los otros

dos trminos, correspondientes al transporte de materia a travs de la capa limite externa que rodea a
las partculas y el producido en el interior de los macroporosttienen rdenes de magnitud diferentes (Wakao y Funazkri, 1978). Mientras que el coeficiente de difusin externa tiene valores de, aproximadamente, 106 m/s, el de difusin en los poros se encuentra alrededor de 10 m2/s, de lo cual se deduce:

R
15% D~ 3k~

[3.7]

Con estas consideraciones, la ecuacin 3.6 puede simplificarse para dar la siguiente expresin:

&
2112

2+L~)LiEj15~2Dpj1t1iEkj

[3.8]

Por otro lado, a partir de la teora de platos (Martin y Synge, 1941) se puede obtener una relacin entre la altura equivalente de un plato terico, AEPT, y el resultado del desarrollo del anlisis de momentos, basado en las teoras de velocidad a partir de las ecuaciones de balances de materia:

AETP =

&

11

7L

[3.91

por lo que comparando con la ecuacin 3.8, se tiene: 2DL +2v~ AEPT= A partir de esta ltima expresin se deduce que para especies que no se adsorban (k -4 0) o que se difundan hacia los sitios de adsorcin muy rpidamente (D~ -4 ~), la AEPT viene dada, simplemente. por (2Djv), siendo un valor constante para cada sistema, esencialmente independiente de la temperatura o de la velocidad del fluido, especialmente a bajos valores del nmero de Reynolds (Bischoft 1960). La posible existencia de asimetra en los picos y la presencia de colas en los mismos as como EjI5EDj IiEkj [3.10]

En este caso, el trmino maeroporo engloba tambin a los mesoporos que, segn la recomendacin de

la IUPAC (Sing el

cd., 1985). comprenden los poros cuyo tamao se encuentra en el intervalo 2 50 nm.
-

PURIFICACIN DE ~-AMILAsA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

73

de mido presente en la seal, hace inviable la utilizacin de momentos de orden mayor a dos. Incluso
en estos ltimos, los problemas descritos pueden afectar significativamente a su determinacin. Se

han descrito algunas modificaciones y correcciones al mtodo de los momentos para poder disminuir
el efecto mencionado. Sin duda, el ms utilizado de ellos es el mtodo de los momentos con peso

(Ostergaard y Michelsen, 1969; Anderssen y White, 1971; Ramachandran y Smith, 1978; Wolf et al., 1979). Este mtodo hace uso de la relacin entre los momentos ordinarios y la transformada de Laplace. El primer y segundo momento central con peso, g~ y o%, se definen como:

r=O

t est C(t) dt [3.11]

Je~ C(t) dt
t=0

J(t
&(s) =
p
t~O

&sL

C@) dt [3.12]

Jest C(t) dt
r=O

siendo s un parmetro arbitrario de la transformacin con unidades de inversa del tiempo. Para s = 0, los momentos con peso coinciden con los ordinarios. Para s > 0 el trmino (est) acta como un factor de peso que hace disminuir la contribucin al valor de i o & de los datos de concentracin a tiempos elevados, esto es, situados en la zona de cada del pico donde la asimetra es grande. El valor de s se determina como aqul que minimiza la varianza de la curva de distribucin (Anderssen y White, 1971).

Tambin se han descrito procedimientos para aplicar el mtodo de los momentos ordinarios a
picos con asimetra mediante el truncamiento de los datos, es decir, la eleccin de un punto de la curva a partir del cual no se integra la curva de respuesta (Skopp, 1984). Este mtodo ha dado resultados aceptables solo en determinadas ocasiones ya que para picos muy asimtricos el error obtenido es elevado y, adems, la frecuencia de recogida de datos y el espaciado, regular o no, entre ellos influye en la determinacin del punto de truncaniento.

El mtodo de los momentos permite un anlisis matemtico sencillo y rpido de las respuestas
obtenidas experimentalmente a partir de una perturbacin en impulso introducida a un sistema cromatogrfico. Este anlisis permite estimar la constante del equilibrio de adsorcin correspondiente a la ley de Henry, es decir, suponiendo la isoterma de tipo lineal, lo cual, debido a las bajas concentraciones que implican los impulsos de adsorbato, suele ser una aproximacin inicial oportuna.

74

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADsoRCtN

Una vez se hayan determinado los valores de la constante de equilibrio para cada temperatura ensayada, mediante la aplicacin de la ecuacin de Vant Hoff puede obtenerse la variacin de

entalpa ocurrida en el proceso de adsorcin, suponiendo aquella constante:

A

0 y AH RT K0exp(

[3.13]

y la entropfa correspondiente, por la siguiente expresin:

AS0 =RInKA

AH0 T

[3.141

Adems, a partir del segundo momento central puede obtenerse el valor del coeficiente de difusin en los poros. Es necesario estudiar los resultados que se obtengan mediante esta tcnica con visin especialmente crtica, analizando hasta que punto las simplificaciones llevadas a cabo tienen un fundamento razonable. En cualquier caso, los parmetros cinticos y termodinmicos, as calculados, servirn de punto de partida para los anlisis ms rigurosos desarrollados para los procesos de adsorcin en tanque agitado y lecho fijo que se describirn en los apartados siguientes.

3.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO

Para realizar el diseo de procesos de purificacin por adsorcin en slidos porosos, mediante cualquiera de los mecanismos existentes, es necesario conocer las etapas de transferencia de materia que determinan la velocidad de dicho proceso. Esto implica la determinacin de los parmetros cinticos y ternodinncos relacionados con los procesos de transporte de materia externo hacia las partculas adsorbentes y con los procesos difusionales y de equilibrio que ocurren en el interior de los poros. Los dispositivos experimentales basados en tanque agitado discontinuo permiten el estudio y determinacin de dichos parmetros de forma sencilla ya que en ellos es posible eliminar el control de la transferencia de materia externa. Adems, en estos sistemas no existen otros mecanismos no ideales como los de dispersin axial asociados al flujo a lo largo de columnas de relleno.

3.3.1.- Introduccin
Los modelos matemticos desarrollados para representar el comportamiento de los sistemas de adsorcin en tanque agitado. buscan la obtencin, numrica o analtica, de la disminucin de la concentracin del adsorbato o adsorbatos con el tiempo en funcin de una serie de parmetros empricos o no empricos. Los modelos ms sencillos suelen considerar isoterma de tipo lineal y una sla resistencia a la

PURIFICACIN DE rx-AMILAsA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

75

transferencia de materia, bien sea la difusin interna (Huang y Li, 1973) o la externa (Crank, 1975).

Komiyama y Smith (1974a) y Furusawa y Smith (1974) dan cuenta de una difusividad interna efectiva mucho mayor de la esperada para disoluciones de benzaldehdo, atribuyndola a la existencia de una difusin superticial en paralelo a la difusividad molecular en el interior de los poros. La determinacin de la difusividad superficial se pudo hacer en trminos del calor de adsorcin y la aplicacin de la isoterma de Freundlich (Komiyama y Smith, 1974b). Este ltimo mecanismo es
significativo si la interaccin entre adsorbato y adsorbente es muy fuerte (Krishna y Wesselingh, 1997) o existe control a la transferencia de materia en los microporos (Ruthven, 1984), siendo la

contribucin al flujo del mismo orden de magnitud que la debida al mecanismo de Knudsen (Doong y Yang, 1986). Tambin se han descrito modelos en los que se diferencia la difusin en microporos y en
macroporos correspondiente a slidos con distribucin bimodal de tamaos de poro (Ruckenstein et al., 1971). Otros acercamientos al problema, pese a incluir la isoterma no lineal, no contemplaban la

acumulacin de adsorbato en la fase lquida en el interior del poro (Suzuki y Kawazoe. 1974; Hasbimoto c a,!., 1975). Neretnieks (1976) incluye la utilizacin de isoterma no lineal y la resistencia
a la transferencia de materia externa e interna, diferenciando la difusin superficial y la difusin molecular efectiva. La resolucin numrica se hace en base a diferentes casos lmite en los que se pueden realizar determinadas simplificaciones, por lo que es necesario conocer, a priori, si las condiciones experimentales las cumplen o no. Con el fin de abordar de forma ms sencilla el problema matemtico se han propuesto ecuaciones empricas que describen, en determinadas condiciones, el perfil de concentracin de adsorbato en la fase lquida del interior de los poros. La aproximacin ms sencilla corresponde a la consideracin de la fuerza impulsora lineal (Glueckauf y Coates, 1947), por la que el transporte de materia a travs del interior de la partcula es proporcional a la diferencia entre la concentracin en el borde exterior y la concentracin media en toda la partcula. Otros tratamientos posteriores consideran

un perfil parablico (ifice, 1982), existiendo otras expresiones como polinomios de cuarto grado (Do
y Rice, 1986) o funciones exponenciales (Do y Mayfield, 1987) que describen la distribucin del

adsorbato en funcin del radio de la partcula.

La aplicacin de modelos no empricos a la adsorcin de biomolculas en sistemas de tanque agitado es reciente. Despreciando la contribucin de la difusin interna y aplicando la isoterma de Langmuir, se realiz el estudio de la adsorcin de fibringeno y albmina (Aptel el a,!.. 1988). Por otro lado, eliminando la transferencia de materia externa, se ha aplicado un modelo a la adsorcin de seroalbmina bovina mediante intercambio inico con isoterma no lineal (Yoshida el al., 1994). Los modelos que incluyen las dos resistencia a la transferencia de materia se han resuelto, en algn caso,

76

MODELO MATEMTICO DEL PoCEsO DE ADSORCIN

restringiendo su uso a la zona de la isoterma donde el comportamiento es lineal (Membrez et a,!., 1996), resolviendo por transformadas de Laplace las ecuaciones del balance de materia. Modelos completos, que cuenten con la difusin externa e interna y un comportamiento no lineal de la isoterma, se han aplicado a aminocidos y penicilina O (Grzegorcyk y Carta, 1996) o a la adsorcin de cefalosporina C (Casillas eta,!., 1993).

3.3.2.- Modelo

El proceso de adsorcin de ct-amilasa sobre slidos porosos mediante interaccin hidrofbica

e intercambio inico en un tanque agitado en operacin discontinna ha sido modelado matemticamente de acuerdo al planteamiento que a continuacin se describe. En dicho modelo se han tenido en cuenta las etapas de difusin externa, difusin interna y adsorcin superficial como responsables de la velocidad global de transferencia de materia. Pese a ello, la eliminacin del control de la etapa de difusin externa y la suposicin de una velocidad de adsorcin suficientemente elevada, permitir obtener valores ms exactos del coeficiente de difusin en los poros a partir de los experimentos realizados. Esta situacin se consigue aumentando, por agitacin, la velocidad relativa entre las partculas de adsorbente y la disolucin de adsorcin en el tanque. Para obtener unos mejores resultados, es aconsejable que la densidad del slido no sea demasiado diferente a la del fluido en el que Se encuentra.

Establecimiento de hiptesis
Para el planteamiento y posterior resolucin del modelo matemtico que describe el proceso de adsorcin en tanque agitado discontinuo se han establecido las siguientes hiptesis: i) Las partculas de adsorbente son esfricas, de igual dimetro y densidad. Los sitios
-

de adsorcin son iguales y se encuentran homogneamente distribuidos por la superficie de la partcula. it) La velocidad de transporte de materia viene determinada por la existencia de dos procesos en serie. Una etapa de difusin externa en la que las molculas de adsorbato atraviesan la capa lmite que rodea a las partculas y otra de difusin interna que corresponde a la difusin del adsorbato por el interior de los poros. La velocidad de cada uno de estos procesos viene caracterizada por el coeticiente de transferencia de materia externo, k1. y el coeficiente de difusin en los poros, D0, respectivamente. iii) El proceso es isotermo.

PURIFICACIN DE a-AMILA.SA DEAspergillus oryzae POR ADSORCIN

77

iv) La adsorcin del adsorbato sobre los sitios de adsorcin es instantnea y reversible y la velocidad con que se realiza es mucho mayor que la correspondiente a las etapas de difusin previas. y) El equilibrio de adsorcin se establece entre la concentracin de adsorbato en la fase
lquida del interior de los poros, e, y la concentracin de arisorbato adsorbida en la superficie interna, q. Dicho equilibrio viene descrito mediante la isoterma de

adsorcin: q= f(c)
vi) El coeficiente de difusin en los poros es independiente de la concentracin.

Balance de materia en la fase lquida

La disminucin de la concentracin de adsorbato en la fase lquida viene dada por el flujo que se difunde a travs de la capa limite que rodea a las partculas esfricas de adsorbente, pudiendo
expresarse como: dC

dt

H~2iEP kC

cl~

[3.15]

donde y es el volumen de disolucin en el tanque, v~ el volumen de poros por unidad de masa de adsorbente, C la concentracin de adsorbato en el seno del liquido del tanque y c la concentracin en
la fase lquida del interior de los poros..

Balance de materia en una seccin radial de la partcula Suponiendo que el mecanismo de transporte en el interior del poro es mediante difusin en la
fase lquida y que el coeficiente de difusin efectivo no vara con la concentracin, para una partcula

esfrica, se tiene: at +(1E0)

E0

[3.16]

donde q = f(c) es la isoterma de adsorcin.

As, puede escribirse:

Dq
Dt

dq Dc
dcDt

[3.17]

78

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADsORCIN

Condiciones de contorno e iniciales El flujo de adsorbato que atraviesa la superficie exterior de la partcula deber ser igual al
flujo de adsorbato transportado por difusin a travs del interior de los poros:

En

= k~

(c cl)

[3.18]

En el centro de la partcula. Dc dr [3.19J

r~O

Las condiciones iniciales seleccionadas son:

c=0 q=0 t=0 t=0 t=0 siendo C~ la concentracin inicial de adsorbato en la disolucin. 0=r=R 0=r=R [3.20]

3.4.- ADSORCIN EN LECHO FIJO Los procesos de purificacin a escala industrial operan, en la prctica totalidad de los casos,

en lecho fijo. Por ello, es fundamental contar con un modelo matemtico que describa dicha operacin para poder disear y posteriormente optimar el funcionamiento del proceso. Tras el modelado matemtico de la adsorcin en tanque agitado discontinuo, el modelo de lecho incluye el flujo de fase fluida en la direccin axial de la columna. Esto hace que, a los modelos planteados para la transferencia de materia en las partculas de adsorbente, sea necesario acoplar modelos para el flujo
mencionado. A continuacin se revisarn los avances ms significativos que se han llevado a cabo el desarrollo de modelos para la adsorcin en lecho fijo.

3.4.1.- Introduccin El desarrollo y planteamiento de los modelos matemticos que se encuentran descritos en la bibliografa ha estado condicionado, fundamentalmente, por las resistencias a la transferencia de materia que, se consideren, controlan la velocidad del proceso. el tipo de isoterma de equilibrio y el modelo de flujo postulado a lo largo de la columna. Otro factor importante son las simplificaciones realizadas o las condiciones dc contorno e iniciales que se planteen para su resolucin. La aparicin de una ecuacin correspondiente al balance de materia en la columna, junto con

PURIFICACIN DE a-AMWA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

79

la procedente del balance de materia en la partcula, complica el tratamiento matemtico del problema
en relacin al modelo de tanque agitado. Desde los pioneros trabajos de Wilson (1940), posteriormente desarrollados por DeVault (1947) y Glueckauf (1949) en los que no se consideraba resistencia a la transferencia de materia, se han planteado numerosos modelos y soluciones en base a

diferentes hiptesis para los sistemas de adsorcin en lecho fijo. Los ms sencillos consideran una sla resistencia y no contemplan la dispersin axial del flujo (Rosen, 1952; Rosen, 1954; Tien y Todos, 1960; Masamune y Smith, 1964), en ellos, la aplicacin de una isoterma de tipo lineal permite la resolucin analtica del sistema de ecuaciones. La inclusin del coeficiente de dispersin axial hace
ms realista el modelo a la vez que hace ms complejo el tratamiento matemtico necesario para su

resolucin (Deisler y Wilhem, 1953; Vermeulen, 1953; Rasmuson y Neretnieks, 1980; Rasmuson, 1981). Las aproximaciones de perfil parablico (Liau eta,!., 1979; Rice, 1982) o de fuerza impulsora lineal (Cooney, 1983; Carta, 1983; Sheng y Costa, 1997) comentadas en el apartado 3.3.1 tambin se han aplicado a la resolucin de sistemas en lecho fijo. A ellas se une la de considerar el perfil de
concentracin en la partcula como una distribucin pseudo logartmico-normal (Xiu et a,!., 1997).

Tambin se han incluido, en ocasiones, la separacin de las contribuciones en micro- y macroporos a

la difusin interna en slidos porosos bimodales (Carg y Ruthven, 1973) o la difusin superficial (Rasmuson y Neretnieks. 1980; Do y Rice, 1987). Tambin se han llevado a cabo simplificaciones del problema relacionadas con la isoterma de adsorcin, considerando un valor medio de la cantidad de soluto adsorbida en la partcula (Hasanain et al., 1983) o aproximando la isoterma no lineal a una de forma rectangular (Yoshida el al., 1984). Otras revisiones detalladas acerca del desarrollo de los modelos para la adsorcin en lecho fijo se encuentran en la bibliografa (Mansour et al., 1982; McKay, 1984). La mayora de los modelos comentados han servido para la explicacin del comportamiento de la adsorcin en lecho fijo para sistemas slido-gas o slido-lquido en condiciones de concentracin muy baja). El desarrollo y aplicacin de modelos cinticos a sistemas lquidos en los que intervengan biomolculas o biopolmeros es poco abundante. Para cromatografa de afinidad se han descrito modelos de diferente complejidad, desde modelos sencillos usados como aproximacin al problema (Arnold eta,!., 1985; Chase, 1984) a modelos ms completos (Arve y Liapis, 1988; Sridhar. 1996: Niemeyer el al., 1996). Pese a ello, la mayora de los trabajos en este campo han sido tericos y su verificacin frente a resultados experimentales es muy escasa. Modelos similares se han utilizado para la adsorcin de protenas sobre resinas de intercambio inico (Skidmore el al., 1990) con resultados no muy satisfactorios. En el presente trabajo se aplicar un modelo matemtico (Aracil el a,!., 1993) que se ha utilizado con xito en el caso de la adsorcin de cefalosporina C sobre resinas hidrofbicas.

so
3.4.2.- Modelo

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADsoRCIN

En el planteamiento del presente modelo que describe la operacin de adsorcin de a-amilasa

en un lecho lijo se ha tenido en consideracin la difusin en la capa lmite que rodea a las partculas, la difusin en el interior de los poros y el proceso de adsorcin de la protena sobre los sitios de adsorcin. Para tener en cuenta la existencia de un flujo no ideal, se ha introducido el coeficiente de dispersin axial para explicar la desviacin del flujo pistn ideal. El modelo, adems, se basa en las siguientes suposiciones:

Establecimiento de hiptesis
El planteamiento y formulacin del modelo matemtico de adsorcin en un lecho fijo se realiza en base a las siguientes hiptesis: i) El sistema opera en condiciones isotermas.

u)

El equilibrio de adsorcin se establece entre la concentracin de atisorbato en la fase lquida del interior de los poros, c, y la concentracin de adsorbato adsorbida en la superficie interna, q. Dicho equilibrio viene descrito mediante la isoterma de adsorcin: q = f(c)

iii) Se consideran dos resistencias en serie al transporte de materia. Una etapa de difusin externa en la que las molculas de adsorbato atraviesan la capa lmite que rodea a las partculas y otra de difusin interna que corresponde a la difusin del adsorbato por el interior de los poros. La velocidad de cada uno de estos procesos viene caracterizada por el coeficiente de transferencia de materia externo, kf, y el
-

coeficiente de difusin en los poros, D0, respectivamente. iv) La velocidad de la fase lquida en la columna y los parmetros de transferencia de materia son independientes de la concentracin en la fase lquida.

y) El flujo de la fase lquida a lo largo de la columna se considera no ideal,

incorporando un trmino de dispersin axial. vi) Las partculas de adsorbente son esfricas y de tamao y densidad uniforme.

Balance de materia en una pancula En base a La suposicin de la forma esfrica de las partculas y de la existencia de un proceso
de difusin interna, el balance diferencial en una seccin radial de la partculas, puede escribirse

PURIFICACIN DE

a~AMILs.. DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

81

como:

dc

______

dt

E~

dq

dt

[3.21]

Se obtiene una ecuacin diferencial en derivadas parciales de tipo parablica. Asumiendo que

se produce un equilibrio instantneo entre el soluto de la fase lquida y el que se encuentra adsorbido,
se puede escribir la siguiente relacin:

dq dc

dc dq dt dc

[3.221

Introduciendo la expresin 3.22 en la ecuacin 3.21, esta quedar de la siguiente forma:

1+

1
1E

13.231 ~l dq ~

E0

dc

Balance de materia la columna Suponiendo un flujo no ideal, con dispersin axial, el balance de adsorbato en una seccin
diferencial del lecho se expresa de la siguiente manera:
DC DC (1E

3k

--DL

dz La velocidad de adsorcin puede expresarse mediante una relacin del tipo:

=

dz

dt

dq =0 dt

[3.24]

f(q,c)

[3.25]

Por tratarse de un modelo de transferencia de materia homogneo en el que se consideran dos

resistencias al transporte, la ecuacin 3.24 puede reescribirse como:

d2C di
Condiciones de contorno

dc
dz

Ej

3 kf

(C

r=R)

[3.26]

Por simetra, en el centro de la partcula: dc

dr

0
r=0

[3.27]

82

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADSORCIN En la superficie de la partcula, el flujo de adsorbato que se difunde a travs de los poros es

igual al que entra a travs de la capa lmite externa:

Ddr =k dc

IC

r=R)

[3.28]

La ecuacin diferencial 3.26 requiere las siguientes condiciones de contorno a la entrada y a

la salida de la columna respectivamente (Danckwerts, 1953):
<Co

dz

__

cl)

[3.29]

dC dz

=0
z=L

[3.30]

Condiciones iniciales C =O C =
c=O

o= z= L

t=0 t>0 t=0 =0 3.31]

o=
0=z=L 0= z= L

q = (1

3.5.- BIBLIOGRAFA
-

Anderssen, AS. y Wbite, E.T. (1971). Parameter estimation by the weighted monients method, Client. Eng. S.. 26, 1203-1221.

Aptel. J.D.: Voegel, J.C. y Schmitt. A. (1988). Adsorption kinetics of proteins onto solid surfaces in the limit of the interfacial interaction control. Colloids and Surfaces, 29. 359-371.

Aracil, J.; Martnez, M. y Casillas, J.L. (1992). Downstream: new trends and industrial applications en: Profiles un biotechnologv (T.G. Villa y J. Abalde Eds.), Universidade dc Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, 523-538.

Aracil, J.; Casillas, iL.; Martnez, M. y Lpez-Gmez, J. (1993). Modelling and solving fixedbed adsorption, MatA. Mcdi. Appl. Sci.,16, 533-544.

Aracil, J. y Martnez, M. (1993). Purificacin de bioproductos, metodologa del cambio de escala, Rex. Real Acad. Ciencias Exactas, Fisicas y Naturales, LXXXVII (4), 675- 680.

Arnold, PH.; Blanch, H.W. y Wilke, C.R. (1985). Analysis ol~ affinity sparations 1: predicting the performance of affinity adsorbers, Cbern. Eng. J., 30, 89-B23.

PURIFICACIN DE a-AMILA5ADEA5pCrgIIIU5

oryzae POR ADSORCIN

83

Arve, B. H. y Liapis, A. 1. (1988). Biospecific adsorption in fixed and periodic countercurrent

beds, Biotechnol. J3ioeng., 32, 616-627.

-

Bischoff, KB. (1960). Notes on fue diffusion-type model for longitudinal mixing in tlow, Chem. Eng. S., 12(1), 69-70.

Carta. 0. (1993). me linear driving force approximation for cycic mass trausfer in spherical particles, Chem. Eng. Sci., 48 (3), 622-625.

Casillas, J.L.; Martnez, M.; Addo-Yobo, F. y Aracil, J. (1993). Modelling of the adsorption of cephalosporin C on modified resins in a stirred tank, Chem. Eng. J., 52, B71-B75.

Chase, HA. (1984). Prediction of the performance of preparative affinity chromatography, 1 Chromatogr., 297,179-202.

Cooney, DO. (1993). Comparison of simple adsorber breakthrough curve method with exact
solution,AIChEJ., 39(2), 355-358.

Crank, J. (1975), en: Mathematics ofdiffusion (2& ed.), Clarendon Press, Oxford. Danckwerts, PV. (1953). Continuous flow systems. Distribution of residence time, Cliem. Eng.
Sci.. 2,1-13.

Deisler, P.F. y Wilhelm, R.H. (1953). Diffusion in beds of porous solids, bid. Eng. Chem., 45 (6). 1219-1226.

DeVault. 0. (1943). The theory of chromatography, 1 Am. Chem. Soc., 65, 532-540. Do, D.D. y Mayfield, PL. (1987). A new simplified model for adsorption in a single particle,
AICIiE 1.. 33(8), 1397-1400.

Do, D.D. y Rice, R.G. (1986). Validity of the parabolic profile assumption in adsorption ~tudies,
AICAE.Ii, 32(1), 149-154.

Do, D.D. y Rice, RO. (1987). On the relative importance of pore and surface diffusion in nonequilibrium adsorption rate processes, Chem. Eng. Sci., 42 (10), 2269-2284.

Doong, S.J. y Yang, R.T. (1986). Bulk separation of multicomponent gas mixtures by pressure

swing adsorption: pore/surface diffusion and equilibrium models, AJChE 1., 32, 397-410.
-

Furusawa, T. y Smith, J.M. (1974). Intraparticle mass transport in slurries by dynamic adsorption studies. AlOjE, 1, 20 (1), 88-93.

Garg, DR. y Ruthven DM. (1973). Theoretical prediction curves for molecular sieve adsorption columns
-

1. Asymptotic solutions, Chem. Eng. Sci., 28, 791-798.

84

MODELO

MATEMTICO DEL PROCESO DE ADsoRCIN

Glueckaut E. (1949). ~Theoryof chromatography. VII. The general theory of two solutes
following non-linear isotherms, Disc. Faraday Soc., 7,12-25.

Glueckauf, E. y Coates, JI. (1947). Theory of chromatography, part 4. The influence of incomplete equilibrium on the tiont boundary of chromatogram and on the effectiveness of separation, 1 Chen-t Soc.. 13 15-1321.

Grzegorczyk, D.S. y Carta, 0. (1996). Adsorption of amino acids on porous polymeric adsorbents

II. Intraparticle mass transfer, Chem. Eng Sci., 51(5), 8 19-826.

-

Hasanain, MA.; Hines, KL. y Cooney, D.O. (1983). Adsorption kinetics for systems that
exhibits non-linear equilibrium isotherms, AIChE Symp. Ser., 79 (230), 60-66.

Hashimoto, K.; Minka, K. y Nagata, 5. (1975). Intraparticle diffijsivities in liquid-phase adsorption with nonjinear isotherms, 1 Chem. Eng. Japan, 8 (5), 367-373.

Hashimoto, N. y Smith, J.M. (1973). Macropore diffusion in molecular sieve pellets by

cbromatography, bid. Eng. Chem. Fundam., 12 (3), 353-359.

Haynes, 1W. y Sarma. P.N. (1973). A model for the application of gas chromatography to measurements of diffusion in bidisperse structured catalysts, AIChEJ., 19(5), 1043-1046.

Huang, T.C. y Li, K.Y. (1973). lon-exchange kinetics for calcium radiotracer in a batch system,
bid. Eng. Client, Fundarn., 12 (1), 50-55.

Klinkenberg, A. y Sjenitzer, F. (1956). Holding-time distributions of te Gaussian type, Client Eng. Sci., 5, 258-270.

Komiyama, H. y Smith, J.M. (1974a). Intraparticle mass transport in liquid-filled pores, AJOtE

.1, 20(4), 728-734.

-

Komiyama, H. y Smith, J.M. (1974b). Surface diffusion in liquid-tilled pores, AIOiR 1, 20 (6), 11101117.

Krishna. R. y Wesselingh, JA. (1997). The Maxwell-Stefan approach to mass transfer, Chem. Eng. Sci., 52(6), 861-911.

Kubin, M. (1965a). Beitrag zur theorie der chromatographie, Col,!. Czech. Ozem. Cornmun.. 30,
1104-1118. Kubn. M. (1965b). Beitrag zur theorie der chromatograpbie II. Einfluss der diffusion ausserhalb und der adsorption innerhalb des sorbens-korns, Co,!,!. Czecl. Oiem. Commun., 30, 2900-2907. Kucera, E. (1965) Contribution to the theory ofchromatography. Linear non-equilibrium elution chromatography, .1. Chroinatogr., 19, 237-248.

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCIN

85

Lapidus, L. y Amundson, N.R. (1952). Mathematics of adsorption in beds. VI. Re effect of

longitudinal diffusion in ion exchange and chromatographic columns, 1 Phys. Chem., 56 (8), 984-988.
-

Levenspiel, O. y Smith, W.K. (1957a). Notes on the diffusion-type model for the longitudinal
mixing in flow, Chem. Eng. Sci., 6,187-191.

Levenspiel, O. y Smith, W.K. (1957b). Notes on the diffusion-type model for ffie longitudinal mixing of fluids in flow, Chem. Eng. Set, 6, 227-233.

Liaw, CH.; Wang, J.S.P.; Greenkorn, RA. y Chao, K.C. (1979). Kinetics of fixed-bed

adsorption: A new solution, AIChEI, 25(2), 376-381.

-

Mansour, A.; von Rosenberg, D.U. y Sylvester, N.D. (1982). Numerical solution of liquid-phase multicomponent adsorption in fixed beds, AIChE J., 28(5)765-771.

Martin, A.J.P. y Synge, R.L.M. (1941). A new form of chromatogram employing two liquid phases. Biocliern. J., 35. 1358-1368.

Masamune, 5. y Smith, J.M. (1964). Transient mass trausfer in a fixed bed, bid. Eng. Chem., Fundam., 3, 179-181.

McKay, 0. (1984). Mass transfer processes during the adsorption of solutes in aqueous solutions in batch and tixed bed adsorbers, Chem. Eng. Res. Des., 62, 235-246.

Membrez. J.: Infelta, PP. y Renken, A. (1996). Use of the Laplace transform technique for simple

kinetic parameters evaluation. Application to the adsorption of a protein on porous beads, Chem.
Engi Sci.. 51(19), 4489-4498.
-

Neretnieks, 1. (1976). Adsorption in finite bat and countercurrent flow with systems having a nonlinear isotherm, Chem. Eng. Sci.. 31, 107-114.
Niemeyer, B.; Feilenreiter, T. y Tiltscher, H. (1996). Iheoretical studies on biospecific

adsorption for large-scale affinity separations, Chem. Eng. Sci., 51(24), 5263-5271.
-

Ostergaard, K. y Michelsen, ML. (1969). On the use of imperfect tracer pulse method for

deternination of hold-up and axial mixing, Can. 1 Chem. Eng., 47, 107-112.
-

Ramachandran, PA. y Smith, J.M. (1978). Transport rates by moment analysis of dynamic data, bid. Eng Chern., Fundam., 17 (3), 148-160.

Rasmuson, A. (1981). Exact solution of a model for diffusion in particles and longitudinal dispersion in a packed bed, AJOtE .1., 27, 1032-1035.

Rasmuson, A. y Neretnieks, 1. (1980). Exact solution of a model for diffusion in particles and

86

MODELO MATEMTICO DEL PROCESO DE ADsoRCIN

longitudinal dispersion in packed beds, AJOtE J., 26 (4), 686-690.

-

Rice, R.G. (1982). Approximate solutlons for batch,. packed tube aud radial flow adsorbers Comparison with experiment, Chem. Eng. Sci., 37(1), 83-91.

Rosen, J.B. (1952). Kinetics oa fixed bed system for solid diffusion into spherical particles, 1 Chern. Ph., 20, 387. Rosen, J.B. (1954). General numerical solution for solid diffusion in fixed beds, bid. Eng. Cli em., 46(8), 1590-1594.

Ruckenstein, E.; Vaidyanathan. AS. y Youngquist, GR. (1971). Sorption by solids with bidisperse pore structures, Otem. Eng. S.. 26, 1305-1318. Ruthven, DM. (1984), en: Principies ofadsorption ~rndadsorption processes, John Wiley & Sons, Nueva York. Shah, D.B. y Ruthven, DM. (1977). Measurement of zeolitic diffiisivities and equilibrium isotherms by chromatography, AICliE .1, 23 (6), 804-809. Sheng, P. y Costa, C.A.V. (1997). Modified linear driving force approximations for cyclic adsorption-desorption processes, Cliern. Eng. Sci., 52 (9), 1493-1499.

Sing, K.S.W.; Everett, D.H.; Haul. R.A.W.; Moscou, L.; Pierotti, RA.: Rouqurol, J. y Sieniieniewska, T. (1985). Reporting physisorption data for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity, Pure & Appl. Client., 57(4), 603-6 19.

Skidmore, CL.; Horstman, B.J. y Chase, HA. (1990). Modelling single-component protein adsorption to the cation exchanger 5 Sepharose FF, .L Otromatogr., 498, 113-128.

Sridhar, 1. (1996). Modelling of aftinity separation by batch and tixed bed adsorption comparative study, Chem. Eng. Teclino,!., 19, 357-363.

Suzuki, M. y Kawazoe, K. (1974). Hatch measurements of adsorption rates in agitated tank, 1 Cliern. Eng. pan, 7 (5), 346-350.

Tien, C. y Rodos. 0. (1959). Ion exehange kinetics for systems of nonlinear equilibrium relationships, AJCliE J., 5(3), 373-378.

Van Deemter. EJ.; Zuiderweg, F.J, y Klinkenberg. A. (1956). ~Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography, Client. Ettg. Sci., 5, 271289.

Van der Laan. E.T. (1958). Notes on Ihe diffusion-type model for the longitudinal mixing in flow (OLevenspiel and W.K.Smith, Cliem. Eng. S., 7,187-191.

PURIFICACIN DE U-AMILA5A DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCIN

87

Vermeulen, T. (1953). Theory for irreversible and constant-pattern solid diffusion, md. Eng. Cliem., 45 (8), 1664-1670.

Wakao, N. y Funazkri, T. (1978). Effect of fluid dispersion coefficients on particle-to-fluid mass transfer coefficients in packed beds. Cliem. Eng. Sci., 33, 1375-1384.

Wilson, J.N. (1940). A theory of chromatography, 1Am. Chem. Soc., 62, 1583-1591.

Wolf, H.J.; Radeke, K.H. y Gelbin, 0. (1979). Heat and mass transfer in packed beds IV. Use of
-

weighted moments to determine axial dispersion coefficients, Cliem. Eng. Sci., 34, 101-107.
-

Xiu, G.H.; Nitta, T.; Li, P. y Jin, 0. (1997). Breakthrough cunes for fixed-bed adsorbers: Quasilognormal distribution approximation, AJOtE J., 43(4), 979-985.

Yoshida, H.; Kataoka. T. y Ruthven, DM. (1984). Analytical solution of the breakthrough curve tbr rectangular isotherm systems, Client. Eng. Sci., 39 (10), 1489-1497.

Yoshida, H.; Yoshikawa, M. y Kataoka, T. (1994). Paraflel transport of ESA by surface and pore

diffusion in strongly basic chitosan, AICliE J., 40(12), 2034-2044.

PURIFICACIN DE

(1-AM ILMA DE Aspergi,!,!us oryzae POR ADSORCIN

89

4. CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLISIS

4.1.- CARACTERIZACIN DEL ADSORBATO En este apartado se describen los mtodos utilizados para caracterizar las diferentes fuentes de cx-amilasa utilizadas as como los resultados obtenidos con las mismas. Debido a que la <x-amilasa es una enzima industrial de gran consumo, se procedi a la
comparacin entre las fabricadas por las compaas productoras ms importantes. A partir de todos los

datos de que se dispona previamente (bibliogrficos y de los fabricantes) y de los obtenidos a partir de
los ensayos de caracterizacin llevados a cabo, se seleccionar la enzima comercial con la que se va a desaaollar el estudio en el presente trabajo de investigacin. En la tabla 4.1 se muestran las diferentes a-amilasas de Aspergillus oryzae comerciales

analizadas en el presente trabajo y donadas directamente por cada una de las compaas que las
producen.

90

CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

La ct-amilasa de A. oiyzae seleccionada para el estudio de su comportamiento cromatogrfico ha sido la procedente de Fungamyl 1600 HG type WF (Novo Nordisk PUS, Bagsv~erd, Dinamarca).

Tabla 4.1: a-aniilasas deA. orvzae utilizadas.

Denominacin
Brewers Fermex Rapidase [EF Rapidase PS Amylase [500 Grindamyt ASOGO Grindamyl 5100 Qrindamyl S250 Fungarnyl 1600 cx-Amylase type X-A Sanzyme SF6300 Swzynie SP 3500 Sanzyme A 7000

Fabricantet
Gist-brocades

Actividad~

45 000 SKBU/g 25 000 SKBU/g 113 500 SKBU/g Grindsted

<

50 000 SKBU/g 2000 SKBU/g 500 SKBU/g 1 600 FAU/g 27 000 BU/g 93 600 SKHU/g 51500 SKBU/g 8 543 SKBU/g

Novo Nordisk Sigma Smkyo

4.1.1.-

Determinacin de la cantidad de protena total:

Los preparados comerciales de a-aniilasa contienen una serie de sustancias que acompaan a la

enzima (sales. nutrientes y otros productos del caldo de fermentacin, estabilizantes, otras protenas, etc.). La informacin sobre la composicin de estos productos, habitualmente, no est disponible por parte de las empresas productoras. Los ensayos generales para la determinacin de la concentracin de

La referencia completa
-

de cada fabricante es:

Gist-brocades Ny. Delft. Holanda.

Grindsted Products. Brabrand, Dinamarca.

Novo Nordisk A/S. Bagsvard, Dinamarca. Sigma Chemical Co. St. Louis. MO, EEUU Sankyo Co.. Lid. Tokyo, Japn.

Las diferentes unidades se tiefinen:

FAU (unidad de amilasa fngica>: 1 FAU corresponde a la cantidad de enzima que descompone 526 g de almidn por hora a 37 0C y pH 4.7 (Novo Nordisk. Analytical Method AF 216). -SKBU: I0SKBU~tFAU
-

BU: 1 BU libera It) mg de maltosa a partir de almidn en 3 minutos a pH 6.9 y 20 oc (Bemfeld. 1955).

PuRIFICACIN DE a-AMILASADE

Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

91

protena en una disolucin suelen estar interferidos, en mayor o menor grado, por las diferentes sustancias que acompaen a las protenas. Por esta razn y con objeto de conocer la concentracin de protena en cada uno de los preparados comerciales de ct-ainilasa con los que se ha trabajado, se ha medido a travs de dos procedimientos basados en principios diferentes para poder realizar comparaciones y obtener mejores conclusiones.

Mtodo de absorbancia en ultravioleta

Existen diferentes mtodos de determinacin de la concentracin de protena en una disolucin que hacen uso de la absorbancia de la misma en diferentes bandas de la regin ultravioleta. El mtodo

de Warburg y Christian (1941) requiere la medicin de la absorbancia a 260 y a 280 mu. La concentracin total de protena en el medio analizado puede determinarse mediante la siguiente
frmula:

Concentracin de Protena [mg/m]= 1.55

A 280 -

0.76 . A260

Esta correlacin ha sido estimada en base a la absorbancia de una protena utilizada como patrn de calibracin (enolasa de levadura cristalizada). Sin embargo, aunque la mayora de las protenas
tienen una absorbancia a 280 nm en el intervalo 0.5
- 2.0

para una concentracin de 1.0 mg/m, existen

algunas que se encuentran hiera del mismo (Dawson eta,!., 1993).

Mtodo de Bradford
Este mtodo (Bradford, 1976) se basa en el cambio diferencial de color de un colorante en presencia de concentraciones variables de protena. El reactivo de tincin, Coomassie Brilliant Blue

G-250, es capaz de unirse a las protenas formando un complejo de coordinacin. El ensayo se basa en que dicho reactivo, en disolucin cida, desplaza su mximo de absorbancia desde 465 mn hasta 595
mn cuando pasa a encontrarse unido a una protena (por desplazamiento de su pKa). Se ha observado (Spector, 1978) que el coeficiente de extincin molar del complejo colorante-albmina es constante sobre un amplio intervalo de concentracin, por lo que se puede aplicar la ley de Beer para la determinacin de la concentracin total de protena en una disolucin. La concentracin se determina por comparacin con el resultado obtenido para una protena de concentracin conocida mediante una

recta de calibrado adecuada.

Este ensayo presenta una serie de ventajas respecto a otros mtodos clsicos de como son el mtodo de Eiuret o el de Lowry (Seopes, 1987). En primer lugar, necesita una menor cantidad de muestra, siendo ms rpido y sensible que los citados y, al menos, tan exacto como el mtodo de

Lowry. En segundo lugar, ante la presencia de determinadas sustancias, se producen menos

interferencias que con los otros mtodos citados.

92

CARACrEPszACIN y MTODos DE

ANLIsIs

En el presente trabajo, el procedimiento operativo utilizado para la realizacin de este ensayo est basado en el descrito por Bradford (1976). El calibrado del presente ensayo se ha realizado con seroalbmina bovina cristalizada y liofilizada. La disolucin del reactivo de tincin y la protena patrn, Bio-Rad Protein Assay Kit II, eron suministradas por Bio-Rad Laboratories (Munich,
Alemania).

4.1.2.-

Cristalizacin de a-arnilasa Los resultados obtenidos a partir de los anlisis de cantidad de protena y electroforesis

realizados sobre la (1-amilasa comercial hicieron necesaria la obtencin de muestra con alta pureza a
fin de eliminar las posibles influencias que las impurezas pudiesen provocar durante el proceso de adsorcin de ct-amilasa. Con objeto de obtener las cantidades necesarias de ct-antilasa con la pureza requerida para el desarrollo del presente trabajo de investigacin, se decidi llevar a cabo la purificacin del preparado comercial Eungamyl 1600 BO type WF. El procedimiento seguido (Akabori et al.. 1954) comprende

unas etapas de extraccin de la enzima, consistentes en la precipitacin de la misma mediante la

adicin de (NH4)2504 seguido de una etapa de precipitacin selectiva con lactato de 6,9-diamino-2etoxiacridina monohidrato (rivanol) y posterior cristalizacin con acetona. Los cristales de a-amilasa se disuelven y se recristalizan 3 veces en acetona y, por ltimo, se liofilizan. Todo el proceso se ha 0C. Las etapas de filtracin descritas en la metodologa realizado en cmara termostatizada a 4 (Akabori el al., 1954) han sido sustituidas por centrifugacin refrigerada a 12000 x g. A continuacin se detallan los materiales utilizados para la cristalizacin de a-amilasa: acetato

sdico, acetato clcico y rivanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), hidrxido sdico (Merck. Darmstadt, Alemania) cido actico (Panreac Qumica. Barcelona. Espaa), caoln, acetona y
sulfato amnico (Fluka Chemie. Neu-U]m, Alemania). Las bolsas de dilisis, Dialysis Tubing
-

Visking n0 5 (Medicel International Ltd. Londres, Gran Bretaa), tienen un corte de masa molecular entre 12000 y 14000. Se ha usado una centrfuga refrigerada Sorval Superspeed RC2-B con rotor SS34

(DuPont de Nemours, Herts, Gran Bretaa).

4.1.3.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

La electrotbresis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sdico, SDS, es uno de los mtodos electroforticos ms comnmente utilizados con fines analticos y de caracterizacin de

polipptidos. Esta tcnica permite la separacin de las protenas de una mezcla en funcin de su masa
molecular. Las molculas del detergente dodecil sulfato sdico se unen fuertemente a las de protena de tal forma que slo un 0.1% de aquel es suticiente para saturar la cadena polipeptdica, quedando

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

93

aproximadamente una molcula de detergente por cada 2 residuos de aminocido (1.4 gramos de SOS
por gramo de protena). Cada molcula de SOS tiene una carga negativa por lo que una protena saturada por ellas soportar un gran exceso de carga neta negativa. En la prctica, debido a dicho exceso, se puede considerar que todas las protenas adquieren una relacin carga/tamao virtualmente

idntica, independientemente de la carga neta que tuviese en condiciones nativas, muy pequea en
comparacin con las procedentes de su unin al dodecil sulfato sdico. Por otro lado la placa de gel presenta un gradiente de concentracin de poliacrilamida, siendo

mayor en la parte inferior (cercana al nodo) y menor en la superior (cercana al ctodo). Bajo la accin
del campo elctrico, las protenas cargadas negativamente se mueven hacia el nodo. Las molculas de

menor tamao y mayor movilidad avanzarn a travs del gel, alcanzando las zonas de mayor
-

concentracin, donde la porosidad es menor y la difusin de las molcuias de mayor tamao se ve

impedida. Al cesar la aplicacin del campo elctrico sobre el gel, se habr logrado la separacin de las diferentes protenas que componan la muestra y que se haban aplicado en un punto de la zona

cercana al ctodo, habiendo avanzado ms las de menor tamao molecular. En estas condiciones existe
una relacin lineal entre el factor de retencin y el logaritmo de la masa molecular de la protena. Esta se determina por comparacin con una recta de calibrado realizada con una mezcla de protenas de masa molecular conocida. El procedimiento operativo (Pharmacia Biotech [a]) consiste en la adicin de un tampn (15 ~l) con SDS y ~-mercaptoetanol a la disolucin de protenas (5 pl) que se desea analizar. Posteriormente se hierve la mezcla para desnaturalizar la protena y que el SDS se una a la cadena polipeptdica. A continuacin se aplican 10 pi de la muestra en un extremo del gel de poliacrilanida, se aade el tampn y se aplica el campo elctrico durante un tiempo determinado. Para detectar las bandas correspondientes a cada protena separada, es necesario realizar la tincin de las mismas mediante un procedimiento (Phannacia Biotech lib]) en el que se utiliza Coomassie.

En el presente trabajo, se ha utilizado un PhastSystemMR (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)

como equipo experimental compacto, con unidad de desarrollo y fuente de alimentacin y unidad de

tincin y lavado. Las placas de gel, PhastGel Gradient 8-25 (Phannacia Biotech, Uppsala, Suecia)
conteman un gradiente de poliacrilamida del 8 al 25%. Se utiliz un sistema de tampn discontinuo

PhastGel SDS Buffer Strips a pH 8.1 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las protenas utilizadas
como marcadores para el calibrado del sistema y su masa molecular han sido: fosforilasa E (94000),

seroalbmina bovina (67000). ovoalbnina (43000), anlxidrasa carbnica (30000), inhibidor de la tripsina de soja (20100) y lactoalbmina (14400), todas ellas suministradas por Pharmacia Biotech
(Uppsala, Suecia). Coomassie Brilliant Blue R-250, fi-mercaptoetanol, glicerol, cido actico y dodecil sulfato sdico fueron suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).

94

CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

4.1.4.- Espectroscopia de absorcin ultravioleta

Las cadenas laterales aromticas de los aminocidos fenilalanina, tirosina y triptfano, son las principales responsables de la absorbancia de las protenas en la regin ultravioleta. Las propiedades espectrales de estas cadenas laterales son muy sensibles al entorno que las rodea, desplazndose el

mximo de absorbancia en funcin del medio en que se encuentren. El resto de aminocidos con absorcin en esta regin del espectro no presentan una sensibilidad tan acusada. Debido al alto nmero
de residuos, los aminocidos aromticos de una protena se encuentran rodeados de una multitud de microentornos diferentes, por ello, el valor obtenido para la absorbancia en ultravioleta de una cadena

polipeptdica refleja un valor medio del comportamiento espectral de cada uno de dichos grupos
aromticos.

Tabla 4.2: Propiedades espectroscpicas de los aminocidos

aromticos a pH neutro (Creighton, 1993).
Xm=

(nm)

Absorbanca molar (M~~cm~)

197 1420 5600

Fenilalanina Tirosina Triptfano

257.4 274.6 279.8

Adems este mtodo puede ser de gran utilidad para el seguimiento y determinacin de la
concentracin de protena en los diferentes procesos de adsorcin que se van a llevar a cabo ya que, realizando el calibrado adecuado, la concentracin de protena en disolucin est relacionada proporcionalmente con la absorbancia a determinada longitud de onda.
1
i r.qr.,(.tr~r,7qr4An mpriinnta

1 .

nhtAniAn

ApI

pcnp,trn

iiltrO,inlpt~

cg

h<i

rp~li,~rln

cnt

un

espectrofotmetro de matriz de diodos modelo 8452A (Hewlett-Packard. Avondale, PE, EE.UU.).

4.2.- CARACTERIZACIN DE LOS ADSORBENTES El conocimiento de las caractersticas tisicoquimicas de los slidos porosos utilizados como adsorbentes es fundamental para conprender y. en su caso, explicar la interaccin de este con el adsorbato en los diferentes procesos de adsorcin. Por otro lado, los modelos fenomenolgicos desarrollados incluyen algunos parmetros fsicos de las resinas, como son la porosidad y la densidad de las mismas, por lo que es necesaria su caracterizacin. En la tabla 4.3 se muestra la informacin, suministrada por el fabricante, sobre las propiedades tisicoquimicas de ambos adsorbentes. Debido a que esos datos no son suficientes o no estn

PURIFICACIN DE

a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

95

suficientemente definidos de acuerdo con las necesidades planteadas anteriormente, se ha completado

la caracterizacin mediante los ensayos que se describen a continuacin.

Tabla 4.M Propiedades fisicoqumicas comerciales de los adsorbentes de 1-lIC e IEC.

Duolite XAD-761

(HIC)
Matriz Grupo funcional

Duolite A-568 (IEC)

Copolmero de fenol-formaldehdo entrecruzado policondensado Amina terciaria

1.12 (forma bsica) 57
65

Hidroxilo fenlico (principal) Metilo Densidad aparente [mg/m] 1.11 Retencin de humedad [%] Radio de poro [nm] Hinchamiento reversible [%] Capacidad de intercambio 60 65
-

20 30
-

15-25

7
1.2 eq/l (base hmeda)

5 eqlkg (base seca)

En el presente trabajo de investigacin se ha estudiado la adsorcin de una protena, la aamilasa de A. orvzae, mediante dos mecanismos diferentes: interaccin hidrofbica (HIC) e intercambio inico (IEC). Los adsorbentes utilizados han sido, respectivamente para cada uno de ellos, Duolite XAD-761 y Duolite A-568 (Rohm and Haas Co., Filadelfia, PA, EE.UU.). Los dos
adsorbentes seleccionados tienen la misma matriz, diferencindose fundamentalmente en los ligandos

de que estn recubiertos, confirindoles un carcter hidrofbico o de intercambiador de aniones. As, se podrn estudiar de forma ms independiente el comportamiento en el proceso de adsorcin debido a
cada uno de los mecanismos mencionados.

4.2.1.- Adsorcin en fase gaseosa

La adsorcin de gases es una tcnica ampliamente empleada para la caracterizacin de una gran variedad de tipos de slidos porosos. En particular, la aplicacin de estudios de fisisorcin (adsorcin fsica) es adecuada para determinar el rea superficial, el volumen de poro y la distribucin de tamaos
de poro de catalizadores, adsorbentes, pigmentos, ridos y otros materiales. Para el presente trabajo se ha utilizado la adsorcin de nitrgeno como tcnica de caracterizacin de los adsorbentes porosos. El equipo empleado para la caracterizacin de las resinas porosas por adsorcin de nitrgeno ha sido un ASAP 2000 (Micromeritics Instrument Corp., Nortcross, GA, EE.UU.).

96

CARACTERIzACIN Y MTODOS DE .XNuss

rea superficial (reaJET)

La determinacin del rea superficial mediante esta tcnica se basa en el conocimiento de La

cantidad de gas necesario para formar una monocapa completa de molculas del mismo adsorbidas a la
superficie del slido. A continuacin se expone, de forma resumida, el procedimiento experimental: Una cantidad conocida del slido poroso que se desea analizar se desgasitica sometindola a

calentamiento y vaco en una bureta de gases. La isoterma de adsorcin se construye punto a punto registrando la presin de equilibrio que se alcanza tras la introduccin en la bureta de cantidades
conocidas de nitrgeno. Paralelamente, se debe realizar un ensayo en blanco para corregir la cantidad de gas que se adsorbe a las paredes del sistema.

La determinacin del rea superficial se lleva a cabo mediante el mtodo estndar de BrunauerEmmett-Teller (BET) a partir de los datos de la isoterma de fisisorcin (Sing eta,!., 1985): p
na (~o

~) n~ C

Clp
_

nl, C

PO

[4.1]

donde na es la cantidad de gas adsorbida a la presin relativa p/p0, nam representa la capacidad de la monocapa y C es una constante que depende exponencialmente de las entalpias de adsorcin y licuefaccin. De la pendiente de la representacin lineal de pI(na.(po~p)) frente a p/p0 (representacin
EET) se obtiene el valor de n

0,. El intervalo de linealidad est restringido a una zona limitada de la isoterma, normalmente para valores de presin relativa inferiores a 0.3. As, el rea superficial (rea BET) puede calcularse a partir de la siguiente ecuacin:
ABEr

na,1. L am

[4.2]

siendo a,,1 el rea media ocupada por cada molcula adsorbida en la monocapa completa (su valor para
N2 a 77 K es 0.162

nm

2) y L es la constante de Avogadro.

Distribucin de tamao de poro A valores altos de presin relativa (p/p0), la forma de la isoterma de adsorcin se curva hacia
arriba debido al progresivo llenado los mesoporos del slido mediante el proceso de condensacin

capilar. Cuando los nesoporos se llenan por completo, la isoterma se estabiliza alcanzando una lnea
horizontal. El volumen total de mesoporos puede derivarse de la cantidad de vapor adsorbido cuando la isoterma se encuentra en la zona estabilizada mencionada (es decir, cuando pip0 tiende a la unidad) y, por tanto, los poros se han llenado con el adsorbato condensado en estado liquido.

En base a la ecuacin de Kelvin para la variacin de la presin de vapor con la curvatura superticial del menisco de un liquido en un cilindro capilar cerrado por un extremo (Rouqurol et a,!.,
1994) y con los datos de fisisorcin de nitrgeno en el adsorbente poroso se puede determinar el

PURIFICACIN DE c-AMILASADEAspeTgiIIUS orvzae POR ADSORCIN

97

volumen de poro asociado a cada valor del radio del mismo, rp:
2
=

a V~1

cos6

RT n(p ~,o)

[4.3]

donde a y y11, son la tensin superficial y el volumen molar del lquido condensado respectivamente

3/mol y e = 0~). El parmetro t es (para el nitrgeno liquido a 77.4K, a 8.7210~ N/m, Vm= 34.68 cm un factor de correccin que representa el espesor de la capa ya adsorbida en las paredes del poro
(espesor de la multicapa).

El tamao de los poros de mayor tamao que pueden medirse mediante este mtodo esta limitado por la gran variacin del radio del menisco del lquido con la presin cuando la presin reducida se acerca a la unidad (Satterfield, 1980). Por lo tanto, el mtodo puede aplicarse a poros de hasta 60 nm de dimetro, produciendo errores significativos del volumen de poro en la zona de la distribucin cercana a ese lmite superior. Para determinar la distribucin de tamaos correspondiente a poros del orden de 60 nm y mayores, se deber recurrir a la porosimetra de mercuno.

4.2.2.- Porosimetra de mercurio

La porosimetra de mercurio es una tcnica muy empleada para la determinacin de la

distribucin del tamao de poro as como de la porosidad y densidad de slidos porosos. En el presente trabajo se han caracterizado ambos adsorbentes porosos mediante esta tcnica utilizando un equipo Micromeritics Pore Sizer 9310 (Micromeritics Instrument Corp., Norcross, GA,
EE.UU.).

Distribucin de tamao de poro

Este mtodo de caracterizacin se base en el comportamiento, en el interior de tubos capilares,

de lquidos que no mojan. Cuando el ngulo de contacto, O, entre el lquido y la superficie del slido tiene un valor comprendido entre 900 y 1800, la tensin superficial del lquido, a, se opone a la entrada
del mismo en el interior del capilar. Para forzar su intrusin, es necesario aplicar suficiente presin

hidrosttica externa. En situacin de equilibrio y para poros cilndricos, la fuerza que se opone a la
entrada del lquido y la fuerza debida a la presin externa aplicada se igualan, obtenindose la siguiente relacin (Smith, 1981) entre el radio de poro, r 0 y la presin ejercida, P:
2 a cosO
[4.4]

De acuerdo con la bibliografa (Rootare y Prenzlow, 1967), el valor ms exacto para la tensin
superficial del mercurio es de 0.485 N m. El ngulo de contacto vara en funcin dcl material y su

98

CA&xcrrprzACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

valor oscila entre 120 y 1500. En el presente trabajo se ha utilizado un valor de 1300 (Alen, 1990).

La aplicacin de este principio fue desarrollada experimental y tcnicamente por Ritter y Drake
(1945). Para realizar experimentalmente este ensayo, se introduce una cantidad conocida del slido

poroso en un recipiente cerrado y se somete a vaco para eliminar el aire ocluido en los poros. Entonces, se aade un volumen conocido de mercurio de forma que cubra la muestra por compLeto. A
continuacin el sistema se somete a presiones progresivamente crecientes, midiendo, para cada valor de presin, la disminucin del nivel de mercurio en la celda calibrada, correspondiente al volumen de

mercurio que ha penetrado en los poros de La muestra. De acuerdo con la ecuacin anterior, se
determina el radio de poro para cada valor de presin externa. La distribucin de tamaos de poro,

AV/Ar0 frente a r0, se obtiene teniendo en cuenta que el volumen de mercurio introducido en los poros,
AY, en el intervalo de presiones P y (P+AP) coincide con el volumen de los poros cuyo radio est

comprendido entre r0 y (r0-Ar0). El volumen total ocupado por los poros viene dado por el valor final del volumen de mercurio que se ha introducido en los poros. El tamao mnimo de poros que puede medirse mediante la tcnica de intrusin de mercurio viene impuesto por la presin mxima a la que el porosmetro es capaz de trabajar. Este valor es de,
aproximadamente, de 350 MPa que se corresponde con un tamao de poro de alrededor de 4 nm. La densidad aparente, Pa, es aquella que tiene en cuenta el volumen ocupado por los poros y se determina midiendo la diferencia, previa a la aplicacin de presin, entre el volumen ocupado por el mercurio en presencia y ausencia del slido poroso. La densidad real, Pr, solo tiene en cuenta el material slido del que estn hechas las partculas: 1

1
Pa

[4.5]

Pr

siendo v~, el volumen de poro por unidad de masa de adsorbente

La porosidad interna de las partculas slidas puede ahora calcularse, a partir de su definicin, mediante los datos experimentales obtenidos:
y
1

1
y

[4.61

Pa

Area superficial
Existen tratamientos matemticos para estimar el rea superficial del slido poroso a partir de los datos obtenidos mediante porosimetra de mercurio basados en modelos que suponen geonietras especficas para describir los poros. El ms sencillo de ellos es el que supone una distribucin de poros

PURiFICACIN DE ct-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR

ADSORCIN

99

cilndricos (Men, 1990>, aunque se ha descrito alguna en la que no es necesario considerar ninguna geometra determinada para la forma de los poros (Rootare y Prenslow. 1967). Se considera que el trabajo necesario para forzar la introduccin del mercurio, por la accin de la presin, es proporcional a la superficie cubierta, de la siguiente manera:

dW

a cose dS = P dV

[4.7]

donde W es el trabajo realizado y 5 el rea cubierta tras la aplicacin del trabajo. Integrando en todo el intervalo de presiones se obtiene: j

J
yo

PdV

[4.8]

o bien: [4.9]

macosO yo siendo S~ el rea superficial especfica y m la masa del slido utilizada en el anlisis.

4.2.3.- Absorcin de lquido Uno de los procedimientos ms simples para la determinacin del volumen de poros consiste en poner en contacto al slido poroso con un liquido que lo moje, de tal manera que llene el espacio interno de la partcula formado por los poros (Anderson y Pta11, 1985). El procedimiento operativo
seguido en el presente trabajo para cada uno de los adsorbentes utilizados se describe a continuacin.

Se pesan, exactamente, alrededor de 5 gramos de slido y, en un recipiente adecuado, se recubren con agua destilada en exceso durante 15 minutos. Posteriormente se centrifuga a 2i00 rpm durante 40 minutos, se separa el agua en exceso y se pesa el slido mojado. El volumen de fluido que se ha introducido en los poros se calcula mediante diferencia de peso entre el slido hmedo y el seco,
conocida la densidad del liquido.

4.2.4.- Distribucin del tamao de partcula por dispersin de luz Una de las tcnicas de determinacin de la distribucin de tamaos de partculas ms importante
y habitualmente utilizada es aquella que implica los diferentes mtodos basados en la dispersin de luz. Cuando un haz de radiacin se ve interrumpido por la presencia de una partcula, sufre una

dispersin que proporciona informacin acerca de dicha partcula. La distribucin radial de la

100

CARAcrrmzACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

intensidad de la radiacin dispersada es funcin del tamao, la forma y el ndice de refraccin de la

partcula, de la longitud de onda de la radiacin incidente y del ndice de refraccin relativo entre la

partcula y el medio que la rodea (Alen, 1990). En base a estos principios existen dos tipos de analizadores que difieren en cuanto a la disposicin de sus componentes principales; unos con el detector situado en ngulo recto respecto a la direccin del haz de luz incidente y otros con el detector enfrentado al mismo en la misma direccin. El primero de ellos es muy sensible a cambios en el tamao de partcula pero la dispersin, detectada a 90~, depende muy acusadamente del ndice de refraccin de la misma. En el segundo tipo de equipos, este ltimo efecto es muy dbil, aunque el tamao mnimo de las partculas que puede detectar es algo ms elevado que en el primer caso. Otras ventajas que presenta el sistema de deteccin situado en la misma direccin que el haz incidente son
las que a continuacin se indican (Alen, 1990):
-

el tamao medio puede determinarse sin necesidad de diagramas tericos de dispersin.

es independiente de la concentracin en un amplio intervalo. no es demasiado sensible a la forma de las partculas.

se puede hacer uso de las teoras establecidas sobre el efecto (Rayleigh-Gans, Fraunhofer).
puede determinarse la dispersin de la distribucin.

La cantidad de luz dispersada por partculas de menor tamao que la longitud de onda de la
radiacin incidente es directanente proporcional a su volumen y para partculas mayores dicha cantidad est relacionada con el rea transversal de la partcula proyectada en el haz de luz. Si la

fuente de emisin es un lser, en lugar de una lmpara de luz blanca, el aumento de la intensidad hace que la determinacin sea mucho ms precisa y permita medir distribuciones de partculas de mucho menor tamao (hasta de 0.05 pm dependiendo del sistema de deteccin). La distribucin de tamaos de partculas mediante dispersin de lser se ha llevado a cabo en un
equipo MasterSizer X 6023 (Malvern Instruments Ltd. Worcestershire, Gran Bretaa).

4.3.- METODOS DE ANLISIS

A continuacin se describen los mtodos utilizados para el seguimiento de la a-amilasa en los procesos de adsorcin llevados a cabo en el presente trabajo. El principal de ellos ha sido el seguimiento y determinacin de la concentracin de a-amilasa mediante absorcin ultravioleta a 280 nm. La razn de esta eleccin ha sido la sencillez, rapidez, exactitud y bajo coste del procedimiento.

Adems, esta tcnica ha mostrado ser altamente reproducible y repetitiva. La medida de la actividad
bidroltica de la u-amilasa se ha utilizado para comprobar la variacin de la funcin enzimtica durante el desarrollo de los procesos de adsorcin y determinar la influencia del proceso en la desnaturalizacin, si esta se produjese, de la protena.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR

ADSORCIN

101

4.3.1.-

Absorbancia en ultravioleta La relacin entre la absorbancia, A, y la concentracin molar, c, viene dada por la ley de

Lambert-Beer:
E

A
=

cd

[4.10]

siendo d el espesor de muestra que tiene que atravesar la luz y e el coeficiente de extincin molar, el

cual es un valor caracterstico de la sustancia que tambin depende de la longitud de onda (Perkampus,
1992). Los espectrofotmetros suelen producir grficos que relacionan la longitud de onda frente a la

absorbancia, la cual se define mediante la siguiente relacin:

A
=

log
1

[4.11]

donde h e 1 son la intensidad de la luz monocromtica incidente y transmitida respectivamente. Segn lo descrito en el apartado 4.1.3. las disoluciones de protena absorben en la regin ultravioleta debido, principalmente, a la existencia de grupos aromticos en los residuos de fenilaanina, tirosina y triptfano que forman la cadena polipeptdica. En concreto, la a-amilasa
presenta un mximo de absorbancia a 280 nm por lo que se ha utilizado este valor para realizar el seguimiento y medida de la concentracin de a-amilasa en cada uno de los experimentos que as lo requeran en el presente trabajo de investigacin. En la figura 4.3 se muestra la relacin existente entre la concentracin de a-amilasa y la absorbancia correspondiente a 280 nm.

4.3.2.- Actividad de a-amilasa

La ct-anilasa es una enzima aruiloltica que cataliza la hidrlisis de los enlaces a-1,4 entre las subunidades de cx-D-glucosa que forman el almidn, siendo maltosa y dextrinas los productos finales
de la reaccin.

Cuando se planifica y realiza un proceso de purificacin de una protena con actividad enzimtica, un objetivo prioritario junto con la eficacia del proceso y el grado de pureza definido por
las especificaciones del producto final, es el de mantener la actividad cataltica que presenta para una o varias reacciones determinadas.

Los mtodos de medida de la actividad enzimtica de una protena suponen la puesta en

contacto de la misma con el sustrato en unas condiciones de pH, temperatura, fuerza inica y composicin del medio de reaccin durante un tiempo determinado. Para cada enzima o tipo de

enzimas pueden describirse diferentes definiciones de actividad con distintos procedimientos para determinara. Las diferencias entre cada uno de los mtodos de determinacin de la actividad

102 consisten, principalmente, en:

-

CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLISIS

Condiciones y composicin del medio reaccin Tiempo de reaccin

Referencia al sustrato consumido o al producto formado Mtodo de anlisis para la deteccin y cuantificacin del sustrato o del producto

Dependiendo de la definicin de actividad, el ensayo correspondiente para su determinacin

vara. Las equivalencias entre las diferentes unidades de actividad son difciles de establecer o incluso

pueden no llegar a deducirse o establecerse. Por otro lado, este tipo de ensayos son de difcil estandarizacin debido a la baja reproducibilidad que existe al realizarla con medios y equipos
diferentes. Por ello, los anlisis de actividad debern servir como herramienta comparativa de la

prdida o no de la actividad cataltica de la enzima objeto de ensayo. De los numerosos ensayos de actividad descritos para la a-ainilasa, en el presente trabajo se ha utilizado un mtodo simple. exacto y rpido (Bernfeld, 1955) en el que la actividad se define de la
siguiente manera: Una unidad libera 1.0 mg de maltosa a partir de almidn en 3 minutos a pH 6.9 y 200C. El procedimiento consiste en aadir un volumen determinado de disolucin de enzima sobre

una disolucin de almidn de concentracin conocida. La mezcla se incuba durante 3 minutos a 200C,
transcurridos los cuales se detiene la reaccin mediante inmersin en agua hirviendo. A continuacin se aade un reactivo que colorea la muestra en funcin de la maltosa producida en el medio y tras enfriamiento del conjunto, se diluye con agua. Para cada ensayo se deber realizar el correspondiente anlisis en blanco (sin enzima), determinando la cantidad de maltosa producida. y por tanto la actividad, por comparacin de la absorbancia medida a 540 nm con los resultados obtenidos para una recta de calibrado realizada con diferentes concentraciones de maltosa conocidas.

4.4.- RESULTADOS Y DISCUSIN

A continuacin se muestran los resultados experimentales obtenidos a partir de los ensayos de

caracterizacin del adsorbato. a-amilasa, y los adsorbentes de interaccin hidrofbica e intercambio inico. Duolite XAD-761 y Duolite A-568 respectivamente, mediante las tcnicas descritas a lo largo de los apartados precedentes.

4.4.1.-

Caracterizacin del adsorbato

Canadad de protena
Se ha llevado a cabo la medida de la concentracin de protena total mediante absorcin

PURIFICACIN DE

a-AMILASA DE Aspergil,!us oryzae POR ADSORCIN

103

ultravioleta a 260 y 280 nm y por el mtodo de Bradford. Se observa disparidad en los resultados
obtenidos por ambos mtodos para cada una de las protenas ensayadas. Las enzimas comerciales suelen contener sustancias que pueden interferir en ambos mtodos. La pureza de la a-amilasa

purificada a partir de Fungainyl 1600 BG mediante el mtodo de cristalizacin descrito en el apartado

4.1.2 es con los dos mtodos descritos, 2.8 y 2.6 veces la obtenida para el preparado comercial de

partida, obtenindose valores superiores al 100%. Esta circunstancia puede ser debida a que el valor
del coeficiente de extincin molar de la ct-amilasa no tiene necesariamente que ser similar al de las

protenas utilizadas en las correlaciones de absorbancias en la regin ultravioleta ni su respuesta en el mtodo de Bradford igual a la de la seroalbilinina bovina del calibrado correspondiente. Sin embargo,
-

eL factor de concentracin, definido como el cociente entre la concentracin de la enzima purificada y

la de la cx-amilasa de partida, son muy prximos para ambos mtodos. Esto puede indicar que, en el
proceso de cristalizacin, la concentracin de a-ainilasa se ha multiplicado por un factor de,

aproximadamente, 2.7.

Espectroscopia ultravioleta La caracterizacin de la ~-atnilasa mediante espectroscopa de absorcin ultravioleta puede

observarse en la figura 4.2. El espectro de absorcin de la a-amilasa en la regin ultravioleta presenta

un mximo de absorbancia a 280 nm que, prcticamente, no se desplaza en un amplio intervalo de

concentracin. La otra regin de alta absorbancia sita su mximo a una longitud de onda alrededor de 210 nm, desplazndose hacia valores mayores segn aumenta la concentracin de la muestra. La absorcin de luz ultravioleta en esta banda del espectro se debe a la presencia del enlace peptdico de las protenas.

104

CARACTERIZACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

3.0

2.5

2.0

1.5

((.5

0.0 200 250 300 % nial 350 4(1k)

Figura 4.2: Espectro de absorcin UV de la ~-amilasa a diferentes

concentraciones en tampn Tris/HCI 0.05M, pH 7.0 y fuerza inica 0.60.

2.5

2.0

1.5

I.0

0.5

WC

+0

0.5

.0

1.5

2.0

2.5

Concentracin ln~ml 1

Figura 4.3: Relacin entre la absorbancia a 280 nm y la concentracin de u-amilasa en disolucin de tampn Tris/HCI 0.05M, pH 7.0 y fuerza inica 0.60. A partir de los resultados obtenidos para el espectro de a-amilasa se procedi a realizar un

PURIFICACIN DE CZ-AMILASA DEAspergillus oryzae POR ADSORCIN

105

calibrado de la absorbancia a 280 mn frente a la concentracin de enzima en disolucin (figura 4.3). Con el fin de determinar la concentracin de ct-amilasa, puede considerarse que sus disoluciones
siguen la ley de Lambert-Beer hasta una concentracin de, aproximadamente, 1 mg/ml. Por esta razn,

en el presente trabajo, la medida de concentraciones supenores a ese valor se ha realizado mediante dilucin de la muestra original o mediante el uso de la curva de calibrado de la figura 4.3. La
utilizacin del primer procedimiento se encuentra limitada a casos en los que no sea necesaria la recuperacin de la fraccin de disolucin medida y la del segundo no estara aconsejada, en cualquier caso, a concentraciones superiores a 2.2 mg/ml debido al enor que se generara ya que a partir de ese valor la variacin de la absorbancia a 280 nrn es excesivamentepequea.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

~4

~
..v2+:tfl*~
44:& ____

e ~

Figura 4.4: Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Las muestras corresponden a las siguientes enzimas: (Al) Rapidase PFP, (A2) Rapidase PS, (A3) Amylase P500, (A4) Grindamyl ASOGO, (AS) Grindamyl 5100, (A6) Grindamyl 5250, (A7) Marcadores de masa molecular; (B1) Fimgamyl 1600 BO, (B2) a-amylase type X-A, (B3) Sanzyme SP300, (B4) Sanzyme SP3500, (BS) Sanzyme A7000, (B) Marcadores de masa molecular.
Mediante anlisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, se ha observado que no hay presencia significativa de otras protenas en Fungamyl 1600 BU (figura 4.4), lo cual tambin ha sido confirmado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en estado nativo. Para determinar la presencia o no de sales acompaando a la enzima liofilizada, procedentes de la formulacin de Fungamyl 1600 BU o del propio proceso de purificacin, se procedi a medir la conductividad de una disolucin de a-amilasa cristalizada. El resultado IXie una variacin

106

CARAcTERIZACIN Y MTODOs DE ANLIsIs

prcticamente nula de la conductividad, en cualquier caso correspondiente a una disolucin de fuerza inica menor de 0.001. Esto indicara que la cantidad de sales que acompaan a la cx-amilasa en la muestra cristalizada es un pequeo porcentaje de la masa total.

4.4.2.- Caracterizacin de los adsorbentes

Adsorcin en fase gaseosa Tras los datos correspondientes a las isotermas de adsorcin (figuras 4.5A y 4.5B) y mediante
las

ecuaciones 4.1 y 4.2 se obtuvo el rea I3ET de los dos adsorbentes estudiados. Los anlisis de las

resinas mediante esta tcnica han dado como resultado un rea BET considerablemente mayor para la resma de intercambio inico frente al determinado para la hidrofbica. Los valores obtenidos han sido, respectivamente, de 27.2 m2/g para la Duolite XAD-761 y 92.8 m~/g para la Duolite A-568. A partir de los datos de adsorcin de nitrgeno se determin la distribucin de tamao de poro,
obteniendo valores cercanos y superiores a 60

nm por lo que dicha distribucin se dar a partir de los

resultados obtenidos mediante porosimetra de mercurio. Como puede observarse, ambas isotermas pueden clasificarse dentro del tipo II (Brunauer a a,!., 1940) que se corresponde con isotermas tpicas de slidos meso- y macroporosos, presentando
adsorcin en multicapa sin restricciones sobre un sustrato heterogneo, completndose la monocapa de nitrgeno al alcanzar el punto de inflexin (p/p0 = 0.25) (Emmet y Bmnauer, 1937). Las isotermas de

los dos adsorbentes muestran histresis del tipo -II. correspondiente a Ja existencia de poros tubulares abiertos con secciones transversales de diferentes formas (Anderson y Pratt, 1985).
005

iB)
0.04
AA

-r

0.03
A-

A y-

y002 .7 0.01 a

z
0

2~

0.~.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.0 LO 0.0 0. 0-2 0.3

Presin relativa [p/p0I

p/p

Figura 4.5: Duolite XAD-76 1: (A) Isoterma de adsorcin-desorcin de N

2, (B) grfica BET.

PURIFICACIN

DE

a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

t 07

00L5

(IX)
0-ole

A
aA-

yy-

-7

-r-y-

y-e y-

-y0.~5 yA
A

0. ~ 0.0 Presin relativa [plpOj 0.l PIPO 0.2

0.3

Figura 4.6: Duolite A-568: (A) Isoterma de adsorcin-desorcin de N2, (B) grfica BEl.

En la siguiente tabla se resumen los valores obtenidos tras la caracterizacin de los slidos
adsorbentes por adsorcin de nitrgeno.

Tabla 4.4: Resultados de la adsorcin de nitrgeno. Duolite XAD-761 2/gj rea BET [m C (ecuacin 4.1) 27.2
79.3

Duolite A-568 92.8

62.7

Poros imetra de mercurio

Los resultados experimentales de distribucin de tamaos de poro obtenidos (ecuacin 4.4), para los dos adsorbentes, mediante porosimetra de mercurio se muestran grficamente en la figura 4.7. El volumen de intrusin de mercurio correspondiente a poros de tamao superior a 1000 nm se ha considerado que pertenece al espacio interparticular de la muestra analizada. Los resultados muestran una distribucin de tamaos de poro ms estrecha en el caso de la resma Duolite A-568. Una fraccin importante del volumen interno de esta resma (69%) es debido a la existencia de poros que se encuentran en la regin de los mesoporos (tamao entre 2 y 50 nln), correspondiendo el resto a la regin de los macroporos. De hecho, el 75% del volumen de poros para este adsorbente pertenece a

poros de tamao entre 20 y 80 mn. La distribucin para la resma hidrofbica, Duolite XAD-761, es
ms abierta, conteniendo poros en un intervalo de tamaos mayor. La fraccin de volumen
correspondiente a los mesoporos es del 41%, conteniendo una cantidad significativa de macroporos de tamao superior a 20() nm

y mesoporos inferiores a 20 nm.

105

CARACTERIzACIN Y MToDos DE ANnss

~t

(.30

0.25 e
e o A-

a
e e

e
e
L..

e o
o

e
e

e
e

t Radio de

Loo

o
Radio de poro Innil

poro Inm

Figura 4.7: Distribucin volumtrica acumulada de tamafio de poro mediante porosimetra de mercurio:
(A) Duolite XAD-761, (E) Duolite A-568.

Los valores de porosidad y densidades se calcularon de acuerdo a las expresiones mostradas en

las ecuaciones 4.4 y 4.5 a partir de los datos experimentales obtenidos por porosimetra de mercurio. En la tabla 4.5. se resumen los parmetros fsicos obtenidos para cada uno de los adsorbentes
analizados por este mtodo.

Tabla 4.5: Resultados de la porosimetra de mercurio.

Duolite XD-761 Volumen de poro [cm3/g] Densidad aparente [glcm3] Densidad real [g/cm3] Porosidad Tamailo medio de poro (nm)i 0.42 1.08 1.97 0.45 23.0

Duolite A-568
0.53 0.94 1.89 0.50 28.5

Obtenido a partir de: ~ = (4vp)/Sg

PURIFICACIN DE LY-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

109

Absorcin de lquido
La tcnica de absorcin de lquido (agua) no se ha mostrado adecuada para la determinacin

del

volumen de poros para la resma Duolite XAD-761 ya que una fraccin de la muestra flotaba
parcialmente y se obtuvo un valor excesivamente bajo. Para el otro adsorbente, Duolite

A-568, el

ensayo se pudo realizar con-ectamente, estimndose un valor del volumen de poro especfico de 0.59 cm3/g, prximo al determinado mediante porosimetria de mercuno. Tamao de partcula por dispersin de luz
Se ha determinado la curva de distribucin de tamaos de partcula para las ambas resinas

correspondientes a las fracciones utilizada como relleno de las columnas de HPLC. Para partculas de tamao menor de 100 gm el tamizado mecnico puede verse dificultado por factores tales como la electricidad esttica que acumula el slido. En estos casos, la fraccin de partculas recogida entre dos tamices puede que tenga un tamao de corte inferior que no coincida con el nominal del tamiz de menor tamao de luz de malla. Por otro lado, la existencia de partculas que no se asemejen a una esfera, es decir que tengan una dimensin diferente a las otras dos, puede producir que en la fraccin recogida por tamizado existan partculas mayores que las que le correspondera al tamiz de mayor tamao.
25 lOO 35

loo

30 20
-

80

80

25 60>.

60

>.

2
-c

es
o e.

20

es

E
A

a E
a

lo

15 40

es. o
~2

40~
10 20

20

lO
Dhin,etro

0 100

10

0 100

de

parcula h~]

Dimetro de pardcula html

Figura 4.8: Distribucin de tamafio de partcula de la fase estacionaria de las columnas de HPLC:

(A) Duolite XAD-761, (B) A-568.

lo

CARAcTERIzACIN Y MTODOS DE ANLIsIs

Ambos efectos no son tan significativos a medida que se aumenta el tamao de las partculas con las que se trabaja. Por ello, en los experimentos de adsorcin en tanque agitado y lecho fijo, en los que se utilizan partculas de mayor tamao, se tomar el valor medio de la luz de malla de los tamices utilizados para cada fraccin como tamao medio de las partculas. La distribucin de tamaos de pancula para las resinas indicadas se muestran en la figura 4.8. En ambos casos el mximo de la distribucin se sita en un valor de 36 m. Sin embargo, la

distribucin correspondiente a la resma de HTC (Duolite XAD-761) es ms abierta, contando con una
fraccin significativa de partculas inferiores a 10 ~m, lo cual dar un empaquetamiento ms compacto

que la columna de intercambio inico.

4.5.- BIBLIOGRAFA
-

Akabori, 5.: lkenaka, T. y Hagihara, IX. (1954). IsoLation of crystalline taka-amylase A from

Takadiastase Sankyo, .1? Biochem,, 41(5), 577-582.

-

Alen, T. (1990), en: Particle size measurement (40 ed.), Chapman and Hall, Londres. Anderson, J.R. y Pratt, K.C. (1985), en: Introduction to characterization and testing of cata,!vsts,
Academic Press Australia, Melbourne.

Bernfeld, P. (1955). Amylases, ~ and 3, Meflods Enzymo,!., 1, 149-158. Bradford. M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteii utilizing the principie ofprotein-dye binding, Anal. Biochern., 72, 248-254.

Creighton. TE. (1993), en: Proteins: siructures and molecular properties (20 ed.), W.H. Freeman,
Nueva York

Dawson, R.M.C.; Elliott, D.C.; Elliott, W.H. y Jones, KM. (1993), en: Jata for biochernica,! research (30 ed.), Clarendon Press, Oxford.

Drake, L.C. y Ritter, HL. (1945). Macropore-size distributions in some typical porous substances, md. Eng. Gem., Anal. Ed., 17(12). 787-791.

Emmett, P.H. y Brunauer, 5. (1937). The use of 10w temperature Van der Waals adsorption

sotherms in determining the surface area of iron synthetic ammonia catalysts, 1 Ant. Client. Soc., 59, 1553-1564.
-

Perkampus, H.H. (1992), en: Uy-Vis s-pctroscopv a,d rs app,!ications, Springer-Verlag, Berlin
Heidelberg. Pbarmacia Biotech [a]. PhastSystem. Separation technique. File No lO. SDS-PAGE, Uppsala.

PURrFICCIN DE ~-AMILASA DE Aspe rgillus oryzae POR ADSORCIN

III

Suecia. Pharmacia Biotech [b]. PhastSystem. Development tecbnique. File No 200. Fast coomassie staining, Uppsala, Suecia.
-

Ritter, HL. y Drake, L.C. (1945). Pore-size distribution in porous materials. Pressure porosimeter

and determination of complete macropore-size distributions, bid. Eng. Chem., Anal. Ed., 17 (12),
782-786.
-

Rootare, HM. y Prenzlow, CF. (1967). Surface area from mercury porosimeter measurements, Ph. Chem., 71(8), 2733-2736. Rouqurol, 1.; Avnir, D.; Fairbridge, C.W.; Everett, DH.; Haynes, LH.; Pernicone, N.; Ramsay, J.D.F.; Sing, K.S.W. y Tnger, K.K. (1994). Recommendations for the characterization of porous solids, Pare & Appl. Chem., 66(8), 1739-1758.

Sattertield, C.N. (1980), en: Heterogeneous cata,!ysis inpractice, McGraw-Hill, Nueva York. Scopes, R.K. (1987), en: Protein purification. Princip,!es and practice (2~ ed.), Springer-Verlag, Nueva York. Sing, K.S.W.; Evereu, D.H.; Haul, R.A.W.; Moscou, L.; Pierotti, R.A.; Rouqurol, J. y

Siemieniewska, T. (1985). Reporting physisorption data for gas/solid systems with special reference to the determination ofsurface area and porosity, Pare & AppL Ghem., 57 (4), 603-619.
-

Smith, J.M. (1981), en: Chemical engineering kinetics (3a de.), McGraw-Hill, Tokio.
Spector, T. (1978). Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation, Anal. Jiiochem., 86, 142-146. Warburg, O. y Christian, W. (1941). lsolierung und kristallisation des g~irungsfermenter enolase, Biochem. Z., 310, 384-421.

PURIFICACIN DE cL-AMILASA DEASPERCILLUS ORYZ4E POR ADSORCIN

113

5. EXPERIMENTAL
En el presente captulo se detallan los materiales y se describen los equipos experimentales utilizados durante la realizacin del trabajo de investigacin para cada uno de los procedimientos estudiados: impulsos de adsorbato en columnas de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), adsorcin en tanque agitado discontinuo y adsorcin en lecho fijo. Tambin se describen los mtodos utilizados para desarrollar cada uno de los experimentos que se han llevado a cabo. Por ltimo se justifica la eleccin de las variables y condiciones de operacin en base a los objetivos que se desean alcanzar y el conocimiento previo de los sistemas que se ha obtenido a partir de los experimentos diseados para tal fin.

5.1.- PREPARACIN DE LOS ADSORBENTES Previamente a la utilizacin de ambos adsorbentes es necesario someterles a un pretratamiento con el fin de eliminar las impurezas y restos del monmero del que estn que estn formados y que hubiese quedado ocluido durante el proceso de sntesis, mejorando as el rendimiento de la adsorcin. A la tesina de intercambio inico se la someti, de forma secuencial y en discontinuo, a

114

EXPERIMENTAL

tratamiento con 5 volmenes de NaOH l.5M, 20 de agua destilada. 5 de 1-ICI 2CM y de nuevo agua
destilada hasta alcanzar un pL! neutro. Para realizar el pretratamiento a la resma hidrofbica se repiti dos veces la secuencia descrita anteriormente, tras la cuai se lav con metanol y, finalmente, con agua destilada. A continuacin cada resma fue sometida a vaco (2 mmHg) en un desecador con objeto de

eliminar todo el agua retenida y adsorbida por ella. A lo largo de toda la experimentacin realizada en el presente trabajo, se han utilizado
diferentes tantalios de pancula, para lo que, en cada caso, se tamiz para obtener la fraccin correspondiente al tamao deseado.

5.2.- CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) La cromatografa lquida de alta eficacia es una tcnica ampliamente utilizada como mtodo analtico dc una multitud de compuestos qumicos de muy diversa naturaleza. Se ha descrito su capacidad como mtodo preparativo (Felinger y Cuiochon, 1994; Compton y Kreilgaard, 1994, Kenney el al.. 1989; Velayudhan y l-forvth, 1988; Gooding ci aL, 1986) o incluso como mtodo de purificacin a escala industrial para la industria farmacutica (Kato tel., 1985; Clonis el al., 1986). Debido a su exactitud, sensibilidad, repetibilidad, facilidad de uso y necesidad de muy pequeas cantidades de muestra, tambin puede ser utilizada como herramienta de la investigacin para conocer las propiedades y caractersticas de adsorbatos y adsorbentes as como para estudiar la interaccin que se produce entre ambos. En el presente trabajo de investigacin, las curvas de respuesta (picos cromatogrticos) obtenidas tras la introduccin de un impulso de wamilasa en las columnas de LIC e ffiC se han obtenido mediante un equipo de HPLC. Los datos experimentales, as obtenidos, se utilizarn para realizar el anlisis mediante el mtodo de los momentos. La experimentacin llevada a cabo con este sistema, cuya descripcin se detalla ms adelante, produce una doble informacin: en primer lugar, nos permitir estudiar la influencia de las variables en base a un anlisis de los parmetros clsicos de la cromatografa (tiempos de retencin, factor de retencin, parmetro de interaccin hidrofbica, carga caracterstica del adsorbato, etc.); en segundo lugar, el anlisis mediante el mtodo de Los momentos (ver apartado 3.2) nos dar estimaciones de la capacidad de los adsorbentes, de los parmetros cinticos (coeficiente de difusin en los poros y de dispersin axial) y termodinmicos (isoterma lineal, entalpa y entropa de adsorcin). A continuacin se describe el equipo experimental de cromatografa lquida junto con los procedimientos utilizados para el desarrollo de cada uno de los experimentos y los ensayos previos llevados a cabo para [a definicin x conocimiento del sistema.

PURIFICACIN DE ~-AM[LASADE ASPERGILLUS ORYZ4E POR ADSORCIN

115

5.2.1. Materiales Como fuente de cx-ainilasa de Aspergillus oyzae se utiliz la procedente del producto comercial Fungamyl 1600 BO type WF, lote AF12614, donada por Novo Nordisk (Bagswerd, Dinamarca). La enzima se extrajo, cristaliz y liofiliz segdn se indica en el apartado 4.1.2 del
presente trabajo.

Los adsorbentes utilizados fueron, para los estudios de adsorcin por interaccin hidrofbica (HIC), Duolite XAD-761 y, para los correspondientes a adsorcin por intercambio aninico (IEC), Duolite A-568. Ambos han sido donados por Rohm and Haas Co. (Filadelfia, PA, EE.UU.). Tras ser
sometidos al pretratamiento correspondiente (ver apanado 5.1), fueron tamizados para obtener la fraccin de tamao seleccionada. Las disoluciones reguladoras utilizadas como fase mvil fueron Tris/HCl 0.05M y fosfato 0.OSM en funcin del valor de pH requerido para cada experimento. La fuerza jnica se ajust mediante la adicin de NaC. Para estabilizar la estructura y actividad de la a-amilasa es necesaria la presencia de Ca2~ en el medio (Vallee et al., 1959; Janecek y Balz, 1992), por lo que a cada

disolucin utilizada se le han aadido 40 ppm de CaCl

2. Los trazadores utilizados para los

experimentos en impulso fueron, NaC 2M y NaNO3 0.25M en el tampn correspondiente para las columnas de intercambio inico e interaccin hidrofbica respectivamente. Todas las disoluciones fueron filtradas a travs de membrana de 0.22 gm Millipore 05WP04700 (Millipore Corp. Bedford, MA, EEUU.). Los reactivos tris(hidroximetiflaminometano (Tris), NaC, NaH1PO4, Na2HPO4 y CaCI2 han sido suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), el cido clorhdrico por Merck (Darmstadt, Alemania) y el NaNO3 por Panreac Qumica (Barcelona, Espaa). El agua utilizada ha

sido destilada y desionizada (< 5 MQcm).

5.2.2.- Equipo experimental

El equipo de cromatografa lquida utilizado fue un SmartMR System (Pharrnacia Biotech, Uppsala, Suecia). En la figura 5.1 se muestra un esquema del mismo. Consta de un sistema de dos bombas de pistn y una cmara termostatizada donde se aloja la columna, la vlvula de inyeccin, el colector de fracciones y los detectores de ultravioleta y de conductividad. La vlvula de inyeccin incluye un lazo de 5 jil para la introduccin de la muestra. El sistema refrigeracin se completa con un bao termosttico Haake lI}8-L (Haake. Karlsruhe, Alemania). Las bombas de impulsin, de 1<) ml de capacidad, tienen un intervalo de funcionamiento de 10-2000 g/min a una presin mxima de 25 MPa. El detector ultravioleta junto con una lmpara de

116

EXPERIMENTAL

xenn permite medir la absorbancia, de forma simultnea, a tres valores de longitud de onda en el intervalo 190-600 nm. El volumen muerto del sistema es muy pequeo y se debe, principalmente, al
correspondiente a los tubos por los que circula la fase mvil (80 pi) y al mezclador a la salida de las

bombas (60 pi) ya que la contribucin de la clula de deteccin de ultravioleta (2 III) y de conductividad (1.5 pi) es, en comparacin, despreciable.

(3)

(1) Eluyentes (2) Vlvulas de entrada y Bombas de pistn (3) Mezclador (4) Vlvula dc inyeccin (5) Columna (6) Cbila UY/Vis (7) Clula de Conductividad (8> Colector de fracciones
(9> Ordenador

(5)
-

UNWMI E

CO~4TR&

(6)

(7)
(9)

Figura 5.1: Esquema del equipo de HPLC (Smart System).

Las columnas

de HPLC utilizadas estn realizadas en acero inoxidable y tienen unas

dimensiones de 2. 1 mm de dimetro interno y 200 mm de longitud. Un programa (Smart Manager), del mismo fabricante, implementado en un ordenador personal (Compaq Deskpro XE 466. Compaq Computer Corp., Houston, TX, EE.UU.) gestiona y controla cada uno de los sistemas mencionados a travs de una tarjeta de adquisicin de datos, as como programa y registra los datos de presin, temperatura, caudal, posicin de la vlvula, absorbancia en ultravioleta y conductividad del efluente que proporcionan los correspondientes sensores y detectores.

5.2.3.- Relleno y preparacin de las columnas de HPLC Las columnas de HPLC se empacaron en el laboratorio de la siguiente manera. Una vez realizado el pretratamiento (ver apartado 5.1) a cada uno de los adsorbentes, se tamizaron y se recogi

PURIFICACIN DE CL-AMILASA DE ASPERGILLUS ORYZAE POR ADSORCIN

117

la fraccin seleccionada para los experimentos (25-38 gm). Posteriormente se suspendieron en una disolucin de cido actico que fue bombeada a travs de la columna de HPLC aplicando una presin aproximada de 45 MPa. La columna se mantuvo a la citada presin hasta que 2 litros de la suspensin pasaron a travs de ella. Para terminar la preparacin, se procedi al lavado de la columna, haciendo

pasar agua destilada a un caudal de 1.0 ml/ma durante 24 horas. Una vez realizado este proceso, se
conecta la columna al equipo para el desarrollo de la experimentacin. La masa de adsorbente en el interior de la columna se determin por diferencia de pesada entre la cantidad inicial utilizada y la resma sobrante del proceso de empacado tras el secado de la misma.

5.2.4.- Desarrollo de un experimento Antes de realizar cualquier experimento en impulso o grupo de ellos en unas condiciones de temperatura, pH y fuerza inica determinada, es necesario que la columna se acondicione adquiriendo los parmetros mencionados. Para el acondicionamiento de la columna, con el tampn de concentracin, pH y fuerza inica seleccionado, se bombea, a un caudal de 0.50 m/mm, la fase mvil adecuada durante 12 horas aproximadamente. Previamente las disoluciones han debido ser filtradas y desgasificadas a vaco (60 mmflg aproximadamente) inmediatamente antes de la experimentacin para evitar el ensuciamiento y posible taponamiento de la parte superior de la columna y obtener cromatogramas sin ruido ni deriva en la lnea base Una vez acondicionada la columna, se fija el caudal de la fase mvil y se realiza el llenado del lazo de la vlvula de inyeccin con la disolucin de a-amilasa o del trazador correspondiente. Posteriormente y mediante el programa de control, se inyecta la muestra en la fase mvil que fluye a travs de la columna. El seguimiento de [a concentracin de -amilasa a la salida de la columna se realiz mediante los datos de absorbancia a 280 nm del detector de ultravioleta. El trazador utilizado en la columna de FC fue NaC 2M, realizndose la medida de la respuesta mediante el detector de conductividad.

Como trazador en la columna de 1-LIC se utiliz NaNO3 0.25M, detectndose mediante absorbancia en ultravioleta a 280 nm. Estos datos se almacenan en el ordenador para su posterior tratamiento
mediante el mtodo de los momentos como se indica en el apartado 3.2.

5.2.5.- Experimentos previos Antes de comenzar la experimentacin para el posterior anlisis matemtico de los momentos cromatogrficos obtenidos en los experimentos en impulso, es necesario determinar los valores o, en

118

EXPERIMENTAL

su caso, los intervalos de operacin de las variables que influyen en la respuesta del sistema.

Adsorbentes Como ya se ha comentado anteriormente, se va a estudiar la adsorcin de a-amilasa sobre dos sistemas con mecanismos de retencin diferente, intercambio inico e interaccin hidrofbica. Se han seleccionado dos adsorbentes que tienen la misma matriz, diferencindose fundamentalmente en los ligandos de que estn recubiertos. As, se podrn estudiar de forma ms independiente el comportamiento en el proceso de adsorcin debido a cada uno de los mecanismos mencionados.

ph La wamilasa muestra una estabilidad extremadamente alta en el intervalo de pH entre 6 y 8. reducindose con el tiempo la actividad enzimtica fuera del mismo (Carsen, 1994), por ello se decidi estudiar la influencia del pH en el proceso de adsorcin entre dichos valores. El punto isoelctrico de la u-amilasa de A. oiyzae es 4.2 (Fischer y de Montmollin, 1951) por lo que la protena presentar, en dicho intervalo, una carga neta negativa, lo que justifica la eleccin de una resma intercambiadora de aniones para el estudio de la adsorcin en sistemas de intercambio inico. Para los experimentos de cromatografa de interaccin hidrofbica, a los valores de pH 6, 7 y 8. se utiliz tampn fosfato C.05M. El tampn utilizado en los experimentos con la columna de intercambio aninico, para pH 7 y 8, fue Tris/HCI 0.05M y fosfato 0.05M para pH 6.

Fuerza jnica

La fuerza inica es un parmetro que tiene gran iniluencia en el mecanismo de adsorcin tanto por interaccin hidrofbica como por intercambio inico (ver apartados 1.2.2.1 y 1.2.2.2). La adsorcin en sistemas hidrofbicos se ve favorecida por un aumento en la fuerza inica de la fase mvil y el efecto contrario ocurre en la adsorcin por intercambio inico. Por esta razn, existe un intervalo de fuerza inica en el que se produce una variacin gradual en la intensidad de la adsorcin. Fuera del mismo, la retencin del adsorbato, o bien no es significativa, o bien es total y queda retenida en el interior de la columna. Se han realizado experimentos en un amplio intervalo de fuerza inica para ambos sistemas estudiados y se ha comprobado que los valores entre los cuales puede estudiarse adecuadamente la respuesta cromatourfica ante un impulso de adsorbato son 0.5
-

1.1 para IEC yO.!

0.4 para HIC.

PURIFICACIN DE c%-AMILMA DE ASPERCILLUS ORYZ4E POR ADSORCIN

119

Concentracin de adsorbato Se realizaron experimentos con impulsos de ct-amnilasa a diferentes concentraciones (0.5, 1.0 y 2.0 gIl) para determinar el valor ms adecuado de esta variable. No se encontraron diferencias entre los tiempos de retencin correspondientes a cada una de las concentraciones ensayadas y a diferentes caudales (figura 5.2).
1300 w 250~ ~ 20015010050-

h
a

[~~rgml

lo

.0 mg/ml

&
E

o.
0.1 0.2 0.3 0.4 Caudal 0.5 0.6 0.7

[nl/minI

Figura 5.2: Representacin del tiempo de retencin en

ifincin del caudal de eluyente para diferentes impulsos de concentracin variable de a-amilasa. Colunma de HIC

(Duolite XAD-76l): pH 7.0, 20 0C y voLumen de inyeccin 5

pi.

Las respuestas cromatogrficas obtenidas para la concentracin de 2.0 gIl presentaban mayor asimetra que las otras dos y las correspondientes a 0.5 gIl eran demasiado dbiles por lo que, en condiciones de alta adsorcin, la exactitud de la medida podra verse comprometida. Por ello, la concentracin de wamilasa seleccionada para la realizacin de los experimentos de impulso en columnas de HPLC fue de 1.0 gIl. Tamao de partcula Cuanto menor sea el tamao de las partculas de adsorbente que rellenan una columna cromatogrfica, mayor ser la resolucin de la misma y mayor simetra presentarn los picos obtenidos. Por otro lado, el menor tamao de partcula tiene asociado una mayor prdida de carga a lo largo de la columna. Tras diferentes experimentos con columnas empacadas con adsorbentes de tamao medio diferente, se determin que el tamao de partcula con el que se obtena un mejor
compromiso entre los efectos mencionados era el de la fraccin tamizada correspondiente al corte 0.25 0.38 gm.
-

120

EXPERIMENTAL

Caudal
El intervalo de caudal de elucin de la fase mvil seleccionado para llevar a cabo la experimentacin ha sido 0.40
-

1.00 m/mm. Para valores inferiores, [a anchura del pico obtenido es

considerable y para valores superiores, la prdida de presin es elevada para el tamao de partcula seleccionado.

Temperatura
El valor mximo de temperatura a la que se pueden realizar los experimentos viene dado por la estabilidad trmica de la propia enzima. De los datos obtenidos de la bibliografa y debido a que los procesos de adsorcin a nivel industrial pueden durar muchas horas, se ha considerado 30 0C como

temperatura mxima de experimentacin

Volumen de inyeccin El volumen ptimo del impulso cromatogrfico inyectado en la fase mvil a la entrada de la columna est relacionado con la concentracin de adsorbato en la muestra. Es necesario evitar que la cantidad de wamilasa introducida al sistema llegue a saturar la cabeza de la columna y se est en condiciones de no equilibrio. Por otra parte. un volumen elevado de inyeccin, aun estando en
condiciones de equilibrio, da lugar a respuestas cromatogrficas asimtricas que dificultan el tratamiento de los resultados obtenidos. En base a la experimentacin previa, se ha establecido un volumen de inyeccin de 5 pi de disolucin de a-antlasa para el estudio de la adsorcin mediante cromatografa de impulso en HPLC.

Reversibilidad Con objeto de comprobar que, tras la inyeccin de una disolucin de wamflasa, no queda protena retenida irreversiblemente en la columna, se realizaron una serie de experimentos. Como la respuesta del detector ultravioleta a 280 nm es lineal para el intervalo de concentracin de a-amilasa
utilizado, podemos suponer que el rea de los picos obtenidos es proporcional a la cantidad de protena que se detecta. Para comprobar el grado de reversibilidad se llevaron a cabo dos tipos de experimentos. Por un lado se determin el rea de los picos obtenidos a la salida de la columna tras la inyeccin de pulsos dc ct-amilasa de volumen y concentracin fija para diferentes caudales. Por otro lado, se inyectaron pulsos de a-amilasa en iuuales condiciones de concentracin, volumen y caudal, pero se sustituy la columna cromatogrfica por un tubo capilar. De esta manera, se determina el rea que le correspondera al pulso de entrada en las condiciones indicadas ya que toda la a-amilasa introducida al sistema es detectada. La diferencia entre e] rea del pulso de entrada y el del pico

PURIFICACIN DE ~-AMIA5ADEASPERGILLUSORY7AE POR ADSORCIN

121

cromatografico registrado en iguales condiciones nos indicar la cantidad de a-amilasa que ha quedado retenida en la columna. Se comprob que en los intervalos experimentales estudiados, la adsorcin es completamente reversible, no existiendo diferencias significativas entre ambas reas salvo a caudales bajos (= 0.2 m/mm) debido, fundamentalmente a que a este caudal, el pico cromatogrfico es muy ancho y achatado, existiendo mayor error en la integracin del mismo. Esto justifica tambin la eleccin de caudales superiores para la experimentacin segn se ha comentado en el apartado correspondiente. En la figura 5.3 se muestra un ejemplo de test de reversibilidad.

35 30 < 25 20 15 10 5 0.1
. . . .

O o

[E~iearada [~orespuesj

2
~

go
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

.9.
0.8 0.9

Caudal lmtfndnl

Figura 5.3: Test de reversibilidad de la adsorcin en experimentos de impulso en HPLC. Columna HIC (Duolite XAD-761): pH 7.0, 20 C, concentracin 1.0 mg/ml y
volumen de inyeccin 5

pi.

SU.- Condiciones de operacin De acuerdo con los experimentos previos realizados y con los objetivos del presente trabajo de investigacin, en la tabla 5.1 se resumen los valores e intervalos utilizados en los experimentos realizados para el anlisis de momentos de las respuestas obtenidas ante los impulsos de cx-amilasa en cromatografa de interaccin hidrofbica y de intercambio inico.

122
Tabla 5.1: Condiciones de operacin para [os experimentos de HPLC. HIC (Duolite XAD-761) Fase mvil Fosfato 0.OSM (pH 6, 7, 8)

EXPERIMENTAL

WC (Duolite A-568) TrisHCI 0.05M (pH 7, 8) Fosfato (pH 6) 6.0, 7.0, 8.0 0.50, 0.60, 0.70, 0.80, 0.90, 1.00, 1.10 1.0 5.0

pH Fuerza inica

6.0, 7.0, 8.0 0.10, 0.20, 0.30, 0.35, 0.40

Concentracin (mg/m) Volumen inyeccin Qil) rainao partcula (.Lm) Caudal (ml/mm) Temperatura (0C) 25

1.0

5.0
-

38

25 38
-

0.40, 0.60, OSO, 1.00 15, 17,20,23,25

0.40, 0.60, 0.80, 1.00

15, 17, 20, 23~ 25

5.3.- ADSORCION EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO Este tipo de instalaciones se caracteriza por su versatilidad, facilidad de uso y gran

simplicidad de las mismas. Permiten de manera sencilla la variacin de las condiciones de operacin
de cada uno de los experimentos para poder establecer la influencia que tienen sobre el comportamiento del sistema en los procesos de adsorcin. Uno de los parmetros cinticos que caracterizan la adsorcin de un soluto sobre las partculas de un adsorbente es el coeficiente de transferencia de materia externa. Una vez que se ha llegado a establecer un rgimen de mezcla perfecta, puede considerarse que la resistencia a la transferencia de materia que ejerce la capa lmite que rodea las partculas del adsorbente ha sido

eliminada. Esta situacin se consigue mediante la seleccin adecuada de la velocidad de agitacin, del
tamao de las partculas slidas y del diseo del equipo experimental. De esta forma, el seguimiento de la disminucin de la concentracin de u-amilasa en la fase lquida en un experimento de adsorcin en tanque agitado, proporcionar las curvas cinticas de las que se obtendr el valor del coeficiente de difusin en los poros tras el correspondiente ajuste de los datos experimentales al modelo propuesto para este tipo de sistemas. Por otro lado, la realizacin de los expcrimentos de adsorcin en un sistema de tanque agitado discontinuo proporcionar la informacin correspondiente a las isotermas de adsorcin mediante la obtencin de datos de equilibrio.

PURIFICACIN DE U-AMILASADEASPERGILLUS ORYZAEPORADSORCIN

123

5.3.1.- Materiales
Como adsorbato se ha utilizado a-amilasa de

A. rnyzae cristalizada y liofilizada. Los

adsorbentes, Duolite XAD-761 y Duolite A-568 para adsorcin por interaccin hidrofbica e

intercambio inico respectivamente, fueron sometidos al pretratanfiento descrito en el apartado 5.1. Las disoluciones de adsorcin utilizadas para LIC e ffiC han sido: tampn fosfato 0.05M de pH 6.0 y Tris/HCI 0.05 de pH 7.0, con una fuerza inica de 0.35 y 0.60 respectivamente (ver apartado
5.2.1.). Todas las disoluciones fueron filtradas a travs de membrana de 0.80 iim Millipore

05WP04700 (Millipore Corp. Bedford, MA, EE.UU.).

5.3.2.- Equipo experimental Los experimentos cinticos y de equilibrio de adsorcin en tanque agitado discontinuo se han llevado a cabo en la instalacin cuyo esquema se muestra en la figura 1, pudindose diferenciar las siguientes partes:

Sistema de adsorcin La adsorcin se realiza en un matraz esfrico de vidrio Pyrex de 50 mm de dimetro con tres bocas cuyas funciones son las siguientes:
-

Introduccin del agitador. Introduccin del tubo de toma de muestras con filtro incorporado. Introduccin del tubo de recirculacin.

Sistema termosttico La temperatura del proceso se controla mediante un bao termosttico de enfriamiento Heto DTI CB-8-30e (Heto-Holten, Aller0d, Dinamarca). El fluido utilizado fue agua o disolucin de etiln glicol para los experimentos realizados a 4 0C, siendo la precisin nominal del controlador de 0.01
0C. El tanque con la disolucin de adsorcin y el adsorbente adecuado se sumerga parcialmente en el

liquido del bao (ver figura 5.4).

Sistema de agitacin
La agitacin se lleva a cabo mediante un agitador de hlice de tres palas realizado en vidrio. Este se encuentra impulsado por un motor con selector y regulador de velocidad IKA RW-20 (Janke

& Kunkel, Staufen, Alemania).

124 Sistema de recirculacin

EXPERIMENTAL

Una bomba peristltica Hewlett-Packard 89052B (Hewlett-Pakard, Avondale, PE, EE.UU.) hace circular continuamente la disolucin de adsorcin a travs de la clula de flujo del
espectrofotmetro Uy/Vis y de medida de pH. En el extremo del tubo de toma de muestra, sumergido en la disolucin de adsorcin, se encuentra un filtro de tefln de 0.8 im para evitar que las partculas de adsorbente salgan del medio. El tiempo muerto del sistema es de 15 segundos y el volumen muerto de 2.3 ml.

Monitor de pH

-1

Espectrofotmnetro 11V/Vis

Bomba

peristltica

Bao termosttico

Figura 5.4: Esquema de la instalacin para los experimentos de adsorcin en tanque agitado discontinuo.

EspectroJbtmetro ultravioleta
El espectrofotmetro Uy/Vis de matriz de diodos Hewlett-Packard 8452A (Hewlett-Pakard.

Avondale, PE, EE.UU.) tiene un intervalo de medida entre 190 y 820 nm. Est dotado con una clula
de flujo de cuarzo de 50 pi. La concentracin de a-amilasa en el tanque se determina mediante absorbancia a 280 nm y se monitoriza y almacena en el ordenador (Hewlett-Packard Vectra

486/33VL) mediante los programas de control Ql IOOA (General Scaning) y Ql lOIA (Quantitication)
del propio fabricante.

Medidor de ph
El seguimiento de la variacin de pH se realiza mediante un electrodo situado en una clula de flujo de 30 pi que se encuentra conectado a un monitor digital, pH Monitor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). De esta manera se determinan las posibles variaciones de pH que puedan producirse

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE ASPERGILLUS ORYZ4E POR ADSORCIN

125

a lo largo del experimento en la disolucin de adsorcin.

5.3.3.- Desarrollo de un experimento Los experimentos cinticos y aquellos realizados para determinar las isotermas del equilibrio
de adsorcin se llevaron a cabo en el mismo equipo experimental pero el procedimiento operativo

difiere ligeramente en cuanto a la toma de muestras y medida de la concentracin de a-antlasa.

El procedimiento operativo para la realizacin de los experimentos cinticos de adsorcin en

tanque agitado discontinuo comienza con el acondicionamiento del adsorbente. Una vez pesada en seco la cantidad seleccionada de este, se le suspende en la disolucin tampn correspondiente al experimento de adsorcin (25 ml aproximadamente) y se mantiene en esas condiciones durante 24 horas. La disolucin de adsorcin con la concentracin adecuada de wanilasa se filtra y, tras medir el
volumen correspondiente al experimento, se echa en el matraz de vidrio. Este se introduce en el bao termosttico a la temperatura de experimentacin y se conecta la agitacin, la recirculacin y el

espectrofotmetro. Se mantiene as durante una hora, tiempo necesario para considerar que el sistema se encuentra termostatizado y estabilizado. A continuacin, la suspensin de adsorbente se filtra a vaco, recogiendo la totalidad del mismo. El experimento comienza cuando se aade el adsorbente al matraz, en ese momento comienza la medida continua de la absorbancia a 280 nm mediante el espectrofotmetro. El final del
experimento se determina cuando la medida de la absorbancia a 280 nm da un valor constante.

El retraso del sistema viene determinado por el tiempo que tarda la disolucin de adsorcin en llegar hasta la clula de medida desde el interior del matraz. Este se ha determinado, obtenindose un
valor de lO segundos.

Los experimentos realizados en tanque agitado discontinuo para la determinacin de las isotermas del equilibrio de adsorcin se ha llevado a cabo de manera anloga, a diferencia que la medida de la concentracin de ct-amilasa mediante absorbancia a 280 nm se realiz solamente para el
valor correspondiente al equilibrio. Para ello se tomaron tres muestras del sobrenadante (1.0 m) y se

midi su concentracin sin necesidad de hacer circular la disolucin por la clula de flujo con la bomba peristltica. Para concentraciones mayores de 1.0 mg/m, debido a que la ley de Beer no se cumple satisfactoriamente, se diluy previamente la muestra obtenida.

5.3.4.- Experimentos previos

Para determinar los valores e intervalos de operacin de las variables del sistema, se han llevado a cabo una serie de experimentos previos que proporcionarn la informacin necesaria para tal

126
fin.

EXPERIMENTAL

plly fuerza inica A partir de los resultados obtenidos en los experimentos de adsorcin en HPLC, se han seleccionado las condiciones de pH y fuerza inica a las que se van a desarrollar el estudio de la adsorcin en tanque agitado discontinuo y en lecho fijo. Estos valores son:
-

Adsorcin por interaccin hidrofbica en Duolite XAD-761: pH 6.0, fuerza jnica 0.35,

Adsorcin por intercambio inico en Duolite A-568: pH 7.0, fuerza inica 0.60.

En estas condiciones el factor de capacidad es elevado pero la adsorcin es aun reversible. Si trabajsemos en condiciones extremas que favoreciesen la adsorcin, no slo se uniran fuertemente
las molculas de a-arnilasa sino tambin otros componentes de la mezcla que se desea separar ya que

en esa situacin la adsorcin no es muy especfica. En el caso de la cromatografa, operar en

condiciones de adsorcin reversibles supone la existencia de una velocidad de migracin detenninada para la a-amilasa y, si se optiman los resultados, diferente de las del resto de sustancias que la acompaan.

Velocidad de agitacin
Es necesario determinar la velocidad de agitacin mnima, a partir de la cual el control de la

transferencia de materia externa puede considerarse que no es significativo. Para ello, se realizaron una serie de experimentos en iguales condiciones de operacin pero con diferentes velocidades de
agitacin.

Para velocidades mayores de 600 rpm, no se aprecian diferencias en las curvas cinticas de
adsorcin. A partir de agitaciones superiores a 1200 rpm la aparicin de espumas produce inestabilidades en La medida de la absorbancia a 280 nm, as como una nueva resistencia a la

transferenciade materia. Por ello se ha elegido una velocidad de agitacin de 800 rpm.

concentracin inicial
Se ha elegido un intervalo de concentracin inicial de a-amilasa en la disolucin de adsorcin de 0.10 a 1.00 s/l. A concentraciones mayores, la absorbancia a 280 nm no cumple la ley de Beer, llegando a saturarse el detector ultravio[eta a partir de concentraciones de 2.5 mg/ml.

PURIFICACIN DE (X-AMILA5A DE ASPERGILLUS ORY7AE POR ADSORCIN

127

Tamao de partcula A la velocidad de agitacin elegida, se han realizado experimentos con diferentes tamaos de partcula en el intervalo 0.20-0.80 mm. No se han detectado influencias significativas debidas a un
control de la transferencia de materia externa por lo que se ha elegido un tamao de partcula

correspondiente a la fraccin intermedia tamizada entre 0.32-0.50 mm. Volumen de disolucin El volumen de la disolucin de ct-amilasa no iiffluye en el comportamiento cintico ni de
equilibrio en el proceso de adsorcin. Para volmenes excesivamente pequeos (menores de diez

veces el volumen muerto del sistema de recirculacin), aparecen problemas tcnicos y de retraso de
las curvas cinticas de adsorcin. Si el volumen es demasiado grande, el problema que aparece es el de la correcta mezcla y homogeneizacin de la suspensin, haciendo necesaria la utilizacin de sistemas de agitacin ms complejos con la inclusin de tabiques deflectores en el tanque de

adsorcin. Tras diversos experimentos, se seleccion un volumen de disolucin de 50 mL suficiente para evitar los problemas mencionados, permitiendo as una buena homogeneizacin de la suspensin mediante agitacin simple.

Masa de adsorbente La seleccin de la masa de adsorbente utilizado en cada experimento est relacionada con el
volumen de disolucin y con la capacidad de adsorcin de la resma en las condiciones experimentales, que viene dada por la isoterma de equilibrio. Si la concentracin de adsorbente en la suspensin es elevada, aparecern problemas de transpone de materia, y si es demasiado baja, la

disminucin de la concentracin de enzima en la disolucin puede llegar a ser tan pequea que su seguimiento est sujeto a un error experimental intolerable. A partir de estas consideraciones y de los experimentos previos realizados, se ha decidido llevar a cabo los experimentos cinticos con una cantidad de 0.50 g de adsorbente. Para los experimentos de equilibrio en los que la concentracin de a-amilasa fue superior a 1.0 mg/ml se
utilizaron cantidades entre 0.75 y 1.75 g, en funcin de la concentracin inicial de enzima.

5.3.5.- Condiciones de operacin En la siguiente tabla se resumen las condiciones experimentales e intervalos de las variables de operacin estudiadas:

128

EXPERIMENTAL

Tabla 5.2: Condiciones de operacin para los experimentos cinticos en tanque agitado discontinuo.
HIC (Duolite XAD-761) Tampn pH Fuerza inica Concentracin (mg/mi) Masa adsorbente (g) Agitacin (rpm) Volumen (mi) Tamao partcula Qtm) Temperatura (0C) WC (Duolite A-568)

Fosfato 0.05M 6.0

0.35

Tris/IIC 0.05M 7.0

0.60

0,1 0.5
-

0.1

1.0

0.50

0.50 800 50 0.32 0.50

-

800 50 0.32 0.50

-

4, 20, 30

20, 25, 30

5.4.- ADSORCIN LECHO FIJO

La disposicin ms frecuentemente utilizada a nivel industrial en los procesos de purificacin por adsorcin es aquella que utiliza uno o varios lechos fijos. Respecto a la adsorcin en tanque agitado. la llevada a cabo en lecho fijo es ms fcilmente escalable y el control de las variables del sistema es ms sencillo. Sin embargo en el flujo de un fluido a travs de un lecho fijo, aparece el efecto de mezcla a lo largo del eje longitudinal de la columna, denominado dispersin axial, que produce una disminucin de la eficacia de los procesos de adsorcin. La experimentacin en lecho fijo deber minimizar este efecto para mejorar el rendimiento obtenido en el sistema.
Con el fin de disminuir la resistencia a la transferencia de materia externa es necesario seleccionar panculas de adsorbente suficientemente pequeas. Por otro lado, sera deseable el uso de

caudales elevados ya que el caudal de operacin est directamente relacionado con la produccin del proceso. Sin embargo, el aumento del caudal y la disminucin del tamao de partcula conducen ambos a un incremento de la prdida de carga a lo largo de la columna por lo que ser necesario alcanzar una solucin de compromiso entre ambos factores.
Estas variables (caudal y tamao de partcula), junto con otras caractersticas del proceso

(concentracin, temperatura, tamao de lecho, etc.) tendrn que ser optimadas para conseguir los
niveles de pureza del producto requeridos por las especificaciones establecidas para su uso, as como los valores de produccin y rendimiento especificados en el diseo del proceso.

130

EXPERIMENTAL

la inclusin de un eluyente adicional. Sirven para impulsar la disolucin de adsorcin y las de clucin necesarias para cada uno de los experimentos planificados.

Columna
Durante la experimentacin correspondiente a este estudio sc han utilizado dos tipos de columna con dimensiones diferentes. Ambas columnas, marca Amicon, modelo Moduline (Amicon Corp. Danvers, MA. EE.UU.), estn fabricadas en vidrio. Se encuentran provistas de una camisa externa que permite la termost=atizacin de la misma mediante la circulacin de un lquido refrigerante. Constan de cierres mviles en los extremos, haciendo posible la variacin de la altura del lecho, ajustndola a la cantidad de adsorbente introducido en la columna. Las dimensiones de los dos modelos de columna dc adsorcin son las siguientes:

Tabla 5.3: Dimensiones de las columnas.

I)imetro interno (mm) Altura mxima (mm)

10 16

150 250

Mdulo de anlisis
Como se ha determinado previamente, el seguimiento de la concentracin de wamilasa se lleva a cabo niediante medida de la absorbancia a 280 nm. El sistema experimental consta de una clula de flujo de 2 ml con una lmpara de mercurio conectada al monitor UV-M-II que mide y registra los datos de absorbancia a la longitud de onda mencionada.

Mdulo de pH
Otro de los detectores del sistema consiste en un medidor de pH en continuo que consta de una clula de flujo y un electrodo conectado a la unidad de medida, pH Monitor.

Co lectorde fracciones
Con objeto de recuperar determinadas fracciones del efluente, o de realizar otro tipo dc anlisis paralelos al de absorbancia en ultravioleta para el seguimiento del proceso de adsorcin (medida de la actividad, etc.), se dispone de un colector de fracciones programable, Frac-200, a la

PURIFICACIN DE X-AMILASA DE ASPERGILLUS ORYZ.4E POR ADSORCIN

131

salida del sistema.

Mdulo de control
Est compuesto por un controlador LCC-500 CI y un ordenador personal IBM 330 P100 (IBM Corp. Armonk, NY, EE.UU.) con el programa de control FPLC Director (Pharmacia Biotech. Uppsala, Suecia). Este mdulo controla, programa y registra todas las actividades de cada uno de los diferentes dispositivos de que consta el equipo experimental. Adems, mediante el programa de control, se registran los valores, en continuo, de caudal, pH absorbancia a 280 tun, etc, que permitirn posteriormente su tratamiento numrico en la etapa de modelado matemtico de los experimentos realizados. El equipo dispone tambin de una serie de vlvulas motorizadas (PSV-50, MV-7) que permiten dirigir el flujo de cada una de las bombas a travs de la columna en la etapa de adsorcin y desorcin, as como realizar un cortocircuito a la columna.

5.4.3.- Desarrollo de un experimento Se debern tener preparadas las disoluciones de elucin, de adsorcin y de lavado filtradas y

desgasificadas. La disolucin de elucin es la misma que el tampn en que est disuelta la a-amilasa
en la disolucin de adsorcin. La de lavado es una disolucin que facilita la desorcin de todas las sustancias que hayan podido quedar retenidas en cada uno de los sistemas estudiado: para HIC deber ser una disolucin de muy baja fuerza inica y para IIEC de mayor fuerza inica que la disolucin de adsorcin correspondiente (ver tabla 5.4).

Una vez rellenada la columna cromatogrfica, debe acondicionarse para estabilizarse y

adquirir los valores de pH, fuerza inica y temperatura correspondientes al experimento que se va a realizar. Para ello, se hace pasar un volumen determinado de disolucin de elucin a travs de la

columna y se conecta el sistema de termostatizacin a la camisa que rodea a la misma. Para conocer la
seal de absorbancia a 280 nm correspondiente a la disolucin de elucin y de adsorcin, se realiza un cortocircuito a la columna con cada una de las disoluciones mencionadas. El experimento comienza cuando se cambia la fase mvil que se alimenta al sistema, pasando

de la disolucin de elucin a la de adsorcin con la concentracin de a-amilasa y el caudal

correspondiente al experimento. La evolucin del pH y de la concentracin de adsorbato a la salida de

la columna se determina mediante el monitor de pH y la absorbancia en ultravioleta a 280 nm

respectivamente. Los datos se registran y almacenan en el ordenador para su posterior tratamiento matemtico. El experimento de adsorcin termina cuando la seal de absorbancia en ultravioleta del

132

EXPERIMENTAL

efluente alcanza el valor obtenido para la disolucin de adsorcin (saturacin completa de la

columna) o una fraccin determinada del mismo (saturacin parcial).

Tabla 5.4: Composicin de las disoluciones de elucin y lavado con las cantidades utilizadas en las etapas de acondicionamiento y lavado respectivamente.

mc
Disolucin de elucin Tampn fosfato 0.05M pH 6.0 fuerza inica 0.60 Acondicionamiento 40 volmenes de lecho (90 mm)

WC

Tampn TrisfHCl 0.05M

pH 7.0 ffierza inica 0.35 50 volmenes de lecho (120 mm)

Disolucin de lavado

Agua destilada

Tampn Tris/UCI 0.05M pH 7.0 Fuerza inica 2.50

Lavado

30 volmenes de lecho (60 mm)

20 volmenes de lecho (60 mm)

A continuacin se procede a llevar a cabo el experimento de desorcin mediante un procedimiento experimental anlogo pero, en este caso, la disolucin que se alimenta a la columna
saturada de adsorbato es la de elucin. La desorcin acaba cuando la absorbancia a 280 nm del efluente de la columna es igual a la que le corresponde a la disolucin de elucin.

Posteriormente se realiza el lavado de la columna para eliminar cualquier traza de adsorbatos

que hubiesen podido quedar retenidos al adsorbente. Para ello se hace pasar un volumen adecuado (ver tabla 5.4) de disolucin de lavado, dejando la columna preparada para volver a realizar el acondicionamiento para el siguiente experimento.

5.4.4.- Experimentos previos Los experimentos de adsorcin en lecho fijo se han llevado a cabo en las mismas condiciones de pH y fuerza jnica que los desarrollados en tanque agitado discontinuo para cada uno de los mecanismos de adsorcin estudiados, intercambio inico e interaccin hidrofbica.

caudal
Con objeto de estudiar la influencia de la velocidad de la fase mvil en el comportamiento cintico del proceso de adsorcin, se ha seleccionado un amplio intervalo de valores de caudal. Para

PURIFICACIN DE ~-AMILA5A DE ASPERGILLUS ORYZ4E POR ADSORCIN

133

los experimentos realizados en la columna de 10 mm de dimetro, los valores han sido 0.10
m/mm y para la columna mayor, de 16 mm de dimetro, hasta 5.00 ml/mm.

1.00

Concentracin inicial
Por motivos de comparacin de resultados, los valores de concentracin de adsorcin en lecho lijo, se han elegido en un intervalo similar al correspondiente a los experimentos de adsorcin en tanque agitado, 0.10
-

1.00 mg/mi. Para los experimentos, realizados con fines de escalado del

proceso, llevados a cabo en la columna de mayor tamao, la concentracin de wamilasa en la fase mvil fue de 2.50 mg/mI, de similar orden que la que se puede encontrar en el caldo de fermentacin del cual se obtiene a nivel industrial.

Tamao de partcula
Se ha usado la misma fraccin de tamaos de partcula que en los experimentos en tanque agitado, 0.32 0.50 mm. A diferencia de este sistema, y debido a una menor velocidad superficial del
-

fluido, en el proceso de adsorcin en lecho fijo no se ha eliminado el control a la transferencia de materia externa que ejerce la capa lmite que rodea a las partculas de adsorbente. Por esta razn, se

pretende estudiar el efecto del tamao de partcula en el coeficiente de transferencia de materia

externo, realizando experimentos con otras dos fracciones diferentes, 0.20 0.32 y 0.50 0.80 mm.
-

Dimensiones del lecho

Para un estudio de cambio de escala, es necesario realizar experimentos en Lechos de diferentes dimensiones. Esta variable est directamente relacionada con la masa de adsorbente utilizada en cada uno de los experimentos. En el presente trabajo se han utilizado columnas con una carga de resma de 0.50, 1.00 y 13.00 g. Las dimensiones de cada una de ellas vienen fijadas por la densidad del adsorbente slido as como por la distribucin de tamaos de partcula que determina el empaquetamiento del lecho.

Temperatura
Los valores de temperatura ensayados han sido los mismos y por las mismas razones que los llevados a cabo en los experimentos de adsorcin en tanque agitado, es decir, para la adsorcin por interaccin hidrofbica sobre Duolite XAD-761, a 4, 20 y 300C y para la adsorcin por intercambio

inico en Duolite A-568, a 20, 25 y 300C.

134 5.4.5.- Condiciones de operacn

EXPERIMENTAL

A continuacin se resumen las condiciones experimentales utilizadas en el estudio de la adsorcin de wamilasa en lecho fijo:

Tabla 5.5: Condiciones de operacin para los experimentos de adsorcin en lecho fijo.
HIC Fase mvil pH Fuerza inica Concentracin de entrada (mg/m) Caudal (m/mm) Temperatura (0C) Tamao medio de partcula (mm)
Masa

WC

Tampn fosfato 0.05M 6.0

0.35

Tampn Tris/HCI 0.05M

7.0
0.60 0.25, 0.50, 1.00, 2.50 0.25, 0.50, 1.00, 5.00 20, 25, 30
0.26, 0.41, 0.65 0.5, 1.0, 13.0

0.25. 0.50, 1.00, 2.5 0.25, 0.50,1.00, 5.00 4, 20, 30 0.26, 0.41, 0.65
0.5,1.0

adsorbente (g)

5.5.- BIBLIOGRAFA
-

Carsen. M. (1994). a-Amylase production by Aspergillus oryzae, PhD Thesis. Department of

Biotechnology, Technical University of Denmark.

Clonis, YO.; iones. K. y Lowe. C.R. (1986). Process scaie bigh-performance liquid affinity chromatography, C/irornatogr., 363 (1), 3 1-36.

Compton, B.J. y Kreilgaaid. L. (1994). Chrornatographic analysis of therapeutic proteins Chern., 66 (23), 1175A-1180A.

Anal.

Felinger, A. y Quiochon, 0. (1994). Optimizing experimental conditions for minimum production cost in preparative chromatography, AIChE .L, 40(4), 594-605.

Fisclier, E.H. y de Montmollin, R. (1951). Proprietes de la-amylase dAspergillus oryzae cristallisee. Helv. 0dm. Acta, 34. 1994- 1999.

Gooding, DL.; Schmuck, M.N.; Nowlan, MP, y Gooding, K.M. (1986). Optimization of preparative hydrophobic interaction chromatography purification methods, Chromatogr., 359, 331-337.

Janecek. 5. y Balz, S. (1992). Alpha-arnylases and approaches leading to their enhanced sability~, FELIS Lett.. 304(1). 1-3.

Kato, Y.; Kitamura. T. y -lashimoto, T. (1985). Preparative high-perlbrmance hydrophobic

PURIFICACIN DE

~-AMILA5A DEASPERGILLUS ORY7AE POR ADSORCIN

135

interaction chromatography of proteins on TSKgel Phenyl-5PW, .1? Chromatogr., 333 (1), 202210. Kenney, A.C.; Thompson, P.W. y Harris, J.L. (1989). Automatie chromatography apparatus and method, and their use in monoclonal antibody purification, Bur. Pat. Appl., EP 317 114. Vahee, B.L.; Stein, EA.; Sumerwell, W.N. y Pischer, E.H. (1959). Metal content of alphaamylases of various origins, Biol. Chem., 234(11), 2901-2905. Velayudhan, A.y Horvth, C. (1988). Preparative chromatography of proteins. Analysis of the multivalent ion- exchange formalism, J. Chromatogr., 443, 13-29.

PURIFICACIN DE ct-AMILASADEAspergilIus

oryzae POR ADsORCIN

137

6. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

6.1.- CROMATOGRAFA DE IMPULSO

En este apartado se muestran los resultados obtenidos mediante cromatografa de impulso de

cx-amilasa en columnas de interaccin hidrofbica (HIC) y de intercambio inico (IEC). A partir de

ellos se estudiar la influencia de las variables de operacin en los dos sistemas utilizados y se

determinarn los parmetros cinticos y termodinxnicos de la adsorcin en base a la teora de momentos.

6.1.1.- Planificacin de experimentos Para la consecucin de los objetivos generales del presente trabajo de investigacin, se realizar experimentacin mediante cromatografa de impulso sobre los sistemas de IEC y

mc

seleccionados. En esta etapa experimental se plantearon varios objetivos especficos que a

138 continuacin se detallan.

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCUsIN

En primer lugar se pretende determinar la influencia que tienen las variables de operacin pH,

temperatura, fuerza inica y caudal sobre la retencin de a-amilasa en Duolite A-568 y Duolite XAD761. Para ello, se realizarn experimentos en un determinado intervalo de cada una de las variables
mencionadas de acuerdo con los resultados obtenidos en la experimentacin previa llevada a cabo (ver apartado 5.2.5). En segundo lugar, se proceder a estimar los parmetros cinticos y termodinncos mediante el anlisis de los momentos cromatogrficos en cada una de las condiciones ensayadas. Para la aplicacin de esta tcnica, es necesario contar con experimentos realizados a diferentes caudales para cada valor de pl-!, fuerza jnica y temperatura (ver anexo A, apanado A. 1).

Tabla 6.1: Condiciones experimentales para cromatografa de impulso de a-

amilasa sobre Duolite XAD-761.

Temperatura [0C1 pH Fuerza Lnca Caudal [ml/mm]

0.10 6.0 0.20 0.30

0.35

0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 1140, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00
0.40, 0.60, 0.80, 1.00

0.01 0.10
20 7.0 0.20

0.30 0.40 0.20 3.0 0.30

0.40, 0.60, 0.80, 1.00 040,0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00

GAG
15 17 23 25 6.0 0.35

0.40, 0.60. 0.80. 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00

0.40, 0.60, 0.80, 1.00

Por ltimo, para el estudio de la hidrofobicidad del sistema de HIC

de la carga caracterstica

del sistema de IEC se deber disponer de experimentos llevados a cabo en iguales condiciones de pH,

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

139

temperatura y caudal para diferentes valores de la fuerza inica de la fase mvil Para cada uno de los experimentos correspondientes a impulsos de a-amilasa se ha realizado otro en iguales condiciones de operacin pero utilizando trazador como soluto. El trazador para la columna de intercambio inico ha sido disolucin de NaC 2M y para la de interaccin hidrofbica,

disolucin de NaNO3 0.25M. En las tablas 6.1 y 6.2 se muestra la planificacin de los experimentos mencionados.

Tabla 6.2: Condiciones experimentales para cromatografa de impulso de aamilasa sobre Duolite A-568.
pH Temperatura 0C] [ Fuerza lnica Caudal [ml/mm]

0.90 6.0 1.00 1.10 0.60 20 7.0 0.70 0.80 0.90 0.50 8.0 0.60 0.70 0.80 15 17 23 25 7.0 0.60

GAG, 0.60, 0.80, 1.00 0.40,0.60, 0.80, 1.00

GAG, 0.60, 0.80, 1.00

0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40,0.60,0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 GAG, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 GAG, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00 0.40, 0.60, 0.80, 1.00

6.1.2.- Influencia de las variables de operacin

Los resultados de la cromatografa de impulso se han obtenido en forma de pico cromatogrfico que corresponde a la respuesta detectada a la salida de la columna tras un impulso de a-amilasa a la entrada de la misma. En las figuras 6.1 y 6.2 se muestran algunos picos obtenidos en diferentes condiciones de operacin para cada uno de los adsorbentes utilizados.

140

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCUsIN

Los picos experimentales obtenidos presentan asimetra, siendo ms acusada para condiciones de operacin en las que la adsorcin es ms fuerte, aprecindose esta tendencia en todos los experimentos realizados con impulsos de a-amilasa. La asimetra de los picos en cromatografa puede deberse a la existencia de grandes volmenes muertos entre el inyector y el detector del cromatgrafo

(Johns, 1989), incluyendo la columna (huecos, empaquetamiento deficiente, etc.). Si esta fuese la causa, debera producirse para todos los solutos inyectados, independientemente de su naturaleza. Sin
embargo el efecto mencionado no se presenta en los experimentos realizados con trazador, los cuales producen picos simtricos, asemejndose con gran precisin a una distribucin gaussiana. La posible causa de la forma de los picos obtenidos para los experimentos de a-amilasa (brusca subida hasta el mximo del pico y una bajada con una tendencia lenta hasta alcanzar de nuevo la lnea de base),

puede ser debida a un equilibrio no lineal de adsorcin tanto para la resma de 1-LIC como para la de
IEC.

500

2000

Figura 6.1: Picos cromatogrficos. (1) Impulsos de a-amilasa sobre Duolite XAD-761 a 20 C, pH 6.0 y 0.60

m/mm a tres valores de fuerza inica: (A) 0.10, (B) 0.20 y (C) 0.35. (11) Impulsos de a-ainilasa sobre Duolite A568 a pH 6.0, fuerza inica 0.60 y 0.60 ml/mm a tres temperaturas: (A) 15 0C, (B) 20 0C y (C) 25 C.

Clculo de la poros USad de la columna

tina vez determinada la porosidad interna de las partculas de ad,sorbente mediante porosimetra de mercurio, la porosidad de la columna se ha determinado a partir de las ecuaciones 3.3 y 3.4, que relacionan el primer momento con la constante del equilibrio de adsorcin. Si se realizan experimentos en impulso con un trazador que no se retenga sobre el adsorbente (es decir, KA ecuacin 3.3 quedar de la siguiente forma:
4

(1) la

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

141

Ij

ye)

i{
-h

[6.1]

sabiendo que la relacin entre la velocidad lineal, y, y la velocidad intersticial, por

y =

y,

viene determinada

V/e.
200

200

(A)
50150--

(B)

loo-Asri
j.

loo--

50--y

-v

0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200

L/V lsl

L/V lsl

Figura 6.2: Representacin grfica del primer momento frente a LP! correspondiente al trazador en: Duolite

XAD-761 (A} y Duotite A-568 (B).

De esta forma, de la pendiente de la grtica g frente a L/V figura 6.2 se ha calculado el valor de la porosidad externa de cada una de las dos columnas utilizadas, con lo que ambas columnas quedan caracterizadas (tabla 6.3).

Tabla 6.3: Caractersticas de las columnas de HPLC

Duolite XAD-761 (HIC) Duolite A-568 (WC)

0.57
0.45 L [mi Dimetro interno [m] 0.20

0.56
0.50 0.20

2.1 o-~

2.1

flidrojbicidad de la resma Duolite XD- 761

Para caracterizar la hidrofobicidad que presenta la resma Duolite XAD-761 frente a la

adsorcin de a-amilasa de A. oryzae en base a la teora solvofbica (Melander a nI., 1984) es

Determinada por porosimetra de mercurio (apartado 4.4.2).

142

RESULTADOS EXPERIAffNTALE5 Y DysCusrN

necesario conocer la variacin del tactor de retencin, k, en funcin de la concentracin salina de la fase mvil. En la figura 6.3 se representan los resultados obtenidos para dicha variacin correspondiente a los tres valores de pH estudiados. IDe acuerdo con la ecuacin 1.9, la pendiente de cada una de las rectas representa el parmetro de interaccin hidrofbica (?~) y la ordenada en el origen (ln k~) corresponde al factor de retencin extrapolado a concentracin salina nula. Los resultados se muestran en la figura 6.4 y en la tabla 6.4.

3-

o
--

-2
4---

-.4

1---~~
SS-60.1

----A

0.2

((.3

0.4

ni [aol kg~]

Figura 6.3: Variacin del factor de retencin en

ncin de la

concentracin salina de [a fase mvil para tres valores de pH en el sistema u-arnilasa/Duolite XAD-76 1. Como puede observarse, al aumentar el pH la ordenada en el origen no vara

sianificativamente, disminuyendo la pendiente de frma considerable. Ella bibliografa hay muy pocos datos experimentales relacionados con la variacin de estos dos parmetros con el pH, sin embargo, para estudios realizados con lisozima se ha observado que el pH afecta a la ordenada en el origen pero no a la pendiente (Fausnaugh y Regnier. 1986). El primer parmetro, ln(k~), determina la retencin en ausencia de sal, teniendo en cuenta la interaccin neta debida a fuerzas electrostticas y de Van der Waals (Kaui et aL, 1987). Este parmetro tiene un valor muy bajo a los tres valores de pH utilizados, correspondiendo a una retencin prcticamente nula en ausencia de sal. Esta situacin en la que la retencin no es significativa se extiende hasta valores de fuerza inica de 0.1. Por otra parte. Los valores obtenidos de X indican que la adsorcin de wamilasa en Duolite XAD-76 1 depende fuertemente de la concentracin salina del medio. El parmetro de interaccin hidrotk5bica es proporcional a la superticie hidrofbica de contacto entre la protena y el adsorbente (El Rassi y Horvth. 1986) y, en el sistema estudiado, aumenta al disminuir el pH en el intervaLo

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

143

experimental. La disminucin del rea hidrofbica accesible podra deberse a algn cambio conformacional sufrido por la cz-amilasa al aumentar el pH. Para comprobar y explicar la causa de esta circunstancia, sera necesario realizar estudios adicionales relativos a la estructura y conformacin de la a-amilasa en diferentes medios.
.

o.

Tabla 6.4: Parmetros

-

-s

caractersticos de la interaccin hidrofbica calculados por regresin a partir de la figura 6.3.

ln(kw>

A 18.1 14.8 7.9 0.994 0.972 0.984

~ lo

pH 6.0
-u

-5.9

pH 7.0 pH 8.0

-5.7
-5.6

1
6

pH

Figura 6.4:

Variacin del parmetro de

interaccin hidrofbica con el pH para la adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD-761.

Carga caracterstica de la cx-amilasa en la resma Duolite 568

Mediante la ecuacin 1.10 se ha calculado la carga caracterstica de la a-amilasa para cada valor de pH a partir de la pendiente de la recta obtenida al representar el logaritmo del factor de retencin frente al logaritmo de la concentracin molar de la sal (figura 6.5). Debido a que el contrain sujeto a intercambio es el Cf, se ha tomado como valor de la carga, Z3, igual a 1. En el intervalo experimental de pH (6
-

8), el estado de ionizacin de los aminocidos vara

poco, slo el grupo imidazol de la histidina puede encontrarse ionizado o no a valores de pH correspondientes a dicho intervalo (pK 6.0 7.0). Debido a que el punto isoelctrico de la a-amilasa
-

es 4.2, presentar carga neta negativa a valores de pH superiores a ese valor. En el intervalo experimental, a medida que el pH de la fase mvil aumenta, la carga neta tambin lo har, siendo la progresiva ionizacin de la histidina la principal contribucin a ese aumento de carga negativa. Como puede observarse, los resultados experimentales muestran (tabla 6.5 y en la figura 6.6) un ligero incremento de la carga caracterstica de unin de la a-amilasa en la resma Duolite A-568 que ira asociado, posiblemente, al incremento de carga neta experimentado por la protena a nedida que aumenta el pH del medio.

144

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

2.0

In<t/[NaCjI)

Figura 6.5: Influencia de la concentracin molal de sal en

el factor de retencin a tres valores de pH en el sistema w amlasaDuolite A-568.

.8.4.

3.2
A

Tabla 6.5: Valores de la ordenada en el origen,

3.8

In(A), y carga caracterstica de la a-amitasa 4, calculados por regresin lineal a partir de los datos de la figura 6.5 de acuerdo con la ecuacin 1.10.
,

2.8 N

-r
2.6

In(A) pH 6.0 pH 7.0

4,
2.6
2.8 3.2

1.48
0.19 -1.14

0.999
0.982 0.988

2.2 8 7.8

pl

rl-! 8.0

Figura 6.6: Variacin de la carga caracterstica de la rt-amilasa de A. oryzae con el pH en la

resma de intercambio jnico Duolite A-568.

Influencia de las variables

La retencin de la -amilasa sobre cada uno de los adsorbentes ensayados, depende de una serie de factores que a continuacin se describen. Se ha representado el factor de retencin en funcin de la fuerza inica para diferentes valores de pH (figura 6.7). Se observa que la fuerza jnica tiene una influencia positiva sobre la retencin en el caso de [a adsorcin sobre la resma hidrofbica Duolite XAD-761 (figura 6.7A). El aumento de la fuerza inica hace aumentar k, en el intervalo utilizado, de forma muy rpida a pH 6, moderada a pH

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspe rgillus

oryzae POR ADSORCIN

145

7 y muy baja a pH 8. En todos los casos, la retencin experimentada por la protena a valores de fuerza inica cercanos a cero es prcticamente nula. El aumento de la concentracin salina en la fase

nvil, produce interacciones hidrofbicas de intensidad creciente entre la ct-anilasa y el adsorbente. Este hecho est de acuerdo con la teora de retencin de adsorbatos modulada por la concentracin de
sal (Horvth el al., 1976; Melander y Horvth, 1977; Melander et al., 1989) basada en la teora solvofbica (Sinanoglu y Abdulnur, 1965; Sinanoglu, 1982). De acuerdo con esta teora, a medida que aumenta Ja concentracin salina, los iones se solvatan, dejando menos molculas de agua disponibles para hidratar las molculas de protena, por lo que se favorecen las interacciones entre las zonas apolares de esta con los lgandos hidrofbicos del soporte. Esta situacin no ocurre en presencia de determinadas sales que favorecen la hidratacin de las protenas como son las que contienen determinados cationes bivalentes como el Mg2~, Ba2~ o Ca2~ (Arakawa y Timasheff, 1982; Szepesy y Horvth, 1988).
0

4.0 -

EJ

(A)
8

(B)

EJ
pU 6.0
E

3.0

6y

2.1.) -

44
1.0
-

y y

2A

u
y-

Y
-& y

-y
1

-y
0.1 0.2

-- A-

O
0.3 0.4

00

0.5

0.7

0.9

1.I

Fuerza jnica

Fuerza jnica

Figura 6.7: Variacin del factor de retencin con la fuerza inica para diferentes valores de pH en la resma de HIC (A) y de WC (B). Experimentos realizados a un caudal de 0.60 ml/mm y 20 0C. Se observa que la influencia de la fuerza inica sobre el intercambio inico de a-amilasa en

Duolite A-568 es opuesto al comentado para la interaccin hidrofbica (figura 6.7B). Los iones,
aniones Cf en el presente caso, actuaran como competidores de la protena, cargada negativamente, por los sitios de unin de la fase estacionaria. De acuerdo con el intercambio estequiomtrico

146

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

planteado por la ecuacin 1. 11, la constante del equilibrio del equilibrio vendr dada por:

[] [s] TWuL~v] 3
>j 6<

[6.2]

por lo que un aumento de la concentracin de sal en la disolucin, 5, conducir a una cantidad menor de protena adsorbida a los ligandos inicos de la matriz, lo que explicara los resultados obtenidos
para la influencia de la fuerza inica en el sistema de IEC. El efecto del pH sobre la~ ~adsorcin de ct-amilasa en 1-lIC ha sido parcialmente comentado para valores bajos de fuerza inica (figura 6.7A). El incremento del pH produce una diferencia creciente entre ste y el punto isoelctrico de la a-amilasa (pl = 4.2), aumentando la magnitud de su carga neta negativa. En estas condiciones, las interacciones electrostticas entre la enzima y la fase mvil sern mayores que las interacciones hidrofbicas entre la a-amilasa y el adsorbente, disminuyendo, por tanto, la capacidad de retencin de la fase estacionaria. Como se ha determinado anteriormente para el sistema de intercambio inico, la carga caracterstica de unin de la u-amilasa aumenta al hacerlo el pH. Este efecto no se corresponde con el aumento del factor de retencin al disminuir el valor del pH (figura 6.7B) ni con los modelos que predicen una dependencia exponencialmente creciente de k con el pH (Kopaciewicz
ci

al., 1983;

Velayudhan y Horvth, 1988). Este efecto puede ser debido a que la resma Duolite A-568 es un intercambiador aninico dbil por lo que la disminucin del pH puede resultar en un proaresivo incremento del nmero de grupos amino ionizados, aumentando la capacidad de adsorcin (Bautista et al., 1997). La temperatura tiene una iniluencia positiva importante sobre la adsorcin de wamilasa en IEC. El aumento de la temperatura favorece la retencin de la protena debido a la mayor movilidad de las especies lnicas presentes. En el caso de la adsorcin de a-amilasa en la resma hidrofbica

Duolite XAD-761, la influencia de la temperatura es muy pequea en el intervalo experimental

existiendo una ligera tendencia a disminuir el factor de retencin al aumentar la temperatura. En la figura 6.8 se representa la influencia de la temperatura en la adsorcin de u-amilasa sobre cada una de las dos resinas estudiadas.

PURIFICACIN DE CI-AMILASADEASpergIIIUS cryzae POR ADSORCIN

147

Fr71w1
a
4.5.

4
4.

3.

F
..

15

17

19

21

23

25

Temperatura [C]

Figura 6.8: Efecto de la temperatura en la

adsorcin de a-ainilasa sobre el factor d retencin en los dos adsorbentes utilizados. Condiciones de operacin: pH 6.0, fuerza inica 0.35 (HIC) y pH 7.0, fuerza inica 0.60 (IEC), todos a un caudal de 0.60 ml/mm.

6.1.3.- Anlisis de momentos El anlisis y discusin de resultados mediante el mtodo de momentos se realizar en dos etapas. En la primera se determinarn los parmetros de equilibrio
(KA y

factor de capacidad) y

termodinmicos (AH0 y AS0). En la segunda etapa, con los datos del segundo momento central y los
del primer momento calculado previamente, se estimarn los parmetros cinticos del modelo de

adsorcin, coeficiente de dispersin axial

(0L)

y coeficiente de difusin en los poros (ID).

Datos termodinmicos y de equilibrio

A continuacin se representan los resultados obtenidos correspondientes al primer momento para cada una de las resinas en las condiciones de operacin en las que se ha trabajado el los experimentos de cromatografa de impulso.

148

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCusIN

300

250
200 150

100

50

O 0 10 20 30 40 50 60

L/v [si Figura 6.9: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y 20 C a diferentes valores de fuerza inica para la resma Duolite XAD-761 (HIC).

250

200-
y

4--

150
~4~

y-

100

Ay

50

..-A

-~

o
O 10 20 30 40
50

60

L/v [si Figura 6.10: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y 20 C a

diferentes valores de tuerza jnica para la resma Duolite XAD-761 (HIC).

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

149

125 e
100
-

E
- -,

-,

75

u50

25

10

20

30
L/v [s]

40

50

60

Figura 6.11: Representacin del primer momento frente a Liv a pH 8.0 y 20 0C a diferentes valores de fuerza inica para laresma Duolite XAD-761 (HIC).

300 ~peratura UISC 250

- -

4.. e
.-- -

A20C
@25C3
-

Y.

-.

200

- -

--

-Ji

150 -

-e--

~-1

4
100-

- -

3---a

50 o
0

10

20

30
L/v [s]

40

50

60

Figura 6.12: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y fuerza jnica 0.35 a diferentes temperaturas correspondientes a la resma Duolite XAD-761 (HIC).

150

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

600
uoo
.1001 1 A 110
1
--

u, U
A

400

u-
-

-u

-u-.200 -

---4

--

e-A

---4
A

20
LA [s]

40

<so

Figura 6.13: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 6.0 y 20 0C a diferentes valores de fuerza inica para la resma Duolite A-568 (WC).

600 ml e 400 u
-

- -

e-u
A-

200

-e.4<

y--

--

e.--

o o

-6~~

20

40

60

L/v [si Figura 6.14: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y 20 C a

diferentes valores de fuerza inica para la resma Duolite A-568 (IEC).

PURIFICACIN DE Ct-AMILA5A DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

151

300

200
-Ji

100

20

40

60

L/v [s] Figura 6.15: Representacin del primer momento frente a L/v a pl-l 8.0 y 20 0C a

diferentes valores de fuerza inica para la resma Duotite A-568 (WC).

5000

4000

3000
z

2000

1000

o
1) 20 40

60

L/v [s

Figura 6.16: Representacin del primer momento frente a L/v a pH 7.0 y fuerza inica 0.60 a diferentes temperaturas correspondientes a la mesina Duolite A-568 (WC).

152

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCUsIN

A partir de la pendiente de las grficas anteriores, segn el procedimiento descrito en el apartado Al del anexo A, se determina el valor de la constante de adsorcin, KA, en las condiciones experimentales correspondientes a cada uno de los dos adsorbentes. Tambin se determina el factor de capacidad de los adsorbentes a partir de la siguiente definicin: Factor de capacidad 1
traz.

[6.3]

Los resultados se muestran en las tablas 6.6 y 6.7. Ambos parmetros se ven influidos, cualitativamente, por las condiciones de operacin en el mismo sentido que se ha observado para el factor de retencin anteriormente comentado. En este caso, el clculo de la constante de adsorcin permite cuantificar la magnitud de dichas influencias.

Tabla 6.6: Constante de adsorcin y factor de capacidad obtenidos mediante el mtodo de momentos para la adsorcin de a--amilasa en Duolite XAD-761 (HIC) para las diferentes condiciones de operacin.
[ U] pH Fuerza Jnica
KA

Factor de Capacidadt

0.10 6.0 0.20 0.30 0.35 0.02 0.10 20.0 7.0 0.20 0.30 0.40 0.20 8.0 030 0.40 15.0 25.0 6.0 6.0 0.35 0.35

0.83 3.54 8.90 8,86 0.15 0.30 1.39 3.09 5.42 0.61 0.86 1.10 6.22 7.52

0.2 0.9 2.6 2.5 0.0 0.0 0.3 0.8 1.4 0.1 0.2 0.2 12 1.8

Como puede observarse, en el caso del sistema de HIC, la fuerza inica favorece el equilibrio de adsorcin para los tres valores de pH utilizados, Por otro lado, a valores de pH creciente, la
Calculado como el valor medio de los obtenidos para los diferentes caudales ensayados en iguales condiciones de pH. temperatura y tuerza jnica.

PURIFIcAcIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORcIN

153

capacidad de adsorcin de la resma disminuye, siendo a pH 6.0 cuando la resma presenta el valor ms alto. La influencia de la temperatura es pequea y no presenta una tendencia regular en el intervalo experimental (15 25 0C).
-

Tabla 6.7: Constante de adsorcin y factor de capacidad obtenidos mediante el mtodo de momentos para la adsorcin de a-ainilasa en Duolite A-568 (WC) para las diferentes condiciones de operacin.
[ C] pH Fuerza lnica 0.90 6.0 1.00 KA Factor de Capacidad~

21.23
18.72

5.8
5.2

1.10 0.60 20.0

7.0

14.21 19.48 12.55 9.05

6.61

3.9 5.4 3.5 2.6

1.9

0.70 0.80
0.90

0.50 8.0 0.60 0.70 0.80 15.0 17.0 25.0 7.0 7.0 7.0 0.60 0.60 0.60

11.61 6.24 4.38 4.77 14.06 21.43 207.53

3.3 1.8 1.3 1.4 4.0 6.1 59.0

Como en el caso anterior, el anlisis de momentos para la resma de IEC da unos valores de la constante de adsorcin que varan de acuerdo con lo previsto a raz del estudio de la influencia de las variables. Los valores del factor de capacidad aumentan a medida que la concentracin salina de la fase mvil disminuye, siendo mayor segn disminuye el pH. La temperatura hace aumentar mucho la constante de adsorcin a partir de valores superiores a 20 0C. En general, los mayores valores del factor de capacidad y de la constante de adsorcin se obtienen para la adsorcin de u-amilasa en la resma de intercambio inico Duolite A-568. A partir de los resultados obtenidos en esta etapa, se ha decidido realizar el estudio de la purificacin de o.amilasa en tanque agitado discontinuo y en lecho fijo. para cada uno de los adsorbentes, en las

Calculado como el valor medio de los obtenidos para los temperatura y fuerza lon,ca.

diferenes caudales ensayados en iguales condiciones de pH,

154

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCUsIN

condiciones experimentales que se indican en la tabla 6.8. El criterio utilizado para la eleccin de esas condiciones de operacin ha sido el de contar con un valor elevado de la constante de adsorcin pero sin llegar a trabajar en condiciones de adsorcin irreversibk?. Si esto ocurriese, la retencin de aamilasa sobre el adsorbente sera mayor pero se hara menos especfica. En estas condiciones, no sera posible modular la adsorcin ni la velocidad de migracin del adsorbato en el caso de realizar la purificacin de la a-amilasa a partir de un caldo de fermentacin complejo.

Tabla 6.8: Condiciones de operacin para la purificacin de o.-amilasa en tanque agitado y lecho fijo.
Duolite XAD-761 (HIC) Tampn pH Fuerza inica Duolite A-568 (WC)

0.OSM Fosfato 6.0 035

0.05M Tris/HCI 7.0 0.60

Los valores de la entalpa y entropas de adsorcin se han calculado para las condiciones de pH y fuerza jnica seleccionados (ver tabla 6.8) tanto para WC como para IEC. Mediante la aplicacin de la ecuacin de Vant Hoff (ecuacin 3.13) a los valores de constante de adsorcin en funcin de la temperatura, se obtienen AH0 y AS0. El primero de ellos representa la energa necesaria para que se produzca la adsorcin de la a-amilasa a los ligandos unidos a la matriz de la resma.

Tabla 6.9: Variacin de entaipa y entropa para la adsorcin de a-amilasa en

HIC e [ECen las condiciones experimentales listadas en la tabla 6.8.

AH0 [kI/molJ Duolite XAD-761 Duolite A-568 AS0 [J/mohK]

-25.2
196

103 700

Los resultados (tabla 6.9) muestran, para la adsorcin de a-amilasa, un comportamiento exotrmico en la resma hidrofbica y endotrmico en la de intercambio aninico. Ambas producen aumentos en la entropa global del proceso. Como puede comprobarse mediante la aplicacin del segundo principio de la termodinmica,

El trmino irreversible no hace referencia a su sentido estrictamente termodinrnico. Se refiere a la escala temporal en la que se realiza el experimento y el adsorhato se eluye completa y rpidamente al modificar las condiciones ce la fase mvil en el sentido adecuado.

PURIFICACIN DE cx-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

155

en el intervalo de temperatura experimentado, la variacin de energa libre, AG0, es negativa. Esto se traduce en que, en ambos casos, el proceso de adsorcin se produce de forma espontnea.

Datos cinticos
En primer lugar se ha determinado el valor del coeficiente de dispersin axial, D~, a partir de los resultados de La altura equivalente de un plato terico, AEPT, para los experimentos realizados con trazador. Los trazadores elegidos (NaC para WC y NaNO 3 para HIC) no se adsorben sobre la resma correspondiente y, debido a su pequeo tamao, tampoco experimentan resistencia significativa por difusin a su paso a travs de los poros de las partculas de adsorbente. Por ello, el segundo trmino de la ecuacin 3.10 tendr un valor muy pequeo, simpliticndose dicha expresin a: AEPT~ 2D
y

[6.4]

De esta forma, la contribucin fundamental al valor de la AEPT vendr dada por trmino correspondiente a la dispersin axial, teniendo un valor aproximadamente constante para cada valor de la velocidad intersticial de la fase mvil. En la figura 6.17 se representan los valores de AEPT para cada una de las resinas. Se ha determinado, por tanto, el valor del coeficiente de dispersin axial en funcin de la velocidad de la fase mvil, obteniendo las siguientes expresiones: 0L~80 104v ColumnadeHlC: Columna de IEC: DL = 9.0 04 y donde DL y
y

vienen expresados en mis.

A continuacin se procedi al clculo del segundo momento central de forma numrica segn la ecuacin 3.2. Debido a la asimetra de los picos y a la excesiva anchura de los mismos, el clculo de

& est sujeto a un error considerable, ya que el desarrollo del mtodo de momentos supone que los

picos son simtricos y en forma de distribucin gaussiana. Se aplic entonces la correccin que suponen el mtodo de los momentos con peso y el de los momentos truncados (ver apartado 3.2.2). Ambos, aunque mejoraron los resultados calculados presentan todava un elevado grado de error en el clculo del segundo momento, no ajustndose correctamente al modelo descrito. Hay que decir que la aplicacin de los dos mtodos correctores mencionados, no vara los resultados derivados del clculo del primer momento, ya que estos dependen inicamente del tiempo de retencin.

156

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

2. CX)

2.50

(A)
1.75--

(B)
2.25-

1.50-

<2D1. N)
u

3in
=

1.6 10u

S
=
~

2.1)9-

(2D1. A) .8 IO-3m
1.75-

.25--

1.50--

1.10-: 0.0

1.2= 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 2.0

4.0
y.

6.0

8.0

10.0

103 [ni

s41

10~ [m s1

Figura 6.17: Valores de AEPT frente a la velocidad intersticial para la resma hidrofbica (A) y de intercambio inico (B) usando como trazador NaNO

3 y NaC respectivamente.

10.0

9.0

u
8.0

u-y
7.0

u
y
6.0

-.

5.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

1U~ [mis] Figura 6.18: Representacin de la AFFT frente a la velocidad intersticial para

la adsorcin de a-amilasa en Duojite A-568 a 20 C: (1) pI-! 7.0, fuerza inica 0.60 y (II) pH 8.0. fuerza inica 0.80. A modo de ejemplo se han presentado (figura 6.18) los resultados obtenidos de la AEPT por el mtodo de los momentos truncados para la adsorcin en la resma de intercambio inico correspondiernes a dos condiciones de operacin. La primera (1) en la que la adsorcin es elevada y otra (11) en la que la constante de adsorcin tiene el menor valor de los obtenidos experimentalmente. Se han calculado los valores del coeficiente de difusin en los poros mediante la ecuacin A.3, determinando, por regresin lineal, la pendiente ce los puntos que representan la variacin de la

PIJRIFICACIN DE o.-AMILA5A DE Aspergillus orvzae POR ADsORCIN

157

y 0.73 para los casos 1 y II respectivamente y los valores de D0 estimados para ambos casos fueron 9.9~ io~ y 1.2. W m2/s.
AEPT con la velocidad. Los coeficientes de correlacin,

r, han sido 0.87

Como resumen, puede decirse que el estudio de la adsorcin mediante cromatografa lquida de alta eficacia, HPLC, es una tcnica sencilla, rpida y sensible, adecuada para conocer la iniluencia de las variables de operacin y la caracterizacin de determinados aspectos de la interaccin adsorbato-adsorbente. La aplicacin del mtodo de los momentos permite cuantificar el valor de la constante del equilibrio y conocer as su variacin con factores del medio como el pH, temperatura y fuerza inica. Esto facilita la eleccin de las condiciones de operacin para posteriores estudios de adsorcin de ct-amilasa en los adsorbentes estudiados. El clculo del coeficiente de difusin en los poros a travs de la determinacin del segundo momento central no es adecuado para experimentos en los que los picos presenten alta asimetra, aunque da una idea del orden de magnitud que puede tener este parmetro.

6.2.- ISOTERMAS DE ADSORCIN

En este apartado se expondrn los resultados experimentales obtenidos para la determinacin de las isotermas de adsorcin a diferentes temperaturas para los adsorbentes de HIC e IEC estudiados. Posteriormente, los datos experimentales se ajustarn a las ecuaciones correspondientes a diversos tipos de sotermas que reproduzcan los resultados adecuadamente.

6.2.1.- Resultados experimentales Se han determinado las isotermas de adsorcin mediante experimentos en tanque agitado de acuerdo con el procedimiento experimental descrito en el apartado 5.3.2. En las grficas se representan las concentraciones en el equilibrio correspondientes a la a-amilasa adsorbida en la superficie de la resma (q [mg/g]) frente a la de a-amilasa en la disolucin (Qq [mg/m]). Esta ltima se determina mediante el anlisis de la absorbancia en ultravioleta a 280 tun a partir de la curva de calibrado. La concentracin superticial se calcula a travs del balance de adsorbato en el sistema (ecuacin 6.5) y est referida a la masa de resma. q= (C0 ~Ca)VL [6.5]

w
siendo C 0 la concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, VL el volumen de la misma y W la nasa de resma utilizada. 0C Las isotermas de equilibrio para el sistema a-amilasaIHIC de han determinado a 4. 20 y 30

158

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

y las del sistema o.-amilasa/IEC a 20, 25 y 30 0C. El volumen de disolucin utilizado, en todos los casos, ha sido de 50 m, variando la masa de resma entre 0.50 y 1.75 gen los diferentes experimentos realizados. La concentracin de cx-amilasa se midi tras 12 horas, asegurndose as que se haba alcanzado el equilibrio. Las condiciones de pH y fuerza inica. para los experimentos realizados con la resma de HIC han sido 6.0 y 0.35 respectivamente y en los llevados a cabo con la de WC se utiliz un pH de 7.0 y una fuerza inica de 0.60, de acuerdo con lo expuesto en el apartado 5.3.1. ncrementarse la temperatura.

25
remperalur. O 4.0C

20.0 ~C

20

3
o
A

o
A

5
o
A A A

E lo
o
A ~

5
O

A
~

A A

o
o
.3

3
al

[mgmF!

Figura 6.19: lsotermas de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite XAD-761 a tres

temperaturas. Los resultados experimentales se muestran en las figuras 6.19 y 6.20 para Ja adsorcin sobre La resma de interaccin bidrofbica y de intercambio inico respectivamente. En todos los casos se observa un comportamiento no lineal del equilibrio de adsorcin para cada una de las temperaturas ensayadas en ambas resinas. La curvas resultantes presentan una pendiente decreciente al aumentar la concentracin en la fase lquida siendo, por tanto, cncavas y clasiticndose como isotermas favorables para la adsorcin (figura 2.3). Como se ha observado mediante la experimentacin en HPLC, se comprueba que la capacidad de adsorcin aunena al disminuir la temperatura para la adsorcin de o.-amilasa sobre Duolite XAD76 1 (resma de 1-lIC), es decir, la curva correspondiente a una temperatura menor se encuentra por encima de otra cuya temperatura sea menor. En el caso de la adsorcin en la resma de IEC, Duolite A-

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus oryzae POR

ADSORCIN

159

568, la influencia de la temperatura acta en sentido opuesto, aumentando la cantidad adsorbida al

35
30

Temperatura o 20.OC 25.0C

a
o

25

a
o

20
o

15

A
o

10-

5 o

o
C
eq

[mgm1-

Figura 6.20: Isotermas de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite A-568 a tres

temperaturas. Comparando las isotermas obtenidas para ambas resinas (figura 6.21) en las condiciones de temperatura en las que Ja adsorcin se ve ms favorecida, se observa que la resma de WC tiene mayor capacidad de adsorcin que la de HJC en el intervalo de temperaturas estudiado ya que la concentracion de a-amilasa en la fase adsorbida en el equilibrio es siempre ms alta para la primera resma.

160

RESULTADOS EXPERIN~NTALES Y DISCUSIN

40-

[~E~4c71
~~30C) a a

30

- -

? 20--

a
A

A
10 a

00

C
tq

[mgn*J

Figura 6.21: Isotermas de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite XAD761 a 4 0C y sobre Duolite A-568 a 30 C.

6.2.2.- Ajuste de los resultados a modelos de isotermas Una vez obtenidos los datos experimentales del equilibrio de adsorcin de a-amilasa en cada uno de los adsorbentes para cada temperatura, se ha procedido a ajustarlos a algunas de las ecuaciones de isotermas comentadas en el apartado 2.3.3. Las isotermas de Langmuir y Freundlich (ecuaciones 2.13 y 2.14 respectivamente) son habitualnente utilizadas para describir el comportamiento no lineal del equilibrio de adsorcin de un slo componente. El ajuste de los datos experimentales a cada una de las expresiones se ha llevado a cabo mediante regresin no lineal utilizando el algoritmo de Marquardt. A continuacin se muestran los resultados obtenidos del anlisis de regresin, con los parmetros estadsticos caractersticos, para todas las isotermas determinadas. Los ajustes se han realizado tornando un intervalo de confianza del 95%. Se incluyen como indicadores de la bondad del ajuste, el error medio de los parmetros estimados, el coeficiente de correlacin. r, y el test chicuadrado,

x2

En las tablas 6.10 a 6.15 se resumen dichos parmetros y en las figuras 6.22 a 6.27 se

representan grficamente las curvas correspondientes al ajuste a las isotermas de Freundlich y Langmuir con los parmetros obtenidos. En el anexo B se muestra un estudio ms detallado del ajuste, incluyendo el anlisis de residuos.

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergiflus

oryzae POR ADSORCIN

161

Tabla 6.10: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 4 C.

Isoterma Parmetros
=

Error 1.98

xl

Langmuir

28.78

0.9962

0.5064

b = 0.544 Freundlich
= =

0.085 0.46 0.799 0.9941 0.7993

9.68

0.530

25

20

15

E lo

.3

[mg~m]

Figura 6.22: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y Freundlicb para la adsorcin de r-amilasa en Duolite XA.D-76 1 a 4 0C.

162

RESUlTADOs EXPERIMENTALES Y DISCUsIN

Tabla 6.11: Parmetros de ajuste dc la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite XAD-76 1 a 20 0C. Isoterma Parmetros
q ~, = 26.35

Error

Langmuir

1.00
+

0.9979

0. 1563

0.554

0.045 0.9895 0.7764

Freundlich

Kf = 9.28
=

0.46
+

0.513

0.038

25

20

15
St

E 10

o 0
1
.3
-<

C e q [mg-mF1 Figura 6.23: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y

Freundlich para la adsorcin de u-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 0C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

163

Tabla 6.12: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 30 0C.
Isoterma Parmetros
=

Error
1.35 +

2
0. 1096

Langmuir b Freundlich 3

24.09
0.398

0.9987

0.045
0.9927

6.51

0.45 0.056

0.6254

0.602

25

20

15 SL eL

E lo

o
0 1 2 3 4

eq

[mgmI-]

Figura 6.24: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y

Freundlich para la adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 30 C.

164

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Tabla 6.13: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de u-amilasa en Duolite A-568 a 20 0C. Isoterma Parmetros
=

Error 2.64
0.084

Langmuir

45.46

0.9923

1.4690

b = 0.696 Preundlicb Kf= 17.89

0.28 0.019

0.9953

0.9096

3 = 0.532

40

30

SL,o
eL

10

o
o
-3

ec

[mgmL]

Figura 6.25: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y

Freundlicb para la adsorcin de u-amilasa en Duolite A-568 a 20 0C.

PURIFICACIN DE o.-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

165

Tabla 6.14: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C.
Isoterma Parmetros
=

Error

Langmuir

45.40

1.49
+

0.9988

0.37 10

b = 0.840

0.064 0.993 5 1.9702

Freundlich

Kf= 19.19

0.56
+

3 = 0.539

0.035

40

30

SL 20
eL

lo

o
(1 1 2 3

C eq

1] [mgmF

Figura 6.26: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas de Langmuir y

Freundlich para la adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C.

166

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Tabla 6.15: Parmetros de ajuste de la isoterma de equilibrio de a-amilasa en Duolite A-568 a 30 C. Isoterma Parmetros
q 01

Error

Langmuir

0.7153 =47.17 1.96 0.080

1.5928
0.49

0,9988

b = 0.867 Freundlich Kf= 20.21

0,9947

3 = 0.530

0.028

40

30

SL20
eL

E LO

O 0

eq

jugmnI1l

Figura 6.27: Ajuste de los datos experimentales a las isotermas 0C. de Langmuir y

Freundlich para la adsorcin de o.-amilasa en Duolite A-568 a 30

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

167

En base a los resultados del anlisis de regresin realizado, se observa que los valores de r y son mejores para el ajuste de los datos experimentales a la ecuacin de Langmuir excepto en el caso de la isoterma de adsorcin de a-amilasa sobre la resma de WC realizada a 20 0C para el que el ajuste a la ecuacin de Freundlich es ligeramente mejor considerando el intervalo completo de experimentacin. A partir del anlisis de residuos (ver anexo B) de los ajustes se han confirmado errores elevados (>10%) de forma sistemtica para los valores de q calculados mediante la isoterma de Langmuir correspondientes a concentraciones menores de 0.20 mg/mi en el caso de ambos adsorbentes. Para concentraciones de ct-amilasa inferiores a la comentada, la isoterma de Langmuir predice resultados considerablemente inferiores a los obtenidos experimentalmente, situndose la mayora de los puntos correspondientes a estos valores en el intervalo de error de -15 a -30%, debido a que para concentraciones bajas, el comportamiento de la isotenna puede considerarse lineal. Para valores de concentracin superiores al indicado, los residuos se distribuyen sin apreciarse tendencia alguna y se sitan en el entorno de error de 5%. En todos los casos, en el ajuste de los datos experimentales a la isoterma de Freundlich, se observa cierta tendencia en el anlisis de los residuos (ve anexo B). Para valores de concentracin baja, la utilizacin de la ecuacin de ajuste de Freundlich produce errores, por exceso, muy elevados (hasta del 40%) por la tendencia lineal que presenta la isoterma a valores bajos de concentracin. En el intervalo de concentraciones de 1 a 3 mg/mi, aproximadamente, los, residuos correspondientes a este ajuste se sitan en valores negativos, para pasar a magnitudes positivas y en rpido aumento para concentraciones superiores. Esto ltimo se debe a que la expresin de la isoterma de Freundlich no predice la saturacin del adsorbente, comportndose de forma montonamente creciente. Como resumen, pueden realizarse los siguientes comentarios: Se han obtenido experimentalmente las isotermas de adsorcin de a-ainilasa sobre las resinas de HIC e IEC a diferentes temperaturas. Se observa un comportamiento no lineal en todos los casos estudiados y que, en el intervalo experimental de temperatura, la resma de intercambio inico, Duolite A-568. tiene una capacidad de adsorcin mayor que la de interaccin hidrofbica, Duolite XAD-761. Esta circunstancia no invalida ni reduce, en absoluto, la utilidad de esta ltima ya que al operar ambas en condiciones diferentes de fuerza inica y temperatura, podrn ser adecuadas en determinadas etapas del proceso de purificacin, en funcin de la composicin y caractersticas del medio. Por ejemplo, el uso de una etapa de purificacin por HIC podra ser aconsejada en situaciones en las que la protena est en un medio de alta concentracin salina y esta quiera reducirse, ya que la adsorcin en HIC se ve favorecida a alta fuerza inica y la elucin del adsorbato se produce con medios en los que la concentracin salina es pequea.

168

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Por otro lado se han ajustado los datos experimentales de las isotermas de adsorcin a las ecuaciones de Langmuir y Freundlich determinando los parmetros de regresin no lineal. Se ha comprobado que el uso de la ecuacin de Langmuir reproduce, con errores inferiores al 5%, los resultados experimentales para valores de concentracin en la fase lquida mayores de 0.2 mg/ml. El ajuste a la ecuacin de Freundiich genera errores sistemticos que no la hacen apropiada para el sistema experimental estudiado. Como solucin a este ltimo problema se propone realizar un ajuste lineal a bajas concentraciones para ser utilizado en los casos en los que se necesite predecir la cantidad adsorbida en el equilibrio con concentraciones inferiores a 0.2 mg/ml. Los valores de la constante de adsorcin para la isoterma lineal con validez en el intervalo de concentraciones se presentan en el anexo B.

6.3.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO En el presente apartado se exponen los resultados obtenidos en los experimentos cinticos de adsorcin de o.-arnilasa sobre las resma de HIC y de WC en un sistema de tanque agitado discontinuo. Estos resultados se utilizarn posteriormente para obtener los valores del coeficiente de difusin en los poros para cada uno de los experimentos, mediante el ajuste de los datos experimentales al modelo matemtico propuesto para dicho sistema.

6.3.1.- Planificacin de experimentos Mediante la realizacin de experimentos de adsorcin en un sistema de tanque agitado en operacin discontinua se pretende obtener el valor del coeficiente de difusin efectivo en los poros, D13. para cada una de las condiciones de operacin ensayadas con los adsorbentes de HIC e IEC estudiados en el presente trabajo. Dicho parmetro se determinar mediante el ajuste y optimacin de los datos cinticos experimentales al modelo de adsorcin propuesto para este sistema (ver apartado 3.3.2). De esta manera, se estudiar la influencia de las variables de operacin sobre el valor de D~. Las condiciones generales de experimentacin (pH, fuerza inica, masa de resma, volumen de disolucin. tamao de partcula y velocidad de agitacin) son las mostradas en la tabla 5.2. A continuacin (tablas 6.16 y 6.17) se expone la planificacin de experimentos para cada resma en funcin de las variables cuya influencia se va a estudiar: temperatura y concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, C~.

PURIFICACIN DE

a-AMWsA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN Tabla 6.16: Experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre resma de HIC realizados en tanque agitado discontinuo.
Temperatura [0C] C~ [mg/mi]

169

0.10 4.0
0.25

0.50 0.10 20.0

0.25

0.50 0.10 30.0

0.25

0.50

Tabla 6.17: Experimentos de adsorcin de o.-amilasa sobre resma de IEC realizados en tanque agitado discontinuo.
Temperatura [OCI C 0 [mg/mi]

0.10 20.0
0.25

1.00 0.10 25.0

0.25

1.00 0.10 30.0

0.25

1.00

6.3.2.- Resultados Se ha medido, de forma continua, la evo[cin de la concentracin de a-amilasa en la disolucin de adsorcin en cada uno de los experimentos. Los resultados se muestran en forma grfica representando la concentracin adimensional, C/C0, frente al tiempo. Como se ha verificado anteriormente, el efecto de la temperatura sobre la adsorcin de a-

170

RESUUrADOs EXPERIMENTALES Y DtSCUSIN

amilasa en las resinas de HIC e WC estudiadas es opuesto. Como se observa en la figura 6.28 y en la tabla 6.18, la disminucin de la temperatura aumenta la cantidad de a-arnilasa adsorbida sobre la resma de HIC, ya que la curva experimental correspondiente a 4 0C est por debajo de la de 20 0C, quedando por encima de estas la curva de mayor temperatura, 30 0C (esto es as debido a que el resto de las variables de operacin son comunes a los tres experimentos).

1.00

0.95

u u

0.90

0.85
0 50 100 150 200 250

Tiempo [mini

Fgura 6.28: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD-

761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.50 mg/ml. Para la resma de WC, la adsorcin de la enzima est favorecida por el aumento de la temperatura (figura 6.29 y tabla 6.20), mostrndose de esta manera en todo el intervalo experimental de concentraciones. En cl apartado Cl (anexo C) se representan el resto de los resultados experimentales en los que se compara el efecto de la temperatura en la cintica de adsorcin correspondientes a otras concentraciones iniciales para la resma de HIC (figuras C.l y 2) y para la de WC (figuras C.3 y C.4). El tiempo al que se alcanza el equilibrio es menor para los experimentos realizados a lemperaturas ms elevadas, debido a una mayor velocidad de transferencia de materia, lavorecida por temperaturas crecientes. Este efecto es comn a los dos adsorbentes en todo el intervalo experimental.

PURIFtCACIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCtN

171

1.00

0.95

090

0.85

0.80
0

50

lOO

150
Tiempo [mm]

200

250

Figura 6.29: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a

diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 1.00 mg/ml. La concentracin inicial de adsorbato tambin intluye significativamente en las curvas cinticas de adsorcin. En este caso, el comportamiento de las dos resinas es, cualitativamente, anlono (figuras 6.30 y 6.31). Al disminuir la concentracin inicial de la disolucin de adsorcin, el nivel de desaparicin de adsorbato en el seno de dicha disolucin es mayor (tablas 6.19 y 6.21), es decir, el valor final que alcanza la concentracin adimensional es menor. Sin embargo, la capacidad de la resma por unidad de masa aumenta para concentraciones iniciales crecientes, de acuerdo con lo predicho por la isoterma de equilibrio. Las figuras C.5 a C.8 (anexo C) muestran el resto de los resultados experimentales en los que se compara el efecto de la concentracin inicial en la adsorcin de u-amilasa sobre las dos resinas estudiadas. La utilizacin del proceso de adsorcin en condiciones de alta dilucin, a pesar de aprovechar slamente una pequea fraccin de la capacidad total de la resma, podra tener inters en la eliminacin de determinados contaminantes que se encuentren en concentraciones muy bajas. De esta manera, se podra reducir el nivel de dichos contaminantes hasta los mrgenes tolerados por las especificaciones legales, tcnicas o comerciales.

172

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6 0 100 200 300 400 500 600

Tiempo [mini Figura 6.30: Comparacin de la cintica de adsorcin de ~-amilasaen Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 4 C.

[.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

100

200

300

400

500

600

Tiempo [mini

Figura 6.31: Comparacin de la cintica dc adsorcin de i-amilasa en Duolite A-568

para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 30 0C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

173

Tambin puede observarse que el equilibrio se alcanza antes en los experimentos en los que la concentracin inicial de a-amilasa es ms elevada. El flujo que atraviesa la capa lmite externa que rodea a las partculas es directamente proporcional a la diferencia de concentracin de a-amilasa entre los extremos de dicha pelcula (ecuacin 2.1), aunque los experimentos realizados en el presente trabajo se han diseado de forma que la velocidad de transferencia de materia externa no controle la velocidad global del proceso. Sin embargo, el flujo por difusin en el interior de los poros viene descrito por una expresin basada en la ley de Fick, siendo el gradiente radial de concentracin la fuerza impulsora que rige el flujo (ecuacin 2.8), el cual es mayor en el caso de que la concentracin tambin lo sea. A modo comparativo, en las tablas 6.18 y 6.19 se muestran los resultados para la resma de
1-LIC de la cantidad de ct-amilasa adsorbida por unidad de masa de adsorbente y de la fraccin de a-

amilasa eliminado de la disolucin, C4Co, respectivamente y en las tablas 6.20 y 6.21 las correspondientes para la resma de WC. Tabla 6.19: Fraccin de a-amilasa eliminada de la disolucin de adsorcin con la resma de HIC.
Co [mg/mi] 0.50

Tabla 6.18: Cantidad de a-amilasa adsorbida por

onidad de masa de adsorbente con la resma de HIC.

Co [mg/mi] 0.10 4.0 0C 20.0C 30.00C 0.25

0.10 4.00C 20.0 ~C

30.0 OC

0.25

0.50

2.87
2fl9 1.70

3.81
3.28 3.01

5.81
5.11 3.15

0.71 0.79
0.83

0.84 0.86
0.87

0.88 0.89
0.93

Fabla 6.20: Cntidad de a-aruilasa adsorbida por unidad de masa de adsorbente con la resma de IEC.
Co [mg/mi] 0.10 20.0 0C 25.0 0C 30.0 OC 0.25 1.00

Tabla 6.21: Fraccin de a-amilasa eliminada de la disolucin de adsorcin con la resma de IIEC.
C 0 [mg/mi] 0.10 0.25 1.00 0.90
20.0 0C

3.82
4.35 4.62

6.56
6.99

9.76 10.06 14.63

7.24

25.0

0C

0.56 0.53

0.61

0.73

0.72 0.71

0.89 0.85

30.0 0c

174

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DIsCusIN

6.4.- ADSORCIN EN LECHO FIJO

En este apartado se exponen los resultados obtenidos en el proceso de adsorcin de a-anlasa en lecho fijo utilizando los adsorbentes de interaccin hidrofbica e intercambio aninico estudiados en el presente trabajo de investigacin. Se ha realizado una planificacin de los experimentos necesarios para alcanzar los objetivos fijados en el apartado 1.3.

6.4.1.- Planificacin de experimentos

Tabla 6.22: Experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre Duolite XAD-761 en lecho fijo (dimetro interno de la columna: 10.0 mm).
T [tI C~ [ng/m] Caudal [ml/mini 0.25 R [mm] W [g] L [mml

0.50

0.50 1.00 0.25

20.0

1.00

0.50

1.00
0.25

41.0

1.00

25.5

2.50

0.50 1.00 0.25 0.50 1.00

4.0 30.0
20.0

1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

0.50 0.50 0.50

(>50

26.0
65.0

1.00 1.00 0.50

32.0 25.0 [3.0

20.0 20.0

0.50

26.0

Uno de los objetivos del presente trabajo de investigacin es la determinacin de la inluencia de las diferentes variables de operacin (temperatura, concentracin de entrada y caudal) y

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

175

caractersticas fsicas de cada sistema experimental (radio medio de partcula, masa de adsorbente y longitud de lecho) en el proceso de adsorcin as como, posteriormente, en los parmetros cinticos de transferencia de materia que caracterizan la adsorcin de la a-amilasa en un lecho fijo. Con este fin, se han realizado los experimentos que se muestran en las tablas 6.22 y 6.23 para las resinas de HIC e IEC respectivamente.

Tabla 6.23: Experimentos de adsorcin de ui-amilasa sobre Duolite A-568 en lecho fijo (dimetro interno de la columna: 10.0 mm). T [OC] C0 [mg/m] Caudal [ml/mm] 0.25 0.50 0.50 1.00 0.25 25.0 1.00 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 20.0 30.0 25.0 25.0 25.0 0.50 0.50 1.00 1.00 1.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 26.0 65.0 26.0 1.00 1.00 0.50 32.0 30.0 19.0 41.0 1.00 31.0 R [mm] W [g] L [mmj

Adems, se ha estudiado [a estabilidad de los dos adsorbentes para conocer la prdida de capacidad de cada uno de ellos debida a la reutilizacin de la columna. Para ello se realizaron ciclos de adsorcin-desorcin en las condiciones de operacin que se detallan en la tabla 6.24.

1.76

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Tabla 6.24: Condiciones de operacin de los ciclos de adsorcin-desorcin. [ OC] Duolite XAD-761 DnoliteA-568 20.0 25.0 C~ [mg/mi] 1.00 1.00 Caudal [ml/mm] 0.50 0.50 [ mm] 41.0 41.0 [ g] 1.00 1.00 [ mm] 25.5 31.0

6.4.2.- Resultados experimentales

Los resultados experimentales se muestran en forma de grficas que representan las curvas de ruptura de cada uno de los experimentos. En ellas se representa la concentracin, en forma adimensional (C/C0) a la salida de la columna frente al nmero de volmenes de lecho (Ny) que han pasado a travs de la columna. En algunos casos, por motivos de claridad, la abscisa corresponde al tiempo de operacin (t). El nmero de volmenes de lecho se determina a partir del caudal columna de adsorcin (Y1) mediante la siguiente expresin: N VV ~tQ [6.6]

(Q) y

del volumen de la

Los experimentos muestran unas curvas de ruptura cori la forma sigmoidal tpica de los procesos de adsorcin, en los que transcurrido un tiempo determinado, sucede la ruptura, aumentando la concentracin de u-amilasa en el elluente de la columna. A tiempos suficientemente elevados, la columna alcanza la saturacin y la concentracin a la salida de la misma se iguala a la concentracin de alimentacin a la entrada del lecho. La forma de dichas curvas esta determinada por una combinacin compleja de mecanismos correspondientes a procesos de equilibrio y de no equilibrio (Johnston et al., 1991). Una vez alcanzada la saturacin, la cantidad de a-amilasa adsorbida en la superficie interna de la resma viene dada por el siguiente balance de materia: q.WQ.C}.J[1(C/CO)].dtCO.VL.[E+E0.(lE)]
o

[6.7]

donde el valor de la integral corresponde al rea que hay por encima de la curva de ruptura y corresponde a la definicin del momento cero (go) de la misma (Martnez et al., 1991). As, la capacidad de la resma es proporcional al producto del momento cero, el caudal y la concentracin de entrada. Por ello definimos el factor de capacidad como:

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

177

F.C.

~.t0
.

[6.8]

Los valores del factor de capacidad calculados para los experimentos de adsorcin en las resinas de interaccin hidrofbica e intercambio iitco se muestran en las tablas 6.25 y 6.26 respectivamente.

Tabla 6.25: Factores de capacidad para los experimentos en lecho fijo con la resma de HIC. C0 [mg/mi] 0.5
0.5 0.5

Q [ml/mm]
0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.0 0.25 0.50 1.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

T [OC] 20 20 20 20 20 20 20 20 20 3 30 20 20 20

L [mm]
25.5

dp [mm] 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.65 0.26 0.41

F.C. [mg]

1.05 1.01 0.97 1.92 1.73 1.87 4.15

3.95

25.5
25.5

1.0 1.0 1.0

2.5

25.5 25.5

25.5 25.5 25.5 25.5 25.5 25.5 25.0 32.0 1.28

2.5 2.5 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5

3.70 1.73 2.00 1.85 2.79 1.10

178

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Tabla 6.26: Factores de capacidad para los experimentos en lecho fijo con la resma de IEC,

C0 [mg/inI] 0.5
0.5

Q [nl/minI 0.25
0.50

0C1 T[ 25
25

L [mm] 31.0
31.0

dp [mm] 0.41
0,41

F.C. [mg] 2.94

2.80

0.5 1.0 1.0 1.0

2.5

1.00 0.25 0.50 1.0

0.25

25 25 25 25
25

31.0 31.0 31.0 31.0

31.0

0.41 0.41 0.41 0.41

0.41

2.01 7.67 5.89 3.95

7.78

2.5 2.5 0.5 0.5 1.0 1.0 0.5

0.50 1.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

25 25 20 30 25 25 20

31.0 31.0 31.0 31.0 32.0 32.0 15.5

0.41 0.41 0.41 0.41 0.65 0.26 0.41

8.53 7.23 2.54 3.02 6.77 10.22

1.22

Efecto del caudal De acuerdo con los resultados experimentales obtenidos (figuras 6.32 y 6.33), se observa que la pendiente de las curvas experimentales, tras la ruptura del lecho, es mayor a medida que aumenta el caudal de alimentacin a la columna. En el caso de la adsorcin de a-antilasa sobre la resma de WC, esta situacin se presenta ms acusada que en el caso de la adsorcin sobre la resma de HIC. Debido a
-r r...-. ..~x.,:
1
~ -. ~

nr

ir

flor,

tic

tU

fnr~nt,ic rin Aolnt.

que el vuiuiwu tic ia~e uuvu llcUcMuta fa oaum U IULIItJ n1nn~ a utilizados, a igualdad del resto de las condiciones de operacin, el tiempo de saturacin de la columna disminuye al aumentar el caudal. De esta forma, para cada valor de la concentracin de entrada, el factor de capacidad disminuye segn aumenta cl caudal (tablas 6.25 y 6.26). Este fenmeno puede deberse a que la cintica de adsorcin est controlada por los procesos de difusin de la a-amilasa desde el seno de la fase mvil hasta el interior de las partculas. En esta situacin, la utilizacin de caudales crecientes puede conducir a que, en una seccin transversal de la colunna. no todas las molculas de adsorbato tengan el tiempo de residencia suficiente como para permitir que se difundan hacia el interior de las (ti ir 1cnrh~n1 ti ji ini, v~ncin 1 a trw a y la ca nac-i dad del nrr3cesn de. adsorcin. fJWL1Ltutac~ wu, ~
iC t~UtttOflI)~.~ItU ~

PURIFICACIN DE 0I-AMILASADEASpergII/US

oryzae POR ADsORCIN

179

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.0

1.0

2.0 Volmenes de lecho

3.0

7.0

8.0

Figura 6.32: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para una concentracin de entrada de 1.00 mg/ml a 20.0 C.

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 0 2 4 6 8 10 24 26

Volmenes de lecho

Figura 6.33: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para una concentracin de entrada de 1.00 mg/ml a 25.0 0C.

180

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Los dos comportamientos comentados (mayor capacidad a caudales bajos y menor tiempo necesario para la adsorcin a caudales altos) debern tenerse en cuenta a la hora de la optimacin del proceso con el fin de elegir el caudal ms adecuado para el sistema utilizado. Para ello se debern considerar los costes de operacin derivados del tiempo consumido por el proceso, el valor del producto purificado as como la estabilidad en funcin del tiempo que presente la enzima en las condiciones en las que se lleve a cabo la purificacin

Efecto de la concentracin
Como puede observarse en las figuras 6.34 y 6.35, el aumento de la concentracin de aamilasa en la disolucin de alimentacin a la columna afecta a la forma de las curvas de ruptura experimentales. Para ambos adsorbentes, se comprueba que las curvas correspondientes a los experimentos de mayor concentracin tienen una pendiente ms acusada, alcanzando la saturacin del lecho a tiempos inferiores que los correspondientes a experimentos de concentracin interior.

t,0

0.8

0.6 u u 0.4

0.2

0.0
0-o

1.0

2.0

3.0

9.0

10.0

Volmenes de echo Figura 6.34: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de fflC para un caudal de 0.50 m/mm a 20.0 C.

Estos efectos, relacionados entre si se deben a que la diferencia entre la concentracin de aamilasa en la fase mvil y la concentracin de dicha enzima en el interior de los poros no saturados es mayor cuanto mayor sea la primera. Esto produce un aumento en el flujo de a-amilasa en direccin al interior de los poros de las partculas de adsorbente hasta ms sitios de adsorcin, alcanzndose ms

PURIFICACIN DE c-AMILSADEASpeTgIIIus oryzae POR ADSORCIN

181

rpidamente el equilibrio entre ambas fases.

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

24.0 26.0

Volmenes de lecho Figura 6.35: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columin de WC para un caudal de 0.50 mi/mm a 25.0 0C. Se ha determinado que, para cada uno de los adsorbentes, el factor de capacidad aumenta (tablas 6.25 y 6.26) a medida que lo hace la concentracin a la entrada de la columna. De acuerdo con la isoterma de adsorcin, en el equilibrio, la cantidad de -amilasa retenida en la resma aumenta (hasta alcanzar el valor de saturacin) con la concentracin de la enzima en la fase fluida del interior de los poros.

Efecto de la temperatura
La influencia de la temperatura en el equilibrio de adsorcin de cz-amilasa en las resinas de
HIC e IEC se ha establecido mediante la determinacin de las isotermas de adsorcin. Segn estas,

para la resma de intercambio inico, la cantidad de a-ainilasa adsorbida en equilibrio con una determinada concentracin de la misma en la fase fluida aumenta con la temperatura. Esta situacin se corresponde con los resultados experimentales obtenidos a diferentes temperaturas para la resma de
IEC (figura 6.36) donde el factor de capacidad (tabla 6.26) aumenta con la temperatura.

182

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

1.0

0.5

0.6
0 O

0.4

0.2

0.0
0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

24.0 26.0

Volmenes de lecho

Figura 6.36: Efecto de la temperatura sobre las curvas de ruptura correspondientes a la

columnade WC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 0.50 mg/ml a 25.0 0C.

1.0

0.5

0.6
o

O O

0.4

0.2

0.0
0.0

1.0

2.0 Volmenes de lecho

3.0

6.0

7.0

Figura 6.37: Efecto de la temperatura sohre las curvas de ruptura correspondientes a la columna dc HIC para un caudal de 0.50 nl/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a 20.0 C.

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

183

En el caso del equilibrio de adsorcin de ct-amilasa sobre la resma de HIC, la temperatura tiene el efecto contrario, es decir, la cantidad de enzima adsorbida aumenta al disminuir la temperatura. A partir de los experimentos correspondientes a diferentes temperaturas (figura 6.37), se determina el factor de capacidad (tabla 6.25) para cada uno de ellos, observando que el mayor valor se obtiene para el experimento desarrollado a una temperatura mayor. Esto se debe a la existencia de efectos negativos para la cintica de adsorcin a medida que la temperatura disminuye. Al reducir la temperatura, la viscosidad de la fase mvil aumenta, por lo que el coeficiente de transferencia de materia externo disminuye (Wilson y Ceankoplis, 1966), reducindose el flujo de c-amilasa que pasa al interior de las partculas de adsorbente a travs de la capa lmite externa que rodea a las mismas. Por otro lado, el coeficiente de difusividad molecular, definido por la ecuacin de Polson (ecuacin 2.4), es directamente proporcional a la temperatura e inversamente proporcional a la viscosidad de la fase fluida, lo cual conduce a valores decrecientes de D,~ al disminuir la temperatura.

E.tcto del tamao de partcula

La variacin del coeficiente de materia externo con el dimetro de partcula viene determinada por la correlacin de Wilson y Geankoplis (1966), la cual predice que, para un lecho fijo y a una determinada velocidad del fluido, el valor de kf es proporcional a dp213, por lo que al disminuir este, el valor de aquel aumenta. Debido a ello, a igualdad del resto de las variables de operacin. las curvas de ruptura correspondientes a lechos empacados con partculas de menor tamao tendrn pendientes mayores tras el punto de ruptura, alcanzando ms rpidamente la saturacin. Como puede observarse (figuras 6.38 y 6.39), para ambas resinas, el comportamiento de las curvas de ruptura obtenidas experimentalmente difiere del descrito anteriormente. La porosidad del lecho no se mantiene constante para los tres tamaos de partcula, ya que para una misma cantidad de resma, cada uno alcanza diferentes longitudes en columnas de igual dimetro. Por esta razn no se da la condicin del mantenimiento del resto de los parmetros constante. Por otro lado, el factor de capacidad aumenta al disminuir el tamao medio de las partculas de adsorbente en el caso de ambas resinas. Al reducir el dimetro de las partculas, la variacin del rea superficial de la resma no vara significativamente (Smith, 1981), sin embargo, el camino que las molculas de cz-amilasa tienen que recorrer por el interior de los poros disminuye. Como ya se ha descrito (ver apartado 1.1.1), la molcula de wamilasa puede considerarse como un elipsoide de dimensiones 80 x 45 x 35

A.

As, se ha determinado la relacin entre su tamao y el dimetro medio

de poro para la ambas resinas, obteniendo los valores que se muestran en la tabla 6.27.

184

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

23.0 24.0

Volmenes de lecho

Figura 6.38: Efecto del tamao de partcula sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a 20.0 C.

LO

1,

Ir

0.8

0.6
e

0.4

0.2

Tamao de partcula

h
0.0
o-o

6 mm 0.65 mo rl,
1~
.

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

22.0 24.0

Volmenes de lecho

Figura 6.39: Efecto del tamaflo de partcula sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 0.10 m/mm y una concentracin de 1.00 mg/ml a25.0C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

185

Estos valores, relativamente elevados, aumentan en gran medida para la fraccin significativa de poros cuyo dimetro es inferior al tamao medio determinado (ver apartado 4.4.2) para cada uno de los adsorbentes. Por ello, las molculas de c-amilasa que queden adsorbidas en las zonas de un poro ms cercanas al exterior, podrn bloquear el paso, de forma que en el caso de utilizar tamaos de partcula mayor, el volumen de poro inaccesible ser tambin mayor debido a que la longitud de los poros tambin lo es.

Tabla 6.27: Relacin entre el tamao de la a-amilasa ~ y el tamao medio de poro (~).

4~ [nml
fflC WC 23.0 28.5

tN.aI4~ptt
0.15 - 0.35 0.12 - 0.28

Efecto de la altura de lecho En los dos sistemas de adsorcin estudiados, a medida que la longitud de lecho disminuye, la pendiente de la curva de ruptura aumenta ligeramente, saturndose antes el lecho. En la figura 6.40 se muestra la influencia de la altura de lecho en la adsorcin de wamilasa en resma de intercambio inieo para columnas de igual dimetro interno y tamao de partcula. Este efecto est causado porque las pequeas irregularidades existentes en el

empaquetamiento de ambas resinas, suman una mayor cantidad en la columna de mayor longitud, aumentando el efecto de mezcla y desvindose ms del flujo pistn ideal. Por ello, la curva de ruptura correspondiente al lecho de mayor longitud se ensancha, aumentando el tiempo total de saturacin y disminuyendo la capacidad de la resma en el punto de ruptura (Johnston eta!., 1991). Sin embargo, el factor de capacidad por unidad de masa de resma en el equilibrio es similar para ambas columnas (tablas 6.25 y 6.26), no alterndose el equilibrio por la variacin de la longitud de la columna.

Calculados para las dimensiones menor y mayor, respectivamente, de la molcula de -amilasa.

186

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

1.0

0.8

0.6 Q Q
e

0.4

0.2

0.0

10

20

30
Tiempo [mm]

40

50

110

120

Figura 6.40: Efecto de la longitud de lecho sobre las curvas de ruptura correspondientes a la

columna de IEC para un caudal de 0.50 m/mm y una concentracin de 0.50 mg/ml a 20.0 C.

6.4.3.- Estahilidad y reutilizacin de la columna

Generalmente, en los procesos de purificacin a escala industrial se cuenta con dos o ms columnas operando en paralelo. De esta manera, una de las columnas se encontrar en operacin de adsorcin hasta que el adsorbente haya alcanzado el nivel de saturacin fijado como ptimo. En ese momento, la corriente de entrada pasa a alimentar a la otra columna, comenzando en la primera la operacin de desorcin para recoger la protena purificada. Con el objetivo de conocer el comportamiento a largo plazo de cada uno de los adsorbentes, se han realizado ciclos de adsorcindesorcin simulando el comportamiento real de una operacin continuada. Posteriormente, se ha evaluado el factor de capacidad para cada uno de los ciclos con el fin de cuantificar la variacin de la cantidad adsorbida en cada uno de ellos. Las condiciones de operacin de los experimentos realizados se muestran en la tabla 6.23. En las figuras 6.41 y 6.42 se representan las curvas de adsorcin y desorcin para las columnas de 1-lIC e IEC respectivamente. En la etapa de desorcin se ha utilizado como eluyente el tampn usado en la disolucin de adsorcin correspondiente.

PURIFICACIN DE x-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

187

1.0

II

It

0.8 .

(2 (2 (2(2 2

~ 1 1
(4

0.6
e

1~) O 0.4

1
3

fi

0.2 -

0.0

0123456789

.1.1.1.1.1 i

.11 lA

3 1

4041424344454647484950

Ciclo

Figura 6.41: Ciclos de adsorcin-desorcin realizados con la resma de HIC en las siguientes condiciones de operacin: C0 = 1.0 mg/mI, Q = 0.50 ml/mm, T = 20 0C.

1.0

0.8

0.6
o

0 O 0.4

0.2

0.0

o
Ciclo

Figura 6.42: Ciclos de adsorcin-desorcin realizados con la resma de WC en las

siguientes condiciones de operacin: C 0 = 1.0 mg/mi, Q = 0.50 m/mm, T = 25

0C.

En ambos casos, la cantidad retenida en el primer ciclo es mayor que en los sucesivos ciclos

188

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

debido a que se parte de una columna estabilizada y con ausencia de wamilasa adsorbida a su superficie. La operacin de adsorcin-desorcin se ha programado de forma que los ciclos tengan la misma duracin, alcanzando niveles de saturacin de u-amilasa del 90-95% en la adsorcin y disminuyendo al 3-5% en la desorcin. A partir del segundo ciclo se observa que las curvas obtenidas coinciden con bastante fidelidad. Para cuantificar la semejanza y el comportamiento de ambas columnas se ha calculado el factor de capacidad para cada una de las etapas de adsorcin. Los valores calculados no muestran tendencia a disminuir (o aumentar) con el tiempo de operacin y el uso, variando entorno al valor medio con una desviacin estndar relativamente baja (tabla 6.28). La utilizacin de las mismas condiciones de pH y fuerza inica en las etapas de adsorcin y desorcin ha mostrado un comportamiento reversible del proceso. La eficacia de la desorcin, sin embargo, aumenta cuando se modifican las condiciones de operacin (por ejemplo, aumento de la fuerza inica en IEC o disminucin en HIC) como se ha demostrado en el presente trabajo.

Tabla 6.28: Valor medio del factor de capacidad y desviacin estndar para los ciclos de adsorcindesorcin.
F.C. lIC WC 0.98 1.82 a 0.08 0.14

A partir de estos resultados puede concluirse que ambos adsorbentes son adecuados para ser utilizados a escala industrial por la estabilidad que presentan y por la reversibilidad mostrada tras la aplicacin de numerosos ciclos de operacin sin que las columnas presenten sntomas de prdida parcial de capacidad para la adsorcin de wamilasa en las condiciones de operacin estudiadas.

6.5.- BIBLIOGRAFA
-

Arakawa, T. y Timasheff, SN. (1982). Preferential interactions of proteins with salts in concentrated solutions, Bioclernistty, 21(25), 6545-6552

Bautista, L.F.: Soriano, R.; Martnez, M. y Aracil, 1. (1997). Comparative study of the adsorption of a-amylase tbr HIC and IEC using the HPLC technique, LC-GC Ita.. 10(7), 431-434

El Rassi, Z. y l-lorvth, C. (1986). Hydrophobic interaction chromatography of t-RNAsand proteins, J. Liq. Clrornatogr.. 9 (15), 3245-3268

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN

189

Fausnaugh, J.L. y Regnier, FE. (1986). Solute and mobile phase contributions to retention in hydrophobic interaction chromatography of proteins, .1. Chromatogr., 359,131-146

Horvth, C.; Melander. W.R. y Molnar, I.J. (1976). 1 Chromatogr, 125, 129. Johns, D. (1989). Columns for HPLC separation of macromolecules, en: HPLC of
macromolecules: a practica! approaclz (R.A.W. Oliver Ed.), IRL Press, Oxford

.lohnston, A.; Mao, Q.M. y Hearn, M.T.W. (1991). High-performance liquid chromatography of aminoacids, peptides and proteins. CXII. Analysis of operating parameters affecting the breakthrough curves in fixed-bed chromatography of proteins using several mathematicals models., J. Chromatogr., 548, 127-145

Katti, A.; Maa, Y.F. y Horvth, C. (1987). Protein surface area aud retention in hydrophobic interaction chromatography, Chromatographia, 24, 646-650

Kopaciewicz, M.A.R.; Fausnaugh, J. y Regnier, FE. (1983). Retention model for highperformance ion-exchange chromatography, 1 Chromatogr., 266, 3-21

Martnez, M.; Casillas, J.L.: Aracil, J. y Addo-Yobo, F. (1991). Purification of bioproducts using modified resins. Discrimination of adsorbents evaluating breakthrough curves with the method of moments, en: Upstrearn and downstream processing iii biotechno!ogy III, Technologisch Instituut
-

Kl MIV, Mechanical Separation & Partiele teehnology (Eds3, vol. 16, 3.45-3.5 1.

Melander, W. y Horvth, C. (1977). Effect of neutral salts on te formation aud dissociation of protein aggregates, 1 Solid Phase Biochera., 2(2), 141-161 Melander. W.R.; Corradiul, D. y Horvth, C. (1984). Salt-mediated retention of proteins in hydrophobic-interaction chromatography. Application of solvophobic theory, .1. Chromatogr., 317, 67-85

Melander, W.R.; El Rassi, Z. y Horvth, C. (1989). Interplay of hydrophobic and electrostatic interactions in biopolymer chromatography. Effect of salts on te retention of proteins, 1
Chromaogr.,

469, 3-27

Sinanoglu. 0. (1968), en: Molecular Associations it tio!ogy (B. Pullman Ed.), Academic Press, Nueva York

Sinanoglu. O. y Abdulnur, 5. (1965). Effect of water and other solvents on the structure of biopolymers, Fed. Pi-oca Fed. Am. 5cm. 4. Bici., 24(2, part III), S12-S23

Smith, J.M. (1981), en: Chemical Engineering Kinetics (3 ed.), McGraw-Hill. Tokio Szepesy, L. y Horvth, C. (1988). Specific salt effects in hydrophobic interaction cbromatography

190 of proteins, Chromatographia, 26,13-18

RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIN

Velayudhan, A. y Horvth, C. (1988). Preparative chromatography of proteins. Analysis of the multivalent ion- exehange formaiism, J. Chromatogr.. 443, 13-29 Wilson, EJ. y Geankoplis, C.J. (1966). Liquid mass transfer at very 10w Reynolds numbers in packed beds, bid. Eng. Chem., Fundam., 5 (1), 9-14

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN

191

7. MODELADO MATEMTICO

7.1.- ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO

Una vez que se han obtenido experimentalmente las curvas cinticas de adsorcin, correspondientes a los sistemas wanilasa/HIC y a-amilasa/IEC, los datos de aquella se ajustan al modelo matemtico propuesto en el apartado 3.3.2. Los resultados del ajuste para cada uno de los experimentos se muestran en las tablas 7.1 y 7.2, en las que se incluyen, junto con las variables de operacin, los valores del coeficiente de difusin en los poros (De), del factor de tortuosidad (t) calculado mediante la ecuacin 2.7 y de la funcin objetivo utilizada en la optimacin del ajuste (Q) y descrita en la ecuacin A. 16 del anexo A. A la vista de los resultados, se observa que la temperatura influye en el valor de D0, aumentando para valores crecientes de aquella, para el caso de ambos adsorbentes, de acuerdo con lo previsto por la teora de Stokes.Einstein para la difusin molecular (lvarez et al., 1982). Por otra parte, se observa que existe variabilidad en los valores de D0 calculados para cada concentracin inicial a una temperatura determinada. Esta es mayor en el caso de la adsorcin sobre la

192

MODELADO MATEMTICO

resma de IEC. Los valores del coeficiente de difusin en los poros correspondientes a la concentracin inferior (0.10 ng/m) se alejan de los obtenidos para las otras dos concentraciones. Esto puede ser debido al error en la estimacin de la isoterma de adsorcin a bajas concentraciones, segn se ha comentado en el apartado 6.3.2. Tabla 7.1: Resultados del modelado matemtico de la adsorcin de a-amilasa en la resma de HIC (Duolite XAD-761) en tanque agitado discontinuo. T [0C] 4
C 0 [mg/m] 0.10 2/s] Dp [m 2.32~ 10
t

1.9
3.0

2.72 io-3
1.29

0.25
0.5<)

1.50 . 10.11
1.32 10

itt

3.4

1.29

0.10
20 0,25

3.72 10<
1.76 10<

2.0
4.2

l.22~ 0<~
315 .

l0~

0.50

1.52 10<

4.8

3.85

jo5
04

30

0.25 0.50

2.15 10 2.11 [0<

4.4 4.5

1.21

[.24 t

labIa 7.2: Resultados del modelado matemtico de la adsorcin de ~-amilasaen la resma de FC (Duolite A-

568) en tanque agitado discontinuo.

-r [0C]
20

Co [mg/m]
0.10 0.25 1.00 0.10

Dp [m2/s]

<D

5.20 10
2.21 .

1.4 3.3 2.6 1.4 3.5 3.3 1.3 3.4 3.5

2.08 . o< 7.04~ D4 2.29 o5 1.86 O< 3.71 1.60 6.01

. o5 - o3

10<

2.08 10< 6.02 10

2.41

25

0.25

10<

1.00 0.10 30 0.25

1.00

2.55 10 7.41 10 2.8010<

2.75
-

4,15 10~ 2.78 . O-5

10.11

Para todas las temperaturas estudiadas, la diftsividad de la cx-amilasa en la resma de IEC es nayor que en la resma hidrotbbica. Este hecho podra explicarse en trminos de las caractersticas porosas de ambos adsorbentes. El tamao medio de poro en las partculas de la resma de intercambio

PIJRIEICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

193

inico (28.5 nm) es mayor que el de la hidrofbica (23.0 nn), facilitando as el transporte de las molculas de a-amilasa a travs de los poros. Adems, la mayor resistencia a la transferencia de materia (de u-amilasa) en el interior de la resma de HIC puede estar de acuerdo con una mayor complejidad de la estructura porosa de la misma, caracterizada por el factor de tortuosidad, t, segn se ndica en las tablas 7.1 y 7.2. Lo anteriormente comentado, se ve apoyado por los datos de la caracterizacin de ambas resinas mediante porosimetra de mercurio (ver apartado 4.4.2), en los que se detecta una fraccin significativa del volumen de poro de la resma de HIC que corresponde a tamaos inferiores a 20 nm. En las tablas 7.3 y 7.4 se resumen los valores mediost del coeficiente de difusin en los poros y del factor de tortuosidad. Estos sern los utilizados en la simulacin de los procesos de adsorcin de ct-amilasa en las resinas de 1-nC e IEC y se usarn como valores iniciales en la estimacin de los parmetros cinticos durante la etapa de modelado en lecho fijo.

Tabla 7.3: Valores medios resultado del modelado matemtico para la

adsorcin de ~-amilasaen laresma de HIC en tanque agitado.

T [0C] D~ [m2/s]
t

4 20 30

1.4 lO<~ 1.6 10 2.1 . 10<

3.2 4.6 4.5

Tabla 7.4: Valores medios resultado del modelado matemtico para la adsorcin de a-amilasa en la resma de ffiC en tanque agitado.
T [0C] D~ [m2/s]

20
25

2.1 10
2.5 io-~

3.5 3.4 3.4

30

2.8 10

Estos valores del coeficiente de difusin en los poros son del mismo orden que los obtenidos para la difusin de protenas en resinas macroporosas, pese a la escasez de datos experimentales sobre la materia. Se ha descrito unos valores de la diisividad efectiva de la insulina en el interior de los poros de resinas sintticas hidrofbicas dc 2.6 - 3.4 . O1 m2/s (Firouztale et al., 1992) y. para el caso de seroalbmina bovina en resinas de intercambio inico. de 1.0 1994)
-

2.7

j~- mWs

(Yoshida et al..

No se han utilizado los valores correspondientes a los experimentos de concentracin inicial ms baja. 0.10 mg/ml.

194

MODELADO MATEMTICO

1.00

<1.95

0.90

0.85

0.80 0 100 200 3<10 400 500

Tiempo [mm]
= 1.50 10.11 m2/s), de la adsorcin de u-amilasa en Duolite XAD-76 1 a 4 C y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.

Figura 7.1: Curvas, experimental y terica (D~

1.00

0,95

0.90

0.85

0.80
0 50 100 Tiempo [mini 150 200

Figura 7.2: Curvas, experimental y terica ~D 0= 225 . ItT mis), de la adsorcin de 0C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.

r-amilasa en Duolite A-568 a 30

PURIFICACIN DE ~-AMlLASA DE

Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

195

La bondad del ajuste puede comprobarse en las figuras 7.1 y 7.2, en las que se muestran la curva predicha por el modelo junto con la correspondiente al experimento realizado en las mismas condiciones de operacin para las resinas de HIC e IEC respectivamente. El resto de las curvas de ajuste al modelo cintico se encuentran en el anexo C (figuras C.9 a C.24). En la figura C.33 (Anexo A) se muestra, como ejemplo, la representacin grfica de la optimacin (miimizacin) de la funcin objetivo respecto al valor de D~ utilizado.

7.2.- ADSORCIN EN LECHO FIJO Cada una de las curvas de ruptura obtenidas en los experimentos de adsorcin de a-amilasa sobre las resinas de 1-lIC e IEC en lecho fijo se han ajustado al modelo matemtico, para esta operacin, propuesto en el apartado 3.3.3. Los valores del coefieciente de difusin en los poros (D1) y de transferencia de materia externo (lcD se han determinado mediante optimacin de dichos parmetros a partir de la metodologa descrita en el apartado A.3 del anexo A.

TabLa 7.5: Parmetros cinticos y condiciones experimentales para la adsorcin de amilasa en un lecho tito sobre resma de WC.
C0 [ng/mi] Q [nl/mi] 0.5 T [TI

~-

~, [m

2/s]

k 1 [mis] 5.4~ 10.6

Error tk]
[

0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.50 0.50

20 20 20 20 20 20 20 20 20
4

1.3 10 1.8~ 10 1.8 10< 1.8 10< 2.0~ 10~ 1.9 10 2.0 10< 2.0~ 10< 2.8 10<
1.5 10

5.6

0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 2.5

2.5

8.9 tt 1.3 o-~ 2.7 0.6 9.0 itt 1.7 o-~ 2.8 106 8.1 . 10.6 1.8 o-~ 7.1 1& 9.2 10.6

5.8 9.8
4.4

3.6
5.3

1.7
-1.7

2.5 1.0 1.0

-2.7 2.4
~.s

30

2.4~ 10~

En las tablas 7.5 y 7.6 se muestran los resultados obtenidos de D~ y k 1 correspondientes a cada uno de los experimentos desarrollados en las condiciones de operacin que figuran en dichas tablas, con un tamao medio de partcula de 0.41 mm para ambos adsorbentes. Los resultados mostrados en las tablas 7.5 y. 7.6 sealan, para ambos adsorbentes, una

196

MODELADO MATEMTICO

tendencia en la que el coeficiente de transferencia de materia externo aumenta con el caudal de la fase mvil. La resistencia al transporte de materia a travs de la pelcula externa que rodea a las partcula est caracterizada por el nmero adimensiona.l de Sherwood, pudiendo correlacionarse este en funcin de los nmeros de Reynolds y Schmit (Wilson y Geankoplis, 1966; Wakao y Funazkri, 1978>. A partir de estas correlaciones se deduce un aumento del nmero de Sherwood con la velocidad de la fase mvil en un lecho fijo y por tanto, una disminucin de la resistencia a la transferencia de materia externa, lo cual se observa en los resultados experimentales obtenidos (ver tabla 7.7).

Tabla 7.6: Parmetros cinticos y condiciones experimentales para la adsorcin de aamilasa en un lecho mo sobre resma de IEC. Co lmg/ml] 0.5 0.5 <5.5 1.0 1.0 1.0 2.5 2.5
2.5
Q [ml/minJ

T [0C]

D~ [m2/sJ

k< [m/s]

Error

[%] 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50 1.00 0.25 0.50

1.00

25 25 25 25 25 25 25 25
25

[.6 . 10< 2.0 10 1.8 10< 2.5 10< 2.6 10 3.1 . 10< 1.6 o~ 1.9 10<
1.8 10

9.9. jo7 3.1 - l0~ 5.1 . tt 1.5 itt 2.3 10.6

2.5 1tT6

5.2

8.4 5.2 3.4

-0.9 -3.0

6.3 0~2 1.7 o~

4.1 .

5.6 8.5
-2.2

0.5 0.5

0.50 0.50

20 30

1.7 10< 2.5 . 10

1.3 .tt 4.5 .10.6

3.1 2.5

Tabla 7.7: Valores medios de kf en funcin de la velocidad intersticial del fluido

para cada una de las resinas utilizadas.

y [mis]

IIIC kr[m/sl

y [mA]

WC kr[m/sl

9.83 . tt 1.97- itt 3.93 . itt

3.6 10.6 8.7 10.6 1.6- 0~5

9.50. 1W 1.90~ D4 3.78 10<

1.0 10.6 2.4 10< 3.9 10<

El valor del coeficiente de difusin en los poros aumenta con [a temperatura de acuerdo con los modelos hasados en la teora de Stokes-Einstein que predicen un incremento del coeficiente de diltsividad molecular con la temperatura. En las tablas 7.8 y 7.9 se muestran los valores del coeficiente de difusin en los poros y del factor de tortuosidad correspondientes a las temperaturas

PURIFICACIN DE ~-AMILA.SA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

197

estudiadas. El valor medio del factor de tortuosidad para la resma de HIC es 3.6 y para la resma de IEC, 4.0. Los valores de 1$ calculados son del mismo orden que los obtenidos para la difusin de otras protenas (Firouztale et al., 1992; Sridhar el al., 1994; Yoshida el aL, 1994) en resinas macroporosas tanto de intercambio inico como hidrofbicas.

Tabla 7.8: Valores medios resultado del modelado matemtico para la adsorcin de a-amilasa en la resma de lIC en lecho fijo.
T [0C] D~ [m2/s] t

4 20 30

1.5 10< 1.9 . l0<~~ 2.4 10~

3.0 3.9 4.0

Tabla 7.9: Valores medios resultado del modelado matemtico para la

adsorcin de a-amilasa en la resma de IEC en lecho fijo.

TIYC] D~[m2/s] t

20
25

l.7~ 10<
2.1 . l0~~

4.3
4.0

30

2.5~ 10<

3.8

Con el objetivo de cuantificar la desviacin de la curva que predice el modelo respecto a la obtenida experimentalmente se ha calculado el error a partir de los factores de capacidad para la curva de ruptura experimental (F.C.eXP) y terica obtenida mediante el modelo (F.C.oeo), de acuerdo con la siguiente expresin:
Error[%]=

loo.

EC~exp F~C.,~ 0 FC. exp

[7.1]

Los valores de este parmetro se muestran en la tabla 7.5 para la adsorcin de ct-amilasa en la tesina de lIC y en la tabla 7.6 para la resma de IEC. Se comprueba que los errores son siempre inferiores al 10%, teniendo un valor absoluto medio de 4.1% para el modelado de la adsorcin sobre la resma hidrofbica y del 4.4% para el correspondiente a la de intercambio inico.

0C Valor medio de los experimentos experimentos realizados a 25 20 0C

198

MDELADO MATEM-rCo

1.0

0.8

0.6
o

Q 0.4

0.2

0.0 0 5 10 15 20 25

tiempo [mm]
Figura 7.3: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el

modelo paz-a la resma de WC en las siguientes condiciones: C0 m/mm; T = 20 <C.

1.00 mg/mI; Q

0.50

1.0

0.8

0.6
e

(14

0.0 0 5 10 15 20 25 30 75 80

tiempo [mm]
Figura 7.4: Comparacin de la corva dc ruptura experimental y calculada mediante el

modelo para la rcsina dc IEC en las siguientes condiciones: C0 ml/mi ii: T = 25 C.

2.50 mg/m;

0.25

Para comprobar la bondad de los ajustes de las curvas de ruptura experimentales al modelo

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

199

matemtico, a continuacin se muestran dos de las grficas (figuras 7.3 y 7.4) en las que se comparan los datos obtenidos experimentalemente con la curva terica predicha por el modelo a partir de los valores de 114 y k~ que producen un mejor ajuste. El ajuste se ha realizado mediante la optimacin de la funcin objetivo (4)) respecto de los dos coeficientes cinticos mencionados de acuerdo al procedimiento expuesto en el anexo A. El resto de las grficas comparativas se muestran en el apartado C4 del anexo C (figuras C.34 a C.5 1). Los resultados del modelado matemtico de la adsorcin de ct-amilasa sobre las resinas de HIC e WC para los sistemas de tanque agitado discontinuo y de lecho fijo (tablas 7.3, 7.4, 7.8 y 7.9) muestran un acuerdo satisfactorio. Las diferencias obtenidas, para cada temperatura, son ligeramente ms elevadas para el caso de la adsorcin sobre la resma de intercambio inico, siendo del 16% la diferencia mayor entre los valores obtenidos por ambas tcnicas y del 6% la menor.

7.3.- BIBLIOGRAFA
-

lvarez, R.; Bueno, J.L. y Andrs, L.J. (1982). Coeficientes de difusin molecular en fase lquida. 1 . Ecuaciones de prediccin y de correlacin en sistemas binarios, Ingeniera Qumica, 154, 137-155

Firouztale, E.: Scott, A.P.; Dalvie S.K. y Von Blohn, G.M. (1992). Experimental and theoretical study of key parameters of adsorption on reverse phase macroporous resin, AIChE Symp. Ser., 88 (290), 25-33 Sridhar, P.; Sastri, N.V.S.; Modak, J.M. y Mukherjee. A.K. (1994). Mathematical simulation of bioseparation in an affinity packed column, Chem. ng. Technol., 17, 422-429

Wakao, N. y Funazksi, T. (1978). Effect of fluid dispersion coefflcients on particle-to-fluid mass transfer coefficients in packed beds, Chem. Eng. Sci., 33, 1375-1384

Wilson, E.J. y Geankoplis, C.J. (1966). Liquid mass transfer at very 10w Reynolds numbers in packed beds, bid. ng Chem., Fundam., 5 (1), 9-14

Yoshida, H.; Yoshikawa, M. y Kataoka, T. (1994). Parallel transport of BSA by surface aud pore diffusion in strongly basic chitosan, AIChE .1., 40(12), 2034-2044

PURIFICACIN DE tx-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADsORCIN

201

8. ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

8.1.- ESCALADO DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO En el captulo anterior se ha realizado el modelado matemtico de la adsorcin de c&ainilasa en lecho fijo, esto es, la obtencin de los parmetros cinticos caractersticos del modelo propuesto mediante el ajuste y optimacin de las curvas tericas a los resultados experimentales. A partir de ellos se han obtenido unos ajustes cuya bondad se ha comprobado y se ha considerado adecuada. A continuacin, con el propsito de verificar que los parmetros obtenidos (Dr, lc<, isoterma) reproducen el comportamiento de otros sistemas experimentales de dimensiones distintas y funcionando en condiciones de operacin diferentes, se ha procedido a simular un proceso de adsorcin en una columna cuyo tamao es ms de diez veces mayor que los utilizados en la etapa de

202

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO EDO

modelado y comparar los resultados con los obtenidos en un experimento realizado en las mismas condiciones. La concentracin elegida ha sido de 2.5 mg/m, mayor que en los experimentos utilizados en el modelado con el fin de comprobar la validez del modelo fuera del intervalo en el que se han obtenido los parmetros. Adems este valor de la concentracin es del orden en el que la a-ainilasa se produce en los fermentadores a escala industrial y de planta piloto por lo que el funcionamiento de la columna se encontrar en unas condiciones ms cercanas a las utilizadas industrialmente. Las condiciones de operacin y caractersticas fsicas del sistema utilizado se recogen en la tabla 8.1. y los parmetros cinticos y termodinmicos usados en la simulacin figuran en la tabla 8.2, los cuales corresponden a los obtenidos en el apartado 6.2 (parmetros de la isoterma de Langmuir) y 7.2 (coeficientes de difusin externa y en el interior de los poros).

Tabla 8.1: condiciones de operacin y caractersticas del sistema.

Adsorbato ct-Amilasa

(A. oryzae)

Adsorbente Fase mvil

Duolite A-568 (IEC) Tampn Tris/HCI 0.05M

pH 7.0, fuerza jnica 0.60 U [cm]

Wg 7[CIfl]

16.3 1.60
0.41

R[mm]
E

0.58
2.50

C0[mg/ml]

Q [ml/minJ 0C1 r [

5.00

25.0

Tabla 8.2: Parmetros de la sinulacin. Parmetro Valor

D~ [m2/sJ k< [mIsI q~, [mg/gl b

2.10 10 8.2 W
45.40

0.84

En la figura 8. 1 se muestra el resultado de la comparacin entre la simulacin realizada y el experimento desarrollado en las misnas condiciones.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

203

[.0

0.8

0.6 Q
e

0.4

0.2

0-o O 10 20 30 40 50 450 500

Tiempo [mm]

Fgnra 8.1: Comparacin de la curva de ruptura experimental con la obtenida por simulacin. La concordancia entre ambas curvas es buena, por lo que para cuantificar el grado de ajuste, se ha procedido a calcular el factor de capacidad correspondiente tanto a la curva de ruptura experimental como a la obtenida por simulacin. Como puede observarse, el error es inferior al 10% s se considera el proceso de adsorcin hasta la saturacin completa de la columna. Sin embargo, en operacin industrial no se alcanza ese grado de saturacin, ya que esto supondra una importante prdida de arisorbato en el elluente, lo que hara disminuir la rentabilidad econmica del proceso hasta hacerlo inviable. Si se calcula el error entre la a-amilasa adsorbida experimentalmente y la que predice el modelo al 95% de la saturacin, el error se reduce drsticamente hasta un valor de 0.08%, siendo aun inferior para niveles inferiores de saturacin. La diferencia entre ambas curvas se localiza en la zona cercana a la asintota correspondiente a la saturacin de la capacidad de adsorcin de la resma. Para valores de concentracin adimensional (C/C)) superiores a <).97, la curva experimental se acerca muy lentamente a 1.0 mientras que la correspondiente a la simulacin alcanza ese valor ms rpidamente. Esto podra estar causado por la lenta velocidad de transporte de materia por difusin en el interior de los poros cuando estos se encuentran prcticamente cubiertos de adsorbato sobre su superficie. De acuerdo con estos resultados, puede concluirse que el modelo matemtico propuesto para describir cl comportamiento de los procesos de adsorcin de a-amilasa en lecho fijo es adecuado y

204

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DF. ADSORCIN EN LECHO

FiJo

reproduce los resultados experimentales con un grado de aproximacin elevado, pudiendo ser utilizado como herramienta para el diseo y escalado de estas operaciones a nivel industrial.

Tabla 8.3: Factores de capacidad y error de la simulacin.

F.C. (experimental) F.C. (simulacin) Errort L %]

al 99.9% de la saturacin
al 95.<)% de la saturacin

190.7
164.1

173,1
164.3

9.2
-0.08

8.2.- SIMULACIN TERICA DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

Como se ha comprobado y expuesto previamente en el presente trabajo, el modelo matemtico que describe el proceso de adsorcin de u-amilasa en un lecho fijo mediante los mecanismos de interaccin hidrofbica e intercambio inico, describe adecuadamente los resultados experimentales obtenidos. En el modelo matemtico se han incluido las etapas de transporte de materia por difusin externa e interna as como la existencia de flujo no ideal debida a efectos de dispersin axial, encontrndose, cada uno de los procesos anteriores, caracterizado por un parmetro cintico (k<, D~ y Dj. La experimentacin llevada a cabo ha permitido la obtencin de los mismos as como de los parmetros termodinmcos correspondientes a la isoterma de equilibrio, que en el caso de la adsorcin de wamilasa en las resinas estudiadas ha mostrado un comportamiento no ideal. Para desarrollar la simulacin y diseo de procesos de adsorcin en lecho fijo a partir del modelo matemtico propuesto, es necesario conocer las caractersticas fsicas del adsorbente (porosidad, densidad, tamao de poro y de partcula>, del adsorbato (difusividad molecular) y del sistema experimental (dimensiones y porosidad del lecho) as como las condiciones de operacin definidas para la realizacin de los experimentos (caudal, temperatura y concentracin de alimentacin). Los ensayos de caracterizacin del adsorbente son los comnmente utilizados para tal fin (ver captulo 4), mientras que la difusividad molecular del adsorbaio ped&obtnerse a partir de diversas correlaciones (lvarez el al., 1982). Los mecanismos de adsorcin estudiados, interaccin hidrofbica e intercambio jnico, son de aplicacin general y no suponen unin bioespectica entre la u-amilasa y el adsorbente

Calculado rncdiante la ecuacin 7.1

PURIFICACIN DE a-AMILsADEAspergillus ozyzae POR ADSORCIN

205

correspondiente. Todas las protenas contienen zonas hidrofbicas y residuos con grupos funcionales cargados elctricamente en su superficie que permiten, en funcin de las condiciones de operacin, la adsorcin a los ligandos unidos a la matriz de la fase estacionaria. Por ello, es de esperar que el modelo propuesto pueda aplicarse a la adsorcin de otras protenas a resinas de LIC e IEC. Tras la etapa de modelado, la simulacin de un proceso permite determinar que variables y de que forma influyen en el mismo, conduciendo, de esta fonna, a un mejor y ms completo conocimiento del proceso de adsorcin de un soluto en un lecho fijo. La simulacin matemtica, por otro lado, permitir el diseo de nuevos procesos as como la optimacin de otros ya existentes. En el presente apartado se realiza un estudio terico de la influencia de las variables que intervienen en el proceso en base al modelo matemtico desarrollado y cuya validez se ha comprobado. En la tabla 8.3 se indican los valores utilizados para la simulacin en el estudio terico realizado. En cada caso, se mantendrn constantes todos los parmetros excepto aqul cuya influencia se est estudiando.

Tabla 8.4: Parmetros de la simulacin. Parmetro L [cm] <Pc[cm]

E

Valor 10.0 2.0

p [kg/m31
sI 3

0.60 1890 0.50 45.40 2.50 2.1 10< 2.0~ 10

q,., [mng/g] 3] C0 [ng/cm

D~ 1m2/s]
kr [m2/s]

En la figura 8.2 se muestra la variacin de las curvas de ruptura con el valor del coeficiente de difusin en los poros. A medida que este aumenta, el punto de ruptura se retrasa, obtenindose curvas ms estilizadas cuya pendiente es mayor. a[canzando la saturacin de la columna ms rpidamente. Para valores pequeos de Dp, la forma sigmoidal de la curva de ruptura se hace ms ancha, perdiendo la simetra que presenta, respecto del punto de inflexin, a valores superiores. Para adsorbatos de elevada masa molecular (MA). como es el caso de las protenas, la difusividad molecular es proporcional a MA<J (ecuacin 2.4), por lo que su valor se encuentra, a temperatura ambiente, dentro del orden de 10< m2/s para protenas de pequeo tamao, hasta 3
.

10.12 m2/s para las mayores

206

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESo DE ADSORCIN EN LECHO Eno

protenas. Por esta razn, las curvas de ruptura de la wamilasa en las resinas de HIC e IEC obtenidas en el presente trabajo, presentan este comportamiento caracterizado por la baja simetra de las mismas. Las molculas de protena, tras atravesar la capa lmite externa que rodea a las partculas, sufren una lenta difusin en el interior de los poros hasta los sitios de adsorcin debido a su gran tamano y, por tanto, al pequeo valor de D~. La variacin del coeficiente de transferencia de materia externa (figura 8.3) modifica el comportamiento del sistema de manera que para valores bajos del mismo, las molculas de soluto no tienen el tiempo de residencia suficiente como para atravesar la capa lmite y entrar en el interior de los poros de las partculas. As, se produce un aumento rpido de la concentracin de salida debido a las molculas que no se han difundido hacia los poros. disminuyendo la eficacia de la operacin. A medida que aumenta el valor de kf, la ruptura se retrasa, permitiendo un mayor flujo de adsorbato a travs de Ja capa limite. La capacidad de adsorcin de la resma viene dada por el valor de qm correspondiente a la ecuacin de la isoterma de Langmuir (ecuacin 2.13). Como puede observarse en la figura 8.4. un mayor nmero de sitios de adsorcin accesibles requiere mayor tiempo para que el adsorbato llegue a saturar los centros de adsorcin del adsorbente. En la figura 8.5 se examina el efecto de la porosidad del lecho. En ella se advierte que un aumento de e desplaza la curva de ruptura hacia la izquierda, reduciendo la utilizacin de la capacidad de la resma, la cual est relacionada con el rea por encima de la curva de ruptura (segn figura en el apanado 6.5.2). Manteniendo constante el valor de la densidad del adsorbente y la distribucin de tamaos de partcula, un aumento de la porosidad de la columna estar causado por un empaquetamiento defectuoso, lo cual genera un aumento de las zonas de mezcla en el interior de la columna, disminuyendo la eficacia de la operacin de adsorcin. La porosidad de las partculas tiene un efecto importante en el comportamiento de la adsorcin y. por tanto, en la forma de las curvas de ruptura. El factor de tortuosidad, t, caracteriza, en parte, la estructura porosa de las partculas de adsorbente, dependiendo de la porosidad interna de las mismas. Adems, el coeficiente de diflisividad efectivo es directamente proporcional al valor de r <ecuacin 2.7). Por otro lado, manteniendo constantes el resto de las caractersticas de la resma, el aumento de e~ conduce a una menor masa de resma en la columna y de capacidad. El efecto global de estas iniluencias se representa en la figura 8.6, observndose un aumento de la eficacia de la adsorcin con la disminucin de la porosidad interna. En la ligura 8.7 se muestra el efecto del caudal de alimentacin en las curvas de ruptura. Para una nisma columna, el caudal es directamente proporcional a La velocidad del fluido por lo que. al aumentar aquel. tambin lo hace el coeficiente de transferencia de materia externo (l-lidajat u al..

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADsoRCtN

/3

207

1987) ya que este es proporcional a y

La ruptura se produce antes para caudales mayores,

aumentando la anchura de la curva y la eficacia de la adsorcin a medida que disminuye el caudal, ya que, de esta manera, se aumenta el tiempo de contacto entre las fases permitiendo que se alcance una situacin ms cercana al equilibrio local. Respecto a la concentracin de adsorbato en la fase mvil, se observa (figura 8.8) que afecta considerablemente a la forma y posicin de las curvas de ruptura. A medida que aumenta el valor de C0, se alcanza antes la saturacin del lecho. El clculo de los factores de capacidad (ecuacin 6.8) para cada una de las curvas obtenidas por simulacin indica que, al aumentar la concentracin, el factor de capacidad tambin aumenta. La influencia de Las dimensiones del lecho en el proceso de adsorcin en lecho fijo puede observarse en las figuras 8.9 y 8.10. En la primera de ellas se observa el comportamiento de las curvas de ruptura en funcin de la altura de lecho. Segn se aumenta L, la pendiente de la curva, tras la ruptura, va disminuyendo hasta alcanzar un valor constante. A partir de ese valor, la forma de las curvas de ruptura no vara, desplazndose estas progresivamente hacia la derecha. Este desplazamiento est causado nicamente por la mayor cantidad de adsorbente que habr en la columna de mayor tamao por lo que la cantidad de adsorbato que se une ser proporcional al aumento de longitud ya que el resto de los parmetros del proceso permanecen constantes. Para columnas de menor tamao, la curva de ruptura se muestra asimtrica, debido a que las resistencias difusionales del sistema permiten que existan molculas de adsorbato que atraviesen la columna sin haberse difundido hasta el interior de las partculas. Este efecto llega a ser poco significativo a partir de determinada altura de columna, en la que las molculas tienen el suficiente tiempo de residencia en el interior del lecho como para terminar difundindose hasta los sitios de adsorcin de la resma. La variacin del dimetro de la columna, 4)~, a caudal constante (figura 8.10), produce una variacin de la velocidad intersticial del fluido en sentido contrario que es proporcional a (ccV o, lo que es lo mismo, al rea transversal de la columna. Como se ha comentado anteriormente, la velocidad de la fase mvil afecta positivamente el valor de k~ y un aumento del dimetro, manteniendo constante el caudal, har disminuir la velocidad, permitiendo un mayor tiempo de contacto del adsorbato con la fase estacionaria y. por ello, una nayor eficacia del proceso de adsorcin, aunque el tiempo de operacin aumenta considerablemente. La variacin del tamao de las partculas del adsorbente (figura 8.11) tambin afecta al valor 4~ (Hidajat et al., 1995). La disminucin del tamao de partcula de k1, siendo este proporcional a R~ aumenta la eficacia del proceso y retrasa el punto de ruptura, haciendo las curvas ms estilizadas.
-

Junto a esto, para el escalado de este proceso se deber tener en cuenta que tamaos de partculas decrecientes harn aumentar la prdida de carga a lo l~rgo del lecho, de acuerdo a la ecuacin de

208

ESCALADO Y SmMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO Fizo

Carman-Kozeny, proporcionalmente a R2.

PURIFICACIN DE U-AMILA5A DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

209

1.0

0.8

0.6
o

Q 0.4

0.2

0.0
0 50 100 150

2(X)

Tiempo [mini
Fgura 8.2: Influencia del coeficiente de difusin en los poros.

1.0

0.8

0.6
o

Q 0.4

0.2

0.0 0 50 100 150 200

Tiempo [mini
Figura 8.3: lntluencia del coeficiente de transferencia de materia externa.

210

ESCALADO Y SmMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO Fo

1.0

0.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0 0 50 100 150 200

Tiempo [mini
Figura 8.4: Influencia de la capacidad del adsorbente.

1.0

0.8

0.6 Q) 0.4

0.2

0.0 0 50 100 150 200

Tiempo [mm]
Figura 8.5: Influencia de ta porosidad dcl lecho.

PURIFICACIN DE a-AMILA5A DE Aspergillus otyzae POR ADSORCIN

211

1.0

0.8

o u

0.4

0.2

0.0 0 50 100 150 200

Tiempo [mini
Figura 8.6: Influencia de la porosidad de partcula.

1.0

(.1.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0 50 100 150 200 250

Tiempo [mini
Figura 8.7: Influencia del caudal.

2t2

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

1.0

0.8

0.6
u

0.4

0.2

0.0 0 50 100 150 200 250

Tiempo [mm]
Figura

8.8: Influencia de la concentracin de alimentacion.

1.0

0.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0

100

200

300

400

Tiempo [mini
Figura 8.9: Influencia de la longitud de columna.

P1IRIFICACIN DE hl-AMILASA DE Aspergillus

orvzae POR ADSORCIN

213

1.0

0.8

0.6 Q
o

0.4

0.2

0.0 O lOO 200 300 400

Tiempo [mini
Figura 8.10: Influencia del dimetro de lacolumna.

1.0

0.8

0.6

Q 0.4

0.2

0.0 0 50 lOO 150 200

Tiempo [mini
Figura 8.11: Influencia del dimetro de partcula.

214

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESo DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

8.3.- PREDICCIN TERICA DEL CAMBIO DE ESCALA En los apartados anteriores se ha comprobado que eJ modelo matemtico planteado reproduce los resultados experimentales dentro y fuera del intervalo de condiciones de operacin en el cual se determinaron los parmetros caractersticos del mismo; posteriormente se ha estudiado la influencia de las condiciones de operacin (concentracin, temperatura, caudal), caractersticas tsicas del sistema (dimensiones de la columna, porosidad del lecho y del adsorbente) y parmetros cinticos (coeficiente de transferencia de materia externa y de difusin en los poros) y termodinmicos <isoterma) en el comportamiento del proceso de adsorcin en un lecho fijo.

Tabla 8.5: Parmetros de la simulacin.

Parmetro Valor

L [ml

5.0 - 10.0 2.0 0.60 1890 0.50

p 1 kg/m3]
gp

Una vez completadas las etapas del presente estudio, descritas anteriormente, se ha realizado la simulacin de una columna de adsorcin con la resma de intercambio inico (Duolite A-568), a escala industrial, con las caractersticas que se indican en la tabla 8.5. Las condiciones de operacin elegidas han sido las que se indican en la tabla 8.6. Los parmetros del modelo (ver tabla 8.7) han sido los determinados en la etapa de modelado matemtico a partir de los resultados experimentales.

Tabla 8.6: Condiciones de operacin para a smmulacin a escala industrial, Parmetro C 0 [mg/cm T Id 3] Valor 5.00
1.0
-

rabIa 8.7: Parmetros dcl modelo para la simulacin a escala industrial. Parmetro q,, [mg/g] D~ [mn2/s] k<lm/s] Valor 45.40 2.1
2.0

Caudal [m3/sj

10<

10<
10

25.0

En la figura 8.12 se muestra el resultado de la simulacin. Se observa que las curvas de ruptura correspondientes a las dos columnas de diferente longitud presentan una forma y una pendiente similar, aunque desplazadas en el tiempo ya que al contener diferente cantidad de

PURmFICACIN DE cx-AMILASADEAspergIIIus oryzae POR ADSORCIN

215

adsorbente, el tiempo necesario para la ruptura tambin, varia. Estos resultados se corresponden con los estudios tericos llevados a cabo en el apartado anterior.

1.0

0.8

0.6 Q
o

0.4

0.2

0.0 0 250 500 750 1000 1250 1500

Tiempo [mm]
Figura 8.12: Simulacin del comportamiento de dos columnas de adsorcin de

diferente altura, a escala industrial, para el sistema wamilasa/Duolite A-568. En operacin a escala industrial no se llega a alcanzar la saturacin completa de la capacidad del adsorbente (C/C0
=

1) ya que esto supondra una importante prdida de producto en la corriente

del efluente que sale de la columna. En funcin de la optimacin tcnica (estabilidad del producto de inters, rendimientos, etc.) y econmica (costes de produccin, costes de materias primas y productos, etc.) se deber determinar el tiempo de operacin y el porcentaje de saturacin adecuado para realizar la purificacin de cada producto. A partir de las simulaciones realizadas, se han calculado el tiempo de operacin y la cantidad de a-amilasa adsorbida por cada una de las columnas correspondientes a la saturacin completa y al 20% de la misma (C/C0 = 0.2). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8.8. Como puede comprobarse, para la columna de 5 metros, con un aumento del tiempo de operacin del 30% (desde el 20% al 100% de la capacidad mxima), se consigue un incremento de la cantidad de wamilasa adsorbida de slo el 7.6%. Para la columna de 10 metros de altura, el aumento del 20% en el tiempo de operacin supone un 5.2% de aumento de la cantidad de a-amilasa adsorbida.

216

ESCALADO Y SIMULACIN DEL PROCESO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

Tabla 8.8: Resultados de la simulacin del proceso de adsorcin de ~-amilasasobre

Duolite A-568 a escala industrial.

Saturacin [%] Columna de 3m Columna delOm

tiempo de operacin [bI

a-amilasa adsorbida 1kg] tiempo de operacin Lh] a-amnilasa adsorbida [kg]

20

8.8
158 12.7 171

18.0
322.3

22.5
340

Por lo anteriormente comentado, junto al hecho de que el aumento del nivel de saturacin al final de la operacin de adsorcin supone un aumento de las prdidas de producto, sera aconsejable, en operacin real, detener el proceso de adsorcin (comenzando la operacin de desorcin) a valores reducidos de la concentracin del adsorbato en el efluente de la columna.

8.4.- BIBLIOGRAFA
-

lvarez, R.; Bueno, iL. y Andrs, L.J. (1982). Coeficientes de difusin molecular en fase lquida. 1
-

Ecuaciones de prediccin y de correlacin en sistemas binarios, Ingeniera Qumica,

154. 137-155.
-

l-lidajat, K.; Aracil, J.: Carberry, J.J. y Kenney, C.N. (1987). Laboratory catalytic studies: the role of transport phenomena, .Lfltal.. 105, 245-248.

Hidajat, K.; Aracil, J.; Carberry, J.J. y Kenney, C.N. (1995). lnterphase fluid-particle mass transport at 10w Reynolds numbers, Catal. Leurers, 30, 213-217.

PURIFICACtN DE rL-AMtLASA DE

Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

217

9. RESUMEN, CONCLUSIONES Y FUTUROS TRABAJOS

A continuacin se resume la investigacin desarrollada y expuesta en la presente memoria junto con las conclusiones que de ella se han extrado:
-

Se ha desarrollado una metodologa que permite un acercamiento y conocimiento progresivo de los mecanismos y parmetros que intervienen en el proceso de purificacin por adsorcin de a-amilasa sobre resinas de interaccin hidrofbica e intercambio mediante experimentacin en HPLC, tanque agitado discontinuo y lecho fijo.

Mediante experimentacin en HPLC, se han identificado y cuantificado los factores que influyen en el proceso de adsorcin de waniilasa sobre la resma de interaccin hidrofbica Duolite XAD-761 y la de intercambio inico Duolite A-568. Se ha determinado que dichos parmetros son pH, temperatura fterza inica y los propios de las condiciones de operacin de cada uno de los sistemas experimentales utilizados (concentracin, caudal, dimetro de partcula del adsorbente, dimensiones del lecho).

218

RESUMEN, CONCLUSIONES Y FUTUROS TRABAJOS

Se ha aplicado el mtodo de momentos al estudio de la adsorcin mediante cromatografa de impuiso en un sistema de HPLC. Se han obtenido los parmetros cinticos (coeficiente de difusin en los poros) y termodinmicos (constante de adsorcin, factor de capacidad, altura equivalente de un plato terico, entalpias y entropas de adsorcin).

Se han determinado las isotermas de adsorcin de a-amilasa sobre ambas resinas, observando un comportamiento no lineal. Los resultados experimentales se han ajustado a la ecuacin de Langmuir, obteniendo los parmetros caractersticos por optimacin.

Se ha propuesto un modelo matemtico que describe de forma adecuada el proceso de adsorcin en tanque agitado discontinuo, teniendo como parmetro el coeficiente de difusin en los poros, determinndose su valor en funcin de la temperatura.

Se ha propuesto un modelo matemtico que describe de forma adecuada el proceso de adsorcin en lecho fijo, teniendo como parmetros el coeficiente de difusin en los poros y el de transferencia de materia externa. Ambos se han determinado para el sistema experimental estudiado.

El modelo de adsorcin en lecho fijo ha demostrado su capacidad para predecir el comportamiento de la adsorcin de a-amilasa, por lo que puede ser utilizado como herramienta en el diseo y escalado de la operacin de adsorcin en lecho fijo.

Se ha realizado un estudio terico utilizando el modelo anterior para conocer en profundidad la influencia de las variables de operacin, las caractersticas fsicas del sistema y los parmetros cinticos y termodininicos que intervienen en el proceso.
.
.

El nmero de productos obtenidos a travs de procesos biotecnolgicos se encuentra en constante aumento. Adems, las especificaciones de pureza a las que se encuentran sujetos dichos productos son, cada vez, ms exigentes. Por ello y a partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo, se propone la continuacin de la investigacin a travs de las siguientes lineas:
-

Estudiar y modelar la adsorcin de otras protenas y sustancias que, tpicamente, acompaan a la u-auulasu
cli us t4uts ue euie,Lduju,
UUI3UQ

Q~ta

pi~UU~.

L~OLa ~.tapa

deber comprender el estudio de la adsorcin de cada uno de ellos, tanto de forma individual como conjunta.
-

A partir de la etapa anterior, desarrollar un modelo matemtico que describa el comportamiento de cada uno de los adsorbatos en los procesos de adsorcin tnulticomponente.

PIJRIFICACIN DE U-AMILA5A DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

219

Con objeto de generalizar el uso de los modelos matemticos propuestos para el diseo de procesos de purificacin en biotecnologa, se deber verificar que describen,

satisfactoriamente, los procesos de adsorcin en los que intervienen protenas y biomolculas con diferentes caractersticas y adsorbentes de diversa naturaleza.
-

La purificacin por adsorcin mediante la operacin en lecho expandido permite eliminar etapas primarias de separacin con el consiguiente aumento de la eficacia global y reduccin de costes de proceso. Esta operacin, de reciente aplicacin a la biotecnologa, se encuentra en un estado de desarrollo emprico por lo que sera de gran inters desarrollar modelos matemticos que describan dicha operacin, en base al modelo propuesto en el presente trabajo de investigacin para la adsorcin en lecho fijo.

PURIFICACIN DE -AMRASA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN

221

ANEXO A. RESOLUCIN NUMRICA DE LOS MODELOS DE ADSORCION

A

A.1.- ANLISIS DE MOMENTOS A continuacin se muestra la secuencia de clculo para la determinacin, mediante el anlisis de momentos, de los parmetros cinticos y termodinmicos caractersticos del modelo. En primer lugar, a partir de las curvas de respuesta experimentales, se calcula el primer y segundo momento central mediante las ecuaciones 3.1 y 3.2 La integracin se realiza numricamente utilizando el mtodo de Gil y Miller (1972). A continuacin se ajustan linealmente, por mnimos cuadrados, los datos del primer momento frente a L/v para los experimentos realizados en iguales condiciones de pH, fuerza jnica y temperatura. A partir de la ecuacin 3.3. la pendiente de dicha regresin vendr dada por:

222

ANEXO A: RESOLUCIN NUMRICA DE LOS MODELOS DE ADSORCIN

pendiente

1 +

E) k

[A.]]

calculando directamente la constante de equilibrio aparente, k, y con la ecuacin 3.4, la constante de equilibrio,
KA.

Estimando la altura equivalente de un plato terico mediante la ecuacin 3.9 y de acuerdo con la expresin 3.10, la regresin lineal de los valores de AEPT frente a la velocidad intersticial, y, generar una recta cuya ordenada en el origen y pendiente correspondern a las siguientes relaciones: ordenada en origen
E

2DL
y

[A.2]

pendiente

1E

15% D

jC 1

(1

E) k
0L

[A.3] y de difusin

a partir de las cuales puede determinarse el valor del coeficiente de dispersin axial, en los poros, D,,, respectivamente.

4.2.- MODELO DE ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO Con objeto de simplificar la resolucin del modelo, en primer lugar, las variables de operacin correspondientes al modelo planteado se transforman en las siguientes variables adimensionales:
e (0=

[A.4]

As, el balance de materia en una seccin radial de la partcula, queda de la siguiente manera:

a
it
L+C~Eoj~1] C-~~

[AS]

La velocidad de desaparicin de adsorbato en la fase lquida viene dada por: dU Wc

_

___

JE 0

(u

ct~)

Sh

Li~&jsr (u

[MS]

Las condiciones de contorno pueden escribirse de la~siguiente forma:

PURIFICACIN DE -AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

223

z=O

[A.7]

__

Sh

[A.8]

Las condiciones iniciales, de esta forma, son:

10=0 t=0 0<z=1

q=0 U=1

t=0 t=0

0=z=l

[A.9]

La solucin del modelo matemtico planteado para la adsorcin en tanque agitado no es posible de forma analtica, salvo para el caso de que el equilibrio cumpla la ley de Henry y, por tanto, la isoterma sea lineal. Por ello, se procede a resolver numricamente las ecuaciones de balances de materia mediante la aplicacin de incrementos finitos. De esta forma, el sistema de ecuaciones diferenciales parablicas se convierte en un sistema de ecuaciones ordinarias muediante la aplicacin de los incrementos finitos. A continuacin, este sistema se resuelve mediante integracin numrica llevada a cabo a travs de un programa de ordenador realizado en lenguaje Fortran, utilizando el paquete de subrutinas de anlisis matemtico NAG Fortran Library (Numerical Algorithms Group Inc., Downers Grove, IL, EE.UU.). La obtencin del valor del coeficiente de difusin en los poros D1 se realiz mediante optimacin uniparamtrica de una funcin objetivo utilizando el algoritmo de Coggins (Kuester y Mize, 1973). La funcin objetivo mencionada que hay que minimizar es la siguiente:
=

i~N
I~I

C1)

[A.l0]

siendo N el nmero de puntos experimentales, C~

y C son la concentracin medida

experimentalmente y la predicha por el modelo correspondientes para cada instante, i.

A.3.- MODELO DE ADSORCIN EN LECHO FIJO De igual forma que en el caso anterior, es necesaria la resolucin por mtodos numricos del sistema de ecuaciones diferenciales que forman la descripcin del modelo matemtico de la ~adsorcin en un lecho fijo. Transformando en adimensionales las variables del modelo, se obtiene:

224 C
C0=

ANEXO A: RESOLUCIN NUMRICADE LOS MODELOS DE ADSORCIN

Dt
1

[Ah]

Sustituyendo estas variables en las ecuaciones del balance de materia en una seccin radial de la partcula. se tiene:

ico
it
=

[A.12]

Las condiciones de contorno para el balance de materia anterior, quedan de la siguiente forma:
En el centro de la partcula:

Dc
Dx
,=~

=0

[A.13]

En la superficie exterior de la partcula:

D} ix
-

k1R1
p

(u

[A.14]

p~

La transformacin de la ecuacin de] balance de materia en una seccin transversa] en el lecho y sus con-espondientes condiciones de contorno, con las variables adimensionales, produce: 2 uR i2(0 DR iu L p p (u-o~~) [Ab] it L2D~ iz2 LD ~e) D~
_

A la entrada de la columna:

iu
2= e

uL

DL

(1 uI~~)
-

[A 16]

A la salida de la columna:
DU

~Z

[A.17]

Z=L

Las condiciones iniciales quedan ahora como:

PURIFICACIN DE rx-AMILASA DE Aspergillus orvzae POR ADsORCIN

225

[3=0 U=1 (O~0 Q=0

0=Z=1 0=Z 0=Z=1 0=Z=l

-t=0 t>0 t=0 t=0 [A.18]

Al igual que en el caso de la adsorcin en tanque agitado, la resolucin del modelo planteado
para lecho fijo deber realizarse de forma numrica para el caso de que la isoterma de equilibrio no

sea lineal. El sistema de ecuaciones diferenciales planteado se resuelve mediante el mtodo de colocacin ortogonal (Carey y Finlayson, 1975; Villadsen y Stewart, 1967). En este caso, tambin se procede a la determinacin de los valores ptimos del coeficiente de transferencia de materia externa, k1 y del coeficiente de difusin en los poros, D~. Se utiliza el mtodo del simplex con 3 puntos (2N+l, siendo N=2, el nmero de variables independientes, en este caso k~ y D1). La funcin objetivo elegida es la A.16 y los valores ptimos de los parmetros corresponden a la situacin en la que se cumple la siguiente condicin:

< 10rn

[A.251

N+1 siendo, para cada tanteo, ~ cada uno de los valores de la funcin objetivo en los vrtices del simplex y ~Dm el valor medio de los mismos. La resolucin numrica de los modelos, as como el ajuste de los datos experimentales y la optiniacin de los parmetros de cada uno de los modelos se ha realizado a travs de un programa de ordenador escrito en lenguaje Fortran, utilizando el paquete de subrutinas NAG Fortran Library.

AA.- BIBLIOGRAFIA
-

Carey, OF. y Finlayson, BA. (1975). Orthogonal collocation of finite elements, Chem. Eng. S., 30, 587-596.

Gil, PE. y Miller, GE. (1972). An algorithm for the integration of unequally spaced data, Comp.

J., 15, 80-83

-

Kuester, J.L. y Mize, J.H. (1973), en: Oprimization tecl-zniques witl Fortran, McGraw-Hill, Nueva York.

Villadsen, J.V. y Stewart, W.E. (1967). Solution of boundary-value problems by orthogonai collocation, Clzem. Eng. Sci., 22, 1483-1501.

PURIFICACIN DE -AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

227

ANEXO B. AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLISIS ESTADSTICO

A continuacin se presenta el analisis estadistico correspondiente al ajuste a las isotermas de Langmuir y Freundlich de los datos experimentales de las isotermas de adsorcin de cx-amilasa sobre Duolite XAD-76 1 y Duolite A-568 a diferentes temperaturas. Los residuos representados se han calculado de acuerdo con la siguiente expresin: q ap

ER

[B]

q erp donde qexp es el valor, determinado experimentalmente, de la concentracin de -amilasa adsorbida en la resma y qie, es el valor calculado mediante la ecuacin de la isoterma correspondiente. En las tablas B.l a 8.6 se indican, en porcentaje, los valores del residuo medio y de la desviacin estndar de los residuos para cada uno de los ajustes. Los nmeros entre parntesis

228

ANEXO B: AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLIsIS ESTAD{5TICO

corresponden a los errores calculados para los puntos de concentracin de equilibrio mayor de 0.20 mg/ml. Como se ha indicado en el apartado 6.3.1, para valores de concentracin inferiores a la anterior, se utilizar un ajuste lineal de la isoterma utilizando slamente los valores de baja concentracin, que tienen una tendencial lineal. Los resultados de la constante de adsorcin (constante de Henry), as obtenidos, se muestran en las tabla B.7 y B.8.

PURIFICACIN DE -AMILASA DE Aspergillus orvzae POR ADSORCIN

229

Tabla 8.1: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en

Duolite XAD-761 a 4 0C.

Isoterma

bR

medio [%] -3.5 (0.6)

2.3

e [%] 11.3 (5.8) 6.6

Langmuir Freundlich

25 0.3 20

(8)

0.2 o.m
..~

.~

mS

0.0~

1~ -o.m ~ -0.2 e -0.3 -0.4 u

q

0 (experimentam)

10

15

20 [n,~/gl

25

Concentraeinadsorbida

Figura

11.1: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de HIC a 4 0C: (A) Valores de y (B) anlisis de residuos.

q predichos

por el

aiuste frente a los obtenidos experimentalmente

0.4 0,3 02 Q ~ O ~ 0.1 0.0 -0.1 02 -0.3 -0.4 0 15 25 0 5 mO lmg/g] 20 25 A A A (8)

q (experimental)

Concentraeinadsorbida

Figura

11.2: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HLC a 4 0C: (A) Valores de q predichos y (B) anlisis de residuos.

por el

ajuste frente a los obtenidos experimentalmente

230

ANEXO B: AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN ANLISIS ESTA.DtSTICO

Tabla 11.2: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite XAD-761 a 20 C.
Isoterma
bR

medio [%]

Langmuir Freundlich

-1.0 (0.6) 3.7

5.7 (2.9) 11.2

(3) 0.3

(B)

e e

ci-

a 0,0 e -0. e -0.2-0.3-

-0.4

15

20

c (experimental>

Concentracin adsorbida

lmg/gl

Figura 11.3: Ajuste a la isoterma de Lax3gmuir para la resma de HIC a 20

0C: (A) Valores de q predichos por el

ajuste irente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

25 13
0.2
01

(11)

-e e

e 0.0a

~ o
e

0.

-0.2
-0.3 -0.4-

mo

20

25

cm (exmerin,eiital)

mo 5 Concentracin adsorbida [n,~/g]

Figura 11.4: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HIC a 20 0C: (A) Valores de q predichos por cl ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (E) anlisis de residuos.

PURIFICACIN DE ~-AMILASADE Aspergillus

or}~ae POR ADSORCIN

231

Tabla B.3: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite XAD-761 a 30 0C.
Isoterma
bR

mnedio [%]

e [%]

Langmuir Freundlich

2.2 (2.2) 8.6

7.0 (7.0) 19.4

20

0.4 0.3

(B)
u

ms
e
O lo

0.2 -

E
O

0.m 0.0

os

o e -0.1 -0.2 a-0.3 -0.4 5 lO 15 20 o

-

o-

q (experimental)

5 0 5 Concentracin adsorbida Inw/r]

20

Figura 11.5: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de HIC a 30 0C: (A) Valores de q predichos por el

ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

20

0/ 0.3-

(B)

5 -e
!

-e
O

0.2 -

o 0.1 o
O

0.0 -0.1
-

5
5

-0.2-0.35 mo ms Concentracin adsorbida lmg/gl 20

q (experinitittal)

Figura 11.6: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de HIC a 30 0C: (A) Valores de q predichos por el ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

232

ANEXO E: AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLISIS ESTADSTICO

rabIa B.4: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en
Duolite A-568 a 20 C.
Isoterma
tR

medio [%] 68 (2.0) 1.1

e [%] 17.7 (4.0) 6.1

Langmuir Freundlich

35 30 25 20
os os

os

(B)
((402--

a
o

u 0.0

.c

.4

a a

a -0.2 -

-z
-04-

-o. 3 0 5 20 25 30 35 0 5 lO 15 20 25 .3(3
35

ci texperirnental)

Concentracin adsorbida [ng/gl

Figura 11.7: Ajuste a la isoterma de L-ngmuir para la resma de WC a 20 0C: (A) Valores de q predichos por el ajuste frente a los obtenidos cxperimentalmente y (E) anlisis de residuos.

35 30 25
-~

0.~-

(11)
0.4 0.2 -

20
15

-a e
0.0

A
A

At A

A.

o mO

o ~0.2e
-04-

0.,, (5 20 35 0 5 lO 15 20 25 30 35

cl texpCriU1Cnt~I)

Concentracin de equilibrio lrnWgl

Figura 11.8: Ajuste a la isoterma de Freundlich parata resiflade

IEC

a 20 C: (A) Valores de q predichos por el

ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

PURIFICACIN DE -AMILAsA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

233

Tabla 11.5: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en Duolite A-568 a 25 0C.
Isoterma
~it medio

[%]

o [%] 9.0 (5.1) 14.1

Langmuir Freundlich

-3.6 (-1.1) 6.4

35 30 25
a-

0.4 0.3 0.2

(B)

a~2o-

os 0.1
0.0
...~ u u

tu
u u

os
.4
15

o- o

e
5

-0.1

~ -0.2
u

-0.3 0.4

II

5 q (experimental>

10

20

25

30

35

Concentracin adsorbida lng/gI

Figura 11.9: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de WC a 25 C: (A) Valores de q predichos por el Qiuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

35 30 25 ~
-~
O

0.4 0.2 0,2 0. 0.0 -0,1 -0.2

____________________________________

(B)
u u
u

20 5

e
o

u u

e
O
O

a-0.3 -0.4 0 5 0 15 20 25 30 35

<1 (experiniental)

Concentracin de equilibrio lmg/mlI

Figura 11.10: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de WC a 25 C: (A) Valores de q predichos por el

ajuste frente a los obtenidos experimentalmente y (E) anlisis de residuos.

234

ANEXO B: AJUSTE DE LAS ISOTERMAS DE ADSORCIN. ANLISIS ESTADSTICO

Tabla 11.6: Errores de cada uno de los ajustes de las isotermas de adsorcin en

Duolite A-568 a 30 C.
Isoterma Rmediol%]

e[%1 9.6 (3.1)

12.6

Langmuir Freundlich

-44(1.8) 4.9

O...,

(B)
0.3 0.2 -

o u
os

E os
.4 0.0
O

e e

e .4 o-

u
~02-0.3 -

15

20

25

30

35

-O.., O

20

25

30

35

q <experimental)

Concentracin adsorbida lmg/g~

Figura 11.11: Ajuste a la isoterma de Langmuir para la resma de WC a 30 0C:

(A) Valores de q predichos por el

4iuste Irctnte a los t)btenidos experimentalmente y

(B)

anlisis de residuos.

o
0

-o

15

20

25

3(2

35

25

35

q (experimental)

Concentracin adsorbida

lu/gl

Figura 11.12: Ajuste a la isoterma de Freundlich para la resma de IEC a 30 C: (A) Valores de q predichos por el aiuste frente a los obtenidos experimentalmente y (B) anlisis de residuos.

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

235

Tabla B.7: Constantes de equilibrio de Henry vlidas

para baja concentracin en el sistema a-antilasa/HIC
Temperatura [C] KA

4.0 20.0 30.0

17.80.4 14.1 0.6 8.40.1

Tabla 11.8: Constantes de equilibrio de Henry vlidas para baja concentracin en el sistema a-amilasa/LEC.
Temperatura [0C] KA

20.0 25.0 30.0

35.2 3.2 36.2 1.8 42.80.8

PURIFICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

237

ANEXO C. FIGURAS

CA.- EXPERIMENTOS DE ADSORCION EN TANQUE AGITADO

A continuacin se representan los resultados experimentales de la adsorcin de wamilasa en las resinas de HIC e WC (figuras C.1 a C.8). En las figuras C.9 a C.24 se muestran los ajustes de los datos experimentales al modelo matemtico propuesto. Por ltimo, en la figura C.25 se representa grficamente un ejemplo de la optimacin llevada a cabo para la determinacin del coeficiente de difusin en los poros en la que se minimiza el valor de la funcin objetivo, F, decrita en la ecuacin A.16 del anexo A.

238

ANEXO C: FIGURAs

1.0

0.9

=
Y

0.8

0.7

0.6 0 100 200 300 400 500 600

Tiempo [mm] Figura C.1: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilas-a en Duolite XAD761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.

1.0<>

0.95

090

0.85

1)80 0 100 200 300 Tiempo [mini 400 500

Figura C.2: Comp-oracin de la dntica de adsorcin dc ~-amilasaen Duolite XAD761 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.

PURIFICACIN DE ~-AMWASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

239

1.0

0.9

0.8
=

Q Q

0.7

0.6

0.5

0.4 0 100 200 300 Tiempo [mm] 400 500 600

Figura C.3: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.

1.0

0.9

Q u

0.8

0.7

0.6

tOO

200

300

400

500

600

Tiempo [mm]
Fgura C.4: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a

diferentes temperaturas para una concentracin inicial de 0.25 mg/mi.

240

ANEXO C: FIGURAS

1-o

0.9
u u

0.8

0.7

100

200

300

400

500

600

Tiempo [mm]

Figura C.5: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 20 0C.

1,0<)

0,9 5

Y
u

090

085

0,80 O lOO 200 300 Tiempo 400 500 600

[mini

Figura C.6: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD761 para diferentes concentraciones iniciales de adsorhato llevadas a cabo a 30 C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

241

LO

0.9

0.8

Ql

0.7

0.6

0.5

0.4

lOO

200

300

400

500

600

Tiempo [mio]

Figura C.7: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 20 tt.

1.0

0.9

0.8
c

Ql Ql

0.7

0.6

0.5

0.4 0 100 200 300 400 500 600

Tiempo (mio]
Figura C.8: Comparacin de la cintica de adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 para diferentes concentraciones iniciales de adsorbato llevadas a cabo a 25 C.

242

ANEXO C: FICTIJI1AS

C.2.- EXPERIMENTOS DE ADSORCIN EN LECHO FIJO

En el presente apartado se muestran las grficas correspondientes a las curvas de ruptura experimentales para cada uno de las dos adsorbentes en las condiciones de operacin estudiadas. Se compara la influencia del caudal, la temperatura, la concentracin a la entrada de la columna, el tamao de partcula y la altura del lecho. La explicacin y comentario de las grficas que a continuacin se muestran se encuentra en el apartado 6.4.

1.0

0.8

0.6
Ql Ql

0.4

0.2

O-O O-O
i,O 2.0 3.0 [1.0 12.0

Volmenes de Lecho Figura C.9: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna

de HIC para una concentracin de entrada de 0.50 mg/ml a 20.0 0C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

oryzae POR ADSORCIN

243

1.0

0.8

0.6
=

Ql Ql 0.4

0.2

0.0 0.0 1.0 2.0 Volmenes de lecho 3.0 4.0

Figura CAO: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de HIC para una concentracin de entrada de 2.50 mg/ml a 20.0 0C.

t .0

0.8

0.6 Ql Ql

0.4

0.2

0.0

o-O

2.0

4.0

6.0

23.0 24.0

Volmenes de lecho Figura C.l1: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la

columna de WC para una concentracin de entrada de 0.50 mg/ml a 25.0 0C.

244

ANEXOC: FIGURAs

t .0

0.8

0.6
Ql Ql 0.4

0.2

0.0 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

14.0

16.0

Volmenes de lecho

Figura C.12: Efecto del caudal sobre las curvas de ruptura correspondientes a la

columnadc WC para una concentracin de entrada de 2.50 mg/ml a 25.0 0C.

1.0

0.8

0.6 Ql Ql 0.4

0.2

0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 9.1) lOO

Volmenes de lecho Figura C.13: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura

ct3rrespondientes a la columna de HIC para un caudal de 0.25 m/mm a 20.0 C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

ozyzae POR ADSORCIN

245

1.0

0.8

0.6
Ql Ql

0.4

0.2

O-o

o-o

1.0

2.0 Volmenes de lecho

3.0

11.0 12.0

Figura C.14: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre tas curvas de ruptura

correspondientes a lacolumna de HIC para un caudal de 1.00 rril/min a 20.0 0C.

1.0

0.8

0.6
Ql

Ql
0.4

0.2

o-o
0.0 2.0 4.0

6,0

24.0 26.0

Volmenes de lecho Figura C.15: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 0.25 mI/mm a 25.0 C.

246

ANEXO C:

FIou&~s

1.0

0.8

0.6
Ql Ql 0.4

0.2

0.0

o-o

1.0

2.0

3.0

4.0

16.0 18.0

Volmenes de lecho Figura C.16: Efecto de la concentracin de alimentacin sobre las curvas de ruptura correspondientes a la columna de IEC para un caudal de 1(X) ml/mm a 25.0 C.

C.3.- MODELADO DE LA ADSORCIN EN TANQUE AGITADO DISCONTINUO

A continuacin se presentan las grficas en las que se comparan las curvas obtenidas experimentalmente con las correspondientes predichas por el modelo matemtico con el valor del coeficiente de difusin en los poros obtenido mediante optimacin.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergillus

cryzae POR ADSORCIN

247

1.00

0.95

0.90
=

Ql 0.85 Ql

0.80

0.75

0.70

100

200

300

400

500

600

Tiempo [mm]
Figura C.17: Curvas, experimental y terica (D~ 2.32 lO m de a-antilasa en DuoliteXAD-761 a 4 ~Cy una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=

2/s), de la adsorcin

1.00

0.95

Y Ql
0,90

0.85 0 50 lOO t50 200 250

Tiempo [mini Figura C.18: Curvas, experimental y terica (D~ 1.32 10 m2/s), de la adsorcin de a-amnilasa en Duolite XAD-761 a 4 0C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
=

248

ANEXOC:

FIC,uRAs

t .00

0.95

0.90
Ql Ql

0,85

0.80

0.-ls

100

200

300

400

500

600

Tiempo [mninJ

Figura C.19: Curvas, experimental y terica (D~ 3.72 . l0~ m/s), de la adsorcin de ci-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=

1.00

0.95
Ql

0.90

0.85
(1 100 200 300 400

500

~liempo [mm]

Figura C.20: Curvas, cxperiment-al y terica (D 2/s), de la adsorcin de 0 1.76 iW m de 0.25 mg/ml. u-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 C y una concentracin inicial
=

PURIFICACIN DE u-AMILASA DE Asperg/tus oryzae POR ADSORCIN

249

1.00

Ql = Ql

0.90

0.85

100 Tiempo [mm]

200

300

1.52 10.11 m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite XAD-761 a 20 C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
Figura (2.21: Curvas, experimental y terica (D~
=

1.00

095

Ql

0.90

085

0-so O 100 200 300 400 500 600

Tiempo [mini Figura (2.22: Curvas, experimental y terica (D 2/s), de la adsorcin de 0 1.10 10 m de 0.10 mg/ml. rpamil-asa en Duolite XAD-761 a 30 0C y una concentracin inicial
=

250

ANEXO C:

ROU&xs

1.00

095
Ql Ql

0,90

0,85

100

200

300

400

Tiempo [mm] Figura (2.23: Curvas, experimental y terica (D0

2.15 10 n/s), de la adsorcin de u-amlasa en DuoliteXAD-761 a 30 t y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
=

1,00

Y
Ql

095

0,90 0

100 Tiempo [mini

200

2/s), de la adsorcin de Figura (2.24: Curvas, experimental y terica (D~ 2.11 10. m ry-amilasa en Duolite XAD-761 a 30 0C y una concentracin inicial de 0.50 mg/ml.
=

PURIFICACIN DE U-AMILA.SA DEAspergi/Jus oiyzae POR ADSORCIN

251

1.0

0.9

0.8

Y Ql

0.7

0.6

0.5

lOO

200

300

400

Tiempo [mm]
Figura (2.25: Curvas, experimental y terica (D~ 5.20 . 1041 m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a 20 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
=

I.0

0.9 Ql Ql 0.8

0.7 Tiempo [mm]

2/s), de la adsorcin 2 2.21 . 10 m de 0.25 mg/ml. de a-amilasa en Duolite A-568 a 20 C y una concentracin inicial
Figura (2.26: Curvas, experimental y terica (D

252

ANEXO C: FIGURAS

1.00

0.95

Y Ql
0.90

0,85

50

100

150

200

Tiempo [mnJ
Figura (2.27: Curvas, experimental y terica (D~ = 2.08 . ~ m2/s), de la adsorcin de a-arnilasa en Duolite A-568 a 20 C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.

t .0

0.9

0.8
e

Ql Ql

0.7

0.6

0.5

0.4 0 100 200 300

Tiempo [mini

400

500

600

Figura (2.28: Curvas, experimental y terica (D~ = 6.02 10 m2/s), de la adsorcin de cx-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.
-

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Asperg/tus

oryzae

POR ADSORCIN

253

1.0

0.9

Ql Ql

0.8

0.7

0.6

100

200

300

400

500

600

Tiempo [mm]

2.41 lo m2/s), de la adsorcin de a-amilasa en Duolite A-568 a 25 0C y una concentracin inicial de 0.25 mg/ml.
Figura C.29: Curvas, experimental y terica (D~
=

1.00

0.95
e

Ql

Ql 0.90

0.85 0 50 100 Tiempo [mm]

= 2.55 10.11 m2/s), de la adsorcin de ~-amilasaen Duolite A-568 a 25 C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.

150

200

Figura (2.36: Curvas, experimental y terica (D~

254

ANEXO C: FIGURAS

1.0

0.9

0.8 Ql
Ql

0.7

0.6

0.5

0.4 0

100

200

300 Tiempo [mini

400

500

600

Figura (2.31: Curvas, experimental y terica (D~ = 7.41 l0~~ m2/s), de la adsorcin de cx-amilasaen Duolite A-568 a300C y una concentracin inicial de 0.10 mg/ml.

0.9

Ql

Ql

0.8

t).7

0.6 0 100 200 300 Tiempo [nxin]

Figura

400

500

600

(2.32: Curvas, experimental y terica (D

0
=

&/s), de la adsorcin dc ctamilasa en Duolite A-568 a 30 C y una concentracin inicial de 1.00 mg/ml.
-

2.75

PURmFICACtN DE a-AMILASA DE Aspergllus

oryzae POR ADSORCIN

255

7.0 -

6.0 5.0 4.0

-

3.0 e -

241 -10- m2/s

2.0 1.0
.4.

0.0

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

D p x 1011 [m2/s] Figura (2.33: Optimacin del valor de D~, por minimizacin de la funcin objetivo

para un experimento de adsorcin de a-amilasa en tanque agitado a 25 0C y concentracin inicial 0.25 mg/ml sobre la resma de intercambio inico.

C.4.- MODELADO DE LA ADSORCION EN

LECHO FIJO

En el presente apartado se comparan las curvas de ruptura experimentales con las tericas

derivadas del modelo matemtico. Los parmetros cinticos utilizados para el modelado figuran en el apartado 7.2 y se han obtenido mediante optimacin del ajuste de ambas curvas.
-

256

ANEXO C: FIcwRs

1.0

(LS

0.6

0.4

0.2
0.0

20

40

60

80

tiempo (mm]
Figura (2.34: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/m; Q = 0.25 m/mm; 1 = 20 0C.

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 0 10 20 30 40

tiempo [mini
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: ~
Figura (2.35: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo = 0.50 mg/m; Q = 0.50 m/mm; T = 20 U.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergllus

oryzae POR ADSORCIN

257

1.0

0.8

0.6

Q 0.4

0.2

0.0

10

25

tiempo [mm]
Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de fflC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/m; Q = 1.00 ml/mln; T = 20 ~C.
Figura (2.36:

1.0

0.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0 0

20

40

tiempo [mm]

60

Figura C.37: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo 0C. para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C~ 1.00 mg/m; Q = 0.25 ml/mm; T = 20

258

ANEXO C:

FIGURAs

1.0

0.8
0.6

0.4

0.2

0.0 0 5 10
15

tiempo [mini
Figura (2.38: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de HIC en las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/m; Q = 1.00 m/mm; T

20(2.

1 .0

0.8

Q) Q

0.6

0.4

0.2

0.0 0 5 lo 15 20 25

tiempo [mm]
Figura (2.39: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma dc HIC en las siguientes condicioncs: (2, 2.50 mg/m; Q = 0.25 m/mm; T = 200(2,

PURifICACIN DE U-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN

259

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 0 5 10 15

tiempo [mm]
Figura (2.40: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de HIC en las siguientes condiciones: Co = 2.50 mg/m; Q = 0.50 m/mm; T = 20 C.

1.0

0.8

0.6 Q) 0.4

0.2

0.0 0 2 4 6 8 10

tiempo [mm]
para la resma de HIC en las siguientes condiciones: ~
Figura (2.41: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo = 2.50 mg/m; Q = 1.00 ml/mm; T = 20
O(2

260

ANEXO (2: FIGURAs

1.0

0.8

0.6 Q
(a)

0.4

0.2

0.0 0
2<)

40

60

80

lOO

240

250

tiempo [mini
Figura (2.42: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

par-a la resma de IEC en las siguientes condiciones: Cf

0.50 mg/mI; Q = 0.25 m/mm; T = 25(2.

1.0

0.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0 0 10 20 30 40

50

110 120

tiempo [mm]
Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para 1-a resma de IEC en las siguientes condiciones: C~ 0.50 mg/mi; Q = 0.50 ml/ruin; T = 250(2
Figura (2.43:

PURmErCACIN DE a-AMILASA DE Aspergllus

cryzae POR ADSORCIN

261

1.0

0.8

(a)

0.6

0.4

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 45 60

tiempo [mini
Figura (2.44: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de WC en las siguientes condiciones: C~ = 0.50 mg/m; Q = 1.00 m/mm; T = 25 O(2~

1.0

0.8

0.6
o

u u

0.4

0.2

0.0 0 20 40 60 80 100 240 25<)

tiempo [mm]
Figura (2.45: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de [ECen las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/ml; Q = 0.25 m/mm; T = 25 C.

262

ANEXO (2: FIGURAs

1.0

0.8

0.6 (a) Q 0.4

0.2

0.0 0 10 20 30

40

110 120

tiempo [mini
Figura (2.46: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de IEC en las siguientes condiciones: C0 = 1.00 mg/mI; Q = 0.50 m/mm; T

25

~(2.

1.0

<18
0.6 Qe 0.4

0.2

0.0 (9 5 lO 15
20 38 40

tiempo [mini
Figura (2.47: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo para la resma de WC eo las siguientes condiciones: ~ = 1.00 mg/mI; Q = 1.00 ml/mio; T = 25 C.

PURIFICACIN DE a-AMWASA DE Aspergllus

oryzae

POR ADSORCIN

263

1.0

0.8

0.6
o

0.4

0.2

0.0 0 5 10 15 20 25 30 65 70

tiempo [mini
y calculada mediante el modelo para la resma de WC en las siguientes condiciones: (2~ = 2.50 mg/mi; Q = 0.50 m/mm; T = 25(2
Figura (2.48: Comparacin de la curva de ruptura experimental

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 0 2 4 6 8 10 18 20

tiempo [mm]
Figura (2.49: Comparaci de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de IEC en las siguientes condiciones: ~

2.50 mg/mI; Q = 1.00 m/mm; T = 25 fl(2~

264

ANEXO C: FIGURAS

1.0

0.8

(a) (a)

0.4

0.2

0.0 0 5 10 15 20 25 3<) 75 80

tiempo [minI
Figura (2.50: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de WC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/mi; Q = 0.50 m/mm; T

20 C.

1.0

0.8

0.6 Ca) (a)

o

0.4

0.0

lO

20

30
tiempo [mini

40

50

110 120

Figura (2.51: Comparacin de la curva de ruptura experimental y calculada mediante el modelo

para la resma de WC en las siguientes condiciones: C0 = 0.50 mg/ml; Q = 0.50 ml/mm; T = 30 C.

PURIFICACIN DE a-AMILASA DE Aspergllus

oryzae

POR ADSORCIN

265

NOMENCLATURA
A,80:
ABEl-:

Absorbancia a 280 nm.

Area BET.
Area molecular de contacto ligando-adsorbato en HIC.

AA5:

b:

Parmetro de la isoterma de Langmuir. Concentracin de adsorbato en la fase fluida en el interior de los poros.

C: D~: O~:
DL: OK:

Concentracin de adsorbato en el seno de la fase fluida fuera de las partculas. Difusividad molecular del adsorbato A en la disolucin B. Coeficiente de difusin intracristalino.

Coeficiente de dispersin axial. Coeficiente de difusividad de Knudsen.

Dimetro de partcula.

dp: Dp:

Coeficiente de difusin en los poros. Aceleracin de la gravedad. Variacin de la energa libre de adsorcin. Variacin de la entropa de adsorcin.
Flujo de adsorbato que atraviesa la capa lmite externa.

0: A0 AH0:

J~.

266
Constante aparente de adsorcin (Ec. 3.4)

NOMENCLATURA

k:
KA:

Factor de capacidad. Constante de adsorcin (constante de Henry). Coeficiente de difusin externa.

Parmetro de la isoterma de Freundlich

k1:
K~:

k0:
L:

Factor de capacidad en ausencia dc sal.

Longitud de lecho.

m:
MA:
MB:
-

concentracin molal. Masa molecular del adsorbato. Masa molecular del disolvente. Presin-Concentracin de adsorbato adsorbida por unidad de masa de adsorbente.

Q:

Caudal. Capacidad mxima del adsorbente. Constante de los gases. Radio de partcula.
0: Variacin de la entropa de adsorcin.

<-ln<

AS
1R~

Tiempo Tiempo de retencin del adsorbato. Tiempo de retencin del trazador. Temperatura. Velocidad intersticial de un fluido.

V:

Volumen molar medio del disolvente. Volumen de disolucin.

VA:
y,,.

Volumen molar medio del soluto a su temperatura de ebullicin. Volumen de poro.

Masa de resma. Car2a caracterstica de la protena.

W: Z 1>:

Z5:

Carga neta del contrain en IEC.

Letras griegas
Parmetro de la isoterma de Freundlich.
e: El,: Porosidad de columna.

Porosidad de partcula. Funcin objetivo (Fc. A.l0). Dimetro interno del lecho.

CF:
CFC.

PURIFICACIN DE tX-AMILASA DE Asperg/tus oryzae POR ADSORCIN

267

Parmetro de interaccin hidrofbica.

ji: Momento dipolar de una protena.

Viscosidad de una disolucin. Primer momento (Ec. 3.1). Densidad de un fluido. p

Pr Densidad aparente de un slido poroso.

Densidad real de un slido poroso.

Incremento molal de tensin superficial de una sal. Segundo momento central (Ec. 3.2).

e: e2:

Factor de tortuosidad.

e:

Fraccin de la superficie de un adsorbente cubierta por molculas de adsorbato.

Acrnimos HPLC: Cromatografa lquida de alta eficacia. HIC: IEC: GH: GP: Cromatografa de interaccin hidrofbica. Cromatografa de intercambio inico. Grado de hidrlisis o equivalente de dextrosa. Grado de polimerizacin.