Tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR)

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.

Variante histolgica
Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios para su realizacin son los siguientes: 1. cido peridico 58% 1. carbol fucsina de Ziehl culina(fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: 1. 0,5 g fucsina bsica 2. 50 cc agua destilada 3. 5 cc etanol absoluto 1. 1. 28,5 g cristales de fenol derretidos 2. hematoxilina 3. alcohol cido 1%: 1. alcohol de 35 2. cido clorhdrico El procedimiento es el siguiente: 1. desparafinar e hidratar los cortes 2. cido peridico 5%, 10 min 3. lavar con agua destilada 4. fucsina fenicada, 15 min 5. decolorar en alcohol cido al 50% 6. lavar con agua destilada 7. hematoxilina, 10 min 8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio 9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

Resultados[editar editar cdigo]

Los microorganismos teidos con el primer colorante (fucsina) sern rojos, rosas, seran cido resistentes, presuntivamente micobacterias. Los otros organismos son azules. Para confirmar neumona ha de hacerse un cultivo en medio selectivo. BAAR: rojo. Ncleos: azul semiamarillo.

Variante clsica o "en caliente"[editar editar cdigo]

sta y la siguiente variantes son para preparaciones citolgicas. 1. Hacer un frotis de la muestra. 1. La fijacin al calor asegurar de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tincin. 2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tincin con los extendidos hacia arriba. Nunca tia ms de 12 portaobjetos a la vez. 2. Dejar el frotis sobre el puente de tincin. 3. Aplicar fucsina-fenicada. 1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este perodo. 4. Calentar con un mechero hasta la emisin de vapores (3-5 minutos). 1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tia la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante. 2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fra hasta que toda la tincin libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua. 5. Decolorar con alcohol-cido. 1. Cubra cada portaobjetos con la solucin decolorante, tal como alcohol cido y mantngalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teido. Enjuague con agua una vez ms los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos an estn rosa, aplique una cantidad adicional de la solucin decolorante de 1 a 3 minutos. 6. Aplicar azul de metileno (1 minuto). 1. Aplique la solucin de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto. 7. Enjuagar con agua

1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire. 8. Ahora coloquele una pequeita gota de aceite de inmersin y haga la observacin al microscopio con 100 x 100

o en "fro" (Tincin de Kinyoun)[editar editar cdigo]

1. Hacer un frotis. 2. Dejarlo en el puente de tincin. 3. Aplicar fucsina-fenicada (solucin con fenol y mayor concentracin de fucsina). 4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. 5. Decolorar con alcohol cido. 6. Lavar con agua del grifo. 7. Contrastar con azul de metileno

Algunos microorganismos cido-alcohol resistentes[editar editar

cdigo]
Mycobacterium: fuertemente cido-alcohol resistentes.
1 2

Nocardia y Actinomices: dbilmente cido-alcohol resistentes. Parsitos coccdeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

FUNDAMENTO Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1. Preparar indicados.

los

frotis

bacterianos

2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min. Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se evapora; es importante que la muestra no se seque. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Teir con safranina 1 min. 5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 6. Secar la preparacin. 7. Observar las tres especies del gnero Bacillus. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de

Antibiograma:
Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibiticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusin de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton. Material Cultivo Puro de un microorganismo Placa con medio de Mueller-Hinton Pinzas metlicas Discos de antibiticos Para la realizacin de la prueba en primer lugar a! que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o c"sped. #a siembra se realiza mediante un isopo est"ril que se empapa con el cultivo l$quido o se impregna en un cultivo slido. %e descarga el isopo realizando una estrella en el centro de la placa !

e&tendi"ndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. 'na vez sembrada la placa se eligen los antibiticos a testar.

#os antibiticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metlicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersin en alco ol. #os discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado( realizando una ligera presin para que queden ad eridos al mismo. Ha! que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara ! no a!an interferencias entre la accin de unas sustancias ! otras.

#a placa preparada con el inculo ! los antibiticos se invierte ! se lleva a incubar durante )* oras a +,-C. .ras este tiempo( se leen los resultados midiendo el dimetro de los alos de in ibicin del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. %e valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que( seg/n el antibitico( tenemos la capacidad de difusin en el medio ! por tanto( la medida de alo que corresponder a una bacteria sensible( moderadamente sensible0de sensibilidad intermedia( o resistente.

Resultados:

Api 20s
IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. A continuacin se propone un esquema de trabajo para la identificacin de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioqumico (Biotipo): 1) Obtener un cultivo puro 2) Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. 3) Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4) Realizacin de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso familia a la que pertenece un aislamiento . Las pruebas primarias son: Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas,crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad. 5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.) Serotipo A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el nmero o letra del antgeno correspondiente.

En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. Tambin se pueden utilizar mtodos de cromatografa gaseosa para identificar productos metablicos, en particular para la identificacin de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: Yersinia entercoltica 4 03 gnero especie biotipo serotipo ENSAYOS BIOQUIMICOS La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de

identificacin, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. Los sistemas comerciales ms comnmente usados son : * BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas bioqumicas. * API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 23 pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana. Otros sistemas: Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. API 10S, versin miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria - Haemophilus) Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras: API 20 C (Para levaduras del gnero Candida) Auxacolor de Diagnostics Pasteur Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificacin de levaduras de inters mdico) b) En la Ctedra se desarroll un sistema para la identificacin de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies ms frecuentemente aisladas de muestras clnicas. Est integrado por las siguientes pruebas: produccin de H2S en agar triple azcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, produccin de indol, descarboxilacin de lisina, descarboxilacin de ornitina,crecimiento en citrato, fermentacin de arabinosa, fermentacin de

sorbitol y produccin de acetona (VP). En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiracin a) oxidasa b) catalasa 2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros 2.1) Requerimientos de oxgeno OF (xido-fermentacin) Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gas Fermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico) d) Esculina e) Hipurato 3) Fuente nica de carbono a) citrato

b) malonato c) hipurato para coliformes 4) Utilizacin de compuestos nitrogenados

4.1) Reduccin de nitrato a) asimilacin b) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros a) indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea 5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6) Deteccin de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) 7) Miscelneos a) KCN b) Bilis c) produccin de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibicin a) Temperatura b) NaCl c) Antibiticos

TABLA MODIFICADA DE COWANS & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERTROFAS tincin gram (cultivo fresco) forma agrupacin crecimiento aerobio crecimiento anaerobio esporas movilidad catalase oxidase fermentacin de glucosa a acido o a acido+gas O/F Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomonas Enterobacterias Aeromonas Chromobacterium Neisseria X X X X X X X X X X X X X X X X X X X + + + + + (o ) + + coco + coco + coco + coco + + + +

bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco pares + + + + +o + + + +o + + + +o + + +o + + + +o + + O + + +o+ + F + + + + + + F + + + O

racimos racimos cadenas tetradas + + + + + + + + +