UNIVERSIDAD DE COLIMA

DOCTORADO EN CIENCIAS: AREA CIENCIAS AGRICOLAS Y

FORESTALES
EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN
LOS PROCESOS DE ORGANOGNESIS Y
EMBRIOGNESIS SOMTICA DE AGUACATE
(Persea americana Mill . )
TESIS
Que para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS:
REA CIENCIAS AGRCOLAS Y FORESTALES
Presenta:
IGNACIO VIDALES FERNNDEZ
Asesores:
DR. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA
DR. MIGUEL NGEL GMEZ LIM
TECOMN, COLIMA, MXICO. NOVIEMBRE DEL 2002
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 590/2002.
C. IGNACIO VIDALES FERNNDEZ
EGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIAS
REA: CIENCIAS AGRICOLAS Y FORESTALES
PRESENTE.
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del rea: de
Ciencias Agrcolas y Forestales de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado y
en virtud de que efectu las correcciones y acat las sugerencias que le haban indicado los
integrantes del mismo, se le autoriza la impresin de la tesis " Efecto de los reguladores de
crecimiento en los procesos de organognesis y embriognesis somtica de aguacate (Persea
americana Mill) ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Rafael Salgado Garciglia,
Profesor Investigador de la UMSNH.
Este documento reuni todas las caractersticas apropiadas como requisito parcial para
obtener el grado de Doctor en Ciencias; Area: Ciencias Agrcolas y Forestales y fue revisado en
cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Miguel A. Gmez Lim, CINVESTAV-IPN Unidad
Irapuato, Dr. Joel E. Lpez Meza, Profesor- Investigador de la UMSNH, Dr. Roberto Lezama
Gutierrez y el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Profesores-Investigadores de la Universidad de
Colima.
Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias, a la
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo y al Centro de Investigacin y de
Estudios Avanzados del IPN por las facilidades proporcionadas para desarrollar la
presente investigacin.
A la Fundacin Produce Michoacn, A.C. por el apoyo econmico en mis estudios de
doctorado y en la investigacin que se presenta.
Mi profunda gratitud y reconocimiento al Dr. Rafael Salgado Garciglia por sus
consejos, orientaciones y excelente asesora en el desarrollo de la tesis.
Al Dr. Miguel ngel Gmez Lim por su apoyo en la interaccin con investigadores
como el Dr. Richard E. Litz y Fernando Pliego Alfaro, as como en sus sugerencias y
asesora en la tesis.
A los Doctores Joel Edmundo Lpez Meza, Alfonso Pescador Rubio y Roberto
Lezama Gutirrez por sus comentarios y sugerencias que indudablemente
enriquecieron el escrito final.
A todos mis compaeros del PICAF, muy especialmente a mi hermano Jos Agustn
Vidales Fernndez y amigos Ercelia ngel Palomares, Jess Garca Magaa y Mario
Aguilar Ramrez, con quienes compartimos cursos, exmenes y horas de desvelo.
A mis compaeros del Campo Experimental Uruapan particularmente a los M.C. Jos
de la Luz Snchez Prez, Jos Alvarez Silva, Jos Luis Aguilera Montaez y Jos Luis
Rocha Arroyo, as como al Dr. Hctor Guilln Andrade y a la Sra. Evelia Capiz Villa,
por su apoyo y consejos.
DEDICATORIA
A MI REYNA Y QUERIDA COMPAERA:
Por su apoyo, comprensin y paciencia en los momentos
difciles de la vida.
A MIS HIJOS:
CARLOS ALBERTO, CONSTANZA Y JUDITH
Por ser mi fortaleza y la razn de mi superacin.
A MIS ABUELITOS Y PADRES:
IGNACIO (q.e.p.d.) Y JUANITA (q.e.p.d.); AGUSTN (q.e.p.d.) Y
ELVIRA
Por ser mi gua en el camino de la vida.
A MIS HERMANOS:
AGUSTN, GUADALUPE, ENRIQUE, ROSA, JOS, ELVIRA, JESS,
HERLINDA, JUAN Y ADELAIDA.
Por la gran familia y unin que formamos.
CONTENIDO
Pgina
LISTA DE CUADROS i
LISTA DE FIGURAS iv
RESUMEN vii
SUMMARY viii
I. INTRODUCCIN 1
Hiptesis 5
Objetivo 5
II. REVISIN DE LITERATURA 7
2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento 7
2.1.1. Auxinas 7
2.1.2. Citocininas 12
2.1.3. Giberelinas 17
2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento 21
2.2. Bases moleculares de la accin hormonal 24
2.3. Micropropagacin 31
2.3.1. Organognesis 33
2.3.1.1. Organognesis en aguacate 34
2.3.2. Embriognesis somtica 42
2.3.2.1. Embriognesis somtica en aguacate 45
2.4. Factores que intervienen en la morfognesis in vitro 52
2.4.1. Inculo o explante 53
2.4.2. Factores fsicos 53
2.4.3. Factores qumicos 55
Pgina
III. MATERIALES Y MTODOS 62
3.1. Localizacin del sitio de investigacin 62
3.2. Material biolgico 62
3.3. Reactivos utilizados 62
3.4. Organogness de aguacate criollo 63
3.4.1. Definicin de las condiciones aspticas del explante 63
3.4.2. Prevencin de necrosis del explante 64
3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros
compuestos del medio de cultivo para lograr la
organognesis in vitro de aguacate criollo 65
3.4.3.1. Induccin de brotes 65
3.4.3.2 Multiplicacin de brotes obtenidos in vitro 67
3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro 67
3.4.4. Aclimatacin de plntulas de aguacate obtenidas
in vitro 68
3.5. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass 70
3.5.1. Desinfeccin de frutos y procedimientos de extraccin
de la nucela 70
3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis
oxidacin de la nucela 70
3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr
la embriognesis somtica de aguacate cv. Hass 71
3.5.3.1. Generacin de callo embriognico 71
3.5.3.2. Multiplicacin y desarrollo de embriones
somticos 71
3.5.3.3 Maduracin de embriones somticos 72
3.5.3.3.1. Anlisis de almidn y glucosa de
embriones somticos maduros 72
3.5.3.4. Germinacin de embriones somticos 73
Pgina
3.6. Condiciones de incubacin de los explantes 74
3.7. Anlisis estadstico 75
IV. RESULTADOS 76
4.1. Organognesis de aguacate criollo 76
4.1.1. Desinfeccin externa 76
4.1.2. Desinfeccin interna 76
4.1.3. Prevencin de necrosis del explante 80
4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros
compuestos del medio de cultivo en la organognesis
in vitro de aguacate criollo 82
4.1.4.1. Iniciacin o establecimiento in vitro de yemas
axilares 82
4.1.4.2. Multiplicacin de brotes 85
4.1.4.3. Enraizamiento de brotes 92
4.1.5. Aclimatacin de plntulas de aguacate criollo
obtenidas in vitro 94
4.2. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass 98
4.2.1. Efecto del cido ascrbico, cistena y luz en la
necrosis del tejido nucelar 98
4.2.2. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros
componentes del medio de cultivo en la
embriognesis somtica 100
4.2.2.1. Induccin de callo embriognico 100
4.2.2.2. Multiplicacin y desarrollo de embriones
somticos 102
4.2.2.3. Maduracin de embriones somticos 106
Pgina
4.2.2.3.1. Anlisis de almidn y glucosa de
embriones somticos maduros 110
4.2.2.4. Germinacin de embriones somticos maduros 110
V. DISCUSIN 113
5.1. Organognesis de aguacate criollo 113
5.1.1. Condiciones ptimas de asepsia para el establecimiento
in vitro de yemas axilares de aguacate. 113
5.1.2. Prevencin de necrosis de yemas axilares de aguacate. 114
5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo en la organognesis in vitro de
aguacate. 114
5.2. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass 119
5.2.1. Prevencin de necrosis de tejido nucelar de aguacate 119
5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo en la embriognesis somtica de
aguacate. 120
VI. CONCLUSIONES 125
VII. LITERATURA CITADA 126
ANEXOS 141
LISTA DE CUADROS
Cuadro No. Pgina
1 Embriognesis somtica en frutales perennes y otras
especies de cultivo. 46
2 Respuesta al ambiente en la micropropagacin convencional.
16
3 Tratamientos evaluados en el estudio sobre concentracin de
sales minerales MS, WPM y McCown's, en la fase de
induccin de brotes. 66
4 Composicin de sales minerales MS y modificadas en
macroelementos, utilizadas en pruebas de multiplicacin y
enraizamiento in vitro de brotes de aguacate. 68
5 Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimatacin
de brotes de aguacate criollo obtenidos in vitro.
69
6 Porcentaje de contaminacin y necrosis de yemas axilares de
aguacate criollo a los 12 das del establecimiento en dos
medios de cultivo (A y B), en la prueba de dosis de Benlate.
77
7 Porcentaje de contaminacin de yemas axilares de aguacate
criollo a diferentes das despus del establecimiento por
tratamiento para permanencia continua y en etapas de
recultivo a medio sin plaguicidas. 78
8 Porcentaje de contaminacin y necrosis de yemas axilares de
aguacate criollo a diferentes das despus del establecimiento
por tratamiento para permanencia continua con dos
severidades de desinfeccin superficial y en etapas de
recultivo a medio sin plaguicidas. 79
9 Porcentaje de contaminacin de yemas axilares de aguacate
criollo a 7 y 14 das del establecimiento, en estudio de
pretratamiento de explantes en solucin con Benlate ms
Agrimicin 100 a diferentes tiempos de permanencia.
80
i
Pgina
Cuadro No.
10 Porcentaje de necrosis y brotacin de yemas axilares de
aguacate criollo por tratamiento en el estudio de
pretratamiento del explante con cido ascrbico. 81
11 Porcentaje de brotacin de yemas axilares de aguacate criollo
a diferentes das por tratamiento en estudio sobre
concentracin de tres sales minerales. 83
12 Prueba de comparacin de medias (Tukey = 0.01) para la
variable longitud del brote (mm) de yemas axilares de
aguacate criollo, a los 127 das del establecimiento. 85
13 Nmero de brotes por explante y longitud del brote de
aguacate criollo en los tratamientos de la interaccin BA-AIB
en sales modificadas completas (MS 100%) y MS 1/2 de su
concentracin. 86
14 Comparacin de medias Tukey ( = 0.05) en la variable
nmero de brotes promedio por frasco de aguacate criollo a
los 25 y 85 das, en tratamiento con reguladores BA-AIB.
88
15 Comparacin de medias Tukey ( = 0.05) en la variable
longitud promedio de brote de yemas axilares in vitro de
aguacate criollo a los 85 das, en tratamientos con
reguladores de crecimiento (BA-AIB). 89
16 Caractersticas cualitativas de los brotes in vitro de aguacate
criollo en los diferentes tratamientos a los 85 das del
establecimiento, en tratamientos con reguladores de
crecimiento (BA-AIB). 90
17 Comparacin de medias Tukey ( = 0.05) en la variable
longitud de raz por brote de aguacate criollo a los 54 y 88 das,
en prueba de enraizamiento de brotes in vitro con AIB e
interaccin AIB AG3. 93
18 Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criollo
obtenidos in vitro a los 88 das del establecimiento, en prueba
de dosis de AIB e interaccin AIB-AG3. 93
19 Porcentaje de supervivencia de plntulas de aguacate en el
estudio de dosis de Folicote. 96
ii
Pgina
Cuadro No.
20 Porcentaje de supervivencia de plntulas de aguacate en el
estudio de preaclimatacin con filtro bacteriolgico en
comparacin a Folicote. 96
21 Prueba de comparacin de medias Tukey ( = 0.05) en la
variable frecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.
97
22 Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hass
en diferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad de
luz. 99
23 Porcentaje de formacin de callo embriognico en tejido
nucelar de aguacate cv. Hass, color y dimetro en los
tratamientos donde se formaron las estructuras
embriognicas. 101
24 Nmero de estructuras embrionarias (globulares y
acorazonados) en callos de aguacate cv. Hass a los 20 das
del establecimiento. Significancia estadstica Tukey ( = 0.01). 104
25 Nmero y porcentajes de viabilidad de estructuras
embrionarias de aguacate cv. Hass en sus diferentes fases,
por cada 10 ml de medio, a los 20 das de cultivo. 106
26 Promedio de embriones somticos maduros de aguacate cv.
Hass por caja de petri, a los 36 das. Significancia estadstica
Tukey ( = 0.01). 108
27 Promedio de embriones somticos maduros de aguacate cv.
Hass por caja de petri a los 23 das. Significancia estadstica
Tukey ( = 0.01). 108
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura No. Pgina
1 Factores que pueden influir en el crecimiento y morfognesis
de las plantas in vitro. 60
2 Nmero de brotes laterales en yemas axilares in vitro de
aguacate criollo en MS 20% de sus sales, a los 127 das de
su cultivo. 83
3 Crecimiento promedio (mm) del brote principal en yemas
axilares in vitro de aguacate en diferentes tratamientos
evaluados y a 55, 72, 86, 100, 117 y 127 das del
establecimiento, estudio de concentracin de tres sales
minerales. 84
4 Brotes en yemas axilares in vitro de aguacate criollo con
formacin de callo en la base del explante y hojas deformes
(MS 100% y BA 0.9 mg/I). 88
5 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitro
con la mayor longitud de brote (MS 100%, sin reguladores). 90
6 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitro,
de color verde oscuro en el tratamiento 2 (MS 100% y 0.3 mg/l
de BA). 91
7 Enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo (MS 100%
y 0.4 mg/1 de AIB), en prueba de dosis de AIB e interaccin
AIB-AG
3
. 94
8 Plntulas de aguacate criollo micropropagadas en la fase de
trasplante y aclimatacin, tratadas con Folicote (ceras) 1 parte
en 20 de agua. 95
9 Estomas de hojas de aguacate criollo rbol adulto (A) y
de plntulas micropropagadas (B). 97
10 Tejido nucelar in vitro de aguacate cv. Hass sin necrosis
(MS 50% y picloram 2 mg/I). 99
11 Callo embriognico de aguacate cv. Hass (MS completo y 101
2 mg/1 de picloram), despus de 40 das de cultivo.
iv
Figura No. Pgina
12 Necrosis en callo embriognico de aguacate cv. Hass,
despus de 60 das de cultivo. 102
13 Masas proembriognicas (MPE) y estructuras globulares (EG)
de aguacate cv. Hass a los 20 das del recultivo (MS 100% sin
reguladores de crecimiento). 103
14 Estructuras embriognicas acorazonados (EA) y en fase de
torpedo (ET) en callos de aguacate cv. Hass, a los 20 das del
recultivo (MS 100% con 400 mg/1 de casena). 105
15 Embriones somticos maduros de aguacate cv. Hass (MS
100% y 20 g/I de agar); A, a los 35 das del recultivo; B, a 40
das del recultivo. 109
16 Embriones somticos de aguacate cv. Hass para su
germinacin en frascos de cultivo tipo magenta, en las
pruebas de dosis adenina y tiempos de inmersin. 111
17 Germinacin de embriones somticos de aguacate cv. Hass;
A, emisin de brotes en medio MS con BA-AIB (0.4-0.01 mg/I),
a los 32 das; B, emisin de races en medio MS con BA-2,4-D
(0.1-0.05 mg/l), a 55 das. 111
18 Plntula de aguacate cv. Hass a partir de embrin somtico
en medio MS con 0.3 mg/I de BA, despus del recultivo previo
por 90 das en medio con sales de Anderson modificadas y
sin reguladores de crecimiento. 112
v
EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOS
PROCESOS DE ORGANOGNESIS Y EMBRIOGNESIS SOMTICA
DE AGUACATE
(Persea americana Mill.)
Ignacio Vidales Fernndez
Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima,
Apartado postal No. 36, C.P. 28100, Tecomn, Colima, Mxico
RESUMEN
El efecto de los reguladores de crecimiento sobre la morfognesis in vitro de
aguacate fue estudiado. La organognesis se estableci en yemas axilares de
aguacate criollo raza mexicana (Persea americana Mill. var. drymifola), se logr la
formacin de brotes en MS 20% con 2 mg/1 de BA y 0.2 mg/l de AIB, mientras que la
brotacin mltiple en MS 100% con 0.3 mg/1 BA; el enraizamiento de los brotes fue
hasta del 44.4% con 0.4 mg/1 de AIB; la aclimatacin al 100% de supervivencia fue con
la aplicacin de ceras. La induccin de embriognesis somtica se obtuvo con tejido
nucelar de aguacate cv. Hass, se gener callo embriognico (MS 50%, 4 mg/I
de picloram y 0.4 mg/1 de AIB), multiplicacin de masas proembriognicas (MS 100%,
sin reguladores de crecimiento), desarrollo de embriones somticos (MS,
con 400 mg/1 de casena hidrolizada), maduracin de embriones somticos (MS, con 20
g/I de agar-agar), y la germinacin de stos (10%) bajo un cultivo de dos fases:
primero en un medio bajo en nitratos y sin reguladores; y posteriormente en medio
MS con 0.3 mg/1 de BA.
PALABRAS CLAVE: Organognesis, embriognesis somtica, aguacate,
reguladores de crecimiento.
vii
SUMMARY
The effect of plant growth regulators on morphogenesis of avocado was studied. The
organogenesis was established with axillary buds of avocado Mexican race (Persea
americana Mill. var. drymifolia), the sprout buds in MS 20%, with BA and IBA at 2 and
0.2 mg/1 each, while a multiple budding was obtained in MS 100% and BA 0.3 mg/I;
sprouts rooting were 44.4% with IBA at 0.4 mg/l; the acclimatization at 100% survival
was obtained with wax foliar applied. Somatic embryogenesis was induced with
nucellar tissue of cv. Hass avocado, embryogenic callus was obtained (MS 50%,
4 mg/l of picloram and 0.4 mg/1 of IBA), proembryogenic masses multiplication (MS
100%, without plant growth regulators), developed somatic embryos (MS with
hydrolyzed casein 400 mg/I); mature embryos (MS with agar-agar 20 g/I), and the
embryos germination was 10%, with two phase culture: first in a Iow nitrate medium
without regulators; and after culturing in MS with BA 0.3 mgll.
KEY WORDS: Organogenesis, somatic embryogenesis, avocado, plant growth
regulators.
viii
I. INTRODUCCIN
Por el tipo de polinizacin cruzada altamente heterocigtica que tiene el
aguacate (Persea americana Miller), en el sistema comn de reproduccin masiva no
se garantiza la pureza gentica del patrn o portainjerto, solamente del injerto, por su
incremento vegetativo con la utilizacin de tejido somtico. De ah que resulte
imposible a travs de la semilla multiplicar portanjertos sobresalientes por sus
caractersticas agronmicas, desde el punto de vista de la perpetuacin de los genes
deseables.
El germoplasma de aguacate que se ha seleccionado por su tolerancia a
enfermedades de la raz, como Phytophthora cinnamomi Rands (Khne, 1992)
tradicionalmente se ha propagado con la tcnica de Frolich (Frolich y Platt, 1972), un
procedimiento que requiere un injerto en patrn nodriza y etiolacin del brote a
enraizar.
El aguacate presenta enfermedades severas que en casos extremos provocan
la muerte del rbol y en general, disminucin en la produccin que llega a alcanzar el
14% y una reduccin en la calidad en un 10% (SAGAR-INIFAP, 1996). Las de mayor
importancia econmica son seis: la antracnosis Colletotrichum gloeosporioides Penz,
roa Sphaceloma persea Jenkins, anillamiento causado por el complejo de bacterias y
hongos Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Corynebacterium sp., Alternara sp.,
Diplodia sp., Dothiorella sp. y Pestalotia sp., tristeza P. cinnamomi, cncer de tronco
y ramas Fusarium epishaeria Snyder y Hansen, P. boehmeriae Sawada y Nectria
galligena Snyder y Hansen, y enfermedades de postcosecha Diplodia natalensis Pole
evans, Rhizopus nigricans Ehr., Alternaria sp., Verticillum sp., Fusarium roseum
Snyder y Hansen, Colletotrichum gloeosporioides Penz y Sphaceloma persea
Jenkins (Vidales, 2001 b).
2
La obtencin de un cultivar de aguacate resistente a enfermedades es urgente
y necesaria, sto con la finalidad de evitar una catstrofe por la vulnerabilidad
gentica que pudiera presentar el cultivar (cv.) Hass, ya que en la zona productora
del estado de Michoacn se depende en un 99% de este genotipo; as, con la
generacin del nuevo cultivar se busca tambin disminuir los costos de produccin y
reducir en gran medida la contaminacin del ambiente, ya que solamente para el
control de la antracnosis se realizan de 5 a 7 aplicaciones de fungicidas al ao, cuyo
costo flucta entre los 7 mil y 10 mil pesos por hectrea, y se emiten en la regin
productora de aguacate aproximadamente 500 ton de productos qumicos en la
prevencin y control del patgeno.
Por otra parte, la colecta y conservacin de germoplasma es urgente y
necesaria para recuperar los genes que se requieren en la formacin de nuevos
cultivares de aguacate; instituciones como INIFAP y CICTAMEX han realizado
esfuerzos importantes en la colecta y conservacin en campo, sin embargo el
mantenimiento de las colecciones demandan grandes erogaciones en mano de obra
y espacio, adems de que estn sujetas a altos riesgos de prdida debido a
enfermedades, plagas y alteraciones del medio ambiente entre otras.
La biotecnologa es una herramienta que se puede emplear para la obtencin
de un cultivar resistente a enfermedades, bien sea mediante la formacin de un
organismo transgnico o al generar variacin somaclonal, en donde estn presentes
las mutaciones, los cambios epigenticos y el efecto del rejuvenecimiento fisiolgico;
sin embargo, para utilizar estos mecanismos de mejoramiento gentico in vitro se
requiere el sistema de regeneracin de una planta completa a travs de
embriognesis somtica y el sistema de organognesis que permita la multiplicacin,
el enraizamiento y la aclimatacin de los genotipos transformados o seleccionados.
Con el cultivo de tejidos vegetales in vitro se proporcionan ventajas de calidad
sanitaria en la produccin de planta de aguacate al ser utilizada como portainjerto o
injerto, se disminuye el tiempo para propagar un genotipo sobresaliente y se
3
garantiza la similitud gentica del material parental, por reproduccin clonal. Adems
de las facilidades que ofrece este procedimiento en el mejoramiento gentico y en la
preservacin de germoplasma, la donacin puede lograrse por injerto, enraizamiento
de estacas, micropropagacin o embriognesis somtica (Bonga y Von Aderkas,
1992). La conservacin in vitro es una opcin para mantener el conjunto de genes
con menor riesgo, en forma ms econmica, disponibles para su utilizacin en
cualquier poca del ao y con alta seguridad sanitaria (Maruyama et al., 1996); no
obstante para lograrlo se demanda en primera instancia la definicin de un sistema
de regeneracin de plantas altamente eficiente y posteriormente trabajar en los
factores que influyen en el crecimiento y desarrollo del explante.
Un sistema de regeneracin in vitro, bien sea a travs de organognesis o
embriognesis somtica, requiere de manera especfica la definicin de los
componentes de los medios de cultivo para sus diferentes etapas, por ser
determinantes en el crecimiento y desarrollo celular; las hormonas o reguladores de
crecimiento vegetal (auxinas, citocininas, giberelinas, etileno y cido abscsico) son
muy importantes en los procesos de crecimiento o diferenciacin (Salisbury y Ross,
1994) o en todos los aspectos del desarrollo (Klee y Estelle, 1991; Davis, 1995);
stas son responsables en primer lugar de la distribucin de los compuestos que la
planta biosintetiza y tambin determinan el crecimiento relativo de todos los rganos
de la planta.
En los procesos de morfognesis in vitro son elementales las auxinas, las
citocininas y las giberelinas, ya que estimulan la elongacin y divisin celular, segn
la combinacin y concentracin de stos. Los reportes de regeneracin n vitro,
indican que la respuesta del tejido depende del tipo de regulador de crecimiento y la
dosis utilizada, la cual es diferente para cada especie vegetal, por lo que no existe
una regla general para una respuesta morfogentica.
Como respuesta a un balance en la cantidad entre auxinas y citocininas, se
regula la dominancia apical o bien el crecimiento lateral; el efecto de la auxina sobre
4
la diferenciacin vascular est bien establecido, la auxina afecta la formacin de
xilema, ya que las plantas sobreproductoras de auxina contienen ms elementos de
xilema, aunque las clulas son pequeas; al incrementar la concentracin de auxinas
se estimula la formacin de races adventicias, pero la sobreproduccin de esta
hormona puede llevar a un crecimiento epinstico de las hojas, debido a la induccin
del etileno, adems de que las hojas son generalmente pequeas y ms estrechas
que las no tratadas. Una baja produccin de auxina, en contraste, conduce a un
arrugamiento de la hoja, debido a un incompleto desarrollo del sistema vascular en
relacin al resto de la hoja (Klee y Estelle, 1991). Lo anterior indica que existe una
interaccin entre hormonas, y que tanto la sobreproduccin como la deficiencia
influyen en la formacin precisa de clulas y tejidos de la planta.
Con base en la carencia de un protocolo comn de regeneracin in vitro para
todas las plantas, es necesario continuar con investigaciones en diversas especies
vegetales, sobre todo en aquellas donde no se han encontrado las condiciones
ptimas del cultivo, para lograr procesos de organognesis o embriognesis
somtica in vitro y as ofrecer un conocimiento ms amplio que lleve a definir cules
son los factores determinantes en la regeneracin de plantas in vitro.
Tal es el caso del aguacate, en el cual no ha sido posible optimizar la
regeneracin in vitro en muchos de sus cultivares comerciales, por lo tanto en la
presente investigacin se plante utilizarlo como una planta modelo que permitiera
avanzar en el conocimiento de la respuesta morfogentica in vitro con la aplicacin
de reguladores de crecimiento, particularmente en los procesos de organognesis y
embriognesis somtica. El establecer sistemas de regeneracin in vtro de esta
planta, permitira la obtencin de material bajo conservacin in vitro, de plantas
mejoradas con alguna caracterstica agronmica importante y de la propagacin
masiva de injertos y portainjertos homogneos (clonas).
5
Hiptesis
En base a lo anterior, en el presente estudio se parti de la siguiente hiptesis
de trabajo:
Al aplicar diferentes dosis y tipos de reguladores de crecimiento a cultivos
(tejidos) in vitro de aguacate, ser posible activar la capacidad de regeneracin de
plantas por los procesos de organognesis y embriognesis somtica.
As, los objetivos que se plantean son:
Objetivos
Objetivo general
Evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la induccin y
desarrollo de la organognesis y embriognesis somtica en aguacate.
Objetivos especficos
1. Determinar los procedimientos de desinfeccin y reduccin de necrosis de
microestacas y frutos, para el establecimiento ptimo de los cultivos in vitro de
yemas axilares de aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass,
respectivamente.
2. Evaluar el efecto de diferentes tipos y dosis de auxina, citocinina y giberelina
sobre la induccin, multiplicacin y enraizamiento de brotes de las yemas
axilares de aguacate criollo.
6
3. Determinar la influencia del tipo y dosis de auxinas, citocninas, giberelinas y
cido abscsico (ABA) y otros componentes de los medios de cultivo para la
generacin de callo embriognico, multiplicacin, desarrollo, maduracin y
germinacin de embriones somticos.
3. Establecer las condiciones ptimas de cultivo durante el transplante y
aclimatacin de plntulas de aguacate obtenidas in vitro, que permita el mayor
porcentaje de supervivencia y lograr plantas aclimatadas en el menor tiempo
posible.
7
II. REVISIN DE LITERATURA
2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento
Son compuestos orgnicos -diferentes de los nutrimentos- que en pequeas
cantidades, fomentan, inhiben o modifican de alguna forma cualquier proceso
fisiolgico vegetal (Weaver, 1990). Las hormonas vegetales se sintetizan en alguna
parte de la planta y se translocan a otra, en donde concentraciones muy bajas
causan una respuesta fisiolgica, que promueve diferentes tipos de crecimiento; en
la actualidad, las auxinas, citocininas, giberelinas, inhibidores y retardadores del
crecimiento, etileno, cido saliclico, triacontanol, brasinoesteroides, turgorinas y
poliaminas, son consideradas dentro del grupo de hormonas y reguladores de
crecimiento (Salisbury y Ross, 1994).
2.1.1. Auxinas
El cido indolactico (AIA) fue la primera auxina natural identificada, y hoy es
considerada la principal auxina en plantas, otras auxinas naturales han sido
identificadas, se incluye al 4-CI-AIA y cido indolbutrico (AIB). Existen auxinas
sintticas, tales como el cido 2,4-d i cl orofenoxi actico (2,4-D) y cido naftalenactico
(ANA), las cuales en bioensayos inducen efectos similares a las auxnas naturales. Al
usar diversas concentraciones de auxina se ha demostrado que existen diferencias
en la sensibilidad a esta hormona (Sitbon y Perrot-Rechenmann, 1997).
La auxina es la hormona vegetal que influye en numerosos aspectos del
crecimiento y desarrollo (Chen et al., 1998; Guilfoyle et al., 1998), se incluye el
desarrollo vascular, iniciacin de races laterales, dominancia apical, fototropismo,
gravitropismo, embriogness, maduracin de frutos (Hobbie et al., 1994; Davis,
1995; Macdonald, 1997), senescencia, abscisin, floracin, elongacin y divisin
celular (McClure et al., 1989; Hooley, 1998; Eckardt, 2001).
8
Los efectos de las auxinas son generalmente divididos en dos principales
categoras: respuesta rpida tal como la elongacin celular, sta es una de las
respuestas hormonales ms rpidas conocidas con un periodo latente de 10 a 25
minutos; y respuestas de trmino largo tal como la divisin celular, diferenciacin, y
morfognesis con un perodo latente de horas o das (Theologis, 1986). La iniciacin
de la divisin celular ocurre de 10 a 24 horas despus del tratamiento con auxina y la
diferenciacin de clulas vasculares en 3 das (Macdonald, 1997).
El AlA se sintetiza a partir de compuestos tipo indol y las evidencias indican
que el AlA se produce a partir del aminocido triptofano. Con plantas mutantes de
Arabidopsis, deficientes o que sobre expresan la sntesis de auxina, se ha revelado
que hay rutas de sntesis independientes de triptofano (Leyser, 1997). Esta y otras
investigaciones aseguran que esta auxina puede tambin producirse por una
variedad de rutas metablicas que son activadas por varas seales del desarrollo o
del ambiente. Las ms importantes son las vas metablicas del corismato y
antranilato, dos rutas metablicas secundarias importantes en plantas, aunque la ruta
de biosntesis de AlA aun se desconoce (Dolan, 1998; Normanly y Bartel, 2000).
Tambin se ha elucidado que el nivel de la auxina en los tejidos vegetales se
determina no solamente por la sntesis, sino por el transporte y su metabolismo
(conversin, conjugacin, desconjugacin y catabolismo). Con las tcnicas de
cuantificacin de compuestos marcados (radioistopos), es posible monitorear en
plantas mutantes o transgnicas, el metabolismo del AlA (Normanly, 1997). Esta
hormona es activada primeramente como cido libre y los niveles endgenos son
controlados in vivo a nivel de sntesis, conjugacin y degradacin. Estos procesos
pueden llevarse a cabo por la conjugacin con azcares, aminocidos y pequeos
pptidos; y por la oxidacin del grupo indol, enzimticamente (AIA-oxidasa) o por luz
ultravioleta (UV) (Ostin et al., 1998).
La produccin de la auxina se ha demostrado que ocurre primordialmente en
los pices meristemticos de tejido verde (tallos, primordios de hoja y hojas jvenes).
9
Aunque se encuentra en grandes cantidades en pices radicales, flores, frutos,
semillas y otras partes vegetativas, las evidencias indican que no se producen all,
sino que son transportadas por los haces vasculares. El movimiento de la auxina
tanto en tallo como en raz es lento (aprox. 1 cm/h), polar o unidireccional: hacia la
base (basiptalo) en tallos y hojas y hacia el pice (basiptalo) en races (Lomax et
al., 1995). A diferencia de los fotosintatos y otros solutos, que se transportan a travs
de los conductos como xilema y floema, el AlA es conducido va clulas
parenquimatosas del floema y que rodean los tejidos vasculares. De esta manera, las
auxinas pueden ser transportadas por difusin de clula a clula, crendose un flujo
unidireccional. Adems, el transporte de auxinas ocurre de clula a clula en la
regin del cambium vascular (Jones, 1998; Raven et al., 1999).
El transporte polar de la auxina juega un papel importante en los procesos de
crecimiento regulados por esta hormona y en la formacin del cotiledn durante el
desarrollo del embrin (Liu et al., 1993; Estelle, 1998). Ensayos de transporte de
auxina han sido usados para mostrar que los hipocotilos de embriones maduros
disectados de semillas de gimnospermas y angiospermas muestran un pronunciado
transporte polar de la auxina hacia el final de la raz indiferentemente de su
orientacin y, que este transporte es completamente bloqueado por cido 2,3,5-
triyodobenzoico (TIBA) (Cooke y Cohen, 1993). El papel del transporte polar de auxina
en embriognesis somtica fue estudiado tambin por Schiavone y Cooke
(1987) en embriones somticos de zanahoria con TIBA y un inhibidor de transporte
de auxina diferente, el cido N-1-naftilftalmico (NPA); ambos inhibidores a una
concentracin de 1 M fueron eficientes para bloquear la capacidad de la
embriognesis somtica. El NPA acta al romper la respuesta trpica, reducir la
dominancia apcal, inhibir la formacin de yema floral y de raz lateral (Estelle, 1998).
Cuando plntulas de Arabidopsis thaliana crecieron en luz sobre medio que contena
1.0 m de NPA, se inhibi la elongacin de hipocotilo y de raz, y el gravitropismo; sin
embargo, cuando crecieron en la oscuridad, el NPA rompi la respuesta a la gravedad
pero no afect la elongacin (Jensen et al., 1998).
10
Uno de los mejores estudios de respuesta de auxina es la rpida elongacin de
secciones disectadas de coleoptilo, tallo o hipocotilo. De acuerdo a la hiptesis de
crecimiento cido, la elongacin celular en secciones del tallo es debida a la
acidificacin inducida por auxina en la pared celular (Rayle y Cleland, 1992; Hobbie
et al., 1994). Estos ltimos autores mencionan que fue demostrado que la aplicacin
de auxina a tallos intactos de chcharo puede tambin inducir elongacin, este
resultado in vivo sostiene la relevancia fisiolgica de la auxina durante el crecimiento
o elongacin, sin embargo, es poco claro como un crecimiento cido contribuye a la
elongacin inducida por auxina in vivo. Asimismo, indican que existe la idea de que la
acidificacin de la pared celular es causada por la activacin de la H
+
-
ATPasa en la
membrana plasmtica y que concentraciones fisiolgicas de auxina (<M) incrementan
la actividad de esta enzima en coleoptilos de maz. Este incremento en la actividad de
la H
+
-
ATPasa resulta en un incremento en el flujo de protones y por eso un mayor
potencial negativo en la membrana celular (hiperpolarizacin), sin embargo las
auxinas inactivan tambin la hiperpolarizacin producida en este sistema,
presumiblemente al activar la H
+
-ATPasa. Como las auxinas inactivas no inducen
crecimiento o elongacin, este resultado sugiere que slo la activacin de la H
+
-
ATPasa no es suficiente para explicar ese efecto.
Aunque hay reportes de que la auxina por s sola no es la responsable de la
elongacin, la teora cida es la ms aceptada (Keller y Volkenburg, 1998).
La dominancia apical se explica por la auxina producida en el meristemo
apical y transportado basipetalmente a los tejidos blanco, donde inhibe el crecimiento
de las ramas laterales (Jensen et al., 1998). En plantas leosas, las auxinas
promueven la actividad del cambium vascular, estimulan la divisin celular, se
expanden las yemas por el movimiento de la auxina hacia los tallos y se forma tejido
vascular secundario, que da como resultado la brotacin lateral (Rayen et al., 1999)
11
El papel de la auxina en la elongacin celular y su posible interaccin con
etileno y giberelina fue estudiada en el hipocotilo de Arabidopsis, cuando plntulas de
tipos silvestres cultivadas sobre medio que contena distintas concentraciones de
auxina, el crecimiento del hipocotilo se inhibi, sin embargo, cuando los mutantes
axr1-12 y 35S-iaaL (los cuales tienen reducida respuesta a auxina) crecieron en las
mismas condiciones, la auxina fue capaz de promover el crecimiento del hipocotifo
(Collett et al., 2000). Estos mismos investigadores indican que cuando la respuesta a
etileno fue reducida usando los mutantes resistentes a etileno etr1 o el compuesto
aminoetoxivinilglicina (un inhbidor de la sntesis de etileno), las respuestas a la auxina
fueron inalteradas o iguales, se indica que la auxina no inhibi la elongacin
del hipocotilo por medio de etileno. En relacin a las pruebas sobre las interacciones
entre auxina y giberelina, las mutantes de auxina crecieron sobre medio que contena
giberelina y las mutantes de giberelina crecieron sobre medio con auxina; la
respuestas encontradas son las mismas a las plntulas de tipo silvestre en todos los
casos; en suma, 1 M del inhibidor de transporte de la auxina NPA no altera la
respuesta de las plntulas de tipo silvestre a giberelina; dobles mutantes fueron
hechos entre mutantes de giberelina y auxina y los fenotipos de stos parecen
aditivos; estos resultados indican que la auxina, la giberelina y el etileno actan
independientemente en la elongacin del hipocotilo.
Una de las aplicaciones prcticas de las auxinas es la estimulacin de la
formacin de races adventicias en segmentos disectados de plantas, lo que las ha
hecho comercialmente importantes. Las auxinas estn involucradas tambin en la
formacin de frutos y en la formacin completa de las semillas. Actualmente se ha
estudiado el papel de las auxinas en las respuestas de defensa de las plantas, se
evidencia su accin en plantas enfermas por patgenos, enfermedades y por
factores del ambiente (estrs hdrico, por altas y bajas temperaturas, etc.) (Rayen et
al., 1999; Zolman et al., 2000).
12
2.1.2. Citocininas
En 1948, Skoog y Tsui descubrieron que la adenina junto con fosfato no slo
contrarrest los efectos inhibitorios de auxina sobre el crecimiento de la yema, sino
que promovi la formacin de yemas y aument el crecimiento de tejido de callos. En
el ao 1955, Miller y col., basados en los resultados de boensayos con tabaco,
obtuvieron de levadura (Saccharomyces cerevisiae) una pequea cantidad del factor
citocinina altamente activo concentrado, el cul aunque no identificado, muestra las
propiedades de una purina; fue descubierto que el ADN degradado de esperma de
arenque y autoclaveado fueron las dos fuentes de actividad de la citocinina; la
estructura qumica del material aislado (p.e. cinetina o 6-furfurilaminopurina) fue
deducido de la composicin elemental (C
10
H
9
N
5
O) y de la degradacin de productos
(adenina y cido levulnico); aunque la cinetina posteriormente demostr ser un
artificio que surge espontneamente en las preparaciones de ADN de
deoxiadenosina, su eficacia como citocinina en muy bajas concentraciones fue
irrefutable, y sta es ampliamente usada como citocinina sinttica en nuestros das
(Minorsky, 2001).
Las citocininas permanecen como uno de los grupos ms misteriosos de las
hormonas vegetales, tienen una estructura qumica simple (N
6
-sustituto derivados de
adenina) e influyen en una gran variedad de eventos diferentes (Mikiashevichs y
Walden, 1997). La citocinina ms activa encontrada naturalmente en plantas, fue
denominada zeatina (ZEA), ya que fue aislada por primera vez de mazorcas de maz.
Se encuentra principalmente en tejidos de alta divisin celular, se incluyen semillas,
frutos, hojas, meristemos radicales, y en la savia de cortes realizados en plantas.
Debido a que los estudios en plantas han revelado que el papel fisiolgico de las
citocininas est ntimamente relacionado con la presencia o ausencia de las auxinas,
stas son aplicadas de manera comercial para modificar algunos efectos de las
auxinas, como la dominancia apical y la germinacin de yemas o semillas.
13
Las citocininas estn involucradas en el retraso de la senescencia de hojas, ya
que con una aplicacin exgena de stas en hojas que han iniciado amarillamiento,
se previene su cada natural. Las evidencias revelan que debido a la ruptura de tejido
vascular entre las hojas y el tallo principal, se evita el transporte de citocininas, las
cuales se acepta que son sintetizadas en los meristemos de las races y se
transportan por xilema hacia la parte area vegetal (Rayen et al., 1999).
Otras investigaciones han demostrado que la concentracin de auxinas
aunado a la de citocininas, es la responsable de los primeros eventos de la
morfognesis, ya que en clulas que presentan alta tasa de divisin celular, que
permanecen sin diferenciarse (clulas meristemticas), se han encontrado altos
niveles de citocininas y en aquellas que sufren elongacin celular (clulas en proceso
de diferenciacin), el nivel ms alto lo presentan las auxinas. En cultivos in vitro, se
ha generalizado el uso de alta concentracin de auxinas para la formacin de races
en tejidos no diferenciados y, al adicionar una alta concentracin de citocinina se
determina la formacin de brotes adventicios; en concentraciones iguales, el callo
continua proliferando sin presentar eventos de morfognesis (Rayen et al., 1999). Sin
embargo, el tejido in vitro presenta diferencias en su capacidad de respuesta, por la
cantidad endgena de las hormonas y a las protenas receptoras que existan en las
plantas, es variable en genotipo, edad, parte de la planta y etapa fenolgica. Por lo
tanto, es necesario realizar estudios que lleven a conocer el tipo y dosis de
reguladores de crecimiento para cada tipo de planta o especies, como modelo para
la aplicacin en diferentes razas, cultivares o variedades.
La aplicacin de una dosis baja de citocinna a la yema apical de plantas que
crecieron en das cortos es otro tratamiento no inductivo que causa varios eventos
normalmente observados en el meristemo despus de la induccin del fotoperiodo de
floracin, tal como un incremento en la proporcin y sincronizacin de la divisin
celular (Bernier et al., 1993); estudios de efectos causados por la aplicacin exgena
de citocininas o, la expresin de genes bacteriales involucrados en la biosntesis de
citocinina revelan que ellas interactan con otras hormonas, en el control de la
14
divisin celular, la morfognesis y el crecimiento de yemas laterales (Davies, 1995;
Cline, 1996), la iniciacin y crecimiento de brotes, la senescencia de la hoja y el
desarrollo fotomorfognico (Brandstatter y Kieber, 1998).
Las citocininas liberan a las semillas de la dormancia y a las yemas axilares de
la dominancia apical, adems de que retrasan la senescencia de las hojas (Brault et
al., 1997); estas hormonas participan en el control de la divisin celular y
diferenciacin, en bioensayos de cultivo de tejidos, los efectos de las citocininas
estn bien definidos (Mok y Mok, 2001), ellas controlan la diferenciacin de
cloroplastos por incremento de la expresin de genes nucleares que codifican
protenas de cloroplasto; estn involucradas adems en la regulacin de la expresin
de genes importantes como el gene de la subunidad pequea de la enzima ribulosa
1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) o el gene de la nitrato reductasa (Lu et al., 1990;
Brault et al., 1997).
Dewitte y col. (1999) estudiaron el papel de las citocininas en los procesos de
desarrollo tales como: iniciacin foliar, induccin floral y formacin de flores; para tal
efecto consideraron la distribucin de las citocininas en pices de brotes de tabaco
(Nicotiana tabacum L.) en distintas fases del desarrollo al utilizar inmunocitoqumica
unida a espectometra de masas cuantitativa; en contraste a los pices vegetativos y
yemas florales, detectaron bases de citocinina libre (zeatina, dihidrozeatina, o
isopentiladenina) en pices de transicin preflorales; adems observaron una
disminucin de 3 veces en el contenido de ribsidos de citocinina (ribsido de
zeatina, ribsido dihidrozeatina e isopentiladenosina) durante esta fase de transicin;
estos investigadores concluyeron que la formacin de rganos (p.e. hojas y flores)
est caracterizada por un incremento en el contenido de citocinina, en contraste a los
muy bajos niveles de citocinina endgena encontrada en pices de transicin prefloral,
los cuales no demostraron organognesis. Los anlisis inmunocitoqumicos
revelaron disentimiento o no estar de acuerdo con la localizacin intracelular de las
bases de citocinina; la dihidrozeatina e isopentiladenina estuvieron principalmente en
el citoplasma y en el perincleo, mientras la zeatina mostr un claro corte de marcaje
15
nuclear; las citocininas no parecen actuar como efectos positivos en la fase de
transicin prefloral en pices de brotes de tabaco, adems, las diferencias en la
distribucin a nivel celular pueden indicar un papel fisiolgico especfico de zeatina
en los procesos del ncleo.
El tidiazuron (TDZ) es entre las substancias denominadas citocininas la ms
activa en el cultivo de tejidos de plantas leosas, lo cual facilita la eficiencia de la
micropropagacin de muchas especies leosas recalcitrantes. Bajas concentraciones
(<1M) pueden inducir una gran proliferacin axilar en comparacin con otras
citocininas, sin embargo, TDZ puede inhibir la elongacin de los brotes, en algunos
casos es necesario transferir brotes a un medio de elongacin con un bajo nivel de
TDZ y/o una menor actividad de la citocinina. En concentraciones mayores a 1 M, el
TDZ puede estimular la formacin de callos, brotes adventicios o embriones
somticos y el subsiguiente enraizamiento de microbrotes puede ser afectado o
ligeramente inhibido por una exposicin previa a TDZ (Huetteman y Preece, 1993).
En relacin a la sntesis de citocinina se tiene que en conversiones entre
bases de citocinina, nuclesidos y nucletidos, generalmente las interconversiones
involucran enzimas comunes al metabolismo de las purinas, estas enzimas
usualmente tienen alta afinidad para adenina, adenosina y AMP; por ejemplo, la 5'-
nucleotidasa del germen de trigo y tomate convierte AMP a adenina y nucletidos de
citocinina a bases de citocinina pero tienen alta afinidad a AMP (Mok y Mok, 2001).
Estos investigadores en su revisin mencionan que el conocimiento de la biosntesis
de citocinina en plantas es muy limitado, generalmente es asumido que i
6
Ade y
zeatina tienen un origen comn y que el primer producto de la biosntesis es i
6
AMP,
aunque esta ruta metablica parece lgica, particularmente en el conocimiento de la
accin del gene ipt de Agrobacterium tumefaciens.
Por muchos aos, ha sido sujeto de debate el ARNt como una fuente de
citocinina; mediciones de la descomposicin de ARNt indican que este proceso
puede contribuir arriba del 50% de las citocininas libres; frecuentemente
16
encontramos argumentos en contra de que el ARNt es una considerable fuente de
citocinina en el hecho que cis-zeatina es la principal citocinina en el ARNt, sin
embargo, este problema puede ser potencialmente resuelto por la isomerizacin de
cis-zeatina a trans-zeatina por cis-trans isomerasas; otra objecin es la naturaleza
general de la descomposicin del ARNt, que ocurre en todos los tejidos, mientras la
produccin de citocinina se localiza en las puntas de la raz, meristemos de los
brotes y en semillas inmaduras, y debe ser altamente regulado (Mok y Mok, 2001).
Brandstatter y Kieber (1998) describen el anlisis de dos genes homlogos,
ibc6 y ibc7 (inducidos por citocinina), que son inducidos minutos despus de la
exposicin a citocinina exgena; esta rpida induccin, acoplada con la insensibilidad
de induccin a ciclohexamida y la especificidad de la induccin por citocininas,
sugiere que ibc6 y ibc7 pueden ser genes de respuesta primaria a citocinina, las
secuencias de ibc6 y ibc7 son similares a dos componentes reguladores de
respuesta bacteria, estos resultados sugieren que ibc6 y ibc7 pueden estar
involucrados en una etapa temprana de sensibilidad a citocinina.
Existen una serie de mutantes identificados en Arabidopsis para citocininas,
tales como: amp1 con elevado nivel de citocinina, el stp1 y cyr1 resistentes a
citocinina y, cki1 y cki2 mutantes que proliferan y producen brotes en ausencia de
citocinina; ckil fue incapaz de producir races y flores normales y fue estril, mientras
cki2 fue capaz de crear semillas, al formar callo tuvo la habilidad de crecer y formar
brotes en ausencia de citocinina; el msh mutante que tambin forma muchos brotes
en ausencia de citocinina pero no prolifera rpidamente (Miklashevichs y Walden,
1997). Sin embargo, por la carencia de mutantes biosintticos y de sealizacin, el
papel regulador de las citocininas no est bien entendido; por ingeniera gentica se
logr la expresin de la citocinina oxidasa en plantas de tabaco transgnico para
reducir su contenido de citocinina endgeno, las plantas deficientes en citocinina
desarrollaron brotes cortos con pequeos meristemos apicales y la produccin de
clulas de la hoja fue solo del 3-4% respecto al tipo silvestre, al indicar un absoluto
requerimiento de citocininas para el crecimiento de la hoja; en contraste, los
17
meristemos radicales de las plantas transgnicas fueron agrandados y dieron
elevado crecimiento rpido y ms ramificacin de races, estos resultados sugieren
que las citocininas son un importante factor regulador de la actividad del meristemo
de la planta y morfognesis, con papel contrario en brotes y races (Werner et al.,
2001).
2.1.3. Giberelinas
Las giberelinas se descubrieron por primera vez en Japn por Kurosawa en
1926, un fitopatlogo que estudi las enfermedades en arroz, especficamente la
nombrada como "bakanae" (plntula loca), las plntulas afectadas tenan una altura
que superaba en un 50% o ms a las de las plantas sanas, pero formaban menos
semillas; la enfermedad era provocada por un hongo ascomiceto (Giberella fujikuroi
forma sexual y Fusarium moniliforme etapa asexual); Kurosawa demostr que la
causa era una sustancia termoestable y junto con sus colegas bosquej las
propiedades qumicas del material activo (Weaver, 1990). En la dcada de 1930,
Yabuta y Hayashi aislaron un compuesto activo del hongo, al que denominaron
giberelina (Salisbury y Ross, 1994).
Las giberelinas son una familia de compuestos terpenoides los cuales regulan
muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de plantas, se incluye la germinacin de
la semilla, elongacin del tallo y peciolo, expansin foliar, floracin, crecimiento de
semillas y fruto (Hooley, 1994; Blzquez et al., 1998; Hedden, 1999).
Estas hormonas vegetales han sido implicadas en el control de la floracin en
varias especies. En Arabidopsis, una severa reduccin de giberelinas endgenas
retrasa la floracin en das largos y evita la floracin en das cortos (Blzquez et al.,
1998), estos investigadores estudiaron como los efectos diferenciales de las
giberelinas sobre floracin correlacionan con la expresin de LEAFY, un gen de
identidad del meristemo floral. Ellos encontraron que el fracaso de mutantes ga1-3
deficientes en giberelina para florecer en das cortos, fue paralelo a la ausencia de la
18
induccin del promotor LEAFY. Una conexin causal entre esos dos eventos fue
confirmada por la habilidad de un transgene LEAFY expresado constitutivamente
para restaurar la floracin en mutantes ga-1 en das cortos; en contraste a das
cortos, el deterioro de la biosntesis de giberelina caus simplemente una reduccin
de la expresin LEAFY cuando las plantas crecieron en das largos o con sacarosa
en la oscuridad.
El efecto de la giberelina y del cido abscisico (ABA) sobre la muerte celular
fue estudiada por Bethke y col. (1999), en clulas de aleurona de cebada (cv.
Himalaya); los protoplastos de aleurona incubados en ABA permanecen viables en
cultivo por un mnimo de 3 semanas, pero expuestos a giberelina inician una serie de
eventos que resultan en muerte, ms del 70% de todos los protoplastos murieron
entre los 4 y 8 das despus de la incubacin en giberelina. La muerte ocurre despus
de que las clulas llegan a ser altamente vacuoladas, se manifest por una
abrupta perdida de integridad en la membrana del plasma seguida por una rpida
contraccin de la clula muerta. La hidrlisis del ADN inicia antes de la muerte y
ocurre cuando el protoplasto cesa la produccin de a-amilasa; la degradacin del
ADN no resulta en acumulacin de fragmentos discretos de bajo peso molecular, la
degradacin del ADN y la muerte celular fue evitada por LY83583, un inhibidor de
sealizacin de giberelina en aleurona de cebada; Bethke y col. (1999) concluyen
que la muerte celular en clulas de aleurona es hormonalmente regulada y esta es la
etapa final de un programa de desarrollo que fomenta el xito en el establecimiento
de un semillero.
Cowiing y Harberd (1999) realizaron experimentos en donde probaron la
hiptesis que la giberelina regula el crecimiento del hipocotilo al alterar la extensin
de la elongacin de la clula del hipocotilo; en estos estudios usaron mutantes de A.
thaliana (L.) Heyhn., deficientes en giberelina y de respuesta alterada a esta
hormona, demostraron que la giberelina regula la elongacin, en hipocotilos que
crecieron en luz como en oscuridad, se influyo en el promedio y la extensin final de
la elongacin celular, sin embargo, los hipocotilos que crecieron en luz y oscuridad
19
exhibieron marcadas diferencias en la relacin de respuesta a la dosis de giberelina.
La longitud de los hipocotilos que crecieron en oscuridad no es afectada por la
giberelina exgena, mientras que la longitud de los hipocotilos que crecieron en luz es
significativamente incrementada por la giberelina exgena; adems los anlisis
sugieren que la longitud del hipocotilo en el control de giberelina es cerrada a
saturacin en hipocotilos que crecieron en oscuridad, pero no en hipocotilos que
crecieron en luz. Los resultados muestran que un gran rango de longitudes del
hipocotilo se logra va la dosis dependiente de alteraciones reguladas por giberelina
en el rango de elongacin de clulas del hipocotilo individuales.
La difusin de cido giberlico (AG
1
, y AG
3
) desde el embrin, y la declinacin
en el contenido de ABA del endospermo, fue asociado con la induccin de la
expresin del gene a-amilasa (EC 3.2.1.1.) en aleurona de granos de trigo (Triticum
aestivum L. cv. Maris Huntsman) germinados a 25C; el escutelo parece ser el
principal sitio para la biosntesis del cido giberlico basado en (1) la abundancia de
AG 20-oxidasa en trigo, (2) el incremento en el contenido de giberelinas en la ruta
metablica temprana AG 13-hidroxilacin, y (3) la acumulacin de ent-kaureno en
granos embebidos en la presencia de un inhibidor ent-kaureno oxidasa; adems, la
iniciacin de la biosntesis de giberelina en el escutelo fue asociada con la induccin
de la expresin del gene de a-amilasa en el epitelio del escutelo, aunque los dos
eventos pueden no estar casualmente ligados (Appleford y Lenton, 1997).
De las 121 giberelinas que han sido identificadas en plantas y hongos,
relativamente pocas son consideradas que poseen actividad biolgica intrnseca, las
giberelinas bioactivas ms importantes para el crecimiento vegetativo y desarrollo
probablemente son AG
1
, y AG
4
, las cuales difieren en la presencia o ausencia,
respectivamente, de un grupo hidroxil en C-13 (Hedden, 1999).
Las giberelinas son productos de la ruta metablica diterpenoide y su
formacin es iniciada por la ciclizacin del comn C
20
precursor pirofosfato de
geranilgeranilo (GGPP). Este intermediario es sintetizado en plastidios a partir del
20
compuesto difosfato de isopentenilo, recientemente demostrado que deriva en estos
organelos a partir de 3-fosfato gliceraldehido y piruvato, ms bien que de cido
mevalnico, como previamente se asumi (Lichtenthaler et al., 1997).
En cultivo de tejidos vegetales, la ciclizacin de GGPP ocurre en proplastidios
y resulta en la formacin de un hidrocarbono, ent-kaureno, en dos etapas del proceso
que requiere la actividad de dos enzimas: CPS, la cual produce el compuesto
intermedio copa difosfato, y ent-kaureno cintasa; GGPP es slo el precursor de
carotenoides y es incorporado en la clorofila; el ent-kaureno es convertido a
giberelinas, bioactivo por una serie de reacciones de oxidacin, catalizadas por dos
tipos de enzimas. Las reacciones son catalizadas por monooxigenasa dependiente
de CitP450 y, en los brotes de tejidos de la mayora de las plantas, surge AG
12
y su
anlogo AG
53
13-hidroxilado; estos compuestos intermedios son metabolizados
adems por dioxgenasas solubles, la cual usa cido 2-oxoglutrico como un
cosubstrato; dos dioxigenasas son requeridas para convertir AG
12
y AG
53
por rutas
metablicas paralelas a los productos bioactivos AG
4
y AG
1
, respectivamente
(Hedden y Proebsting, 1999).
La ruta biosinttica de las giberelinas activas biolgicamente requieren la
accin de diterpeno ciclasas, mono-oxigenaras dependiente de citocromo P450 y
dioxigenasas dependiente de 2-oxoglutarato. Las dioxigenasas incluye a AG 20
oxidasa, 3-hidroxilasa y 2-hidroxilasa; la primera catlisis elimina el carbono-20, la
segunda catlisis la etapa final en la produccin de las hormonas de crecimiento
activo, la cul puede ser desactivada por la 2(3-hidroxilasa. Como una enzima
reguladora, la AG 20 oxidasa est siendo investigada como blanco por manipulacin
gentica de biosntesis de la giberelina; resultados con especies modelos indican que
cambios considerables en el contenido de giberelina y en la morfologa de la planta,
pueden ser obtenidos por la sobre-expresin de genes de la AG 20 oxidasa o al
reducir su expresin por introduccin de secuencias antisentido de ADN (Hedden,
1999).
21
La biosntesis de las giberelinas puede ser separada dentro de tres etapas de
acuerdo a la naturaleza de las enzimas involucradas y la correspondiente
localizacin en la clula: las terpeno ciclasas actuan en protoplastidios,
monooxigenasas asociadas con el retculo endoplasmtico y dioxigenasas
localizadas en el citosol (Rademacher, 2000). Este autor tambin menciona que
existen cuatro diferentes tipos de inhibidores de la biosntesis de giberelina, stos
son: (a) compuestos tipo onium, tales como cloruro de clormequat, cloruro de
mepiquat, clorfonium, y AMO-1618, los cuales bloquean las cclasas copalil-difosfato
sintasa y ent-kaureno sintasa, involucrada en las etapas tempranas del metabolismo
de giberelina; (b) compuestos con un heterociclo que contiene nitrgeno, p.e.
ancimidol, flurprimidol, tetciclasis, paclobutrazol, uniconazol-P e inabenfido, estos
retardadores bloquean a las monooxigenasas dependientes del citocromo P450, as
inhiben la oxidacin del ent-kaureno en el cido ent-kaurenoico; (c) estructura
simulada de cido 2-oxoglutrico, el cual es el co-substrato de dihidrogenasas que
cataliza las etapas tardas de formacin de giberelina, acilciclohexanediones, p.e.
prohexadione-Ca y trinexapac-etil y daminozida, bloquea particularmente la 3(3-
hidroxilacin; (d) 16,17-dihidro-AG
5
y estructuras relacionadas que probablemente
simulan al substrato precursor de giberelina de la misma dioxigenasa.
En Arabidopsis se han detectado cinco mutantes originales que presentan
enanismo como consecuencia de la deficiencia de giberelina (ag1-ag5); en la
mayora de los casos el crecimiento de los mutantes fue restaurado de manera
normal por la introduccin del gene de las plantas del tipo silvestre, dando inequvoca
evidencia que el gene cionado corresponde al locus mutante (Hedden y Proebsting,
1999).
2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento
En este apartado se analizan inhibidores, retardadores del crecimiento y
etileno. Los inhibidores son un grupo muy variado de compuestos que tienen
diferentes efectos biolgicos en las plantas. Hay procesos como la germinacin de la
22
semilla, la supresin del crecimiento de brotes y el letargo de las yemas que los
inhibidores controlan, al menos en parte. Entre stos se encuentran sustancias
orgnicas aromticas como fenoles, flavonoides fenlicos y cidos benzoicos,
adems el ABA, hormona inhibitoria muy difundida en el reino vegetal (Weaver,
1990).
El ABA es una hormona vegetal que naturalmente se acumula en las plantas
bajo condiciones de estrs por sequa (Zeevaart y Creelman, 1988), esta
acumulacin de ABA inicia el cerrado de los estomas, as reduce la planta el uso de
agua bajo condiciones de restriccin de agua disponible (Grossnickle y Folk, 1994),
induce la dormancia en semillas y yemas e inhibe la elongacin de la raz (Anderson
et al., 1994).
La presencia del ABA fue esencial para expresar la embriognesis potencial de
Picea glauca (Attree et al., 1991; Misra et al., 1993), se acept que pudo inducir la
resistencia a la deshidratacin en plantas, este fue el caso; el ABA fue un elemento
ms para enfatizar la relacin entre el agua y la embriognesis somtica (Linossier et
al., 1995).
Las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de las plantas micropropagadas
de Delphinium cv. Princess Caroline fueron estudiadas por Santamara y col. (1993),
las hojas producidas in vitro mostraron un pobre control de la prdida de agua, la
cul parece resultar de la respuesta restrictiva por el estoma y no de un pobre
desarrollo cuticular. Los estomas de las hojas producidas in vitro fueron ms grandes
y ms frecuentes que los producidos durante la aclimatacin; a pesar del hecho de
que el estoma aislado de la epidermis de las hojas producidas in vitro reduce su
apertura cuando se expone a tratamientos de reduccin de la turgencia, ellos no
cierran completamente. Esto, junto con una alta frecuencia estomtica
medianamente explica el pobre. control de la prdida de agua demostrada por las
hojas intactas producidas en cultivo cuando se exponen a aire seco; mientras las
hojas de las plantas aclimatadas demostraron casi un cierre completo con ABA,
23
bajos potenciales de agua, oscuridad y CO
2
, los estomas de las hojas producidas in
vitro reducen su apertura cuando se exponen a esos factores, pero solo a un lmite;
por eso, los estomas de las hojas cultivadas in vitro parecen ser parcialmente
funcionales, pero alguna alteracin fisiolgica o anatmica impide que ellos cierren
completamente; los estomas de las hojas producidas in vitro fueron particularmente
insensibles al ABA, lo cul parece estar en parte asociado con la alta concentracin
de citocininas en el medio de cultivo. En el largo plazo, esta insensibilidad estomtca
al ABA medianamente contribuye a la perdida de planta cuando las plntulas
micropropagadas son transferidas a suelo.
As podemos resumir que el ABA es una potente molcula que ciertamente
modifica el patrn estomtico, la prdida de agua por la planta y probablemente acta
para modificar el crecimiento de las hojas; la hormona es sintetizada en las hojas y en
las races de la planta y se puede mover libremente de la planta al suelo y del suelo a
la planta; puede slo moverse rpidamente por la planta en el xilema y el floema y
ordena la particin entre diferentes compartimentos en diversos tejidos como una
funcin del pH (Sauter et al., 2001).
Los retardadores del crecimiento de las plantas, son compuestos que retrasan
la prolongacin de los tallos, incrementan el color verde de las hojas y afectan
indirectamente la floracin sin provocar deformaciones; retrasan la actividad
meristemtica subapical que es la responsable de la elongacin de los tallos, entre
estos se tienen AMO-1618, Phosphon-D y cloromequat (CCC) (Weaver, 1990).
El etileno (C
2
H
4
) es producido por todas las plantas superiores y en trazas
interacta con otras hormonas vegetales, especialmente auxina. El etileno influye en
la maduracin de frutos, abscisin, rompimiento de la dormancia, floracin y
modificacin de la expresin del sexo (Beyer et al., 1984), provoca epinastia de las
hojas al promover el alargamiento de las clulas del lado superior e inhibe la
elongacin de tallos y races en dicotiledneas, induce la senescencia de las flores,
estimula fuertemente la formacin de flores femeninas en plantas de cucurbitceas y
24
en algunas especies interrumpe la latencia de las semillas; el desprendimiento de
hojas, flores y frutos implica interacciones entre auxinas, etileno y cido abscsico,
sin embargo, la promocin del crecimiento, las etapas iniciales de la produccin de
races adventicias y muchos otros efectos de las auxinas parecen ser independientes
de la produccin de etileno (Salisbury y Ross, 1994).
2.2. Bases moleculares de la accin hormonal
En 1986, Theologis menciona que el mecanismo primario de accin de las
hormonas vegetales en general, y de auxinas en particular, tipificado por el AlA,
continua sin clarificar a los 55 aos de investigacin intensa despus del
descubrimiento del AlA. En su artculo este mismo autor concluye que es evidente
que la auxina induce ARNm especfico en tejido de chcharo y soya. Esta rpida
induccin de ARNm se considera que interviene en la secrecin de H
+
y en la
elongacin celular, posteriormente el ARNm regulado indirectamente por auxina,
puede codificar para protenas asociadas con el sistema al conjugar aspartil por
auxina, cido 1-aminociclopropano-1-carboxlico (ACC) sintetasa, celulasas y otras
hidrolasas, o polipptidos necesarios para la divisin celular, diferenciacin o
iniciacin de meristemos adventicios (Theologis, 1986).
La mayora de los trabajos pioneros sobre la accin de las hormonas utilizaron
acercamientos que involucraron: 1. Escisin de un rgano y substitucin de ste con
alguna combinacin de hormonas; 2. Escisin de un rgano o tejido y crecimiento in
vitro; y 3. Aplicacin exgena de una hormona o inhibidor. Aunque las conclusiones de
estos estudios son correctas, el aprendizaje ha sido limitado. La aplicacin
exgena de cualquier material biolgico est sujeta a limitaciones de toma hacia
arriba, transporte, secuestro y metabolismo; adems, es difcil cuantificar la cantidad
de material activo dentro del tejido, por estas razones ha sido difcil establecer una
relacin directa entre una hormona y un proceso particular de desarrollo (Klee y
Estelle, 1991). Estos mismos autores indican que la biologa molecular y la gentica
desempean un papel importante en clarificar el conocimiento en la accin de las
25
hormonas, adems de que el desarrollo de estudios moleculares para estudiar la
accin de las hormonas vegetales ha sido acompaado por un aumento en el uso de
mutantes para estudiar los procesos de las hormonas en plantas, los beneficios son
varios: primero, la caracterizacin fenotpica de mutantes de hormonas puede dar
informacin sobre el papel de las hormonas en la fisiologa y desarrollo vegetal;
segundo, los mutantes pueden usarse para estudiar la bioqumica, biosntesis y
accin de las hormonas; finalmente, en algunas especies mutantes vegetales pueden
utilizarse para aislar y caracterizar los genes requeridos por procesos hormonales .
La generacin de un mutante est limitada a los medios para lograr
mutagnesis, a la viabilidad de los mutantes producidos y a un adecuado tamizado o
seleccin; actualmente, stas no son restricciones obvias a la mutagnesis vegetal.
Los mutantes pueden ser creados por tratamiento con rayos X o etilmetanosulfonato
(EMS), o bien, un gene marcador o reportero puede ser transportado fuera con uno
u otro elemento de transporte o el T -ADN de Agrobacterium; la mutagnesis qumica
permite la creacin de un gran nmero de mutantes independientes con relativa
facilidad, aunque los nmeros de mutantes con gene etiquetado pueden ser
comnmente limitados, ah es la oportunidad de aislar y caracterizar el gene marcado
relativamente simple; las complicaciones inician con el tamizado para un fenotipo
mutante deseado y la viabilidad de los mutantes producidos (Miklashevichs y
Walden, 1997).
Un mecanismo de accin de las hormonas que fue referido para animales, pero que
recibi mucho apoyo por botnicos, es el que describen Salisbury y Ross
(1994), explican que se inicia con la unin de la hormona primaria a una protena
receptora en la membrana plasmtica de una clula blanco, enseguida, el complejo
hormona-receptor activa una enzima de membrana cercana denominada fosfolipasa
C, misma que hidroliza al 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol, entre el glicerol y el fosfato
unido al carbono 1 de la porcin fosfatada del inositol, de tal forma que se libera
1,4,5-trifosfato de inositol (IP
3
) y diacilglicerol (DAG), estos dos compuestos son
activos y pueden provocar una cascada de respuestas. El IP
3
estimula la liberacin
26
de Ca
2+
vacuolar al citosol, que al incrementarse activa ciertas enzimas, se incluyen
varias protena cinasas. El DAG no es soluble en agua (por los dos cidos grasos
que an contiene), por lo que realiza su funcin dentro de la membrana plasmtica.
donde probablemente tiene gran movilidad; el DAG activa una enzima situada en la
membrana que se conoce como protena cinasa C, enzima que utiliza ATP para
fosforilar ciertas enzimas que regulan diversas fases del metabolismo, la fosforilacin
causa desactivacin en algunas enzimas y activacin en otras.
Rayen y col. (1999) indican que las hormonas interactan con protenas
especficas llamadas receptores, las cuales activan rutas de respuesta particulares.
As las hormonas operan como seales qumicas entre clulas, las clulas blanco
tienen mecanismos para (1) identificar la hormona especfica, (2) medir la cantidad
que est presente, (3) transferir esta informacin va rutas bioqumicas, y (4)
convertir la informacin en un conjunto complejo de cambios desarrollados. Las
clulas reconocen las hormonas vegetales al usar protenas llamadas receptores de
hormonas; cada protena receptora contiene un sitio de ligamiento de la hormona que
es especfico para una hormona en particular. El ligamiento de la hormona al receptor
activa una ruta de respuesta en la clula y provoca un cambio en la
conformacin de la protena receptora; estos cambios permiten al receptor
interaccionar con otros componentes celulares, como algunas protenas de
membrana, que pueden activar bombas de iones, o bien otras pueden actuar
abriendo canales de iones en la membrana.
Las bases moleculares de accin de las auxinas es un rea de intenso estudio
(Harling et al., 1997), ya que evidencias bioqumicas y electrofisiolgicas han
indicado que las auxinas pueden unir una variedad de protenas vegetales (Jones,
1994), como la protena 1 unida a auxina (ABP1) de maz, que tiene las
caractersticas de ser un receptor que interviene en la hiperpolarizacin de la
membrana inducida por auxina. La hiperpolarizacin es un concepto que refleja la
estimulacin de la expulsin de protn del citosol va la H
+
-ATPasa y la acidificacin
del apoplasto (Hager et al., 1991).
27
El ion calcio es importante en la accin de las hormonas, generalmente los
niveles en el citoplasma son muy bajos; sin embargo la estimulacin hormonal de los
canales del ion calcio resulta en una elevacin temporal de los niveles de calcio. El
ligamiento de calcio a los sitios de ligamiento-calcio de ciertas protenas alteran la
actividad de esas protenas, tanto como la actividad de las protenas receptoras de
hormonas. Las protenas cinasas son una clase de enzimas que pueden ser
activadas por calcio u otros "mensajeros secundarios" ; las protenas cinasas pueden
modificar las protenas "marcadas" al transferir grupos fosfatos en ciertos
aminocidos de una protena marcada y alterar su actividad (Rayen et al., 1999).
En relacin a las hormonas en el control de genes especficos, los
investigadores anteriores mencionan que los mecanismos moleculares por los cuales
los genes individuales son encendidos y apagados en los ncleos eucariticos no se
encuentran completamente entendidos, que un nmero de principios estn
emergiendo, sin embargo, estos son comunes a vegetales y animales. Un gene
eucaritico est compuesto de una secuencia codificada, la cual especfica la
secuencia de aminocidos de los productos de protena de genes, as como
secuencias reguladoras, las cuales son regiones de ADN que bordean la secuencia
codificada y juegan un papel regulador en la transcripcin del gene. Las protenas
llamadas factores reguladores de la transcripcin pueden ligar directamente a
secuencias especficas de ADN dentro de una secuencia reguladora, al activar
(encender) o reprimir (apagar) un gene particular (Rayen et al., 1999).
La identificacin del sitio celular de percepcin de la hormona vegetal ha sido
problemtico de demostrar, sin embargo, los reguladores de crecimiento vegetales
tales como el cido giberlico (AG), ABA, y auxina son cidos orgnicos pequeos
que pueden cruzar relativamente fcil las membranas biolgicas en varias formas.
Cuando se adicionan al apoplasto, esas hormonas pueden rpidamente entrar a la
clula y podran ser percibidas por receptores internos, al igual que las hormonas
esteroides de animales, ellas podran slo interactuar con receptores sobre la fase
externa de la membrana del plasma (Gilroy y Jones, 1994). Estos investigadores en
28
sus estudios con protoplastos aislados de capas de aleurona de cebada analizaron el
sitio de percepcin de seal hormonal, en el cual los protoplastos respondieron a la
aplicacin externa de AG
3
con el incremento en la sntesis y secrecin de a-amilasa,
expresin transitoria del gene reportero de la glucuronidasa encendido para los
elementos de respuesta a la hormona del promotor a-amilasa, y la vacuolacin tpica
de las clulas de aleurona tratadas con AG
3
. La aplicacin externa de ABA podra
bloquear la estimulacin de sntesis y secrecin de a-amilasa, mientras la
microinyeccin arriba de 250 M de ABA no fue efectiva para antagonizar el efecto
estimulatorio del AG
3
, resultados indicativos que el sitio de percepcin del AG
3
y ABA
en el protoplasto de aleurona de cebada es sobre la fase externa de la membrana del
plasma.
La senescencia de la hoja es un tipo de muerte celular programada que
constituye la fase final del desarrollo de la hoja, Gan y Amasino (1995) estudiaron
con plantas transgnicas de tabaco, que expresan el gene IPT, el desarrollo de un
sistema de inhibicin de la senescencia; al controlar la expresin de IPT, un gene
que codifica la isopentenil transferasa (la enzima que cataliza la etapa limite-
promedio en la biosntesis de la citocinina), con un promotor especfico de la
senescencia, que resulta en la supresin de la senescencia de la hoja; las plantas
transgnicas que expresan este gen, no exhibieron el desarrollo anormal usualmente
asociado con la expresin IPT porque el sistema es autorregulado; debido a que es
producida suficiente citocinina para retardar la senescencia, la actividad del promotor
especfico de senescencia es atenuada; las hojas con senescencia retardada
muestran una vida prolongada fotosintticamente activas; este resultado demuestra
que de manera endgena se produce citocinina que regula la senescencia y
suministra un sistema para especficamente manipular el programa de senescencia.
Respecto a interaccin entre hormonas, estudios sobre plantas enteras y
tejidos excisados han demostrado la existencia de sinergismo, antagonismo e
interacciones entre auxina y citocinina. En apoyo a la hiptesis que la auxina y
citocinina interactan en mltiples planos, dos diferentes mutantes resistentes a
29
auxina de Arabidopsis, aux1 y axr1, los cuales slo confieren la resistencia a
citocinina con respecto a la inhibicin del crecimiento de la raz, han demostrado que
operan en rutas de sealizacin separadas, esta evidencia gentica sugiere que las
citocininas pueden interactuar con mnimo dos rutas independientes de seales de
transduccin de auxina (Coenen y Lomax, 1997).
Las interacciones entre las hormonas vegetales auxina y citocinina por todas
las partes del desarrollo de la planta son complejas y las investigaciones genticas de
la interdependencia de sealizacin de auxina y citocinina han sido limitadas
(Coenen y Lomax, 1998); estos investigadores caracterizaron la sensibilidad a la
citocinina en la mutante diageotrpica (dgt) de tomate (Lycopersicon esculentum
Mill.) en una amplitud de respuestas reguladas por auxina y citocinina. Las plntulas
dgt etioladas mostraron resistencia cruzada a citocinina con respecto a la elongacin
de la raz, pero los efectos de la citocinina sobre el crecimiento del hipocotilo y la
sntesis de etileno en esas plntulas no fue perjudicado por la mutacin dgt, a las
siete semanas, el tipo silvestre verde y las plantas dgt fueron igualmente sensibles a
la citocinina con respecto al crecimiento de los brotes y la elongacin de hipocotilo e
internudo; en la regeneracin de rgano por cultivo de tejido de hipocotilo dgt los
explantes mostraron reducida sensibilidad a la auxina pero normal a la citocinina, y
los efectos de citocinina y la mutacin fueron aditivos; sin embargo, aunque la
induccin de callos de hipocotilo dgt los explantes requirieron auxina y citocinina, el
callo dgt no mostr la tpica concentracin-dependiente de la estimulacin del
crecimiento por auxina o citocinina observado en callo tipo silvestre; la resistencia
cruzada del mutante dgt a citocinina fue limitada a un pequeo subgrupo de procesos
de crecimiento regulados por auxina y citocinina afectado por la mutacin dgt, se
indico que la auxina y citocinna regulan el crecimiento vegetal por medio de ambas
partes y rutas separadas de sealizacin.
En bioensayos con mezcla de BA y DPU (difenilurea) Christianson y
Hornbuckle (1999) no encontraron evidencia de competicin para receptores de
citocinina; este resultado podra soportar las sugerencias que la citocinina fenilurea
30
acta indirectamente, al alterar el metabolismo de la citocinina endgena, aunque
ellos favorecen otra interpretacin, diferente u otros sistemas de respuesta a
citocinina. La induccin de yemas de los filamentos de protonema de musgo
involucra dos eventos mediados por citocinina, el nmero de yemas es controlado
por el segundo evento mediado por citocinina, si DPU fue pequeo o no afn por el
receptor al encender este segundo evento, tratamientos con DPU produce pocas o
ninguna yema, y el anlisis cintico al usar nmero de yemas no encontr evidencias
por competicin con BA, con base en sus resultados establecen la hiptesis que la
induccin de yemas en Funaria involucra dos receptores de citocinina qumicamente
distintos.
Los elementos ocs son un grupo de elementos promotores que han sido
explotados por dos distintos grupos de patgenos de plantas, Agrobacterium y
ciertos virus, para expresar genes en plantas. Estos son una familia de secuencias de
ADN que relacionan 20-pb y son componentes importantes de los promotores de un
nmero de genes de Agrobacterium expresados en plantas, la expresin de dos
de esos genes, nopalna sintasa (nos) y manopina sintasa (mas), han mostrado ser
inducidos por la hormona auxina en plantas transgnicas (Zhang y Singh, 1994).
Los mecanismos moleculares de accin de las auxinas son pobremente
comprendidos, aunque avances recientes de estudios moleculares de genes
regulados por auxinas y acercamientos genticos han contribuido para la
identificacin de factores de transcripcin, algunos con una funcin gentica definida,
y en la demostracin de la degradacin de protena regulada por la unin ubiquitin-
proteosoma, un papel clave en la accin de las auxinas (Leblanc et al., 1999). Dentro
de los ltimos 10 aos, acercamientos bioqumicos se han desarrollado con el
objetivo de identificar los receptores de auxinas, un nmero de compuestos solubles
y protenas ligadas a auxinas en membranas asociadas han sido descritos, sin
embargo, en la mayora de los casos su papel funcional en sealizacin, transporte,
o metabolismo de auxina no est claro (Jones, 1994; Venis y Napier, 1995). An la
31
funcin de la protena ligada a la auxina ms estudiada (ABP1) permanece difcil de
conseguir (Leblanc et al., 1999).
Para el mejor conocimiento del papel in vivo de la auxina endgena AIB, se
identificaron 14 mutantes de Arabidopsis que son resistentes a los efectos inhibitorios
de esta hormona sobre la elongacin de la raz, pero permanece sensible a la auxina
ms abundante AlA. Estos mutantes tienen defectos en varias respuestas mediadas
a AIB, lo cual permiti agruparlas en cuatro clases de fenotipos. Para el desarrollo de
defectos en ausencia de sacarosa exgena se propone que algunos de estos
mutantes son perjudicados en el acortamiento de la cadena del cido graso
peroxisomal e implican que la conversin de AIB a AlA es solo interrumpida (Zolman
et al., 2000).
La respuesta a la auxina incluye un crecimiento celular inicial rpido (dentro de
15 a 20 minutos) que puede involucrar cambios inducidos por auxina en pH y calcio y
una segunda fase que implica cambios inducidos por auxina en la expresin del gene;
los genes sensibles a auxina incluyen familias de genes de auxina (SAUR,
GH
3
y Aux/IAA), los cuales tienen secuencias distintas conservadas de accin cis y
sus regiones promotoras, varios genes de la enzima glutation S-transferasa y un
gene para la ACC sintasa; la mayora de las funciones en esos genes son
desconocidas (Eckardt, 2001).
En resumen, sobre sealizacin de las hormonas se menciona que stas no
solamente controlan los principales aspectos del desarrollo, sino que tambin la
respuesta de las plantas al ambiente y que uno de los ensayos urgentes es sobre la
convergencia e interaccin de varias rutas de hormonas (Bisseling y Weigel, 2001).
2.3. Micropropagacin
El xito de muchas tcnicas in vitro en plantas superiores depende del xito en
la regeneracin de la planta, la aplicacin de algunas tcnicas, p. e. para el
32
aislamiento de mutantes y fusin de protoplastos in vitro, el cultivo de clulas est
limitado en muchas especies por la dificultad para regenerar plantas. La
regeneracin de plantas es la piedra angular en la metodologa del cultivo de tejidos,
sin sta la hibridacin de protoplastos, los estudios de crecimiento y diferenciacin, la
generacin de variabilidad gentica, el cultivo de anteras, la donacin comercial con
el propsito de una rpida multiplicacin de especies deseables o difciles de
propagar, la eliminacin de enfermedades a travs del cultivo de meristemos, y
muchos estudios de reguladores de crecimiento, seran imposibles de realizarse
(Tisserat, 1991).
Tambin las dificultades de establecer cultivos aspticos de explantes maduros
de plantas leosas est asociado con el necrosamiento de los explantes, la
contaminacin microbiana y la oxidacin fenlica, factores que limitan el progreso en
el desarrollo de la propagacin in vitro de algunas especies (Guzmn y Gmez-Lim,
1997).
La "respuesta regeneradora" in vitro incluye la embriognesis somtica
(induccin de embriones somticos) as como la organognesis (formacin de brotes
o races), procesos de morfognesis que explantes in vitro seguirn para la
regeneracin de una planta completa (Christianson y Warnick, 1988). La
organognesis se origina por la formacin inicial de meristemoides,
subsecuentemente primordios, brotes y finalmente la formacin de races
adventicias; est se utiliza con mayor frecuencia debido a que se tiene un buen
conocimiento de su biologa en un nmero considerable de especies (Vasil, 1994). La
embriognesis somtica es la formacin de un embrin a partir de una clula, sin la
necesidad de la fusin de gametos (Zimmerman, 1993).
La regeneracin de plantas a travs del cultivo de tejidos puede establecerse
al usar uno de los tres mtodos: cultivo de embriones, embriognesis somtica y
organognesis; el cultivo de embriones es el cultivo asptico de un embrin cigtico,
el embrin es obtenido de la semilla u vulo y plantado sobre un ambiente substituto
33
del endospermo (por ejemplo, medio nutritivo); posteriormente el embrin desarrolla y
la germinacin ocurre como debera ser desde la semilla (Tisserat, 1991).
El carcter totipotente de las clulas vegetales y tejidos puede ser expresado
por su habilidad para regenerar plantas va embriognesis u organognesis, ambos
procesos conducen a la regeneracin in vitro y son un prerrequisito para la
transformacin gentica. Sin embargo, la aplicacin general de las tcnicas de
transferencia de genes para el mejoramiento de cultivos puede no ser exitosamente
lograda si los procesos que dirigen la morfognesis no son bien entendidos (Fortes y
Pais, 2000).
2.3.1. Organognesis
La organognesis consiste en un proceso morfolgico secuencia) que se
traduce en la formacin de rganos de novo, que se puede inducir reproduciblemente
a travs de la manipulacin qumica de los medios de cultivo (Villalobos, 1990; Prez
et al., 1999)
En muchas ocasiones los explantes tienen la capacidad de desarrollar brotes,
races, o estructuras florales cuando se cultivan en un medio suplementado con sales
minerales, vitaminas, y una fuente de carbono pero sin hormonas vegetales. Este
proceso puede llamarse "organognesis adventicia", la adicin de hormonas
vegetales muchas veces puede facilitarlo, pero no son absolutamente requeridas. En
esta instancia, los precursores inmediatos de nuevos rganos son las clulas en el
explante mismo. El otro tipo de organognesis es la no adventicia e involucra una
"desdiferenciacin" del explante, formacin de tejido calloso alrededor de la orilla del
corte del explante, y la induccin de rganos nuevos del tejido calloso recientemente
formado. El suplemento exgeno de fitohormonas no solamente controla los
procesos pero es necesario para que la organognesis se presente (Christianson y
Warnick, 1988; Woodward, 1997).
34
Los primeros en demostrar que la organognesis es controlada por el balance
entre auxinas y citocininas en el medio de cultivo fueron Skoog y Miller en 1957
(Minorsky, 2001). Un medio con mayor proporcin de auxina en relacin a citocinina
induce la formacin de races, en tanto que en relacin inversa se forman brotes y
con una relacin intermedia auxina : citocinina se induce crecimiento desorganizado
como tejido calloso.
Frecuentemente es necesario eliminar las citocininas para el alargamiento y el
enraizamiento, segn Von Arnold (1988) la capacidad de enraizamiento de las yemas
est altamente influenciada por la etapa juvenil de la planta madre y la fuente del
explante.
Los estudios de respuesta morfogentica in vitro se basan en combinaciones
diferentes de citocinna/auxina, p.e. al utilizar como explantes hojas de Duboisia
myoporoides y 65 combinaciones de citocinina/auxina se compararon los efectos
sobre la organognesis; dos diferentes tipos de callos fueron inducidos dependiendo
de las combinaciones usadas para la induccin de callos; ningn brote con raz fue
regenerado de los callos inducidos con 7 diferentes combinaciones citocinina/auxina
(Khanam et al., 2000).
2.3.1.1. Organognesis en aguacate
Varios explantes de aguacate, desde embriones maduros e inmaduros,
meristemos y yemas axilares de plantas de vivero y rbol maduro, hoja, flor,
mesocarpo del fruto, pednculo, polen, cotiledn y protoplastos, han sido cultivados
in vitro. Sin embargo, los avances del cultivo de tejidos de aguacate est an en
etapas tempranas (Pliego-Alfaro y Bergh, 1992; Mohamed-Yasseen, 1995a). Estos
investigadores sealan que promover la investigacin en aguacate es una necesidad
para desarrollar sistemas de cultivo de tejidos con la ayuda de seleccin o
transferencia de algunos tratamientos deseables y la donacin de las plantas
mejoradas. El cultivo de callos ha sido establecido en muchos explantes, pero la
35
formacin de yemas adventicias de callos no fue lograda; la embriognesis somtica
fue obtenida de callo formado de embriones inmaduros (Skene y Barlass, 1983;
Money y Van -Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988); en cuanto a brotes y
formacin de plantas, fueron logradas con xito al usar ejes embrionarios (Mohamed-
Yasseen et al., 1992), y yemas axilares (Schall, 1987); aunque se requiere una
considerable investigacin para desarrollar un protocolo exitoso de regeneracin in
vitro y propagacin de aguacate.
Al igual que todas las especies leosas, el aguacate ha presentado
dificultades en su propagacin in vitro. En 1976, Schroeder con el objetivo de
desarrollar tcnicas para obtener material clonal de aguacate por cultivo de
meristemos apicales para patrones u otros propsitos y basado en reportes previos,
indicaba que los tejidos de casi todas las partes de la planta de aguacate pueden ser
cultivados in vitro como masas de callo. El comportamiento general del material
tomado como "yemas intactas" cuando es cultivado en medio, con un amplio rango
de nutrimentos, origina la formacin de callo en la superficie del corte o en la periferia
de ste; ocasionalmente algunas yemas presentan algn crecimiento longitudinal y
eventualmente una proliferacin de callo a una distancia de 4-5 mm; finalmente, se
observa que la etiolacin de plntulas o plantas injertadas y la posterior obtencin de
tejido (yemas) no ha desarrollado ventaja alguna, excepto un mesurado crecimiento
longitudinal pero con un callo masivo en la base del explante (Schroeder, 1976).
Nel y col. (1982) obtuvieron brotes de 3-5 cm de plntulas de 1 ao de P.
indica, de stos sembr pequeas yemas de 5 mm con uno y dos nudos en medio
MS (Murashige y Skoog, 1962) que contena cido ascrbico (25 mg/I), cido
giberlico (1mg/l), vitaminas y otros componentes; para el cultivo inicial y
subsiguiente multiplicacin fue aadido BA a una concentracin de 2 mg/I; el
enraizamiento fue inducido con 2 mg/l de AIB adicionado al medio; con este
procedimiento obtuvieron plntulas de 6 cm de altura en 5 semanas, las mismas que
se dividieron en entrenudos y recultivaron, desarrollaron hasta 12 brotes que
enraizaron en 3 semanas. De las plntulas con raz 50% sobrevivieron despus del
36
trasplante al suelo; sin embargo, con el cultivar Duke 7 el cultivo de tejidos no fue
xitoso.
El portainjerto Duke 7 resistente a P. cinnamomi es ampliamente usado en
Sur frica, pero su propagacin por mtodos convencionales es baja. En ensayos
con 3 diferentes tipos (fuente y edad) de explantes, 4 medios bsicos de cultivo in
vitro y 20 combinaciones de auxina y citocinina, no se present enraizamiento en
todos los tratamientos. Sin embargo, de moderado a un extensivo crecimiento de
callo basal ocurri en algunos tratamientos de BA y AIB, as como el crecimiento de
algunos brotes (Bower et al., 1983).
Al establecer in vitro embriones inmaduros de aguacate (P. americana) de
rboles de 15 aos de edad del cultivar Fuerte, Skene y Barlass (1983) en Australia,
encontraron que embriones menores a 6 semanas de edad rara vez produjeron brotes
viables, y aunque algunas veces las hojas se expandieron cuando el BA (0.5
mg/l) estuvo presente, los tallos no presentaron elongacin (alargamiento). Para
embriones de ms de 6 semanas, el desarrollo fue extremadamente bajo.
impredecible e independiente del tratamiento, a menos de que BA fuera incluido en el
medio; en este estudio tambin utilizaron ejes embrionarios de semillas maduras del
cultivar Fuerte, los que respondieron rpidamente en medio MS lquido a la mitad de
sus sales con BA (0.5 mg/I); despus de 19 das de cultivo, los brotes principales de
cada eje, y cuatro a cinco laterales sufrieron elongacin. Estos brotes fueron
cortados despus de los 40 das de cultivo y ms brotes fueron estimulados a
elongacin sobre los ejes embrionarios. Aunque los brotes cortados fueron lentos
para enraizar, el tratamiento alcalino (aplicacin a la base de cada brote con 1 N de
NaOH por 20 segundos) estimul de 30 - 50% de brotes a formar races.
Gonzlez y Salazar (1984) utilizaron segmentos de tallo de P. americana var.
americana raza antillana, cultivados a partir de semilla y pre-tratados bajo tres
condiciones de luz (parcial , total y oscuridad), se establecieron en medio MS con
diferentes concentraciones de AIB, slo o en combinaciones con cinetina (K); el
37
crecimiento de yemas axilares de segmentos no etiolados fue observado en medio
conformado por 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de K, la formacin de raz fue inducida en
condiciones de iluminacin total en medio con 7.5 mg/1 y 10 mg/1 de AIB.
Gonzlez y col. (1985) emplearon segmentos de tallo de P. schiedeana
cultivados a partir de semillas y pre-tratados bajo tres condiciones de luminosidad
(oscuridad, luz parcial y total) e incubados en medio MS con diferentes
concentraciones de AIB slo o combinado con K, para establecer esta especie no fue
necesario que los explantes recibieran pre-tratamiento con oscuridad e iluminacin
parcial y total, ni fue necesario aadir carbn activado al medio base; el crecimiento
de yemas axilares lo observaron en un medio conformado por 0.1, 1.0 y 0.01 mg/1 de
AIB, en tanto que el crecimiento de yemas con expansin de hojas fue logrado con 1
mg/l de AIB+ 0.3 mg/l de K, 3 mg/1 de AIB+1 mg/l de K y 3 mg/1 de AIB + 0.01 mg/l
de K; plntulas completas fueron generadas en un medio con 1 mg/1 de AIB y 1 mg/l
de K.
En Nueva Zelanda, Cooper (1987) utiliz para su establecimiento in vitro
segmentos nodales con yemas axilares de plantas de semilla de aguacate (P.
americana) de los cultivares Hopkins y Hass, que crecieron en invernadero bajo luz
natural y posteriormente se colocaron en un cuarto obscuro (a 20C y 50% de
humedad relativa) para producir brotes etiolados; cuando los explantes se
sumergieron en etanol al 95% por 2 a 5 segundos, se obtuvo una reduccin de la
contaminacin a niveles aceptables (0-16%); se estimul el crecimiento de las yemas
axilares (65-85% de brotacin en 4 semanas) con 1 mg/1 de BA en medio basa) (MB)
formado con sales minerales de medio para plantas leosas (WPM) (Lloyd y
McCown, 1980), vitaminas, sacarosa (30 g/I) y agar bacteriolgico (Davis, 7 g/). El
medio de multiplicacin consisti en MB, AIB (0.1 mg/I) y BA (0.3 mg/I) donde solo se
logr el enraizamiento en los brotes con hojas grandes bien formadas que estuvieron
6 semanas en medio de multiplicacin, para esta etapa se prob el enraizamiento in
vivo e in vitro, se encontr en el primero menor formacin de callo y un enraizamiento
rpido (en 4 semanas del 80 al 100%), este tratamiento consisti en colocar los
38
brotes en una solucin acuosa con 3,000 mg/I de ANA por 1 segundo y establecidos
inmediatamente en sustrato de piedra pmez: suelo de turba (50:50 v/v) bajo un
pabelln de una alta humedad, temperatura de 26C y neblina intermitente (2
segundos cada 30 minutos). En este estudio tambin se realizaron pruebas para la
micropropagacin de material adulto de Duke 7 sin resultados exitosos.
En 1987, Schall experiment la propagacin in vitro de P. americana cv.
Fuerte, utiliz como explantes plantas injertadas, tallos cortos de 2 a 4 aos de edad,
sembrados en medio MS, mezcla de vitaminas de Morel, FeEDTA (25 mg/I),
NaH
2
PO
4
(170 mg/I), mioinositol (100 mg/I) y sacarosa (30 g/l); logr la proliferacin,
crecimiento y enraizamiento de brotes. El uso de BA de 5-10 mg/I en el medio de
cultivo foment la formacin de tallos jvenes, sin embargo, problemas como
necrosis, oxidacin de explantes, ligados con la produccin de etileno, estuvieron
presentes, las plntulas fueron transferidas al invernadero con un 80% de xito.
Pliego-Alfaro y col. (1987) reportan que la necrosis apical fue la causa
principal de muerte de los brotes cuando se multiplic por cultivo de tejidos los
portainjertos de aguacate IV-8 y GA-13; el uso de medio de doble fase o recultivos
mltiples a intervalos cortos, previno el problema antes indicado; la vitrificacin fue
otro problema serio, especialmente cuando se usaron tcnicas de doble fase de
medio. Estos investigadores cortaron brotes de 15 a 25 cm de longitud, removieron
las hojas, mismos que fueron esterilizados por inmersin en hipoclorito de sodio al
0.5% durante 10 minutos, inmediatamente despus fueron divididos en trozos de 1-
1.5 cm que contenan yemas laterales; el medio de doble fase contena las sales MS,
pero con macroelementos al 50% y otros componentes en las siguientes
concentraciones en mg/I: sacarosa (30,000), inositol (100), tiamina HCI (0.4) y agar
(8,000), la concentracin de BA fue 0.65 mg/1 en medio semislido y 0.1 mg/I en
medio lquido. El medio final de desarrollo para multiplicacin del GA-13 incluy la
mezcla de macroelementos, N y K, los microelementos MS y las concentraciones en
mg/1 de sacarosa (30,000), mioinositol (100), tiamina HCI (0.4), BA (1) y bacto-agar
(8,000). La capacidad de enraizamiento se determin con el uso de una secuencia
39
de dos etapas que incluye tres das de cultivo en medio basa) con macroelementos
MS diluido a 0.3 X y 1 mg/1 de AIB y la subsiguiente transferencia a medio similar de
AIB pero con 1 mg/1 de carbn activado; todos los cultivos fueron incubados a 25C,
1500 lux y 8:16 h de obscuridad y luz.
Solrzano-Vega (1989) utiliz plantas de aguacate del cultivar Colin V-33 y
una seleccin adaptable a suelos salinos, mismas que ubic en una cmara de
etiolacin por un perodo de 30 das. Una vez etioladas fueron establecidas in vitro
en tubos con medio MS, metasulfato de potasio fue aadido para reforzar las
condiciones nutritivas del sustrato. Un control total de la oxidacin fue logrado con la
aplicacin de metasulfato de potasio, en tanto que el radio ptimo de reguladores fue
de 2 mg/1 de BA y GA
3
en iguales cantidades, 25% de los explantes de Coln V-33
murieron debido a la presencia de bacterias.
Con base en los resultados obtenidos por Pliego Alfaro y col. (1987), sobretodo
en el medio de doble fase para la etapa de proliferacin, Zirari y Lionakis
(1994) en Grecia tomaron explantes (puntas de brotes y segmentos nodales solos,
ambos cerca de 1.5 cm de longitud) de brotes de aguacate que crecieron
activamente despus de la poda del tronco principal, en rboles de 19 aos de edad
de los cultivares Topa-Topa, Hass y Fuerte. Dos clases de este material fueron
usados (brotes del ao en curso despus de la poda y brotes de 2 aos de edad), el
material adulto de Duke (13 aos de edad) fue tambin usado y ste obtenido de
brotes nuevos de varetas incubadas bajo luz continua a 25C. El material etiolado fue
obtenido de nuevos brotes de varetas que crecieron bajo total oscuridad a 25C. Los
resultados que obtuvieron sealan que los explantes puntas de brotes produjeron ms
proliferacin de brotes que los segmentos nodales; el cultivar Topa-Topa
produjo el ms alto nmero de brotes axilares, seguido por Fuerte y Hass; el
tratamiento de etiolacin mejor significativamente la produccin de brotes axilares,
la elongacin y el nmero de hojas, especialmente de material del portainjerto Duke.
Las pruebas para enraizar microbrotes de aguacate no fueron exitosas, debido a la
severa necrosis del brote despus de la transferencia a medio de enraizamiento.
40
Mohamed-Yasseen (1995b) describe un mtodo para propagar in vitro
aguacate a partir de ejes embrionarios de semillas maduras de seis cultivares de
Florida (Dade, Maxima, Cataloina, Tower 2, Waldin y Choquette), los cuales cultiv
en medio MS suplementado con 100 mg/1 de mioinositol, 30 g/I de sacarosa, 8 g/I de
agar sin reguladores de crecimiento o con diferentes combinaciones de BA (1, 2, 3
mg/I) o TDZ (0.2, 1, 2 mg/I) y 0.1 mg/1 de ANA. Los explantes fueron incubados en la
oscuridad por 7 - 10 das para reducir la necrosis-oxidacin y transferidos a un
fotoperiodo de 18 horas. Los ejes embrionarios respondieron a la adicin de BA al
incrementar a 8 brotes por explante, cuando el medio MS fue usado solo (sin
reguladores de crecimiento) se form un brote y pequeas yemas laterales pero
abatidas por la dominancia apical del brote principal. Los brotes mltiples fueron
subcultivados para su multiplicacin en medio MS fresco con BA, los brotes fueron
enraizados en MS con 2 mg/1 de AIB.
Embriones maduros de semillas de aguacate (P. americana cv. americana,
raza mexicana) fueron cultivados en medio MS suplementado con K y/o AIB a
252C por 21, das en obscuridad seguido por 14 das de luz continua. La
germinacin del embrin, produccin de un brote y raz de 0.5 cm de longitud
mnima, fue en el 100% de los embriones cultivados con 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 a 0.3
mg/1 de K; concentraciones mayores a 0.3 mg/1 de AIB redujeron la germinacin. El
mayor nmero de brotes adventicios fue obtenido con 3.0 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de
K. La mxima longitud del brote (12.5 cm) fue alcanzada con la combinacin de 1
mg/1 de AIB y 1 mg/1 de K. La mxima longitud de raz (4.9 a 6.6 cm) fue obtenida con
AIB entre 0.3 y 1 mg/1 combinado con 0.1 a 1 mg/1 de K (Llano-Agudelo et al., 1995).
Entre los ltimos reportes se encuentran los de Barcel-Muoz y col. (1999)
quienes en Espaa, desarrollaron un procedimiento para micropropagar la seleccin
IV-8, un portainjerto de aguacate adulto; el cultivo fue iniciado de brotes bsales
obtenidos despus de podar un rbol a nivel del suelo; las yemas brotaron en medio
slido MS con los macroelementos a la mitad de la concentracin de las sales (MS
41
0.5X) y 1.3 M de BA; para inducir proliferacin, los brotes fueron cultivados por 2
semanas en medio lquido en un agitador giratorio con la formulacin de sales de
Gamborg (Gamborg, 1966) y 1.3 M de BA, seguido por 6 semanas en condiciones
de doble fase (medio slido con una capa de medio lquido arriba) al usar la misma
formulacin de sales y dos diferentes dosis de BA, 2.8 M en la fase slida y 0.4 M
en la fase lquida; el 90% de los brotes enraizaron despus de 3 das de cultivo en
medio lquido en un agitador giratorio con macroelementos MS 0.3X y 4.9 M de AIB,
seguido por la transferencia a medio slido en ausencia de auxina pero con 1 g/l de
carbn activado; el promedio de supervivencia durante la aclimatacin en el
invernadero fue del 70%.
En resumen, los esfuerzos para micropropagar el aguacate va organognesis
han sido enormes, se han estudiado con diferentes explantes (Mohamed-Yasseen,
1995a) y con tres especies de Persea y con varios portainjertos e injertos
sobresalientes. Sin embargo, falta el establecimiento de un sistema que garantice en
un 100% la propagacin clonal, sto porque al tomar como explantes ejes
embrionarios y embriones cigticos no se tendra la certeza de estar propagando
idnticamente desde el punto de vista gentico, el material de origen del explante.
Por otra parte se requiere que este sistema permita la micropropagacin con material
de rboles adultos para la conservacin in vitro de germoplasma, o sea evitar la
aplicacin de podas del tallo principal y trabajar con rebrotes, o bien, con plntulas de
vivero propagadas por semilla; adems que sea prctico y econmico, es decir que
se manejen los componentes y dosis mnimas en los medios de cultivo, que su
preparacin no implique complicacin alguna y se evite la dependencia de equipo y
procedimientos sofisticados, que lo nico que ocasionan es el incremento en los
costos de produccin por planta.
As, se demanda un sistema de micropropagacin de aguacate va
organognesis que apoye una serie de aplicaciones futuras del cultivo de tejidos,
principalmente en la conservacin in vitro, la regeneracin de plantas a partir de
tejidos tratados con agentes mutagnicos, bien sean fsicos o qumicos, para la
42
produccin de variantes y mutantes a evaluar ante factores bitcos y abiticos que
afectan al cultivo del aguacate, entre otros aspectos.
2.3.2. Embriognesis somtica
La embriognesis somtica es el proceso de iniciacin y desarrollo de
embriones desde clulas que no son el producto directo de la fusin de gametos, es
un fenmeno natural en muchas especies in vivo (Janick, 1993). Los embriones
somticos tienen, al igual que los cigticos, la capacidad de formar una nueva planta
despus de un proceso de germinacin, con la diferencia de que la embriognesis
somtica es un proceso asexual por lo que la nueva planta ser exactamente igual a
la donadora de la clula inicial. An no se conoce con exactitud el proceso de
induccin de sta, pero se sabe que implica un cambio drstico en los patrones de
expresin gentica mediante el cual las clulas pasan del patrn normal a uno
embriognico. Existen dos tipos de embriognesis somtica in vitro, la directa y la
indirecta, en la primera los embriones aparecen directamente sobre el explante
original, en tanto que en la segunda es indispensable obtener un tejido calloso o bien
una suspensin celular embriognica a partir de la cual se obtendr la diferenciacin
de los embriones somticos (Tisserat, 1991; Prez et al., 1999).
Debido a la totipotencia de las clulas vegetales, la embriognesis somtica
puede ser inducida de tejidos diferenciados y rganos de muchas especies, se
incluye polen, mesfilo, tallo, raz y protoplastos aislados (Carman,1990).
La embriognesis somtica es un sistema ideal para investigar los procesos
completos de diferenciacin de plantas, as como los mecanismos de expresin de
totipotencia en clulas vegetales, tiene muchas ventajas comparado con la
embriognesis cigtica; por ejemplo, a) el proceso de embriognesis es fcilmente
monitoreado, b) el ambiente del embrin puede ser controlado, y c) un gran nmero
de embriones puede fcilmente ser obtenido (Nomura y Komamine, 1999).
43
Los embriones somticos son estructuras bipolares con un eje radical-apical y
carecen de conexin vascular con el tejido materno; estas estructuras bipolares son
capaces de crecer y formar plantas; este mtodo es considerado el ms eficiente
para la produccin masiva de plantas in vitro, ya que se puede regenerar un gran
nmero de plantas por unidad de tiempo (Villalobos y Thorpe, 1991; Gmez, 1998);
Adicionalmente, al cultivar en medio lquido embriones somticos con ayuda de un
biorreactor, se disminuye el costo de produccin de una planta de laboratorio de
cultivo de tejidos, ya que en algunas especies, como por ejemplo en caf (Coffea
arabica var. Catimor) se han alcanzado producciones de hasta 72,000 embriones
somticos/1 de medio con ms de un 80% de conversin (Jimnez y de Feria, 1998).
Se entiende por conversin como la supervivencia y desarrollo en fase de propgulo
en condiciones ambientales ex vitro o sea en suelo (Stuart y Strickland, 1984).
Parrot (1993) y Gmez (1998) mencionan que el desarrollo de un sistema
experimental para la regeneracin de plantas va embriognesis somtica incluye los
siguientes pasos: induccin de los embriones somticos, desarrollo de los embriones
somticos, proliferacin, maduracin, germinacin y conversin en plantas. Prez y
col. (1999) indican que consta de las etapas de:
a) Induccin. Proceso de conversin de una clula somtica a una clula
proembriognica, para que ste se presente son factores determinantes el genotipo, el
grado de diferenciacin de las clulas del explante, las auxinas y el aislamiento
celular.
b) Histodiferenciacin. Las masas de clulas proembriognicas se diferencian
al formar embriones somticos, mediante una divisin y diferenciacin celular
simultneas; se requiere la eliminacin de las auxinas exgenas para que se detenga
la multiplicacin y ocurra la diferenciacin; en esta etapa los embriones somticos
pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a los que ocurren en la
embriognesis cigtica; en las dicotiledneas estos son: globular, de corazn y de
torpedo, mientras que en las monocoltiledneas son: globular, coleoptilar y escutelar.
c) Maduracin. Durante esta etapa ocurre una elongacin celular sin divisin;
Bewley y Black (1985) mencionan que la maduracin es el periodo en el desarrollo
44
del embrin somtico en el cual ocurre la expansin de la clula y la acumulacin de
sustancias de reserva, para la mayora de las especies se sabe que los estmulos
que hacen posible la maduracin de los embriones son la desecacin y el ABA.
d) Germinacin. Proceso de elongacin y reactivacin metablica de un
embrin somtico maduro para convertirse en una plntula; los estmulos requeridos
son tratamientos con fro, incubacin en presencia de luz o aplicaciones de cido
giberlico o citocininas.
De acuerdo con Lozoya (1990) los principales factores que intervienen en la
embriognesis somtica son:
a). Medios de cultivo. Se indica la adicin de substancias al medio para
favorecer la embriognesis, entre ellas se incluyen la tiamina, cido nicotnico,
piridoxina, glicina, mio-inositol, adenina y auxinas.
b). Luz y temperatura. En zanahoria y ctricos, especies en donde los estudios
de embriognesis han sido ms profundos, se reporta que luz y temperatura son
determinantes para que sta se presente; en general una intensidad lumnica de
1,000 a 3,000 lux y una temperatura de 25-28C son adecuadas.
Aunado a lo anterior, la embriognesis somtica es tambin afectada por el
genotipo de la planta, el tipo y estado fisiolgico del explante, los reguladores de
crecimiento y las condiciones de cultivo (Gmez, 1998). Aunque cambios en el pH
inducen la embriognesis somtica en zanahoria (Krikorian y Smith, 1992), en cultivo
de Picea abies, la induccin promedio fue ms alta entre pH de 6.5 a 7.5 que entre
pH 5 a 6 (Von Arnold, 1987). En tanto que Rugkhla y Jones (1998) en Santalum
album y S. spicatum obtuvieron una alta frecuencia de induccin de embriognesis
somtica (100%) en medio MS con TDZ (1 o 2 M) y pH ajustado a 5.8, para el
desarrollo, mantenimiento y multiplicacin de los embriones somticos emplearon
AlA (6 M) y cinetina (1 M), y en la germinacin AG
3
(6 M).
Adems de la multiplicacin in vitro de los tejidos va embriognesis somtica,
tambin puede aplicarse al callo embriognico tratamientos mutagnicos y
45
recuperarse los embriones somticos desarrollados de una sola clula mutada;
dichos embriones seran de mucho mayor valor puesto que no seran quimeras
(Zimmerman, 1988). Los usos de la embriognesis somtica pueden resumirse como
a continuacin se anota: propagacin clonal (micropropagacin o produccin de
semilla sinttica), mejoramiento del cultivo (seleccin de clulas, rescate de
embriones, transformacin, hibridacin somtica y produccin de lneas
homocigticas), produccin de metabolitos, eliminacin de enfermedades y
conservacin de germoplasma (Janick, 1993).
En la actualidad existen varios reportes de estudios realizados en frutales
perennes y otras especies de cultivo para producir embriognesis somtica (Cuadro
1) entre los que se observa que el explante ms frecuentemente utilizado es la
nucela y los embriones cigticos inmaduros, cultivados sobre el medio de cultivo MS
con la auxina 2,4-D en combinacin con citocininas como BA, KIN y 2iP. Sin
embargo, es sealado el papel del 2,4-D en la incidencia de la variacin gentica y
los cambios epigenticos que aparecen en plantas obtenidas de embriones
somticos, no obstante que en muy pocas especies de plantas se han realizado
estudios en campo durante varios aos de poblaciones regeneradas va
embriognesis somtica, uno de los ejemplos es en palma de aceite por ms de 10
aos (Merkle et al., 1996), quienes reportan 11 % ms de productividad en las plantas
obtenidas mediante embriones somticos en relacin a las de semilla; adems
mencionan que la variabilidad somaclonal es rara y que no existe relacin entre el
tiempo de multiplicacin in vitro de los embriones y el porcentaje de anormalidades.
2.3.2.1. Embriognesis somtica en aguacate
Mooney y Staden (1987) utilizaron embriones inmaduros obtenidos de frutos de
3 a 4 mm de longitud de los cultivares Fuerte y Duke-7 de P. americana, que fueron
establecidos sobre medio de induccin de callo, MS modificado de acuerdo con
Pliego-Alfaro (1981) y suplementado con sacarosa 30,000 mg/I, tiamina-HCI 0.4 mgll,
mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l y carbn activado 1,000;mg/l; obtuvieron
46
Cuadro 1. Embriognesis somtica en frutales perennes y otras especies de cultivos.
Reguladores de
crecimiento
d
Familia Especie Explante
b
Medio
c
Auxina Citocinina Citado por
Anacardiaceae Mangifera indica N,E MS 2,4-D ----- Litz et al. (1984)
Caricaceae Carica papaya S MS AlA KIN Yie y Liaw (1977)
Juglandaceae Juglans regia C * AIB BA, KIN Tulecke y McGranahan (1985)
Lauraceae Persea americana E MS PIC Pliego-Alfaro y Murashige (1988)
Musaceae Musa (AAA, ABB) L,R MS Dicamba ZEA Novak et al. (1989)
Myrtaceae Feijoa sellowiana E MS 2,4-D KIN Cruz et al. (1990)
Myrciaria cauliflora N MS 2,4-D ----- Litz (1984)
Oleaceae Olea europaea E MS 2,4-D BA Rugini (1988)
Palmae Cocos nucifera Inf MS 2,4-D BA,2iP Branton y Blake (1983)
Phoenix dactylifera E MS 2,4-D 21P Reynolds y Murashige (1979)
P. dactylifera ST MS 2,4-D 2iP Tisserat (1979)
Rosaceae Eriobotrya japonica N MS 2,4-D BA Litz (1985)
E. japonica ST MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)
E. japonica E MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)
Malus x domestica
M. x domestica
Prunus persica
N
C,L
E
MS
N
MS
ANA
ANA
2,4-D
BA
BA
BA, KIN
Eicholtz et al. (1980)
Mehra y Sachdeva (1984)
Raj Bhansali et al. (1990)
Rubiaceae Coffea arabica L MS 2,4-D KIN Sondahi y Sharp (1977)
Coffea canephora S MS 2,4-D KIN Staritsky (1970)
47
Cuadro 1. (Continuacin).
Reguladores de
crecimiento
Familia Especie Explante
b
Medio
c
Auxina Citocinina Citado por
Rutaceae
Sterculiaceae
Vitaceae
Citrus liman
Citrus nobilis
Citrus paradisi
Citlus sinensis
Theobroma cacao
Vitis longii
Vitis vinifera
Vitis vinifera
Vits sp.
N
N
N
N
E
O
N
E
S,L,P
MS
MT
MT
MS
MS
MS
N,MS
N
MS
-----
-----
-----
-----
ANA
2,4-D
NOA
NOA
2,4-D
-----
-----
-----
-----
-----
KIN
BA
BA
BA
Rangan et al. (1968)
Kochba et al. (1982)
Kochba et al. (1982)
Rangan et al. (1968)
Pence et al. (1979)
Gray y Mortensen (1987)
Mullins y Srinivasan (1976)
Stamp y Meredith (1988)
Krul y Worley (1977)
a
Medio de induccin.
b
C = cotiledn; E = embrin cigtico; Inf = inflorecencia; L = hoja; N = nucela; O = ovario; P = peciolo; R = raz; S = tallo; ST =
meristemo.
c
MS = Murashige y Skoog (1962); MT = Murashige y Tucker (1969); N = Nitsch (1969); * = formacin especfica.
d
KIN = cinetina; PIC = picloram; ZEA = zeatina; AlA = cido indol-3-actico; AIB = cido indolbutrico; ANA = cido
naftalenactico; NOA = cido naftoxiactico; 2,4-D = cido diclorofenoxicetico; 2iP= 2, isopenteniladenina.
48
callo embriognico el cual lo subcultivaron a intervalos de 2 a 3 semanas en medio
de Dixon y Fuller (1976) suplementado con 3 mg/1 de isopentiladenosina (IPA) y
cido benzotiazol-2-oxiactico (BTOA); la regeneracin de plantas fue lograda a
travs del subcultivo de los proembriones globulares en las sales y vitaminas del
medio anterior, sin reguladores de crecimiento. En los estudios histolgicos,
observaron que el callo se form arriba del tejido normal parenquimatoso hacia el
centro de un grupo de clulas y numerosas clulas proembrionales en la periferia de
la masa de los callos; la embriognesis inici en clulas individuales en la periferia de
los callos y desde clulas en la superficie de proembriones existentes; los embriones
iniciales pudieron ser reconocidos por su manifiesto contenido de almidn y por sus
paredes gruesas, las cuales carecen de plasmodesmo; las divisiones celulares
ocurren en clulas con paredes gruesas para dar origen a proembriones globulares;
los proembriones desarrollaron forma acorazonada, de torpedo y en embriones
cotiledonarios y finalmente hacia plantas completas.
Un procedimiento de cultivo de tejidos fue desarrollado para la regeneracin de
embriones somticos de callos cultivados de aguacate; embriones cigticos
inmaduros de P. americana de 0.6 a 0.8 mm de longitud fueron utilizados como
explante original; el medio basa) contena sales MS con sacarosa 30,000 mg/I,
tiamina-HCI 0.4 mg/l, mioinositol 100 mg/l y fue solidificado con 8% de agar, el pH fue
fijado a 5.7; la adicin de 0.1 mg/1 de picloram al medio de cultivo parece ser crtica
para la iniciacin de callos, concentraciones bajas (0.001 - 0.01 mg/I) o altas (1 mg/I)
fracasaron para inducir callos, el desarrollo de embriones fue establecido en las
concentraciones de 0.01 a 0.1 mI/I de picloram; unos pocos embriones bien
desarrollados produjeron brotes verdes; los ensayos para inducir una alta incidencia
de germinacin fue desafortunada (Pliego Alfaro y Murashige, 1988).
Litz (1997) explica que el principal objetivo de las investigaciones que realiza en
Florida, USA, es una nueva generacin de portainjertos de aguacate con alto nivel
de resistencia a Phytophthora pudricin de la raz (PRR); en sus estudios tiene 3
objetivos: 1) la hibridacin somtica de aguacate con especies de Persea resistentes
49
a PRR por medio de la fusin de protoplastos, 2) la transformacin gentica de
portainjertos de aguacate con genes relacionados a la patognesis y 3) el desarrollo
de un protocolo eficiente in vitro para micropropagacin de los portainjertos actuales
y los futuros. Tambin indica que muchos frutos tropicales y subtropicales pueden
reproducirse vegetativamente por la formacin de nucelas, ste es un tejido ovular de
origen materno; as se debe tener la habilidad para demostrar la facilidad de regenerar
las selecciones de aguacate elite por induccin de embriognesis somtica
de nucelas, despus de removerse de semillas jvenes; los embriones nucelares de
aguacate pueden ser utilizados para propagar las selecciones de portainjertos
actuales, pero pueden tambin ser utilizadas en estudios de transformacin gentica
en orden para alterar un cultivar importante por un tratamiento, tales como el control
de la madurez de la fruta o PRR.
Se indujo el desarrollo de cultivo de callos a partir de peciolos de hojas, yemas
axilares y embriones cigticos de nueve variedades de cinco especies de Persea (P.
cinerascens, P. borbonia, P. schiedeana var. G755, P. indica, P. americana cv. Topa
topa y cv. RCF Prpura, y tres clones vegetativos de P. americana : VC6, VC51 y
VC66), con variacin en su resistencia a la pudricin de la raz del aguacate,
enfermedad causada por el hongo Phytophthora cinnamomi; fueron establecidos
procedimientos de desinfeccin de explantes y cultivos de callos y suspensiones;
fueron determinados parmetros de crecimiento comparativos para varios callos; la
yema axilar y el peciolo de hoja fueron los mejores explantes para la induccin de
callo en todas las variedades excepto para P. borbonia, la cual fue mejor inducida de
semillas maduras; un alto promedio de supervivencia (70%) de embriones somticos
fue logrado de callo de aguacate (P. americana) en un medio con cido abscsico 10
mg/I; brotes o brotes y races desarrollaron de embriones somticos en un 12% y 1 %,
respectivamente, en un medio que contena 0.1 mg/l de thidiazurn + 0.5 mg/I de
cido giberlico; los cultivos de Persea se utilizaron para estudiar su respuesta a la
inoculacin de P. cinnamomi y para una posible seleccin in vitro de nuevos clones
resistentes (Raviv et al., 1998).
50
Cruz (1998) a partir de embriones cigticos inmaduros de aguacate induce la
formacin de callo embriognico en medio de cultivo basado en los
macronutrimentos minerales B5 (Gamborg et al., 1968) y micronutrimentos MS,
tiamina 4 mg/I, mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l, sacarosa 30 g/I y agar 8 g/I; el
mantenimiento de las masas proembriognicas fue logrado en el mismo medio de
induccin con excepcin de los macronutrimentos, en esta etapa y en las siguientes
us MS; en la recuperacin de embriones somticos no utiliz reguladores de
crecimiento, en el desarrollo y maduracin de embriones utiliz BA (0.1 mg/l) y
solamente en la ltima etapa emple AG
3
(0.1 M9/0
Un grupo de investigadores de Malaga, Espaa (Pern-Quesada et al., 1999)
estudiaron el efecto del regulador de crecimiento cido abscsico, la sacarosa y un
agente gelificante (gelrite), sobre la produccin y maduracin de embriones
somticos de aguacate; partieron de callo embriognico del cv. Anaheim, iniciaron
suspensiones en medio basa) MS suplementado con picloram 0.1 mg/l; filtraron las
suspensiones a travs de una malla de 2 mm de dimetro y cultivaron la fraccin ms
pequea en medio basa) B5 solidificado con 1.7 g/I de gelrite y suplementado
con: 88, 175, 263 mM de sacarosa o 1, 10 y 100 M de ABA; en el experimento con
gelrite se utiliz medio basa) B5 solidificado con 1.7, 3.4 y 6.8 g/I de gelrite;
encontraron que la concentracin del agente gelificante tuvo un efecto significativo
sobre la produccin de embriones somticos observndose que tanto el nmero de
embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, como el porcentaje de
regeneracin, fueron mayores en la concentracin ms alta de gelrite, 6.8 g/l; la
ytilizapin de elevadas concentraciones de sacarosa tambin tuvo un efecto positivo
sobre la formacin de embriones somticos blanco-opacos, en dosis de 175 mM de
sacarosa se obtuvo el mayor nmero de embriones, as como el mayor porcentaje de
regeneracin a lo largo de tres subcultivos; los resultados obtenidos con el ABA no
fueron concluyentes.
En Florida, USA, Witjaksono y Litz (1999a) indujeron cultivo embriognico de
embriones cigticos inmaduros de aguacate (colectados entre las 3 semanas a 2
51
meses despus de la polinizacin) representado por diferentes razas botnicas e
hbridos complejos; el medio de induccin ptimo consisti de macronutrimentos B5,
micronutrimentos MS, tiamina-HCI 0.4 mg/I, mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/I,
picloram 0.41 M y agar TC 8 g/I; la embriognesis somtica se present directamente
de los explantes en medio de induccin, y proliferaron embriones secundarios y
masas proembriognicas en medio de mantenimiento lquido y en slido; el
mantenimiento del cultivo embriognico fue optimizado en lquido, el medio MS
filtrado-esterilizado, se suplement con sacarosa 30-50 mg/I, tiamina-HCI 4 mg/I y
picloram 0.41 M; dos tipos de cultivo embriognico se reconocieron: genotipos que
proliferaron como masas proembriognicas (tipo-PEM) en presencia de auxina y
genotipos en los cuales la etapa de corazn y las etapas posteriores de embriones
somticos (tipo-SE) desarrollaron en presencia de auxina; los cultivos embriognicos
en suspensin llegaron a ser cada vez ms desorganizados con el tiempo, y esto fue
asociado con una perdida progresiva del potencial embriognico.
En otro estudio (Witjaksono y Litz, 199%) utilizaron masas proembriognicas
de aguacate de cultivos en suspensin para establecer un protocolo en el desarrollo
y maduracin de embriones somticos; los embriones somticos desarrollaron de
masas proembriognicas tanto en medio lquido como en semislido pero slo los
ltimos pudieron desarrollarse para maduracin; el tamao y el nmero de los
embriones somticos opacos se afect por la concentracin del agente gelificante
(gel-gro gellan gum), con una ptima respuesta en medio suplementado con 6-7 g/l de
gel-gro; la concentracin ptima de sacarosa para la recuperacin de embriones
somticos opacos fue 90 g/I; sin embargo, el desarrollo de los embriones fue
suprimido en esta concentracin; consecuentemente, la recuperacin de los
cotiledonarios, embriones somticos opacos fue lograda en medio con 30 g/I de
sacarosa; los embriones somticos desarrollaron de las masas proembriognicas
desdiferenciadas requiriendo para ello de medio con un alto promedio de NO
-
3
:NH
+
4
(1:0 y 3:1) en comparacin con la proporcin estndar (2:1) de medio MS; la
germinacin de los embriones somticos fue espordica.
52
Las investigaciones realizadas indican que el sistema de embriognesis
somtica resulta ms rentable en comparacin a la organognesis, esto porque en
poco espacio es posible producir una gran cantidad de embriones somticos para su
maduracin y encapsulacin, y as tener semillas sintticas; adems el sistema como
tal, tiene tambin otras aplicaciones de enorme importancia en el mejoramiento del
aguacate, no obstante que para recuperar los tejidos transformados, seleccionados o
aquellos que se conservaron in vitro se requiere el tener previamente la metodologa
de multiplicacin de brotes, el enraizamiento y la aclimatacin de las plntulas
(organogness).
Especficamente en aguacate son pocos los estudios realizados para
determinar un sistema ptimo de embriognesis somtica, mximo cuando la mayor
parte de estos utilizaron embriones cigticos inmaduros como explante en la
generacin de callo embriognico, situacin en la cual no se garantiza la propagacin
clonal, y establecen procedimientos imprcticos o compuestos de los medios de
cultivo en muchos casos demasiado costosos; adems de que las investigaciones
reportan una germinacin espordica de los embriones maduros o con porcentajes
demasiado bajos. De ah que se requiere un sistema va embriognesis somtica
que garantice en primera instancia la propagacin clonal, que sea prctico y
altamente eficiente.
2.4. Factores que intervienen en la morfognesis in vitro
Abdelnour y Vicent (1993) destacan algunos de los factores importantes que
influyen en la induccin de la organognesis y embriognesis somtica, estos son el
genotipo, edad de la planta, estado fisiolgico de la planta al momento de tomar el
explante y condiciones del ambiente in vitro (factores fsicos y qumicos).
En un estudio en mora (Morus alba L. vars. Chinese white y Kokuso-27) se
encontr que la callognesis fue dependiente de la naturaleza del explante usado, el
genotipo y los reguladores de crecimiento suplementados en el medio de cultivo; las
53
hojas fueron el mejor tipo de explante usado para induccin de callos (Bhau y Wakhlu,
2001).
2.4.1. Inculo o explante
La eleccin del explante (rgano, tejido o fragmento de tejido, clulas, etc.
cortado u obtenido del material parental para iniciar el cultivo in vitro) adecuado,
constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, ste variar de
acuerdo con el objetivo perseguido. Se ha demostrado que la edad fisiolgica del
mcula es un factor importante en la formacin de rganos, entre ms joven y menos
diferenciado sea un tejido, ms fcil ser su adaptacin y respuesta al cultivo in vitro
(Halperin, 1996). Esto por el transporte basiptalo de auxinas, al ocurrir una
acumulacin en la base del explante, lo cual permite la formacin de callo,
produccin de races y/o inhibicin del desarrollo de brotes en las yemas axilares
ms cercanas (Lomax et al., 1995; Jensen et al., 1998).
2.4.2. Factores fsicos
Entre stos destacan el pH del medio de cultivo, intercambio gaseoso,
humedad, luz y temperatura.
pH. El grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y
especfico para cada tipo de planta, al igual que ocurre en el suelo las especies
vegetales responden de manera diferente, por lo que se hace necesario ajustarlo a
los requerimientos de la especie en estudio. Sin embargo, el pH adecuado en medio
de cultivo se encuentra en un rango de 4.5 a 7 para las plantas, es el pH 5.7 el ms
generalizado (Abdelnour y Vicent, 1993).
Intercambio gaseoso. Los gases ms comunes son O
2
(oxgeno), CO
2
(dixido de carbono) y C
2
H
4
(etileno). En recipientes de cultivo cerrados
hermticamente se ha detectado una acumulacin de gases (dixido de carbono
54
CO
2
, etileno C
2
H
4
y etano) y otras sustancias como etanol y acetaldehdo que,
adems de influir o controlar el crecimiento, tambin pueden afectar los procesos de
diferenciacin y morfognesis (Righetti et al., 1990).
En un estudio sobre dosificacin de CO
2
en nueve especies vegetales, se
observ que el crecimiento en dosis alta de este gas increment el nmero de
mitocondrias por unidad de rea celular de 1.3-2.4 veces el nmero en plantas
control que crecieron en ms bajo CO
2
y produjeron un incremento significativo
estadsticamente en la cantidad de estroma del cloroplasto (sin presin), membranas
tilacoides, comparado con estos en tratamientos ms bajos de CO
2
; no se
observaron cambios en el tamao de la mitocondria; sin embargo, en contraste al
efecto del CO2 en el nmero de mitocondrias, altas dosis de CO
2
promueve una
disminucin en el promedio de masa basado en la respiracin obscura; estos cambios
pueden reflejar un mayor cambio en el metabolismo vegetal y el balance de
energa que puede ayudar a explicar el incremento de la productividad de la planta
en respuesta a elevadas concentraciones de CO
2
(Griffin et a/., 2001).
Humedad. En condiciones in vitro la humedad dentro de los recipientes es de
casi 100 %. Por eso la planta in vitro en general no desarrolla sistemas de regulacin
hdrica tales como cera, estomas, cutcula, etc (Abdelnour y Vicent, 1993), de ah que
se dificulte la aclimatacin de las plantas micropropagadas.
Luz. Es conocido que la luz es una seal importante para el desarrollo de la
planta, influye en casi todos los aspectos del ciclo de la vida desde germinacin
hasta floracin (Campbell y Liscum, 2001).
En condiciones in vitro clsicas, la intensidad y calidad de la luz es muy baja
(10 W/m
2
en comparacin con las condiciones naturales donde la luz puede
presentar una intensidad hasta de 900 W/m
2
). La calidad de la luz tambin es muy
baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una misma sala para tener
diferentes longitudes de onda. El espectro til para los vegetales es de 400 a 700
55
nm. Dos fenmenos importantes dependientes de la luz son: fotosntesis y
fotomorfognesis (Abdelnour y Vicent, 1993).
La morfognesis funciona con la presencia de pigmentos susceptibles a
radiacin azul y roja. Las funciones ms conocidas son las del pigmento susceptible al
rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm); expansin foliar, elongacin de
entrenudos, diferenciacin de estomas, sntesis de clorofila, etc. La falta de CO
2
disminuye los requerimientos lumnicos de los cultivos, es ms importante su papel en
fotomorfognesis que en fotosntesis (Caal et al., 1999).
Las respuestas diversas de las plantas requieren sofisticada sensibilidad de
intensidad, direccin, duracin y longitud de onda de la luz; el espectro de accin de
respuesta de la luz tiene previsto pruebas para identificar tres fotorreceptores
absorbentes en el ultravioleta, azul/cercano a ultravioleta y rojo/rojo-lejano (R/FR); el
mejor grupo caracterizado de esos fotorreceptores es R/RF fitocromos absorbentes.
Los fitocromos controlan el desarrollo hasta el final del ciclo de vida de la planta, al
iniciar con la germinacin de la semilla y de-etiolacin de la plntula (la transicin del
crecimiento en la oscuridad a luz), ellos slo controlan la expansin de la hoja del
cotiledn y elongacin del tallo por la regulacin de la divisin celular y expansin;
los fitocromos permiten la percepcin de plantas vecinas o la sombra, e influyen la
transicin a floracin (Neff et al., 2000).
2.4.3. Factores qumicos
El medio de cultivo. Consiste en una mezcla de determinadas sustancias
sobre o dentro del cual crecen los explantes. Son combinaciones de sustancias
qumicas que los investigadores han descrito despus de numerosos experimentos y
que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro. Lpez (1990) indica
que en general los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes
compuestos:
56
1. Sales inorgnicas.
A) Macronutrimentos. Adems del carbono, hidrgeno y oxgeno, los
elementos ms demandados por las plantas son: nitrgeno, fsforo, potasio, calcio,
magnesio y azufre.
El nitrgeno tiene importancia porque forma parte de la estructura de las
molculas proteicas, cidos nucleicos, porfirinas que intervienen en la fotosntesis, en
general es un elemento esencial porque determina en gran medida la tasa de
crecimiento del tejido; al comparar con el ion nitrato NO
3-
(es la forma ms oxidada
del nitrgeno), el in amonio, NH
4+
es la forma ms reducida; las plantas utilizan
nitrgeno reducido para su metabolismo, y dentro de la planta el nitrgeno existe casi
en su mayor parte en la forma reducida. El fsforo interviene en la estructura de
molculas nucleicas y en la sntesis de compuestos de alta energa, adems de que
participa en la activacin de diversas enzimas; el fsforo es adsorbido por la planta en
forma de iones de fosfato por un proceso que requiere transporte activo con gasto
de energa. El potasio es necesario para la divisin celular normal, sntesis de
carbohidratos y clorofila y asimilacin de nitrgeno, importante en la apertura y
cerrado de estomas, es un activador de enzimas en la sntesis de ciertos pptidos, de
protenas y de CHOs; los iones de potasio son rpidamente transportados a
travs de las membranas y dos de sus funciones ms importantes son regular el pH
y el ambiente osmtico dentro de las clulas (George, 1993; Salgado, 1998).
El calcio es un constituyente de la pared celular en forma de pectato de calcio
y esta involucrado en la plasticidad de las clulas, ya que la remocin del calcio
incrementa la permeabilidad y la plasticidad de la membrana, entre otras funciones
tambin est la organizacin de cromatina en la mitosis, activador de enzimas
(fosfolipasa, arginina-cinasa, ADP fosfatasa y adonil cinasa), nmero de mitocondrias
y en la translocacin de CHOs. El magnesio es importante en los procesos de
fotosntesis y metabolismo de carbohidratos, es un constituyente de la clorofila,
activador de enzimas (biosntesis de CHOs, sntesis de ADN y ARN, fijacin de CO
2

RUBISCO y PEP carboxilasa) y agente de unin de ribosomas (sntesis de
57
protenas). El azufre est presente en algunas protenas en forma de aminocidos
azufrados y constituyente de vitaminas (tiamina y biotina), coenzima A, enzimas
(grupos sulfidrilos), sntesis de esteroles y lignina, importante en la fotosntesis
(sntesis de ferrodoxina); el azufre es absorbido por la planta como S0
4
-2
(George,
1993; Salgado-Garciglia et al., 1997; Prez et al., 1999).
b) Micronutrimentos. Los ms importantes son fierro, manganeso, zinc, boro,
cobre, cobalto y molibdeno, estos ltimos cinco son fundamentales para la sntesis
de clorofila y la funcin de los cloroplastos (Lpez, 1990). El fierro es requerido para
la formacin de los precursores de la clorofila, tiene incorporacin en citocromos y
ferrodoxina, y es componente de varias flavoprotenas (peroxidasas y catalasas). El
manganeso es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso
fotosinttico (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de
manganeso), esencial en los pasos de transferencia de electrones, activador de
enzimas en: ciclo de Krebs, reduccin de nitratos y oxidacin del cido indolactico
(AIA). Cobre y zinc se requieren en la oxidacin e hidroxilacin de compuestos
fenlicos, el zinc adems participa en la sntesis de AlA, a travs de la sntesis de
triptofano (triptofano sintetasa). Molibdeno y fierro forman parte de las enzimas
nitrato reductasa y nitrogenasa. Cobalto es el metal componente de la vitamina B12,
la cual se involucra en la sntesis de cidos nucleicos. Boro es necesario para el
mantenimiento de la actividad meristemtica, est involucrado en la sntesis de
bases nitrogenadas, en particular uracilo, interviene en el transporte de CHOs dentro
de la planta y facilita transporte a travs de membranas (George, 1993; Salgado,
1998).
2. Agentes quelatos. Son compuestos orgnicos que son capaces de formar
complejos con cationes metlicos, en los cuales el metal es sostenido por medio de
enlaces. Son molculas que retienen un in de metal con varias uniones qumicas al
formar un complejo en forma linear o de anillo (EDTA= cido etilendinitrotetra-
actico) (Lpez, 1990; George, 1993).
58
3. Vitaminas. Se requieren en la realizacin de una serie de reacciones
catalticas en los sistemas enzimticos y se emplean en pequeas cantidades. Las
ms utilizadas son: tiamina (vitamina B1) es la nica realmente esencial en casi todos
los tejidos vegetales, cido nicotnico (niacina), piridoxina (vitamina B6), cido
pantotnico ayuda en el crecimiento de ciertos tejidos, cido flico disminuye la
proliferacin de tejido en la oscuridad, mientras que en la luz la aumenta, riboflavina
inhibidor del crecimiento de races, vitamina E ayuda a la formacin de callos y en
cultivos en suspensin ayuda la viabilidad de las clulas y mioinositol no es
propiamente una vitamina sino un azcar-alcohol que tiene efecto estimulante en la
morfognesis y ayuda a la formacin de varios constituyentes celulares como el
cido ascrbico y la pectina, adems de otros compuestos que intervienen en la
divisin celular (Lpez, 1990; Salgado-Garciglia et al., 1997).
4. Aminocidos. Se utilizan como fuente de nitrgeno; glicina es el nico
aminocido usado en medios de cultivo para clulas vegetales; casena hidrolizada
se emplea para enriquecer en nitrgeno el medio de cultivo; otros arginina, L-
metionina, glutamina y asparagna (Salgado-Garciglia et al., 1997).
5. Reguladores decrecimiento. (Vase apartado 2.1.).
6. Carbohidratos. Se utilizan como fuente de energa y como reguladores
osmticos. La sacarosa es la mejor fuente de carbono (George, 1993), y es el azcar
ms empleada, le siguen la glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa, manosa
y lactosa (Lpez, 1990). Se adiciona usualmente en cantidades de 20 a 45 g/l; al
esterilizar el medio se obtiene la combinacin de sacarosa, D-glucosa y D-fructosa
(Salgado-Garciglia et al., 1997).
7. Agentes gelificantes. El agar se ha empleado como soporte en los medios
slidos y semislidos, es un derivado de una alga marina; es un polisacrido con una
elevada masa molecular que tiene capacidad de gelificar los medios (Pierik, 1990).
Generalmente se emplea agar-agar a una concentracin de 0.5 a 0.6%. Se ha
59
estudiado el efecto de la concentracin y marca comercial de agar, los resultados
indican que no existe una correlacin entre las caractersticas y el crecimiento de las
plantas (Caal et al., 1999).
8. Agua. Es el compuesto ms abundante (95%) del medio de cultivo, por lo
tanto la purificacin es necesaria, misma que se lleva a cabo por destilacin, por
intercambio de iones y por smosis inversa (George, 1993). Se utiliza agua
destilada, bidestilada y desionizada.
Por otra parte las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las
caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de las plantas formadas in vitro estn
influenciadas por el ambiente fsico, qumico y gaseoso de los recipientes (Kozai et
al., 1992; Buddenford-Joosten y Woltering, 1994). Este mismo grupo de
investigadores hacen una clasificacin de los factores que pueden afectar al
crecimiento y morfognesis de las plantas n vitro (Figura 1), mencionan que los
fenmenos que controlan los cambios ambientales en el interior de un recipiente de
cultivo son similares a los que ocurren en el interior de un invernadero, ya que de
hecho un recipiente de cultivo es, hasta cierto punto, un invernadero en miniatura
mantenido en condiciones aspticas. De manera concreta Caal y col. (1999)
resumen algunas de las respuestas ms habituales de los explantes introducidos en
cultivo, como resultado de la interaccin que se produce entre los explantes y las
caractersticas ambientales descritas (Cuadro 2).
60
61
Cuadro 2. Respuesta al ambiente en la micropropagacin convencional.
Tejidos Planta
1. Disminucin o alteracin del contenido
de ceras epicuticulares
1. Menor tasa de crecimiento
2. Funcionamiento estomtico anormal 2. Crecimiento suculento
3. Disminucin del contenido de clorofila 3. Desordenes fisiolgicos y morfolgicos
4. Menor peso seco final 4. Formacin de pocas races secundarias
5. Disminucin del rea foliar 5. Elevada variabilidad en tamao, forma
y estado de desarrollo
6. Disminucin del nmero estomtico 6. Mayor frecuencia de mutaciones
7. Menor desarrollo anatmico 7. Presencia de contaminaciones
Lo anterior explica las dificultades para aclimatar plantas cuando existen
problemas en la regulacin estomtica que provoca estrs hdrico y la existencia de
menor cantidad de ceras epicuticulares; de ah que debido a las condiciones
anatmicas y fisiolgicas de las plntulas que se desarrollaron in vitro, se requiere
mantener una alta humedad los primeros das despus del transplante; para este
propsito un significativo nmero de laboratorios comerciales tienen sistemas de
nebulizacin o bien recurren al uso de antitranspirantes como Folicote (Preece y
Sutter, 1991).
62
III. MATERIALES Y MTODOS
3.1. Localizacin del sitio de investigacin
La presente investigacin se desarroll en los laboratorios de Biotecnologa -
Cultivo de Tejidos Vegetales e invernadero del Campo Experimental Forestal y
Agropecuario Uruapan, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales, Agrcolas y Pecuarias, ubicado en la ciudad de Uruapan, Michoacn, en
el Instituto de Investigaciones Qumico-Biolgicas de la Universidad Michoacana de
San Niclas de Hidalgo, Ciudad Universitaria Morelia, Michoacn y en el Centro de
Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional Unidad
Irapuato, Guanajuato.
3.2. Material biolgico
Los explantes empleados en el sistema de organognesis fueron yemas
axilares que se encontraban en el ltimo crecimiento de las ramas laterales de un
rbol de aguacate criollo raza mexicana, Persea americana Mill. var. drymifolia, de 32
aos de edad. En tanto que para el sistema de embriognesis somtica se utilizaron
nucelas obtenidas de frutos de 10 a 12 mm de dimetro, tambin de un solo rbol de
aguacate, P. americana cv. Hass, de 12 aos de edad; ambos fueron seleccionados
en el rea del Campo Experimental Uruapan.
3.3. Reactivos utilizados
Los diferentes medios de cultivo o soluciones que se emplearon en el estudio,
se prepararon con los reactivos que se anotan en el Anexo 1.
63
3.4. Organognesis de aguacate criollo
3.4.1. Definicin de las condiciones aspticas del explante
Las pruebas en desinfeccin del explante se llevaron a cabo en dos formas:
superficial o externa e interna. En la desinfeccin externa se realizaron 6 pruebas
con diferentes combinaciones en dosis del fungicida Benlate (benomilo, 1 y 2 g/I),
fungicida-bactericida Agrimicin 500 (sulfato de estreptomicina + clorhidrato de
oxitetraciclina + oxicloruro de cobre, 1 y 2 g/I) e hipoclorito de sodio comercial (20, 40
y 60%), adems de probar diferentes tiempos de permanencia (10, 15 y 20 minutos)
del explante en el producto y realizar la desinfeccin en diferentes pocas del ao.
Desinfeccin interna. Para eliminar los patgenos endgenos en el explante,
se llevaron a cabo cuatro pruebas: en la primera se prob la dosis de Benlate (0, 0.5,
1.0 y 2.0 g/l de medio de cultivo); adems se evalu si este producto se inactiva con
la esterilizacin. En cada tratamiento se utilizaron 6 frascos tipo Gerber con 3
explantes por frasco en 20 ml de medio, preparado con las sales minerales
completas y vitaminas del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con BA 1 a 2 mg/l,
AIB 0.5 y 0.66 mg/I, azcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y cido ascrbico 25 mg/l;
se midi el porcentaje de contaminacin a los 4, 6 y 12 das despus del
establecimiento y el porcentaje de necrosis nicamente a los 12 das.
En la segunda prueba se probaron dos factores, la interaccin Benlate con
Agrimicin 500 (0 - 0, 1 - 0, 1 - 0.5, 1 - 1, 0.5 - 1 y 0 - 1 gll de medio de cultivo) y
tiempo de permanencia del explante en el medio con los productos anteriores
(permanencia continua, 7, 14 y 21 das), el medio empleado fue MS con la mitad de
sus sales minerales, suplementado con vitaminas MS, BA 1.0 mgll, AIB 0.5 mg/l,
azcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y cido ascrbico 50 mg/I; en este medio se
incorpor el fungicida y el fungicida - bactericida en las dosis indicadas, se prepararon
54 tubos de ensaye con 10 ml de medio y se emplearon 3 tubos por
tiempo de permanencia en cada tratamiento, con una microestaca o yema axilar
64
establecida por tubo; la variable tomada fue solamente porcentaje de contaminacin
a diferentes tiempos en cada tratamiento.
La tercera prueba contempl nuevamente la evaluacin de dos factores, la
interaccin Benlate con el bactericida Agrimicin 100 (1 -1, 1 - 0, 0 -1, 0.5 - 0.5 y 0 - 0
g/I de medio de cultivo) y tiempo de permanencia del explante en el medio con el
fungicida y bactericida (8, 16, 31 y 50 das), en cada tratamiento del primer factor se
emplearon 25 tubos de ensaye con 10 ml de medio de cultivo cada uno y en el
segundo factor se recultivaron 5 yemas axilares una por tubo despus del perodo
de permanencia, el medio de cultivo fue preparado con sales MS a 1/5 parte de sus
macroelementos y microelementos, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, BA 2 mg/I,
AIB 0.2 mg/l, azcar 30 g/I, agar 6 g/l, pH 5.7 y cido ascrbico 25 mg/I; se registr el
porcentaje de contaminacin y el de necrosis a 8, 17, 24, 31, 41 y 53 das del
establecimiento o del recultivo a medio sin los pesticidas para determinar el mejor
tratamiento.
Por ltimo y con la finalidad de observar la posibilidad de eliminar los
pesticidas del medio de cultivo y evitar la contaminacin, se realiz la prueba de
tiempos de permanencia del explante en solucin con Benlate y Agrimicin 100 en
dosis de 1 g/I de cada producto, los tratamientos evaluados fueron: 0, 24, 48 y 73
horas y posteriormente siembra en medio sin pesticidas, en contraste con siembra en
medio con Benlate 1 g/I; se establecieron 20 explantes por tratamiento en tubo de
ensaye y se obtuvo el porcentaje de contaminacin.
3.4.2. Prevencin de necrosis del explante
Se realizaron dos tipos de tratamientos para evitar la necrosis del tejido de las
microestacas de aguacate utilizadas como explante. Para lo anterior se dio un lavado
continuo al explante a chorro de agua; se prob tiempo de permanencia del explante
a chorro de agua (15, 30, 60 y 90 minutos). Posteriormente, de la desinfeccin de las
microestacas y previo a su establecimiento en el medio de cultivo se probaron en
65
solucin acuosa, las dosis siguientes del antioxidante cido ascrbico: 0, 100, 200,
300 y 400 mg/I, con una permanencia del explante en la solucin de 30 y 60 minutos,
para su posterior establecimiento en el medio sin el antioxidante, en contraste con el
tratado a 100 mg/1 de cido ascrbico durante 30 minutos y colocado en medio con
antioxidante. El medio de cultivo empleado fue MS a 1/5 parte de su concentracin
complementado con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l, BA 2 mg/l, AIB 0.2 mg/I,
azcar 30 g/I, agar 6 g/I y Benlate 1 g/I, a los 13 das se recultivaron todos los
explantes de los tratamientos al mismo medio, pero sin Benlate; se utilizaron 10
tubos de ensaye por tratamiento con un explante por tubo; las variables evaluadas
fueron: porcentaje de oxidacin a los 30 das, y porcentaje de brotacin a los 70 das.
3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo para lograr la organognesis in vitro de aguacate criollo
3.4.3.1. Induccin de brotes
Se realizaron 8 pruebas preliminares con la finalidad de inducir la brotacin in
vitro de las yemas axilares contenidas en microestacas de aguacate; en la primera se
evaluaron los medios de cultivo con los reguladores de crecimiento reportados por
Neel y col. (1982) en Persea indica, Gonzlez y Salazar (1984) en P. americana raza
antillana, Gonzlez y col. (1985) en P. schiedeana, Shall (1987) en P. americana cv.
Fuerte y el de Solrzano-Vega (1989) en P. americana cv. Colin V-33. Sin embargo,
las pruebas que aportaron resultados concluyentes fueron dos: a) concentracin de
sales minerales MS, WPM y Mc Cown's, los tratamientos evaluados se presentan en
el Cuadro 3, y b) barrido de reguladores de crecimiento citocinina - auxina en sales
minerales MS, BA (0, 1, 2 y 3 mg/l) - AIB (0, 0.2, 0.5 y 1 mg/l), se formaron 16
tratamientos.
El medio de cultivo se complement con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l,
BA 2 mg/I, AIB 0.2 mgll, azcar 30 g/l, agar 6 g/I, pH 5.7, Benlate 1 g/I y cido
ascrbico 50 mg/l, excepto el tratamiento 6 en el cual la dosis de reguladores fue de
66
2 mg/1 de BA y AIB. Se establecieron 25 yemas axilares por tratamiento y a los 16
das se recultivaron en medio sin fungicida. Se registr el porcentaje de brotacin y
establecimiento a los 55, 100 y 127 das y el crecimiento del brote principal, para
obtener esta ltima variable se obtuvo la longitud promedio de los brotes en mm a los
72, 96, 100, 117 y 127 das.
En el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB el establecimiento
fue en 5 frascos por tratamiento con 4 yemas axilares por frasco, en medio base
MS al 40% de sales, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, azcar 30 g/l, pH 5.7, agar 5
g/l, Benlate 1 g/I y cido ascrbico 50 mg/I; se recultivaron en medio sin Benlate a los
22 das. Se obtuvo el porcentaje de brotacin y establecimiento a los 60, 96 y 110
das, as como la longitud del brote principal a los 96 y 110 das.
67
3.4.3.2. Multiplicacin de brotes obtenidos in vitro
Con la finalidad de multiplicar in vitro los brotes de aguacate obtenidos de la
fase de iniciacin se establecieron dos experimentos, en el primero se evalu la
interaccin BA - AIB (0 - 0, 0.5 - 0.05, 1 - 0.1, 1.5 - 0.15 y 2 - 0.2 mg/I) en sales
minerales modificadas completas (Cuadro 4) y a 1/2 de su concentracin con
adenina 40 mg/I, se establecieron 10 frascos por tratamiento con tres explantes por
frasco; las variables obtenidas fueron: nmero y longitud de brotes a los 40 y 70 das.
En tanto que el segundo estudio y ms concluyente, con sales MS completas y sin
adenina, se realiz un barrido de reguladores de crecimiento BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9
mg/I) y AIB (0, 0.05, 0.1 mg/I), as se formaron 12 tratamientos con 10 frascos y tres
explantes por frasco en cada tratamiento; se consideraron las variables de: das a
brotacin, color del brote, formacin de callo y de brote, nmero de brotes laterales
por explante - frasco y longitud de los brotes.
3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro
En dos experimentos se determin el medio de cultivo ptimo para el
enraizamiento in vitro de brotes de aguacate; en el primero se probaron dos tipos de
sales minerales (MS y modificadas, Cuadro 4) y las auxinas: AIB (0, 0.5, 0.8, 1.1 y
1.4 mg/I), ANA (0, 0.3, 0.6, 0.9 y 1.2 mg/I) y la interaccin AIB 0.5 mg/1 - ANA 0.3
mg/I. En el segundo experimento con sales minerales MS completas se estudiaron
dosis de AIB (0, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2 mg/I) y la interaccin AIB - AG
3
en dosis de
0.6 - 0.125, 0.8 - 0.125, 1.0 - 0.125 y 1.0 - 0.25 mg/I; en los dos estudios la unidad
experimental fue el frasco con tres explantes y 10 frascos por tratamiento. Las
variables evaluadas fueron: inicio de emisin de races, nmero de races por frasco
- brote, porcentaje de brotes con raz, promedio de races por brote y longitud de
raz.
68
Cuadro 4. Composicin de sales minerales MS y modificadas en macroelementos,
utilizadas en las pruebas de multiplicacin y enraizamiento in vitro de
brotes de aguacate.
Cantidad (mg/1)
Compuesto MS Modificadas
NH
4
NO
3
1,650 1,000
KNO
3
1,900 800
CaCl
2
2H
2
O 440 0
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O 0 1,250
MgSO
4
7H
2
O 370 1,250
KH
2
PO
4
170 382
3.4.4. Aclimatacin de plntulas de aguacate obtenidas in vitro
Se probaron diferentes sustratos y procedimientos para aclimatar en el menor
tiempo y con alta supervivencia las plntulas de aguacate obtenidas in vtro, en total
se realizaron 9 pruebas (Cuadro 5) en donde las variables medidas fueron porcentaje
de supervivencia y altura de planta.
Debido a que en las primeras pruebas se obtuvieron resultados negativos, fue
necesaria la realizacin de estudios citolgicos, esto para determinar con precisin el
estado de desarrollo de las clulas compaeras o estomticas; se llevaron a cabo
observaciones de estomas y cutcula de hojas de plntulas obtenidas en laboratorio
por cultivo de tejidos en comparacin con hojas de plantas de vivero y rbol adulto,
este estudio proporcion informacin que sirvi en gran medida para dirigir los
tratamientos a las plntulas; los datos se obtuvieron al utilizar un microscopio de
fases con un ocular 10X, objetivo 40X y un micrmetro ocular en rejilla de 1 mm
2
, se
midi la frecuencia de estomas (FE), frecuencia de clulas no estomticas (FCNE) e
ndice estomtico (IE) que se determin con base en la siguiente formula
(Barrientos y Snchez, 1987)
69
Cuadro 5. Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimatacin de brotes
de aguacate criollo obtenidos in vitro.
No. Descripcin de prueba Tratamientos
1 Proteccin de prdida de humedad. 1. Entrada de aire.
Sustrato de turba tratado con benlate 1g/I y fertilizado con 2. Cierre total con bolsa de polietileno.
30-10-10
1 g/1. 4 repeticiones por tratamiento.
2 Evaluacin de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%
Sustratos tratados con benlate 1 g/I y fertilizados con 30- 2. Sustrato de turba 50% + arena 50%.
10-10 1 gll.
16 repeticiones por tratamiento.
3 Evaluacin de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%
Sustratos tratados con captan 15 g/l + benlate 1 g/I y
fertilizados con 30-10-10
1 g/l + raizal 5 g/I + cido hmico 0.5 cc/I.
2 repeticiones por tratamiento.
2. Tierra "topuri" 50% + arena 50%
4. Evaluacin de sustratos. 1. Agrolita 100%
Sustratos tratados con: a) captan 7.5 g/l + benlate 1 g/I y 2. Arena de "tezontle" 100%
fertilizados con 30-10-10 3. Sustrato de turba 100%
1 g/l + raizal 5 g/I + cido hmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I; 4. Tierra "topuri" 100%
al momento del trasplante se aplico radix 1500 (1500 ppm 5. Arena + Sustrato de turba 50% c/u
de AIB). 6. Arena + tierra 50% c/u
b) captan 7.5 g/I + benlate 1 g/l y fertilizado con raizal 5 g/I 7. Corteza de pino 100%
+ medio liquido MS 100% complementado con vitaminas 8. Arena + corteza 50% c/u
MS, mioinositol, AIB 0.5 mg/l, AG
3
0.25 mg/I, azcar 3%, 9. Sustrato de turba+corteza 50% c/u
pH 5.7. Se establecieron 5 repeticiones por tratamiento 10. Tierra + corteza 50% c/u.
11. Sust. de turba 70% + agrolita 30%.
5 Evaluacin de intensidades de luz. 1. Intensidad de luz 250 luxes
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con ridomil
cobre 8 g/1 + agrimicin 100
5 g/l y se fertilizo con 30-10-10 1 g/l + 0.5 cc/l de cido
hmico. 5 repeticiones por tratamiento.
2. Intensidad de luz 4000 luxes
6 Evaluacin de fertilizacin lquida y reguladores de 1. Fertilizacin MS 100% con vitaminas
crecimiento. MS, mioinositol, BA 0.5, AIB 0.25
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, esterilizado en mg/I, AG
3
0.25 mgll, azcar 3%, pH
autoclave y tratado con benlate 1 g/l. 15 repeticiones por 5.7. A 5 plantas se les aplic ac.
tratamiento. Acetilsalisilico (ASA) 500 mg/I y a 5
2. ac. Absicico (ABA) 4.4 mg/l.
Fert. 30-10-10 1 g/I + cido hmico
0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I.
7 Evaluacin de ASA y Folicote. 1. Aplicacin de ASA 250 mgll
Sustrato arena 50% + turba 50%, tratado con benlate + 2. Folicote (49.46% agua,
agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y fertilizado con 30-10- 41.6% parafina y cera refinada, 4.5%
10 1 g/I + raizal 5 g/l. 20 repeticiones por tratamiento. aceite mineral, 4.3% emulsificante y
0.14% preservativos), en dosis de 1
parte en 20 de agua.
3. Control.
8 Evaluacin de Folicote. Dosis de Folicote
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 1. 1 parte en 20 de agua.
benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/l de c/u y se 2. 1.5 " " " "
humedeci con medio lquido'/2 de MS con vitaminas MS 3. 2 " " " "
y mioinositol, se ajust el pH a 5.7. Con 10 repeticiones
por tratamiento y 20 en el control.
4. Control.
9 Evaluacin de tratamiento de preaclimatacin. 1. Folicote 1 parte en 20 de agua.
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 2. Tratamiento de preaclimatacin 25
benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y se das antes del trasplante, en medio
humedeci con medio lquido'/2 de MS con vitaminas MS de enraizamiento con tapa y filtro
y mioinositol, se ajust el pH a 5.7. Adicionalmente se uso bacteriolgico.
un promotor de enraizamiento Tri-raz en dosis de 12.5 3. Control.
cc/1. Con 10 repeticiones por tratamiento.
70
3.5. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass
3.5.1. Desinfeccin de frutos y procedimiento de extraccin de la nucela
Los frutos fueron primeramente lavados con detergente y cepillo, se llevaron a
campana de flujo laminar, se enjuagaron con agua destilada - estril y asperjados
con etanol, posteriormente se realiz un corte del fruto por la parte media, de cada
mitad se extrajo el tejido nucelar con pinzas, se elimin con ayuda del bistur el tejido
adyacente.
3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis-oxidacin de la
nucela
Basado en los resultados obtenidos en trabajos para evitar la necrosis in vitro
de yemas axilares de rbol adulto, en donde se realizaron tratamientos con cido
ascrbico, se utiliz en este estudio con nucelas los productos y procedimientos que
a continuacin se describen: 1) cistena 0 (control) y 10 mg/l adicionada al medio de
cultivo, 2) inmersin antes de su establecimiento in vitro, en solucin con 0 (control) y
400 mg/i de cido ascrbico durante 5 segundos y 3) incubacin bajo luz con
intensidad de 9.4 Em
-2
s
-1
, con 16 horas de luz por 8 de oscuridad y oscuridad
completa (control) hasta la generacin de callo embriognico; en este experimento se
aplicaron ocho tratamientos en total, al interaccionar los dos niveles de cada factor
2 x 2 x 2 = 8. Se utilizaron 25 nucelas por tratamiento en dos repeticiones,
establecidas en tubos de ensaye de fondo plano de 95 x 25 mm, con medio de
generacin de callo embriognico, formado con: sales minerales MS a 1/2 de su
concentracin, mioinositol 100 mg/l, cido nicotnico 1 mg/I, pridoxina 1 mg/l, glicina
1 mg/l, tiamina 10 mg/l, casena hidrolizada 200 mg/I, picloram 2 mg/I, sacarosa 30
g/I y agar-agar 4.4 g/l, se ajust el pH a 5.7. La variable medida fue solamente
porcentaje de necrosis.
71
3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr la embriognesis
somtica de aguacate cv. Hass
3.5.3.1. Generacin de callo embriognico
En esta fase del sistema se establecieron dos experimentos, en el primero se
utiliz la concentracin completa de sales minerales MS y a 1/2, y dosis de las
auxinas 2,4-D (0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/l) o picloram (0, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/I).
El medio basa) tena vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, tiamina 0.5 mgll, azcar
comercial 30 g/l y phytagel 2 g/l, se ajust el pH del medio a 5.7. En el segundo
experimento tambin se utilizaron sales MS completas y a 1/2, se aumento el
nitrgeno en forma orgnica en el tratamiento MS a 1/2, al adicionar 200 mg/l de
casena hidrolizada y se incremento en la concentracin completa de MS la dosis de
KN03 en un 25%; en cada uno de estos tratamientos se probaron diversas
combinaciones de picloram - AIB (0 - 0, 1 - 0.1, 2 - 0.2, 4 - 0.4 y 2 - 0 mg/l) y 2,4-
D - BA (0 - 0, 1 - 0, 2 - 2 y 4 - 2 mg/I), suplementados los medios de cultivo con
mioinositol 100 mgll, tiamina 10 mg/l, sacarosa 30 g/l y agar-agar 4.4 g/I.
Adicionalmente, en los medios con sales minerales MS a 1/2 se utiliz cido
nicotnico, piridoxina y glicina en dosis de 1 mg/1 de cada compuesto y cistena 10
mg/l; en tanto que en los medios con sales MS completas la dosis de cistena
utilizada fue 7.5 mg/l. En el primer estudio se utilizaron de 7 a 12 nucelas por
tratamiento y en el segundo de 10 a 20, inoculadas en tubo de ensaye de 150 x 24
mm y en caja de petri de vidrio de 90 mm de dimetro. Las variables fueron:
porcentaje de formacin de callo, dimetro en mm y color de callo.
3.5.3.2. Multiplicacin y desarrollo de embriones somticos
En el proceso de multiplicacin y desarrollo de embriones somticos se evalu
medio slido y lquido en nueve pruebas, al utilizar medio base MS suplementado
con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/I, sacarosa 30 g/l, agar-agar en medio slido 5
g/l y se ajust el pH a 5.7, se probaron los reguladores BA (0.11 mg/l), AG
3
(0.11mg/l) y picloram (0.1, 0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I), as como el compuesto nitrogenado
72
orgnico casena hidrolizada (0, 200, 400, 600, 800 y 1,000 mg/l) y el efecto de la luz
indirecta (9.4 Em
-2
s
-1
) y de la oscuridad sobre la multiplicacin y desarrollo de los
embriones; la siembra del inculo en medio slido se llev a cabo en cajas de petri
de 90 mm de dimetro y en lquido en matraces Erlenmeyer de 125 ml, se utilizaron 2
g de inculo en 12.5 y 25 ml de medio, mismos que despus del establecimiento se
colocaron en un agitador orbital a 100 rpm, tambin para la multiplicacin en medio
lquido se emple un biorreactor de 2 litros de capacidad, aunque se prepar
solamente 1 litro de medio de cultivo y se establecieron 5.0363 mg/ml de masas
proembriognicas y embriones somticos globulares. Se contaron masas y
embriones, se determin viabilidad por observacin directa en microscopio de
epifluorescencia previa tincin con diacetato de fluorescena (Widholm, 1972),
adems se obtuvo la ganancia de peso del inculo.
3.5.3.3. Maduracin de embriones somticos
Con base en los resultados de Cruz (1998) y de Witjaksono y Litz (1999b), al
tomar como medio base el empleo de sales MS complementadas con tiamina 4 mg/l,
mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, agar-agar 5 g/I y se ajust el pH a 5.7, se
evalu el efecto del ABA (0, 1, 2, 4 y 8 mg/l), sacarosa (30, 40, 50, 60, 70 y 90 g/I),
agar-agar (5, 6, 7, 8, 10, 11, 14, 20 y 30 g/I) y manitol (70, 90, 110 y 130 g/l) sobre la
maduracin de los embriones somticos, las pruebas realizadas (8) se establecieron
en caja de petri de 90 mm de dimetro con medio slido y de 5 a 10 cajas por
tratamiento; se utiliz como explante embriones somticos en fase globular, corazn y
torpedo; las variables evaluadas fueron: nmero promedio de embriones maduros
por caja y tamao del embrin (ancho x largo en mm).
3.5.3.3.1. Anlisis de almidn y glucosa de embriones somticos maduros
Adicionalmente a los embriones somticos maduros se les realiz un anlisis
de almidn y glucosa; para determinar almidn se utiliz el mtodo semicuantitativo
que consiste en: hacer cortes muy finos del tejido vegetal, colocar dichos cortes en
73
un portaobjetos, agregar de una a dos gotas de lugol (2 g de yoduro de potasio + 1 g
de yodo en 250 ml de agua) y esperar 5 minutos, despus de ese tiempo observar
los cortes al microscopio de fases. En la determinacin de glucosa se utiliz el
reactivo Glucosa (oxidasa) que es un mtodo enzimtico, colorimtrico, de punto final
(Hycel No. 70408 con Reg. No. 0930R87 S.S.A.); el procedimiento consisti en:
obtener el peso de 5 embriones somticos maduros, disolver 2.142 g del reactivo
Glucosa (oxidasa) en 100 ml de agua destilada y de ah se tomaron 2.5 ml a cada
tubo de ensaye (6), un blanco y cinco de problema; moler los embriones somticos
en mortero, colocado este en hielo y agregar 1 ml de agua destilada; obtener el
embrin del mortero y colocar en un tubo Eppendorf y centrifugar a 3,000 rpm por 20
minutos; adicionar 0.02 ml de la solucin superficial de cada tubo Eppendorf a los 2.5
ml de la solucin con el reactivo que contena por tubo de ensaye y se calentaron a
37C por 30 minutos; se observ el cambio de color al dejar en reposo por 10
minutos; se tom el porcentaje de transmitancia en espectrofotmetro a 520 nm; se
sac el valor en curva de calibracin (Glucosa mg/100 ml) y por ltimo se obtuvo la
cantidad final de glucosa por mg de peso de cada embrin somtico, basado en el
valor obtenido en la curva de calibracin que es al peso inicial de cada embrin.
3.5.3.4. Germinacin de embriones somticos
Se probaron diferentes dosis de reguladores de crecimiento y procedimientos
para germinar embriones somticos maduros; la interaccin BA - AG
3
(0.11 - 0.11,
0.11 - 0.24 y 0.11 - 0.36 mg/I en primera evaluacin y 0 - 0, 0.5 - 0, 1.25 - 0, 0.2 - 0.1 y
0.1 - 0.1 mg/1 en la segunda ), el barrido de reguladores BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9
mgll) - AIB (0, 0.03 y 0.06 mg/I), todo sto en medio de cultivo slido; siembra de los
embriones en sustrato de turba previamente esterilizado y humedecido con medio
lquido MS 1/2 de concentracin, complementado con mioinositol 100 mg/l, vitaminas
MS, BA 2 mg/I y se ajust el pH a 5.7; prueba de germinacin en caja de petri con
papel filtro humedecido con medio lquido MS suplementado con mioinositol 100
mg/I, tiamina 4 mg/I, BA 0, 3 y 6 mg/I en primera evaluacin bajo este sistema y en la
segunda BA 0, 0.5, 1 y 2 mg/l, TDZ 0.1, 0.5 y 1 mg/l, BA - AIB (2 - 0.2 mg/l),
74
sacarosa 30 g/I y pH 5.7; en caja de petri con medio slido se evalu
brasinoesteroides (0.1 mg/I) en interaccin con BA (0.05 mg/I) - AG
3
(0.1 mg/l) y con
agua de coco (200 ml/l) - carbn activado (50 mg/I) - glutamina (400 mg/l); en tubo
de ensaye con medio slido se prob una dosis baja de carbn activado (5 mg/l) en
interaccin con BA (0.1 mg/I) - AG3 (0.1 mg/I) y con BA - 2,4-D (0 - 0, 0.1 - 0.05, 0.1
- 0.1, 0.2 - 0.05 y 0.3 - 0.05 mg/l); en magenta con medio lquido MS 50%
complementado con vitaminas MS, BA 1 mg/l, sacarosa 30 g/I y pH 5.7, se estudi la
frecuencia de la inmersin temporal (12, 24, 48 horas e inmersin continua en
primera prueba y 24, 48 y 72 horas en segunda prueba); en magenta y basado en el
mismo medio anterior pero sin BA, se evaluaron las dosis de adenina 0, 25, 50 y 100
mg/l, con una frecuencia de inmersin de cada 24 horas; tambin se probaron las
mismas dosis pero en medio slido en frasco. La ltima prueba fue el establecimiento
de los embriones somticos maduros en medio de Anderson (1975) modificado en
nitratos (+ 25%) y su recultivo a los 90 das en medio MS con 0.3 mg/l de BA. En
relacin a los datos tomados en esta fase, solamente se realizaron observaciones
sobre el tipo de crecimiento del tejido obtenido, el porcentaje de brotacin, nmero y
longitud de brotes.
3.6. Condiciones de incubacin de los explantes
En el estudio de organognesis los diferentes explantes (yemas axilares en
mcroestacas procedentes de rbol adulto y yemas axilares de brotes obtenidos in
vitro), despus de su establecimiento en el medio de cultivo se incubaron en un
cuarto de crecimiento a una temperatura de 252C, fotoperiodo de 16 horas de luz,
con una intensidad de 110.58 Em
-2
s
-1
; para los de embriognesis somtica, una vez
establecidas las nucelas in vitro se pusieron en oscuridad por 45 a 50 das, perodo
despus del cual se colocaron a luz con una intensidad de 9.4 Em
-2
s
-1
, con 16
horas de luz y a la misma temperatura que en organognesis.
75
3.7. Anlisis estadstico
Los porcentajes se analizaron por comparacin directa entre tratamientos;
generalmente la unidad experimental fue el frasco, el tubo de ensaye o la caja de
petri. Con los datos de las variables cuantitativas en organognesis, tales como:
nmero de brotes laterales, longitud del brote y de raz en mm, ndice estomtico,
frecuencia de estomas y frecuencia de clulas no estomticas, se hizo un anlisis
de varianza (ANDEVA) bajo el diseo experimental completamente al azar, tal como
lo sugiere Vera (1987).
En aquellos casos donde se encontr significancia en el anlisis de varianza,
se corri una prueba de comparacin de medias Tukey, de acuerdo con el
procedimiento de Gmez (1996).
En embriogness somtica, los datos de la variable porcentaje de oxidacin
se transformaron a valores de arco seno x se realiz anlisis de varianza bajo
un diseo de bloques al azar con arreglo factorial A x B x C, al encontrar significancia
se aplic la prueba de diferencia mnima significativa (DMS) para determinar el mejor
tratamiento.
En las fases de multiplicacin y maduracin de embriones somticos, con las
variables nmero de: masas proembriognicas, globulares, acorazonados, torpedos
y maduros se realiz ANDEVA con un diseo completamente al azar y pruebas de
comparacin de medias DMS y Tukey.
76
IV. RESULTADOS
4.1. Organognesis de aguacate criollo
El establecimiento in vitro de aguacate criollo (P. americana var. drymifolia),
se obtuvo por diversos procedimientos de asepsia, tratamientos con desinfeccin
externa e interna. En base de prueba y error se observaron aquellos con los menores
porcentajes tanto de contaminacin como de necrosis, esta ltima debida al mtodo
de desinfeccin.
4.1.1. Desinfeccin externa
El mejor mtodo de desinfeccin externa se obtuvo al lavar los explantes con
detergente biolgico y cepillo; cortar en segmentos de 2 a 4 cm con 1 a 2 yemas
axilares; tratar con Benlate (2 g/I, durante 15 a 20 minutos), con Agrimicin 500 (2 g/l,
tambin durante 15 a 20 minutos); enjuagar con agua destilada estril; tratamiento
con hipoclorito de sodio 40-60% + tween 20 (2 gotas/I) de 15 a 20 minutos; y por
ltimo, practicar tres enjuagues con agua destilada estril en campana de flujo
laminar. El tiempo y la concentracin vari de acuerdo a la madurez del tejido y a la
temporada en que se obtuvo el explante, para tejido muy maduro colectado en los
meses de junio - octubre, se utiliz la mxima concentracin de hipoclorito y 20
minutos de permanencia en las soluciones.
4.1.2. Desinfeccin interna
En la primer prueba con dosis de Benlate, adicionado al medio de cultivo y
esterilizado e incorporado despus de la esterilizacin en campana de flujo laminar,
se observ que la aplicacin de Benlate sin esterilizar en autoclave, su accin fue
ms efectiva (0% de contaminacin a los 12 das), aunque se present un alto
porcentaje de necrosis en los dos medios de cultivo probados (88.8 y 66.7%), sto
77
como consecuencia de la aplicacin al explante de una desinfeccin superficial
severa. Al usar Benlate esterilizado en autoclave, la mejor dosis fue de 2 g/I de medio
de cultivo (Cuadro 6), se encontr de 0-22.2% de contaminacin segn el medio de
cultivo, con tan solo de un 50 a un 55.5% de necrosis.
Con estos resultados, es conveniente resaltar que la desinfeccin debe ser
ligera (40% de hipoclorito de sodio y 15 minutos de tiempo de permanencia del
explante en cada desinfectante) y cultivar los explantes en medio con Benlate
esterilizado (2 g/I), para evitar menor dao al tejido vegetal.
Cuadro 6. Porcentaje de contaminacin y necrosis de yemas axilares de aguacate
criollo a los 12 das del establecimiento en dos medios de cultivo (A y B),
en la prueba de dosis de Benlate.
Contaminacin/Necrosis (%) a 12 das Tratamientos
(Benlate g/I y tipo de
incorporacin)
A B
0 44.4/27.7 33.4/72.2
0.5 esterilizado 55.5/33.3 66.7/0
1.0 esterilizado 50/22.2 0/38.9
2.0 esterilizado 0/50 22.2/55.5
1.0 no esterilizado 0/88.8 0/66.7
A = BA 1 mg/I +AIB 0.5 mg/I
B = BA 2 mg/I + AIB 0.66 mg/I
En la segunda y tercer prueba los plaguicidas se incorporaron en campana de
flujo laminar despus de esterilizar el medio de cultivo; en el Cuadro 7 se observa
hasta un 100% de contaminacin en el tratamiento control a los 7 das despus de
su establecimiento, no as con el tratamiento con Benlate 1 g/I que en permanencia
continua hasta los 40 das no mostr contaminacin, este mismo tratamiento en
permanencia de 7 das en medio con el producto y recultivo posterior a medio sin
Benlate hasta los 33 das present contaminacin en 1/3 (33.33%) de los explantes.
78
Cuadro 7. Porcentaje de contaminacin de yemas axilares de aguacate criollo a
diferentes das despus del establecimiento por tratamiento para
permanencia continua y en etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.
Tratamiento Contaminacin (%)
Benlate - Agrimicin Permanencia continua con plaguicidas a los:
500(g/1) 7 14 21 30 40 das
48.6h
14.3b
0
0
0
14.3h
62.9h
---
0
25h
0
39.3h
---
---
0
---
0
---
---
---
0
---
0
---
---
Permanencia 7 das con plaguicidas
14
-
0
33.3h
33.3b
100h
33.3h
---
23
-
0
33.3h
33.3b
---
66.7h
---
33
---
33.3h
33.3h
33.3b
---
---
---
Permanencia 14 das con plaguicidas
50 das
---
33.3h
33.3h
66.6b
---
---
---
20h
0
0
0
0
20h
7
100h
0
0
66.7h
0
100h
7
100h
0
33.3h
33.3b
100h
100h
100h
16
-
33.3h
66.6h
33.3b
---
---
---
26das
---
33.3h
---
---
---
---
Permanencia 21 das con plaguicidas
0-0
1-0
1-0.5
1-1
0.5-1
0 1
0-0
1-0
1-0.5
1 1
0.5-1
0-1
0-0
1-0
1-0.5
1 - 1
0.5-1
0-1
1-0
1-0.5
1 -1
0.5-1
9
0
33.3h
66.6h
33.3h
19
0
66.6h
100h
33.3h
36 das
0
66.6h
---
66.6h
h = hongo, b = bacteria, --- sin explantes, desechados por contaminacin, necrosis
o recultivados.
Cuando los explantes permanecieron 14 das en Benlate, a los 16 das del
recultivo se present la contaminacin tambin en 1/3 y en permanencia de 21 das
no hubo contaminacin alguna. La contaminacin en algunos tratamientos de
79
permanencia, cuando se utiliz Benlate a 1 g/I, obedeci en gran medida a errores
en la manipulacin del explante al realizar el recultivo (Cuadro 7).
Tambin se observ que al aplicar Benlate en combinacin con Agrimicin 500,
no se evit la contaminacin, sto fue ms evidente cuando permanecieron por 14
das, al obtener datos hasta del 100% en casi la totalidad de los tratamientos donde
interaccionan estos dos plaguicidas, lo que resulta en un marcado antagonismo de
los productos. Adems, de manera general se apreci una dominancia de
contaminacin por hongos, sobre los cuales no se observ la eficiencia del oxicloruro
de cobre del Agrimicin 500.
Al utilizar Benlate con Agrimicin 100 en dosis de 1 g/l de cada producto, se
logr un buen control de la contaminacin del explante por hongos y bacterias,
presentndose 0% de contaminacin, aunque la necrosis fue menor (20%) cuando
se utiliz solamente Benlate, ste fue el mejor tratamiento (Cuadro 8).
Cuadro 8. Porcentaje de contaminacin y necrosis de yemas axilares de aguacate
criollo a diferentes das despus del establecimiento por tratamiento para
permanencia continua con dos severidades de desinfeccin superficial y
en etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.
Contaminacin/ Necrosis (%)
Permanencia continua con plaguicidas
8 15 31 48 das
Tratamiento
Benlate -
Agrimicin100
(g/l) DSL DSS DSL DSS DSL DSS DSL DSS
1 - 1 0/0 0/0 010 0/0 0/40 0/50 0/40 0/60
1 - 0 010 0/0 0/0 0/0 0/0 0/40 0/0 0/40
0 - 0 26.7h 0/0 46.7h 0/0 46.7h 0/60 46.7h 0/60
6.7b/0 6.7b/0 6.7b/20 6.7b/40
Permanencia 8 das con plaguicidas
8 24 41 53 das
1 - 1 010 0/0 20b/20 20b/80
1 - 0 20b/0 40b/0 40b/0 40b/60
Permanencia 31 das con plaguicidas
17 31 das
1 - 1 0/40 0/40
1 - 0 0/20 0/40
DSL = Desinfeccin superficial ligera, DSS = Desinfeccin superficial severa,
b = bacteria, h = hongo.
80
En el estudio de pretratamiento de explantes en solucin con Benlate y
Agrimicin 100, 1 g/I de cada uno (Cuadro 9), la contaminacin se present a los 14
das de su establecimiento con un 93.3% en los tratamientos de 0, 24 y 48 horas, y del
100% en el de 73 horas; en tanto que en el testigo de siembra en medio de
cultivo con Benlate solamente se observ un 13.3% de contaminacin, ste fue
nuevamente el mejor tratamiento.
Cuadro 9. Porcentaje de contaminacin de yemas axilares de aguacate criollo a 7 y
14 das del establecimiento, en estudio de pretratamiento de explantes en
solucin con Benlate ms Agrimicin 100 a diferentes tiempos de
permanencia.
Contaminacin (%)
Tratamiento
Tiempo (horas) de permanencia
en solucin (Benlate+Agrimicin
100, 1 g/I de c/u)
Establecimiento en medio
de cultivo
7 14 das
24 horas Sin Benlate 80 93.3
48 horas 80 93.3
73 horas 46.7 100
0 horas 86.7 93.3
0 horas Con Benlate 1 g/I 0 13.3
4.1.3. Prevencin de necrosis del explante
Se determin que 30 minutos a chorro de agua era tiempo suficiente para que,
en combinacin con el uso de antioxidante en la asepsia y en el medio de cultivo, se
evitara que el tejido expulsara fenoles al medio y por consecuencia se deteriorara el
explante.
Con la finalidad de eliminar el antioxidante del medio de cultivo y reducir la
necrosis, se estableci un estudio sobre el tratamiento previo al establecimiento del
explante con cido ascrbico, se encontr que al emplear 400 mg/l durante 30
minutos, se redujo a los 30 das la necrosis al 10% y se obtuvo a los 70 das una
brotacin del 90%, en tanto que cuando se realiz un tratamiento previo con cido
81
ascrbico (100 mg/I) y el establecimiento en medio con 50 mg/l de este mismo
antioxidante, la necrosis fue del 70% y la brotacin de 0%; tambin se encontr que
en dosis alta de cido ascrbico (400 mg/l) combinado con un tiempo de permanencia
del explante de 60 minutos, el porcentaje de necrosis se increment hasta un 70% con
una brotacin de 0%; igual comportamiento se tuvo al dejar el explante 30 minutos en
100 mg/l de ascrbico y establecerlo posteriormente en medio con 50 mg/l de
ascrbico, sto nos indica que en exposicin en alta concentracin o continua del
explante en cido ascrbico se origina necrosis o apardamiento al tejido vegetal
(Cuadro 10).
Cuadro 10. Porcentaje de necrosis y brotacin de yemas axlares de aguacate criollo
por tratamiento en el estudio de pretratamiento del explante con cido
ascrbico.
Tratamiento
Dosis de
Ac. ascrbico
(mg/1)
Tiempo de
permanencia
(min.)
Tipo de establecimiento
en medio de cultivo
Necrosis (%)
a los 30 das
Brotacin
(%)
a los 70 das
100 30 Sin ascrbico 30 40
200 30 40 50
300 30 50 30
400 30 10 90
100 60 50 50
200 60 60 60
300 60 40 60
400 60 70 0
100 30 Con 70 0
Por lo tanto, es recomendable para establecer yemas axilares de aguacate
criollo con bajo porcentaje de necrosis y evidentemente mejor ndice de brotacin,
tratar los explantes, previ a su establecimiento in vitro, con 400 mg/l de cido
ascrbico durante 30 minutos.
82
4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio
de cultivo en la organognesis in vitro de aguacate criollo
4.1.4.1. Iniciacin o establecimiento in vitro de yemas axilares
De las 8 pruebas que se llevaron a cabo en esta fase, solamente se presentan
los resultados de 3, por considerar irrelevante la respuesta del explante en el resto
de stas. Al evaluar los diferentes medios, tipos y dosis de reguladores de
crecimiento que reportaron Neel y col. (1982), Gonzlez y Salazar (1984), Gonzlez
y col. (1985), Shall (1987) y Solrzano-Vega (1989), no se observ brotacin de las
yemas, solamente la formacin de callo en un 10% en el medio de los ltimos
investigadores anteriormente sealados.
En el estudio sobre concentracin de tres sales minerales, la brotacin de las
yemas axilares inici a los 35 das despus del establecimiento in vitro, fue en el
tratamiento MS 20% donde se alcanz el mayor porcentaje de brotacin, con 76% a
los 55 das, se observ una disminucin de este porcentaje a los 100 das y 127 das
de cultivo, debido a la contaminacin de los explantes que ya haban brotado. En el
tratamiento McCown's 100%, se mostr el porcentaje ms bajo de brotacin, con
12% a los 55 das y un 20% a los 100 das (Cuadro 11).
La formacin de brotes laterales pudo observarse en las yemas axilares
cultivadas en el tratamiento MS 20%, nico tratamiento donde se formaron. Los
resultados mostraron que en un 50% de los explantes se encontraron entre 3 y 4
brotes laterales, en un 34% 1 y 2, en un 8% con 6 y en el otro 8% con 8 (Figura 2).
En cuanto al crecimiento en mm del brote principal se encontr la mayor longitud con
36.17 mm a los 127 das en el tratamiento MS 100%*; los que menos crecieron (5 y
11 mm, a los 117 das) fueron los de los tratamientos MS 80% y 20%,
respectivamente (Figura 3).
83
Cuadro 11. Porcentaje de brotacin de yemas axilares de aguacate criollo a
diferentes das por tratamiento en estudio sobre concentracin de tres
sales minerales.
Brotacn (%)
Tratamiento 55 das 100 das 127 das
1. MS 20% 76 72 64
2. MS 40% 24 36 36
3. MS 60% 48 40 28
4. MS 80% 16 4 0
5. MS 100% 63 12 8
6. MS 100%* 32 40 24
7. WPM 100% 16 12 8
8. WPM 50% 40 36 32
9. Me Cown's 100% 12 20 0
10. Me Cown's 50% 36 12
* Tratamiento con 2 mg/1 de BA y AIB.
84
Al observar los datos de crecimiento del brote principal en la Figura 3, el
tratamiento donde mayor crecimiento, promedio por da se logr (0.24 mm) fue el MS
100%*, mientras que en el MS 80% no se sobrepas los 0.06 mm/da. Al realizar el
anlisis de varianza, en longitud del brote principal, result altamente significativo en
127 das, la comparacin de medias entre tratamientos indic que no existen
diferencias estadsticas entre el MS 100%, WPM 100% y MS 100%*, y que stos son
los mejores en relacin a la variable longitud del brote (Cuadro 12).
Con la aplicacin de las diferentes dosis de los reguladores de crecimiento en
la combinacin BA AIB, la formacin de brotes inici solamente en algunos
tratamientos a los 45 das, en tanto que otros ya presentaban brotes con 1 a 2 hojas
pequeas, este es el caso de los tratamientos (1-0, 1-0.2, 2-0, 2-0.2, 3-0 y 3-0.2 mg/l
de BA AIB) con porcentaje de brotacin entre 15 y 53%.
85
A los 96 das, se estabiliz la respuesta del tejido con los resultados
siguientes: en el tratamiento sin reguladores (0-0) y en los tratamientos sin BA y con 1
mg/l, combinados con 0.2, 0.5 y 1.0 mg/1 de AIB (0-0.2, 0-0.5, 0-1 y 1-0.5 mg/I de BA-
AIB), las yemas axilares no formaron brotes. Las yemas axilares que presentaron los
porcentajes ms altos de brotacin (50-65%) fueron las incubadas en los medios de
cultivo con diferentes dosis de BA-AIB, preferentemente con dosis altas de BA sin AIB
o con 1 mg/l de esta auxina (1 -0, 2-0, 3-0 y 3-1 mg/l de BA-AIB).
Los datos de la variable longitud del brote se procesaron en un anlisis de
varanza para un diseo completamente al azar, se encontr significancia a los 96 y
110 das, sin embargo, , al realizar la prueba de comparacin de medias Tukey
(=0.05), no se encontraron diferencias estadsticas significativas (Anexos 2 y 3).
4.1.4.2. Multiplicacin de brotes
Con base en la respuesta de. las yemas exilares en la fase de iniciacin, las
cuales mostraron una mayor longitud dei brote al cultivarlas en el medio MS al 100%,
en este mismo medio se probaron dos concentraciones de sales minerales
86
modificadas (completas y a 1 /2 de su concentracin) con la interaccin BA - AIB y
adenina 40 mg/l. Despus de 70 das de su cultivo, el nmero de brotes por explante
ms alto alcanzado fue de 1.93 para el tratamiento con 1 mg/1 de BA ms 0.1 mg/1 de
AIB en MS a un 1/2 de la concentracin de sales; y para el parametro de longitud del
brote, el valor mayor (17.6 mm) se obtuvo en el mismo tratamiento anterior de
reguladores de crecimiento, pero con la concentracin completa de sales (MS 100%)
(Cuadro 13).
Cuadro 13. Nmero de brotes por explante y longitud del brote de aguacate criollo
en los tratamientos de la interaccin BA - AIB en sales modificadas
completas (MS 100%) y MS 112 de su concentracin.
Tratamiento Nmero de brotes Longitud (mm)
BA - AIB mg/1 Conc. sales
2-0.2 112 1.81 16.06
1.5-0.15 112 1.54 14.40
1-0.1 112 1.93 14.95
0.5-0.05 112 1.37 16.33
0-0 112 1.20 10.47
2-0.2 Completas 1.63 15.96
1.5-0.15 1.85 14.54
1-0.1 1.44 17.60
0.5-0.05 1.92 14.72
0-0 1.78 11.86
En este mismo cuadro se observa que en los tratamientos sin reguladores se
muestra la menor longitud del brote, esto indica qu la interaccin de la citocinina con
la auxina (BA-AIB) promueve en gran medida el crecimiento promedio de los brotes.
No se detect significancia en el anlisis de varianza para el factor concentracin de
sales respecto a la variable nmero de brotes promedio por frasco, situacin similar
se present en la variable longitud de brote por explante.
87
En los tratamientos probados con la combinacin BA AIB pero en el medio
de cultivo MS 100% sin adenina, las yemas respondieron entre los 12 y 15 das
despus del establecimiento en la formacin de brotes, sin que se notaran
diferencias entre un tratamiento y otro. Sin embargo, se observaron diferencias
claras en brotacin segn la posicin del brote formado, en las yemas axilares y
apicales del explante se formaron los primeros brotes, en tanto que las de la base
fueron ms retardadas en su brotacin.
Al realizar el anlisis de varianza con los datos de la variable nmero de
brotes por explante frasco a los 25 y 85 das (Anexos 4 y 5), se observ significancia
entre los tratamientos, no obstante que los coeficientes de variacin resultaron altos,
43.3 y 49%, debido en gran medida a la variacin del inculo; es decir no fue posible
uniformizar la seccin del brote empleado en los tratamientos, para ello se utilizaron
yemas apicales y axilares de los brotes obtenidos in vitro y se eligi al azar el
tratamiento.
La prueba de comparacin de medias Tukey (= 0.05) (Cuadro 14) a los 85
das report que el tratamiento 4 (BA 0.9 mg/l y 0 de AIB, Figura 4), se encuentra en
el primer grupo de significancia estadstica, sin que existan diferencias con los
tratamientos 10, 3, 8, 6, 11, 12, 7 y 2; del anlisis de los niveles de los reguladores
que componen los tratamientos anteriores se deduce que aparentemente no existi
efecto del AIB, puesto que no hay diferencia entre 0.0, 0.05 y 0.1 mg/l. As como
tampoco hubo efecto del BA en dosis de 0.3, 0.6 y 0.9 mgll, pero s son notables con
el testigo (0.0 - 0.0 mg/I de BA - AIB).
En esta misma prueba se realiz un anlisis de varianza con el promedio de la
longitud en mm de los brotes producidos por tres explantes por frasco, a los 25 y 85
das de su establecimiento (Anexos 6 y 7); se detect solamente significancia al nivel
de 0.05 e igualmente que en la variable anterior los coeficientes de variacin fueron
altos, 41.66 y 43.19, esto debido a la heterogeneidad del inculo utilizado.
88
Cuadro 14. Comparacin de medias Tukey (=0.05) en la variable nmero de
brotes promedio por frasco de aguacate criollo a los 25 y 85 das, en
tratamiento con reguladores BA-AIB.
Tratamientos Nmero de brotes por frasco
No. BA - AIB (mg/l) 25 das 85 das
4 0.9-0.0 9.5 A 10.9 A
10 0.3-0.1 8.2 AB 8.4 AB
3 0.6-0.0 8.0 AB 9.0 AB
8 0.9-0,05 7.1 AB 8.3 AB
6 0.3-0.05 6.3 AB 6.4 AB
5 0.0-0.05 6.1 AB 4.9 B
11 0.6-0.1 6.0 AB 7.1 AB
12 0.9-0.1 5.8 AB 9.0 AB
7 0.6-0.05 5.6 AB 5.8 AB
9 0.0-0.1 5.1 B 4.8 B
2 0.3-0.0 4.8 B 6.9 AB
1 0.0-0.0 4.2 4.7 B
89
En la prueba de comparacin de medias Tukey (= 0.05) (Cuadro 15), a los 85
das se detect dentro del primer grupo de significancia al tratamiento testigo (0 - 0
mg/l de BA - AIB, Figura 5), sin que existieran diferencias con el resto de los
tratamientos, excepto con el tratamiento 9 (0.0 - 0.1 mg/1 de BA - AIB) que se ubic
en el grupo B con un promedio de 16.2 mm.
Cuadro 15. Comparacin de medias Tukey (=0.05) en la variable longitud promedio
de brote de yemas axilares in vitro de aguacate criollo a los 85 das, en
tratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).
Tratamientos Significancia estadstica Tukey
No. BA - AIB (mg/l) Media (mm)
2 0.3-0.0 28.5 AB
8 0.9-0.05 22.2 AB
7 0.6-0.05 26.1 AB
4 0.9-0.0 22.5 AB
1 0.0-0.0 31.9 A
3 0.6-0.0 24.2 AB
12 0.9-0.1 18.2 AB
6 03-0.05 23.2 AB
10 03-0.1 20.8 AB
11 0.6-0.1 18.5 AB
5 0.0-0.05 18.9 AB
9 0.0-0,1 16.2 B
Es indudable que no nicamente las caractersticas cuantitativas son
determinantes para decidir cul es el mejor tratamiento, ya que para esto se requiere
el anlisis de las caractersticas cualitativas de los brotes, respecto a lo cual se
encontr que a los 85 das de su establecimiento (Cuadro 16) solamente los
tratamientos 1 y 2 presentaron una coloracin verde oscuro, en tanto que el resto
verde claro, cuando se indujo a la brotacin con dosis altas de BA - AIB
90
Cuadro 16. Caractersticas cualitativas de los brotes in vitro de aguacate criollo
en los diferentes tratamientos a tos 85 das del establecimiento, en
tratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).
Tratamiento
No. BA - A)B (mgll)
Caractersticas de los brotes
Color % de necrosis % de callo Formacin brote
1 0.0-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados
2 0.3-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados
3 0.6-0,0 Verde claro 0 55.56 Deformes
4 0.9-0.0 Verde claro 0 70 Deformes
5 0.0-0.05 Verde claro 0 3,7 Bien formados
6 0.3-0.05 Verde claro 0 36.67 Bien formados
7 0.6-0.05 Verde claro 0 73.3 Deformes
8 0.9-0.05 Verde claro 0 40 Deformes
9 0.0-0.1 Verde claro 0 0 Bien formados
10 0.3-0.1 Verde claro 6.7 40 Deformes
11 0.6-0.1 Verde amarillo 30 36,67 Deformes
12 0.9-0-1 Verde amarillo 50 40 Deformes
(tratamientos 10, 11 y 12) se observ un porcentaje alto de necrosis de los explantes,
91
50% el tratamiento 12; tambin en las dosis altas de reguladores de crecimiento se
present formacin de callo en la base de los explantes; se obtuvieron brotes bien
formados y poca formacin de callo en los tratamientos 1, 2, 5, 6 y 9, esto fue en los
tratamientos con dosis bajas o bien con 0 - 0 mg/1 de BA - AIB.
Al realizar una revisin de los resultados en las diferentes variables en esta
prueba, se obtuvo la mejor respuesta en las yemas axilares cultivadas en el medio
MS con 0.3 mg/l de BA (Tratamiento 2, Figura 6), debido a que se observ un
nmero de 2.3 brotes laterales por explante (6.9 promedio por frasco), una longitud
promedio de brote de 28.5 mm (a los 85 das del establecimiento), un color ptimo de
brote (verde oscuro), un bajo porcentaje de formacin de callo en la base de los
explantes (10%) y una buena formacin de brote. Aunque en el tratamiento sin
reguladores de crecimiento (Testigo), las yemas formaron brotes con la mayor
longitud promedio, bien formados y poca formacin de callo, no es mejor que el resto
de los tratamientos debido a que result con el valor ms bajo en nmero de brotes
promedio.
92
4.1.4.3. Enraizamiento de brotes
En la primer prueba se observ que la respuesta al enraizamiento se obtuvo
con AIB incorporado al medio de cultivo con sales modificadas, logrndose hasta un
25% de enraizamiento y un promedio de 2.3 races por brote, en el tratamiento con 0.8
mg/1 de AIB. Por otra parte, cuando se utiliz ANA generalmente no se obtuvo
formacin de races, excepto en sales MS con 0.3 mg/I de ANA con un 16.67% de
enraizamiento y en sales modificadas en la interaccin AIB 0.5 mg/l - ANA 0.3 mg/I,
con 8.33% de enraizamiento; el hecho de que en los brotes del tratamiento control se
formaran races es normal, ya que cuando no se utilizan reguladores en el medio de
cultivo se presenta enraizamiento, pero en una baja proporcin, 1 de cada 10 brotes
(Anexo 8).
En la segunda prueba, el anlisis de varianza para la longitud de raz indic
alta significancia a los 54 y 88 das de establecida (Anexos 9 y 10), al realizar la
prueba de comparacin de medias Tukey (=0.05) a los 54 das se obtuvo con la
mayor longitud y en el primer grupo de significancia al tratamiento control, sin que
existan diferencias estadsticas significativas con AIB 0.4 mg/l; a los 88 das
permaneci dentro del primer grupo de significancia el tratamiento control pero no
hay diferencias estadsticas significativas con los tratamientos 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2
mg/l de AIB (Cuadro 17).
En el Cuadro 18 se observa en forma ms precisa; que la mayor cantidad de
races por brote se obtuvieron en los brotes incubados en MS con 0.6 mg/l de AIB ms
0.125 mg/l de AG
3
con 4.69 y 4.08 races en el. Medio MS con 0.8 mg/l de AIB ms
0.125 mg/l de AG
3
. Cabe mencionar ,.que en estos tratamientos, los brotes
mostraron alta formacin de callo en la base.
93
Cuadro 17. Comparacin de medias Tukey (=0.05) en la variable longitud de raz por
brote de aguacate criollo a los 54 y 88 das, en prueba de enraizamiento de
brotes in vitro con AIB e interaccin AIB-AG
3
.
Tratamientos (mg/l) Longitud de raz (mm)
AIB AG
3
54 das 88 das
0.8 0.125 7.5 11.81
0.6 0.125 6.9 B 10.78 B
0.4 0.0 16.8 AB 22.97 AB
1.0 0.25 10.1 B 13.85 B
1.2 0.0 12.0 B 16.77 AB
1.0 0.125 7.7 B 15.88 B
1.0 0.0 11.8 B 19.43 AB
0.0 0.0 26.2 A ' 31.83 A
0.8 0.0 6.8 B 20.78 AB
0.6 0.0 10.8 B 20.42 AB
Cuadro 18. Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criollo obtenidos in vitro
a los 88 das del establecimiento, en prueba de dosis de AIB e
interaccin AIB-AG
3
,
Tratamiento
(mg/l)
AIB AG
3
Nmero de
races totales por
brotes
Nmero de races
promedio por brote
Enraizamiento
(%)
Longitud de
raz (mm)
0.0 0.0 12 en 9 1.33 29.03 31.83
0.4 0.0 27 en 12 2.25 44.44 22.97
0.6 0.0 13 en 7 1.86 29.17 20.42
0.8 0.0 17 en 6 2.83 20.00 20.78
1.0 0.0 4 en 3 1.33 9.68 19.43
1.2 0.0 29 en 11 2.64 36.67 16.77
0.6 0.125 61 en 13 4.69 43.33 10.78
0.8 0.125 49 en 12 4.08 40.00 11.81
1.0 0.125 10 en 5 2 19.23 15.88
1.0 0.25 18 en 8 2.25 32.00 13.85
94
En el medio nutritivo con 0.4 mg/l de AIB a los 88 das, los brotes presentaron
un 44.4% de enraizamiento (Cuadro 18 y Figura 7), un nmero aceptable de races
por brote (2.25), sin formacin de callo en la base del tallo y una longitud de raz de
22.97 mm. Lo anterior presenta a este tratamiento como el ptimo para lograr el
desarrollo de plntulas aptas para el transplante. Es importante sealar que al
trasplantar para su aclimatacin brotes con raz y con callo, la supervivencia result
nula.
4.1.5. Aclimatacin de plntulas de aguacate criollo obtenidas in vitro
En las tres primeras pruebas realizadas, aproximadamente a los 12 das de su
establecimiento, se observ muerte prematura de las plntulas. En la cuarta prueba
con sustratos y procedimientos de fertilizacin, a los 10 das la mezcla donde las
plntulas mostraron el mejor comportamiento, con un 100% de supervivencia y mejor
color de plntulas, fue el sustrato de turba 70% + agrolita 30% con fertilizacin de
95
medio lquido MS 100%, sin embargo las plntulas murieron antes de 20 das. En la
prueba sobre intensidades de luz las plntulas mostraron 0% de supervivencia a los
16 das. - En la prueba sobre sistemas de fertilizacin, el comportamiento de las
plntulas fue del 60% de supervivencia a los 18 das del establecimiento con
fertilizacin MS 100% y de 0% en el segundo tratamiento (fertilizacin con 30-10-10,
N-P-K 1 g/I + cido hmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I), por otra parte, en
esta misma prueba no se observ respuesta al aplicar los tratamientos con ASA y
ABA en las plntulas del tratamiento 1, ya que a los 10 das de la aplicacin todas
tomaron una coloracin caf clara por efecto de la prdida de agua o deshidratacin
de los tejidos y posteriormente cambiaron a caf oscura con muerte de las plntulas.
En la prueba 7 sobre aplicacin de 250 mg/1 de ASA en comparacin con el
uso de Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua, a los 20 das se obtuvieron los
siguientes resultados: 20% de supervivencia en Folicote, 0% en ASA y 25% en el
control, pero a los 42 das el porcentaje de supervivencia disminuy al 5% en el
control y el mismo valor en Folicote; a los 100 das sobrevivi solamente un 5% de
las plntulas con Folcote y presentaron stas una altura promedio de 5 cm.
La prueba 8 sobre dosis de Folicote report el siguiente comportamiento de las
plntulas: a los 20 das una supervivencia de 90% en la dosis de 1 parte en 20 y
0% en el control (Figura 8), a los 30 das se quit la tapa transparente a la charola
96
y se observ una disminucin en la supervivencia, muerte de las plntulas por
deshidratacin, el tratamiento 1.5 partes en 20 muestra el porcentaje ms alto con
30% (Cuadro 19); la altura promedio de las plntulas del tratamiento 1 fue de 3.5 cm a
los 60 das y de 4.2 cm a, los 75 das.
Cuadro 19. Porcentaje de supervivencia de plntulas de aguacate en el estudio de
dosis de Folicote.
Tratamiento Supervivencia (%)
20d 30d 40d 60d 75 das
1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 90 10 10 10 10
2. 1.5 60 50 30 0 0
3. 2 60 0 0 0 0
4. Control 0 0 0 0 0
En la ltima prueba (9), a los 45 das se obtuvo una supervivencia del 10% en
el tratamiento tapa con filtro bacteriolgico y del 40% con Folicote, a los 110 das se
estabiliz el. porcentaje de supervivencia superando la aplicacin de Folicote,
producto que cumple satisfactoriamente en la proteccin de la plntula contra la
prdida de agua. La disminucin del porcentaje de supervivencia se debi en gran
medida a la eliminacin prematura de la bolsa de plstico, al exponer drsticamente
a las plntulas a muerte. por deshidratacin (Cuadro 20); a los 110 das se tuvieron
plantas con un promedio de 6 cm de altura.
Cuadro 20. Porcentaje de supervivencia de plntulas de aguacate en el estudio de
preaclmatacin con filtro bacteriolgico en comparacin a Folicote.
Tratamiento Porcentaje de supervivencia
15d 30d 45 d 100 d 110 das
1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 100 90 40 20 20
2. Preaclimatacin tapa con filtro. 90 40 10 10 10
3. Control 100 70 30 5 5
En la validacin del tratamiento con Folicote en dosis de 1 parte en 20 de
agua, con 60 plntulas de aguacate criollo obtenidas in vitro , se obtuvieron
97
porcentajes de supervivencia hasta del 100% a los 100 das del trasplante, al evitar
eliminar la bolsa de plstico o la cubierta de las plntulas durante los 80 primeros
das, o sea hasta que sta forme sus primeras dos hojas en la fase de aclimatacin.
En los estudios citolgicos al realizar el anlisis de varianza, se obtuvo
significancia nicamente en la variable frecuencia de estomas, con un coeficiente de
variacin aceptable (Anexo 11). En el Cuadro 21 se presenta la prueba de
comparacin de medias Tukey (= 0.05), en ste se detecta que el nmero de
clulas estomticas en hojas de plntulas n vitro fue menor y significativamente
diferente a las hojas de plantas de vivero, no as con el rbol adulto (Figura 9).
Cuadro 21. Prueba de comparacin de medias Tukey (=0.05) en la variable
frecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.
Tratamiento Media Signif. Tukey (a=0.05)
Arbol adulto 5.96 AB
Invernadero 6.46 A
Plntulas in vitro 4.56 B
98
En relacin a los valores de las variables FCNE e IE, se tiene que el mayor
valor.con 17.82 de FCNE y el menor IE (5.83) se present en el tratamiento de
plntulas in vitro e inverso con 13.96 de FCNE y 7.39 en lE en las hojas de rbol
adulto (Anexo 12). Adicionalmente se present malformacin de las clulas
estomticas en las hojas de las plntulas in vitro; con relacin a la cutcula los tejidos
de rbol adulto, stos mostraron una cutcula gruesa cerosa, en tanto que en las
plntulas in vitro se observ muy delgada y con ausencia de ceras.
4.2. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass
4.2.1. Efecto del cido ascrbico, cistena y luz en la necrosis del tejido nucelar
nicamente se observ efecto positivo dei cido ascrbico en la reduccin de
la necrosis del tejido nucelar, en donde este antioxidante en una concentracin de
400 mg/l evit la presencia de necrosis en todos los explantes (Figura 10). Los
porcentajes de necrosis promedio por factor de variacin para cada tratamiento se
presentan en el Cuadro 22, con los cuales es notable que tanto en luz como en
oscuridad, el cido ascrbico reduce a 0% la necrosis del tejido; sin antioxidantes, el
porcentaje de necrosis es de 87.5% en oscuridad y del 100% en la luz; adems de
que la cistena prcticamente no tiene efecto en impedir este fenmeno de oxidacin.
Con el anlisis estadstico realizado, se encontr que la significancia estadstica fue
alta solamente en el factor de variacin B (cido ascrbico, Anexo 13); sto se
corrobor al aplicar una DMS al promedio de valores de arco seno x de los
tratamientos.
Estos resultados sugieren que para evitar la necrosis de las nucelas de
aguacate, antes de su establecimiento in vitro deben de sumergirse en una solucin
de cido ascrbico en dosis de 400 mg/1 por 5 segundos, y posteriormente incubarlas
en oscuridad o bien a intensidades de luz de 9.4 Em
-2
s
-1
, con un fotoperiodo de 16
horas de luz por 8 de oscuridad y a una temperatura de 252C.
99
Cuadro 22. Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hass en
diferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad de luz.
Necrosis (%)
Tratamientos Oscuridad Luz
Sin antioxidantes 87.5 100
Cistena 91.5 79.16
Acido ascrbico 0 0
Cistena - Ac. ascrbico 4.15 3.84
100
4.2.2. Efecto de los; reguladores de crecimient y otros Componentes del medio
de cultivo en la embriognesis somtica
4.2.2.1. Induccin de callo embrignico
En el medio de cultivo in vitro, las sales minerales y;. otros componentes del
medio de cultivo as los reguladores de crecimiento, son tambin
fundamentales en la. indo -Ion de formacin de callo embr1 gn ico. El tejido nucelar
respondi de diferente manera al incubarse en los diferentes tratamientos de la
primera prueba, donde se vari la concentracin de nutrimentos del medio nutritivo
MS y el tipo y dosis de auxinas. La mejor formacin de callo se indujo en el medio
MS con la mitad de sus componentes (MS 1/2) suplementado con 0.01 mg/l de 2,4-
D, en un 28.57% de los explantes. Un valor de tan solo un 8.3% de las nucelas con
callo embriognico se obtuvo en el mismo medio MS 1/2 pero con 0.5 mg/l de
picloram.
Con el propsito de aumentar estos porcentajes de explantes con formacin
de callo embriognico, el tejido nucelar de aguacate fue incubado bajo otras dosis de
auxinas, observado un inicio de crecimiento de callo entre los 25 a 40 das despus
del establecimiento de las nucelas en el medio de cultivo, aunque los porcentajes de
nucelas con callo no aument considerablemente, si fue posible lograrlo en varios
tratamientos; se logr un 20% de formacin de callo embriognico en el medio MS 1/2
con 1 mg/1 de 2,4-D; un 17.8% en el tratamiento MS 1/2 con 4 mg/l de picloram ms
0.4 mg/1 de AIB; y un 10% al adicionar al medio de cultivo 2 mg/1 de picloram en
concentracin completa de MS (Figura 11), igual porcentaje se obtuvo con la dosis
de 2 mg/l de picloram ms 0.2 mg/l de AIB (Cuadro 23).
Generalmente los callos presentaron un color blanco crema, amarillento o
cristalino, mismos que con el transcurrir del tiempo cambiaron de color a caf claro y
oscuro (Figura 12); el dimetro que alcanzaron entre los 60 y 70 das fue de 8 a 13
mm (Cuadro 23).
101
Cuadro 23. Porcentaje de formacin de callo embriognico en tejido nucelar de
aguacate cv. Hass, color y dimetro en los tratamientos donde se
formaron las estructuras embriognicas.
Concentracin
de MS
Tipo y dosis de
reguladores de
crecimiento (mg/1)
Porcentaje
de formacin
callo
Color de
Callo
Dimetro de
Callo (mm)
1/2
1/2
Completas
"
Picioram-AIB 4 - 0.4
2,4-D 1
Picioram-AIB 2 - 0.2
Picioram 2
17.8
20
10
10
Blanco crema

Caf claro

13
Irregular
13
8
102
4.2.2.2. Multiplicacin y desarrollo de embriones somticos
En la prueba del efecto de reguladores de crecimiento sobre el desarrollo de
los embriones somticos de aguacate, pudo observarse que en la totalidad de los
tratamientos se present un mejor crecimiento del callo embriognico cuando se
mantena el explante a luz indirecta, a los 30 das de su cultivo; sin embargo, al
comparar de manera preliminar el nmero de embriones, cuando se utiliz BA (0.11
mg/I), la combinacin BA-AG
3
(0.11 mg/I de cada uno) y sin reguladores, no se
observ significancia estadstica en el ANDEVA. Situacin similar a la anterior se
present al evaluar otros tratamientos con reguladores de crecimiento, ya que con
picloram (0.1 mg/l) y sin reguladores, no existen diferencias estadsticas en el
nmero de: masas proembrognicas (MPE), estructuras globulares (EG),
acorazonados (EA), torpedos (ET) y embriones somticos maduros (ESM).
103
Al utilizar dosis mayores de picloram (0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I) y el testigo (0
mg/I), tambin no se detectaron diferencias estadsticas significativas en las
diferentes fases de los embriones somticos. La ausencia de accin alguna de los
reguladores de crecimiento BA (0.2 mg/I) y picloram (0.3 mg/l), sobre la multiplicacin
de masas proembriognicas en medio slido se confirm en la cuarta y quinta
prueba; sin embargo quedaba la duda del tipo de tejido ms adecuado para propagar
las diferentes fases de embriones somticos, para lo cual se establecieron en los tres
diferentes medios (BA, picloram y sin reguladores), dos tipos de tejidos a utilizar:
masas proembriognicas y globulares (Figura 13).
Lo anterior dio como resultado que a los 14 das se observara una
multiplicacin ptima en el nmero de estructuras embrionarias, a partir del tejido con
masas proembriognicas (Anexo 14), pero no as en los otros tejidos, donde no se
observaron diferencias.
104
Al utilizar diferentes dosis de casena hidrolizada, en otro de los experimentos,
se encontraron diferencias entre los tratamientos solamente en embriones globulares
y acorazonados a los 20 das del cultivo (Cuadro 24), no as en masas
proembriognicas, embriones en fase de torpedo (Figura 14) y maduros. En una
concentracin de 400 mg/l, el efecto fue positivo en el aumento del nmero de
estructuras globulares y acorazonados. En el cuadro 24 se observa la relacin
directa entre la concentracin de la casena hidrolizada adicionada al' medio de
cultivo y el nmero de estructuras de estos tipos: sin este compuesto y en
concentraciones altas (1,000 mg/l), no se induce el desarrollo de los embriones
somticos de aguacate.
Al evaluar otras dosis ms bajas de casena hidrolizada (100, 200 y 300 mg/l),
a los 19 das no se report significancia en el ANDEVA en las diferentes fases de
crecimiento y desarrollo de los embriones somticos.
Cuadro 24. Nmero de estructuras embrionarias (globulares y acorazonados) en
callos de aguacate cv. Hass a los 20 das del establecimiento.
Significancia estadstica (Tukey = 0.01).
Tratamientos Nmero de estructuras embrionarias
(Dosis casena, mg/1) Globulares Acorazonados
400 5.68 A 2.54 A
800 5.02 A 2.08 AB
600 4.58 AB 1.04 BC
0 4.20 AB 1.36 B
200 3.44 AB 1.72 AB
1,000 0.88 B 0.2 C
105
Al cultivar las estructuras embrionarias en medio lquido, en donde se
evaluaron diferentes dosis de picloram (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 y 1 mg/I), incubndolas
en agitacin orbital (100 rpm), se observ la presencia de necrosis en el tejido entre
los 15 y 20 das, situacin que no se present al cultivarse en medio slido, en donde
despus de los 25 a 30 das se empieza a deteriorar el tejido; sin embargo, pudo
constatarse que hubo un mayor nmero de estructuras embrionarias con altos
porcentajes de viabilidad (85%) en el medio sin picloram, a los 20 das del cultivo:
se encontraron 29.5 masas proembriognicas, 12.5 estructuras globulares, 4
estructuras en forma de corazn y 4.5 estructuras torpedo, por cada 10 mi de medio
(Cuadro 25).
Adems, en este ltimo tratamiento se observ la formacin de embriones
somticos maduros completos, disgregados y de color amarillo claro, en tanto que en
el tratamiento con la dosis ms alta de picloram, lo embriones se presentaron en
agregados, de color caf claro a oscuro y sin llegar a la maduracin.
106
Cuadro 25. Nmero y porcentajes de viabilidad de estructuras embrionarias de
aguacate cv. Hass en sus diferentes fases, por cada 10 ml de
medio, a los 20 das de cultivo.
Nmero de estructuras embrionarias Tratamiento
Dosis de picloram
(m9/1)
MPE EG EA. ET
Viabilidad
(%)
0 29.5 12.5 4 4.5' 85
0.1 13.5 12 2 1.5 80
0.3 6.5 6 1.5 0.5 35
0.5 13 10 4 0 45
0.7 8.5 8.5 2 > 0:5 55
1.0 6.5 10 2.5 0.5 17.5
Asimismo, al evaluar la ganancia de peso del cultivo de masas
proembriognicas en medio lquido, se encontr la mayor ganancia (0.85 g) en el
tratamiento sin picloram y la menor (0.63 g) en el tratamiento con 0.7 mgll de
picloram, a los 20 das por cada 12.5 ml de muestra.
Con el fin de obtener un cultivo masivo de masas proembriognicas o de
embriones somticos de aguacate, se establecieron cultivos de masas
proembriognicas y embriones somticos en fase globular en un biorreactor.
Previamente se verific que la viabilidad de estas estructuras fuera del 100%. Se
inocul con 5.0363 mg/ml de masas proembriognicas, se encontr .a los 25 das .un
incremento en el peso de la muestra por ml del 200%, al obtener 15.5 mg/ml; cabe
sealar que el medio de cultivo se prepar con 0.3 mg/l de picloram.
4.2.2.3. Maduracin de embriones somticos
Con la adicin al medio de cultivo de los diferentes reguladores de crecimiento
en varias dosis para inducir la maduracin de los embriones y conseguir un nmero
ptimo de embriones somticos maduros (ESM), fue posible observar el efecto de
estas sustancias.
107
En los medios de cultivo con BA (0.11 mg/l) y ABA (1 y 2 mg/I), a los 22 das
del establecimiento se generaron ESM con un promedio por caja de petri (con 5
explantes) de 0.48, 0.66 y 0.76 respectivamente, es decir a mayor cantidad de ABA
el promedio fue, mayor, no obstante no se encontr significancia en el ANDEVA
(Anexo 15). Al aumentar los niveles de BA (1 mg/l) y ABA (2, 4 y 8 mg/l), en dosis de
sacarosa de 30 y 60 g/l, tambin se obtuvieron ESM, se aument el promedio de
stos al incubarse en MS con 8 mg/l de ABA (0.64 ESM), con un valor promedio
mximo de 0.88 en MS con 60 g/I de sacarosa, aunque no se encontr significancia
estadstica en el ANDEVA (Anexo 16).
Con base en los resultados anteriores y de acuerdo a los trabajos de
Witjaksono y Litz (1999b), se decidi probar en el medio de cultivo diferentes dosis de
agar (5, 6, 7, 8 y 10 g/I), sin encontrar valores ms altos de ESM que en el
experimento anterior, y sin diferencias significativas entre los tratamientos. En el
medio de cultivo utilizado como control (MS con 5 g/l de agar), no se. observaron
ESM. El promedio mximo de ESM por caja de petri (con 5 explantes) fue de 0.6 en
MS con 7 g/I de agar y el mnimo de 0.13 al incubarlos en medio nutritivo con 6 g/l.
Debido a esto, se incrementaron las dosis de altar hasta una concentracin mxima
de 20 g/l (8, 11, 14 y 20 g/l), observndose la formacin de ESM a los 36 das en
todos los tratamientos, con valores mximos de 0.9750 en presencia de 20 g/I de
agar, seguido de los valores promedio de EM de 0.5429 y 0.4889 en los tratamientos
con 14 y 11 g/I de agar, respectivamente (Cuadro 26).
Se obtuvo una alta significancia en los valores del factor de variacin
tratamientos (Anexo 17), al realizar el ANDEVA con el promedio de embriones por
caja de petri (con 7 explantes), por consiguiente se aplic la prueba de comparacin
de medias Tukey (=0.01), se elimin el tratamiento testigo que present 0
embriones maduros. En el ltimo grupo de significancia se ubic el tratamiento de 8
g/l de agar (Cuadro 26).
108
Cuadro 26. Promedio de embriones somticos maduros de aguacate cv. Hass por
caja de petri, a los 36 das. Significancia estadstica Tukey (a=0.01).
Tratamientos Media Significancia estadstica
Dosis de agar (g/I) Tukey
20 0.9750 A
14 . 0.5429 B
11 0.4889 B
8 0.0857 C
En otro experimento, donde se probaron 10, 20 y 30 g/I de agar, con la
finalidad de confirmar el efecto del agar sobre la maduracin de los embriones
somticos de aguacate, a los 23 das del cultivo se detect un promedio de ESM por
caja de petri hasta de 1.96 en 20 g/I de agar (Figura 15A), 1.88 en 30 g/I y 0.24 en 10
g/l. No hubo diferencias estadsticas entre los tratamientos de 20 y 30 g/I, pero s con
el de 10 g/I (Tukey, = 0.01) (Cuadro 27).
Cuadro 27. Promedio de embriones somticos maduros de aguacate cv. Hass por
caja de petri a los 23 das. Significancia estadstica Tukey (a= 0.01).
Tratamientos
Dosis de agar (g/l)
Media
20 1.96 A
30 1.88 A
10 0.24 B
Adems, para conseguir la maduracin de embriones somticos de aguacate,
se estudi el efecto de diferentes dosis de sacarosa (30, 50, 70 y 90 g/I) y manitol (7,
9, 11 y 13%) para observar la consecuencia del aumento de la presin osmtica del
medio de cultivo. En los medios de cultivo con la variacin en la concentracin de
sacarosa, se generaron ESM en un promedio mximo por caja de petri de 0.37 con
50 g/l, pero no existieron diferencias entre los tratamientos probados (Anexo 18); se
repiti la prueba anterior, se encontr solamente formacin de ESM en el tratamiento
90 g/I de sacarosa con un promedio de 0.22. Al cultivar las estructuras embrionarias
109
en medios con manitol, no se present la maduracin de embriones somticos y se
detect un alto porcentaje de necrosis en los tejidos incubados (90%).
La maduracin de los embriones somticos de aguacate se percibe por los
cambios de coloracin, formacin de nuevo tejido y por el tamao de stos. Ya se ha
indicado que el color de los ESM cambia de amarillo cremoso a blanco, al observar
la formacin de un tejido envolvente rgido (Figura 15A). El tamao de los ESM llega
a alcanzar los 5 x 3 mm (Figura 15B), aunque esto depende del medio y condiciones
de cultivo. Generalmente los resultados confirman que el tamao de los ESM se
comporta inversamente proporcional al nmero de stos por caja de petri, con la
110
dosis ms alta de agar se encontraron los embriones ms pequeos con un
promedio de 2 x 1 mm, la siguiente de 2 x 2, 4 x 3 y en la dosis ms baja, ESM de 5 x
3 mm.
4.2.2.3.1. Anlisis de almidn y glucosa de embriones somticos maduros
Se analiz la presencia de almidn y glucosa en los ESM de aguacate
obtenidos en esta investigacin para verificar la integridad de stos y relacionar el
contenido con la respuesta de germinacin. Cortes de tejido de los ESM fueron
sometidos a tincin con una solucin de fugo (2 g de yoduro de potasio + 1 g de
yodo en 250 ml de agua), y fueron observados en el microscopio de fases. Las
clulas no mostraron el color azul caracterstico de la presencia de grnulos de
almidn, se concluye que no haba almidn en los ESM. En la cuantificacin de
glucosa, los ESM presentaron un contenido de 6.026 x 10
-4
mg a 13.779 x 10
-4
mg
por cada mg de ESM.
4.2.2.4. Germinacin de embriones somticos maduros
Con las diferentes pruebas realizadas sobre reguladores de crecimiento,
interaccin BA-AG
3
BA-AIB, BA-2,4-D y brasinoesteroides- BA-AG
3
en medio slido,
dosis de BA, TDZ e interaccin, BA-AIB en medio lquido con papel filtro o en
magenta en diferentes tiempos de inmersin o con diferentes dosis de adenina
(Figura 16), no se obtuvieron porcentajes aceptables de germinacin, ya que
solamente en algunos tratamientos se observaron indicios de emisin de brotes o
formacin de races (Figura 17).
De manera general, con niveles altos de reguladores se gener nuevamente
callo embriognico, es decir que los tejidos sufrieron de nuevo desdiferenciacin
celular. No obstante a lo anterior, al establecer los embriones somticos en medio de
cultivo con sales de Anderson (1975) modificada en nitratos (+25%), sin reguladores
de crecimiento y recultivar stos a los 90 das a medio MS con BA 0.3 mg/l, se
111
obtuvo un porcentaje del 10% de germinacin a los 118 das de su establecimiento
(Figura 18).
112
113
V. DISCUSIN
5.1. Organognesis de aguacate criollo
5.1.1. Condiciones ptimas de asepsia para el establecimiento in vitro de yemas
axilares de aguacate
En los cultivos in vitro encaminados a la obtencin de procesos
morfogenticos, como la organognesis, uno de los principales problemas es la
enorme dificultad para establecer los explantes en condiciones aspticas y lograr
excelente brotacin, debido a la alta incidencia de contaminacin por hongos y a la
necrosis apical (Pliego-Alfaro et al., 1987). Para establecer ptimamente un sistema
in vitro, existen mtodos rutinarios de asepsia que involucra el uso de compuestos
detergentes y txicos a microorganismos, as como el uso de plaguicidas y
antibiticos usados directamente sobre el explante o adicionados al medio de cultivo
(McClelland y Smith, 1993).
En las yemas de aguacate, el uso de plaguicidas para eliminar los patgenos
del explante fue ms eficiente cuando se incorporaron al medio de cultivo, esto
probablemente porque su absorcin es lenta y en determinada forma dosificada por
la misma entrada de los compuestos nutritivos a los tejidos del explante. Uno de los
mejores tratamientos para eliminar la presencia de hongos, fue la incorporacin al
medio de cultivo de solamente 1 g/I de benomilo, con una permanencia del explante
que no excedi los 15 das, ya que con los resultados obtenidos, se observ que
estos explantes soportaron hasta los 48 das sin mostrar sntomas de necrosamiento
o fitotoxicidad.
114
5.1.2. Prevencin de necrosis de yemas axilares de aguacate
Al preparar los explantes para su establecimiento in vitro se daan los tejidos y
los compuestos fenlicos que estn acumulados en grandes cantidades en las
vacuolas se mezclan con el contenido de los plastidios y otros orgnulos donde estn
confinadas las polifenoloxidasas y aparece la coloracin negra o marrn como
consecuencia del proceso de oxidacin (Jimnez,1998). El tratamiento que result
ms favorable para eliminar el necrosamiento de las yemas axilares de aguacate in
vitro, fue la inmersin del explante en cido ascrbico (400 mg/I) durante 30 minutos
previo a su establecimiento en el medio de cultivo. Este resultado elimina el problema
de manera ms prctica y econmica que la obtenida por Pliego-Alfaro y col. (1987)
y Barcel-Muoz y col. (1999), ya que el primer grupo de investigadores proponen la
tcnica de cultivo de doble fase o recultivos mltiples a intervalos cortos, condiciones
que inducen hiperhidricidad e hinchamiento de las yemas las cuales mostraron un
lento crecimiento. El segundo grupo indica que para vencer el problema anterior se
deben cultivar las yemas apicales o laterales en medio lquido en un agitador
giratorio por un periodo de 2 semanas. Todo lo anterior increment los costos y
tiempo.
5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en
la organognesis in vitro de aguacate
La composicin de un medio de cultivo es determinante en el crecimiento y
desarrollo del explante, las sales minerales y los reguladores de crecimiento son
importantes. Los resultados obtenidos en la brotacin in vitro de yemas axilares de
rbol adulto de aguacate criollo, indican que en las sales minerales MS 20% con BA
2 mg/l y AIB 0.2 mg/I, se produce el mayor porcentaje de brotacin (76% a los 55
das del establecimiento del explante) y el mayor nmero de brotes laterales (3.41),
aunque la mayor longitud del brote principal (32.17 mm a los 127 das) se obtuvo con
MS 100% y 2 mg/I de BA y AIB; sin embargo, no se observaron diferencias
115
estadsticas significativas cuando se emple MS o WPM al 100% con BA 2 mg/I y
AIB 0.2 mg/l. De manera general, la brotacin fue mayor (43.16%) en los medios de
cultivo preparados con sales minerales MS, en tanto que en sales WPM fue de 28%
y en Mc Cown's del 24%.
En la fase de establecimiento de un explante in vitro se requiere obtener la
mxima brotacin, brotes bien formados, de una longitud aceptable y con la mayor
cantidad de yemas axilares, situacin que en parte se logr en aguacate criollo al
utilizar el medio de cultivo con sales MS 20%, en tanto que Pliego-Alfaro y col. (1987)
con el portainjerto IV-8 muestran que la reduccin de macroelementos MS a la mitad
de su concentracin fue benfico para el desarrollo de brotes; una reduccin del
porcentaje de sales conlleva a obtener una buena brotacin, pero reducida longitud
de stos y por consecuencia menor cantidad de yemas axilares potenciales a
recultivar en la fase de multiplicacin. De estos resultados se observa que existe una
relacin directa entre menos sales (MS 20%), mayor brotacin y menor longitud de
los brotes, y ms sales (MS al 100%), menor brotacin y mayor longitud de los
brotes.
Con relacin al barrido de reguladores de crecimiento realizado en la fase de
iniciacin, resulta notable que la falta de la citocinina en el medio de cultivo es
determinante para lograr la brotacin y que precisamente los tratamientos que
mostraron las mayores brotaciones fue con BA, situacin que coincide con lo
sealado por Davies (1995), Cline (1996) y Brandstatter y Kieber (1998), en donde
para obtener morfognesis, iniciacin y crecimiento de brotes se requiere la
presencia de citocinina.
En resumen, el efecto de las sales minerales MS es mejor que las del WPM y
Mc Cown's para la brotacin de yemas axilares de aguacate criollo (P. americana
var. drymifolia), varios investigadores reportan su uso (Nel et al, 1982; Gonzlez y
Salazar, 1984; Gonzlez et al., 1985; Shall, 1987; Pliego et al., 1987; Solrzano-
Vega, 1989; Mohamed-Yasseen, 1995b y Barcel-Muoz et al., 1999), pero no
116
coinciden los resultados que se obtuvieron con los de estos investigadores, en
cuanto a la concentracin de las sales minerales, y en el tipo y dosis de los
reguladores de crecimiento, ya que en sus estudios emplearon germoplasma
diferente de aguacate, como P. indica, P. americana raza antillana, P. schiedeana, P.
americana cv. Fuerte entre otros, y por el tipo de explante que utilizaron para
regenerar plntulas in vitro: brotes de 3-5 cm de plntulas de 1 ao, segmentos de
tallo obtenidos a partir de semilla, ejes embrionarios de semillas maduras y brotes
bsales obtenidos despus de podar el rbol a nivel de suelo.
En la multiplicacin de brotes in vitro se observ que las yemas axilares y
apicales brotaron primero (12 das), en tanto que las yemas de la base del explante
brotaron posteriormente. Lo anterior es una respuesta normal, debido a que los
tejidos jvenes inician ms rpido el crecimiento en condiciones in vitro, que coincide
con lo sealado por Halperin (1996) quien demostr que la edad fisiolgica del inculo
influye en la formacin de rganos.
Por otra parte, resulta evidente que en la prueba de brotacin mltiple o
multiplicacin de brotes, los valores ms altos en cuanto a nmero de brotes
promedio por frasco (10.9 y 9 a los 85 das) se obtuvieron con dosis altas de
citocinina (0.9 y 0.6 mg/l de BA, y 0.9-0.1 mg/l de BA-AIB), sin embargo estos
tratamientos formaron callo abundante en la base del explante (70, 55.56 y 40%
respectivamente); indudablemente que con slo 0.3 mg/l de BA se observ poca
formacin de callo, un nmero aceptable de brotes promedio por frasco (6.9), buena
longitud promedio de los brotes (28.48 mm) y de color verde oscuro, crecimiento
uniforme y vigoroso. Estos resultados no coinciden con la dosis de reguladores de
crecimiento reportada por Nel y col. (1982) quienes trabajaron con P. indica y que
en la fase de establecimiento as como en las subsecuentes multiplicaciones
agregaron al medio 2 mg/l de BA; tampoco coincide con lo obtenido por Gonzlez y
Salazar (1984) quienes observaron crecimiento de yemas axilares en P. americana
raza antillana en un medio con mayor proporcin de auxina que de citocinina (0.3
mg/I de AIB y 0.1 mg/l de K); tambin difieren con Shall (1987) que utiliz P.
117
americana cv. Fuerte, en donde foment la formacin de brotes con 5 y 10 mg/I de
BA; probablemente esto sea un reflejo de la diferencia endgena de las citocininas
en estas especies de Persea, ya que en la especie y variedad de estudio se requiere
una cantidad mnima de citocinina (0.3 mg/I de BA) para la multiplicacin de los
brotes.
En la prueba anterior tambin se observ que cuando no se utilizan
reguladores de crecimiento se obtiene una buena longitud del brote, pero sin que
ste multiplique, en algunas especies esta etapa es necesaria para desarrollar el
brote, antes de la induccin de races o de la aclimatacin. Lo antes mencionado
coincide con Von Amold (1988) quien seala que frecuentemente es necesario
eliminar las citocininas para el alargamiento y el enraizamiento de los brotes.
En la fase de enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo se reportan
porcentajes de formacin de races hasta del 44.44%, con un promedio de races por
brote de 2.25, aceptable en plantas leosas como el aguacate, aunque este valor es
menor al alcanzado por Barcel-Muoz y col. (1999) con brotes del portainjerto
seleccin IV-8, no obstante que para lograr estos resultados usaron dos tipos de
medio, primero establecieron los brotes en medio lquido en un agitador giratorio con
macroelementos MS 0.3X y 4.9 M de AIB y posteriormente los transfirieron a medio
slido en ausencia de auxina pero con 1 g/I de carbn activado, procedimiento que es
imprctico y costoso. En cuanto a la dosis de la auxina que se encontr como
mejor respuesta, 0.4 mg/I de AIB, no coincide con el nivel obtenido por Nel y col.
(1982), Gonzlez y Salazar (1984) y Mohamed-Yasseen (1995b) en germoplasma de
aguacate diferente, investigadores que sugieren dosis de 2 hasta 10 mg/1 de AIB.
La fase de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro es fundamental y
crtica, por la deshidratacin y la intensidad de luz a que se expone, porque en
general una plntula in vitro no desarrolla sistemas de regulacin hdrica tales como
cera, estomas, cutcula, etc. (Preece y Sutter, 1991) y la intensidad de luz puede ser
hasta 9 veces ms (900 W/m
2
) (Abdeinour y Vicent, 1993); de ah que la proteccin
118
del tejido con Folicote (ceras y parafinas refinadas) en cmara hmeda result
favorable y coincide con la sugerencia de Preece y Sutter (1991). La aplicacin de
Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua y la cubierta plstica durante 80 das o
hasta que la plntula forme dos hojas ms, increment la supervivencia hasta el
100%, estos resultados difieren con los obtenidos por Nel y col. (1982) quienes
alcanzaron tan slo un 50% de supervivencia, Schall (1987) un 80% y Barcel-
Muoz y col. (1999) un 70%.
En los estudios citolgicos de las hojas de las plntulas producidas in vitro se
observaron clulas estomticas deformes, cutcula delgada y ausencia de ceras,
aspectos coincidentes con los sealamientos de Caal y col. (1999) que en
respuesta al ambiente en micropropagacin se presentan: a) En los tejidos.-
disminucin del rea foliar, en el contenido de clorofila y del nmero estomtico,
menor desarrollo anatmico y peso seco, disminucin o alteracin del contenido de
ceras, funcionamiento estomtico anormal y b) En la planta.- menor tasa de
crecimiento, crecimiento suculento, desrdenes fisiolgicos y morfolgicos, formacin
de pocas races secundarias, elevada variabilidad en tamao y forma, mayor
frecuencia de mutaciones y presencia de contaminaciones.
Al integrar de manera conjunta los mejores tratamientos, con base a los
resultados obtenidos, en cada una de las fases del sistema de micropropagacin va
organognesis, se encontr que este sistema resulta prctico, rentable, confiable y
asegura la produccin clonal de plantas libres de enfermedades, adems que en
corto tiempo se puede producir una alta cantidad de plantas. De una yema axilar de
rbol adulto de aguacate criollo, establecida in vitro en la fase de iniciacin, a los 100
das se obtienen 5 yemas axilares, mismas que se establecen en medio de cultivo en
la fase de multiplicacin y que a los 70 das generan 11:5 brotes con 5 yemas cada
uno, o sea en multiplicacin se logran 57.5 yemas que se cultivan en medio inductor
de races, se obtiene un 44% de brotes con raz (25.5 brotes), los cuales a los 6
meses de cultivo en invernadero se encuentran listos para su establecimiento en
campo, o bien para recibir el injerto. En cada una de las fases de laboratorio se utiliz
119
solamente un tipo de medio de cultivo y una cmara de crecimiento con temperatura
constante de 252C y fotoperiodo de 16 horas de luz, a diferencia de algunos
protocolos que requieren para brotacin, subsecuentes multiplicaciones y
enraizamiento, equipo especial tal como un agitador giratorio o bien condiciones de
doble fase (medio lquido - slido o slido - lquido) para poder lograr el propsito.
5.2. Embriognesis somtica de aguacate cv. Hass
La embriognesis somtica es una va ideal para investigar los procesos
completos de diferenciacin de plantas, as como los mecanismos de expresin de
totipotencia en clulas vegetales (Nomura y Komamine, 1999), mejoramiento del
cultivo, eliminacin de enfermedades, conservacin de germoplasma y propagar
clonalmente plntulas sobresalientes (Janick, 1993), de manera ms prctica y
econmica en comparacin a la organognesis, siempre y cuando para esto ltimo
se inicie el proceso con tejido somtico (nucelas) y no con embriones cigticos
inmaduros. Numerosas investigaciones en diferentes especies vegetales indican la
utilizacin de tejido nucelar en la generacin de callo embriognico (Rangan et al.,
1968; Ltz, 1984a; Litz, 1984b), especficamente en aguacate se ha generado la
embriognesis somtica, pero con embriones cigticos inmaduros (Mooney y Van
Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Raviv et al., 1998; Witjaksono y Litz,
1999a).
5.2.1. Prevencin de necrosis de tejido nucelar de aguacate
Una etapa importante en la embriognesis es el establecimiento in vitro de
tejido nucelar que genere callo embriognico, al evitar la contaminacin y oxidacin
del tejido; en este estudio se encontr una reduccin total de la necrosis en las
nucelas de aguacate (P. americana cv. Hass) por efecto del cido ascrbico (400
mgll durante 5 segundos), antes de su colocacin en medio de cultivo. El factor
oscuridad (etiolacin del tejido) y el compuesto cistena que en algunos explantes
120
han reducido la necrosis-oxidacin (Zirari y Lionakis, 1994; Mohamed-Yasseen,
1995b; Llano-Agudelo et a/., 1995; Jimnez, 1998), en tejido nucelar de aguacate no
mostraron un efecto positivo, probablemente por la gran cantidad de fenoles que
existen en esta especie.
5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en
la embriognesis somtica de aguacate
En las pruebas realizadas con tejido nucelar de aguacate cv. Hass se obtuvo
formacin de callo en 28.57% de los explantes con sales MS a 1/2 de su
concentracin ms 0.01 mg/1 de 2,4-D y 17.8% con las mismas sales anteriores pero
con 4 mgll de pictoram ms 0.4 mgfl de AIB; se corrobor as el papel esencial que
juegan las auxinas en la induccin de la embriognesis (Hobbie et a/., 1994; Davis,
1995; Macdonald, 1997). En base a los resultados anteriores y a los sealamientos
de Gmez (1998), en relacin al papel que desempea el 2,4-D en la incidencia de la
variacin gentica y los cambios epigenticos que aparecen en plantas obtenidas de
embriones somticos para la generacin de callo embriognico, es ms conveniente
la utilizacin de las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4mg/I), esto indudablemente en
una concentracin de sales minerales MS 1/2 suplementadas con vitaminas, casena
hidrolizada, sacarosa, agar-agar (Sigma) y ajustar el pH a 5.7. Las dosis de
reguladores de crecimiento difieren en gran medida con las encontradas por Mooney
y Staden (1987), Pliego-Alfaro y Murashige (1988) y Witjaksono y Litz (1999a) con
embriones cigticos inmaduros, quienes determinaron que en la generacin de callo
embriognico se utilice solamente 0.1 mg/1 de picloram, debido principalmente a lo
anteriormente descrito, por la concentracin endgena diferente de los explantes.
En las pruebas sobre multiplicacin de masas proembriognicas y desarrollo
de embriones somticos en medio slido y lquido con uso del agitador, no se detect
respuesta al picloram y fue claro que al incrementar la dosis de esta auxina en medio
lquido se disminuy la viabilidad de los embriones hasta el 17.5% con 1 mg/l de
picloram, adems de la disminucin en un 80% de la formacin de masas
proembriognicas. Estos resultados no coinciden con lo reportado por Mooney y
121
Staden (1987) y Witjaksono y Litz (1999a) investigadores que subcultivaron el callo
embriognico en medio con auxinas, utilizaron cido benzotiazol-2-oxiactico (BTOA
o BOA) los primeros y picloram los segundos, aunque si coincide en los periodos
para recultivar el callo sin esperar a que se deteriore el tejido. El hecho de la falta de
respuesta del tejido vegetal a la auxina es debido a que la permanencia continua en
medio de cultivo con auxina, adems de perderse la capacidad de morfognesis,
tambin se pierde la formacin de masas proembriognicas (Halperin, 1996); por lo
anterior, es conveniente cultivar el callo embriognico de aguacate cv. Hass en
medio sin auxinas.
Con relacin al tipo y desarrollo de embriones somticos que se multiplicaron
en medio de cultivo slido o lquido, se encontr que no obstante que en medio
lquido la multiplicacin es de 5 a 7 das ms rpida que en medio slido, los
embriones estuvieron mejor formados en medio slido.
Los resultados obtenidos en la maduracin de embriones somticos son
coincidentes a los obtenidos por Pern-Quesada y col. (1999) en cuanto al efecto del
agente gelificante, ellos encontraron un efecto significativo de ste sobre el nmero
de embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, fue mayor con la
concentracin de 6.8 g/I de gelrite, mientras que en ste estudio el mayor promedio de
embriones somticos maduros se obtuvo con 20 g/I de agar-agar (Sigma). Sin
embargo, no coinciden en cuanto a que elevadas concentraciones de sacarosa
tienen un efecto positivo en la formacin de embriones maduros. Witjaksono y Litz
(1999b) tambin reportan el efecto de la concentracin del agente gelificante en el
tamao y nmero de embriones somticos opacos, con una ptima respuesta a 6-7
g/I de gel-gro, cabe sealar que tanto el gelrite como gel-gro son agentes
gelificantes, de los cuales normalmente se utiliza entre 1.5 y 2 g/I de medio de
cultivo.
Al endurecer el medio de cultivo con agar-agar se provoc una reduccin en la
humedad relativa dentro de la caja de petri, ambiente que propici una desecacin
122
lenta de los embriones somticos y una condicin de estrs que aceler la
maduracin de stos, no obstante que a mayor concentracin del agente gelificante
el dimetro de los embriones somticos fue menor, respuesta similar a la observado
por Witjaksono y Litz (1 999b).
En los anlisis de los embriones somticos maduros no se encontr la
presencia de almidn, solamente glucosa, aunque en cantidades muy pequeas,
algunas de estas molculas de glucosa se oxidan por completo en las clulas
embrionarias hasta la produccin de H
2
O y CO
2
; otras molculas de glucosa se
convierten en molculas de sacarosa y son transportadas a las clulas que inician el
crecimiento de la raz y tallo, donde algunas son consumidas por completo en la
respiracin y otras se destinan a materiales de la pared celular, protenas y otras
sustancias necesarias para el crecimiento del brote (Salisbury y Ross, 1994).
Se obtuvo hasta un 10% de germinacin en los embriones somticos de
aguacate cv. Hass, con el solo hecho de usar sales minerales de Anderson (1975)
modificadas en nitratos, sin reguladores y recultivar stos en medio ptimo, para
multiplicar brotes de aguacate, cabe sealar que en este ltimo medio de cultivo la
presencia de la citocinina (BA) fue determinante para inducir la germinacin. Las
investigaciones realizadas al respecto con otro germoplasma, mencionan porcentajes
de 12% para emisin de brotes y de 1 % en formacin de brotes-races en un medio
con 0.1 mg/l de la citocinina TDZ ms 0.5 mg/l de AG3 (Raviv et al., 1998) o bien sta
ha sido espordica (Witjaksono y Litz, 1999b).
Al poner 90 das los embriones somticos maduros de aguacate en un medio
de cultivo bajo en nitratos, como fueron las sales de Anderson modificadas, fue un
estimulo para que los embriones despus de este perodo iniciaran la germinacin al
encontrarse en un medio con alrededor de 3 veces ms el contenido de NH
4
NO
3
y de
6 veces el de KNO
3
ms el regulador de crecimiento BA.
123
El sistema de embriognesis somtica que con las diferentes pruebas se
determin, permiti en primer lugar asegurar la propagacin clonal del aguacate,
debido a que en principio se parte de tejido nucelar y no de embriones cigticos
como hasta la fecha lo indican los reportes realizados por varios investigadores. De
manera prctica se encontr que para generar callo embriognico de aguacate cv.
Hass se debe utilizar nucelas obtenidas de frutos pequeos 10 a 12 mm de dimetro y
previo tratamiento con cido ascrbico, proceder a su establecimiento in vitro en
medio MS a 1/2 de su concentracin de sales, complementado con vitaminas,
casena hidrolizada, las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4 mgll), sacarosa, agar-
agar y ajustar el pH a 5.7. En la multiplicacin y desarrollo de los embriones
somticos se emple como explante masas proembriognicas en un medio MS
suplementado con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/l, casena hidrolizada 400 mg/l,
sacarosa 3011 y agar-agar 5 g/l. Mientras que para madurar los embriones somticos
se emple el mismo medio anterior, solamente se increment la cantidad de agar-
agar a 20 g/I de medio y eliminar la casena. El porcentaje de germinacin obtenido
(10%) aunque es bajo, indica la tendencia para incrementarlo, al modificar la
concentracin de las sales minerales y evitar el uso de reguladores de crecimiento en
el medio de cultivo durante los primeros meses.
En esta investigacin, pudo determinarse el efecto de la aplicacin exgena de
los reguladores de crecimiento, al corroborar en algunos casos la funcin de stos
sobre el papel de la morfognesis in vitro. La combinacin de una citocinina con
auxina en una relacin de 10:1 fue efectiva para la induccin de brotes a partir de
yemas axilares de aguacate criollo y su multiplicacin fue contundente con la
supresin de auxina y una dosis baja de citocinina. La funcin de la auxina endgena
fue importante para provocar un enraizamiento ptimo, con slo aplicar de manera
exgena una cantidad mnima de auxina.
Las auxinas durante el proceso de la embriognesis somtica, al implicar la
induccin, la multiplicacin de masas proembriognicas y la germinacin de los
embriones somticos de aguacate cv. Hass, fueron importantes ya que se requirieron
124
en dosis relativamente altas para la induccin, la eliminacin de stas en la
multiplicacin de las masas proembriognicas, desarrollo de las estructuras
embrionarias y en la germinacin. Para este ltimo proceso la adicin de una
citocinina fue relevante.
Los sistemas de organognesis y embriognesis somtica determinados en
esta investigacin son de enorme utilidad, porque sientan las bases para futuros
estudios sobre la conservacin de germoplasma in vitro, seleccin de variantes y
mutantes (variacin somacional), rescate de embriones, transformacin y la
hibridacin somtica; adems de que con estos sistemas es posible propagar
clonalmente plantas libres de enfermedades y la produccin de semilla sinttica.
125
VI. CONCLUSIONES
Se establecieron cultivos in vitro de yemas axilares de rbol adulto de
aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass, se logr evitar la
contaminacin de los explantes mediante la desinfeccin superficial e interna con el
uso de plaguicidas como el Benlate y Agrimicin 500, y el desinfectante hipoclorito de
sodio. As mismo, la necrosis tanto de las yemas axilares y de las nucelas se previno
con un tratamiento de inmersin en solucin con cido ascrbico.
Se determinaron las dosis y tipos de reguladores de crecimiento para
conseguir la organognesis en yemas axilares de aguacate criollo, y la
embrognesis somtica por el cultivo de tejido nucelar de aguacate cv. Hass.
Con la aplicacin de la citocinina BA o la auxna AIB en una relacin
adecuada, se logr la induccin, multiplicacin y enraizamiento de los brotes hasta la
formacin de plantas completas.
La formacin de masas proembriognicas se obtuvo por el efecto principal de
las auxinas picloram y AIB, y despus no fueron requeridas para la multiplicacin y
desarrollo de las estructuras embrionarias (globulares, acorazonados, torpedos y
maduros). La germinacin de los embriones somticos de aguacate cv. Hass se
consigui en porcentajes relativamente bajos, en un cultivo de dos fases: primero en
un medio con baja cantidad de nitratos y sin reguladores de crecimiento; y despus
en presencia de la citocinina BA, en donde se obtuvieron plantas completas.
Las plantas regeneradas de aguacate pudieron ser ptimamente
transplantadas y aclimatadas, al evitar el estrs hdrico de la plntula y mantenerla
en un microambiente especial hasta la formacin de nuevo tejido (2 hojas).
126
VII. LITERATURA CITADA
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141
ANEXOS
Anexo 1.
Reactivos empleados en los diferentes medios de cultivo o soluciones.
Reactivo Frmula Marca
Macroelementos
Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
Cloruro de calcio 2 hidratado
Nitrato de calcio 4 hidratado
Sulfato de magnesio 7 hidratado
Fosfato de potasio monobsico
Sulfato de potasio
Fosfato de sodio
Microelementos
Acido brico
NH
4
NO
3
KNO
3
CaCI
2
.2H
2
O
Ca (NO
3
)
2
4H
2
O
MgSO
4
.7H
2
O
KH
2
PO
4
K
2
SO
4
NaH
2
PO
4
H
3
BO
3
Sigma
"
Sigma
"
J.T. Baker
"
Merck
Sigma
Sigma
Sulfato de manganeso monohidratado MnSO
4
.H
2
O "
Sulfato de zinc 7 hidratado ZnSO
4
.7H
2
O J.T. Baker
Yoduro de potasio KI Sigma
Molibdato de sodio 2 hidratado Na
2
Mo0
4
.2H
2
O Aldrich
Sulfato cprico 5 hidratado , CuSO
4
.5H
2
O Merck
Cloruro de cobalto 6 hidratado CoCl
2
.6H
2
O Sigma
Solucin de fierro
Acido etilendinitrilotetraactico C
10
H
16
N
2
O
8
Sigma
Sulfato ferroso 7 hidratado FeSO
4
.7H
2
O "
Vitaminas MS
Biotina (Vitamina H) C
10
H
16
N
2
O
3
S Sigma
Piridoxina (Vitamina B6) C
8
H
11
NO
3
HCI "
Tiamina (Vitamina B1) C
12
H
17
CIN
4
OS.HCL-
Acido nicotnico (Niacina) C
6
H
5
NO
2
"
142
Reactivo Frmula Marca
Reguladores de crecimiento
Bencilaminopurina (BA) C
12
H
11
N
5
Sigma
Cinetina (K) C
10
H
9
N
5
O "
Thidiazuron (TDZ) C
9
H
8
N
4
OS "
Acido indolbutrico (AIB) C
12
H
13
NO
2
"
Acido Naftalenactco (ANA) C
12
H
10
O
2
"
2,4-D C
8
H
6
C
12
O
3
Sigma
Picloram C
6
H
3
C
13
N
2
O
2
"
Acido giberlico (AG3) C
19
H
22
O
6
"
Acido abscisico (ABA) C
15
H
20
O
4
"
Otros compuestos
Yodo l
2
Sigma
Pantotenato de calcio C
18
H
32
CaN
2
O
10
"
Glicina C
2
H
5
NO
2
"
Mioinositol C
6
H
12
O
6
"
Glutamina C
5
H
10
N
2
O
3
"
Hemisulfato de adenina C
5
H
5
N
5
1/2 H
2
SO
4
"
Azcar refinada comercial
Sacarosa C
12
H
22
O
11
"
Manitol C
6
H
14
O
6
"
Glucosa (oxidasa) Hycel
Agar-agar Sigma
Phytagel "
Acido ascrbico C
6
H
6
O
6
"
Cistena C
3
H
7
NO
2
S "
Carbn activado Merck
Casena hidrolizada Sigma
Diacetato de fluorescena C
24
H
16
O
7
"
143
Reactivo Frmula Marca
Acido clorhdrico HCI J.T. Baker
Hidrxido de calcio NaOH "
Polioxietilensorbitan Monolaurado
(Tween 20)
Sigma
Anexo 2.
Valores de F para la variable longitud del brote principal en barrido de reguladores de
crecimiento con BA-AIB fase de iniciacin.
Valor de
Ft
Factor
de
variacin
Das despus
del
establecimiento
F calc.
0.05 0.01
Tratamientos 60 2.17 2.22 3.05
96 2.19 1.97 2.59
110 2.49 2.07 2.76
144
Anexo 3.
Prueba de comparacin de medias Tukey (0.05) a los 96 y 110 das del
establecimiento en la variable longitud del brote principal (mm) del estudio barrido de
reguladores de crecimiento con BA-AIB fase de iniciacin.
Tratamiento
No. BA-AIB mg/I
Media (mm)
a 96 das Significancia
Media (mm) a
110 das Significancia
10 2-0.2 22.5 A 22.5 A
13 3-0.0 21.6 A 25.4 A
15 3-0.5 21.5 A 24.3 A
9 2-0.0 16.8 A 22.0 A
5 1-0.0 16.5 A 19.7 A
6 1-0.2 16.0 A 17.8 A
14 3-0.2 15.3 A
8 1-1.0 15.0 A 17.3 A
16 3-1.0 14.7 A 20.7 A
11 2-0.5 13.6 A 16.2 A
12 2-1.0 13.1 A 15.0 A
Anexo 4.
Anlisis de varianza en la variable nmero de brotes por frasco, a 25 das del
establecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MS
completas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 260.257 23.659 3.093 2.44 1.89
Error 108 826.108 7.649
Total 119 1086.366
C.V. 43.3%
145
Anexo 5.
Anlisis de varianza en la variable nmero de brotes por frasco, a 85 das del
establecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MS
completas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 399.311 36.301 2.9406 2.44 1.89
Error 100 1234.466 12.345
Total 111 1633.777
C.V. 49%
Anexo 6.
Anlisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 25 das del
establecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MS
completas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 606.22 55.11 2.314 2.44 1.89
Error 107 2547.84 23.81
Total 118 3154.06
C.V. 41.66%
Anexo 7.
Anlisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 85 das del
establecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MS
completas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 2173.88 197.63 2.0722 2.44 1.89
Error 100 9536.92 95.37
Total 111 11710.80
C.V. 43.19%
146
Anexo 8.
Respuesta al enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro de aguacate criollo a los
71 das del establecimiento, en prueba de dosis de AIB, ANA e interaccin AIB -
ANA en dos tipos de sales minerales.
Tratamiento
Dosis de
reguladores (mg/I)
Tipo de sales
minerales
Nmero de
races
Enraizamiento
(%)
Longitud
de raz
(mm)
AIB 0.5 MS 100% 11 en 2 brotes 16.67 10.3
AIB 0.8 0 0 0
AIB 1.1 4 en 2 brotes 16.67 9.0
AIB 1.4 4 en 1 brote 8.33 17.3
AIB 0.5 + ANA 0.3 0 0 0
ANA 0.3 5 en 2 brotes 16.67 24.9
ANA 0.6 0 0 0
ANA 0.9 0 0 0
ANA 1.2 0 0 0
0 2 en 1 brote 8.33 16
AIB 0.5 Modificadas 7 en 2 brotes 16.67 25.3
AIB 0.8 7 en 3 brotes 25 20.6
AIB 1.1 8 en 2 brotes 16.67 22.1
AIB 1.4 2 en 1 brote 8.33 25
AIB 0.5 + ANA 0.3 5 en 1 brote 8.33 39.4
ANA 0.3 0 0 0
ANA 0.6 0 0 0
ANA 0.9 0 0 0
ANA 1.2 0 0 0
0 1 en 1 brote 11.11 20
147
Anexo 9.
Anlisis de varianza en la variable longitud de raz por brote, a 54 das del
establecimiento, en prueba de dosis de AIB e interaccin AIB -AG
3
.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 9 1674.43 186.05 4.19 3.0 2.13
Error 40 1775.81 44.40
Total 49 3450.23
C.V.= 57.58%
Anexo 10.
Anlisis de varianza en la variable longitud de raz por brote, a 88 das del
establecimiento, en prueba de dosis de AIB e interaccin AIB -AG
3
.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 9 2290.20 254.47 3.85 2.76 2.07
Error 54 3568.99 66.09
Total 63 5859.20
C.V.= 44.92%
Anexo 11.
Valores de F y significancia estadstica para cada una de las variables evaluadas en
observaciones citolgicas de hojas de aguacate criollo.
F Variable
Calc. Tab.(0.05)
Coeficiente de
variacin (%)
Indice estomtico 2.235 3.35 25.54
Frecuencia de estomas 5.201 3.35 24.13
Frecuencia de clulas no
estomticas
2.479 3.35 24.41
148
Anexo 12.
Frecuencia de clulas no estomticas e ndice estomtico de los diferentes
tratamientos del estudio sobre observaciones citolgicas de hojas de aguacate
criollo.
Tratamiento Frecuencia de clulas no Indice estomtico (JE)
estomticas (FCNE)
Hojas de rbol adulto 13.96 7.39
Hojas de plantas invernad. 16.38 7.02
Hojas de plntulas in vitro 17.82 5.83
Anexo 13.
Significancia estadstica en el anlisis de varianza de los datos de oxidacin
transformados a arco seno x, en prueba sobre antioxidantes e intensidad de luz.
Factor de Grados Suma de Cuadrado Valor de F Valor de
variacin de cuadrados medio calculada P>F
libertad
Cistena (A) 1 15.2480 15.2480 0.1315 0.726
Ac. ascrbico
(B)
1 20929.4121 20929.4121 180.5106 0.000
Intens. de luz
(C)
1 0.0097 0.0097 0.0001 0.989
A x B 1 413.3066 413.3066 3.5647 0.099
A x C 1 228.0097 228.0097 1.9665 0.202
B x C 1 0.0410 0.0410 0.0004 0.983
A x B x C 1 218.5996 218.5996 1.8854 0.211
Error 7 811.6191 115.9455
Total 15 22838.2558
C.V. = 26.73%
149
Anexo 14.
Significancia estadstica DMS (0.01) en la variable tipo de explante (masas
proembriognicas y globulares) para la multiplicacin de masas proembriognicas a
los 14 das.
Tratamientos Media
Masas proembriognicas 2.95 A
Globulares 2.10 B
Anexo 15.
Anlisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,
a los 22 das del establecimiento, en la primer prueba de ABA.
F tabulada Fuente de
variacin
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 2 0.201334 0.100667 0.2449 3.88 6.93
Error 12 4.9320 0.411000
Total 14 5.1333
Anexo 16.
Anlisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,
a los 44 das del establecimiento, en la segunda prueba de ABA y dosis de sacarosa.
F tabulada Fuente de
variacin
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 6 13.896187 2.316031 1.5996 2.49 3.63
Error 25 36.195999 1.447840
Total 31 50.092186
150
Anexo 17.
Anlisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,
a los 36 das del establecimiento, en prueba de dosis de agar.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variacin libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 3 2.981367 0.993789 34.8651 2.96 4.60
Error 27 0.769603 0.028504
Total 30 3.750970
C.V. = 31.53%
Anexo 18.
Anlisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,
a los 30 das del establecimiento, en prueba de dosis de sacarosa.
F tabulada Fuente de
variacin
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 3 0.375428 0.125143 0.8928 2.95 4.57
Error 28 3.924572 0.140163
Total 31 4.30000
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN
NICOLS DE HIDALGO NICOLS DE HIDALGO
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUMICO-
BIOLGICAS
Lab. De Biotecnologa de Plantas Edificio B-3, Ciudad Universitaria
salgaciglia@hotmail com 58030, Morelia, Mico. MEXICO.
Tel-Fax: (443) 3 265788
DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO
COORDINADOR ACADMICO
PICAF-UNIV. DE COLIMA
PRESENTE.
La presente es con el fin de comunicarle que he revisado el documento final del trabajo de
tesis "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de organognesis y
embrognesis somtica de aguacate (Persea americana Mill.)" del Ing. Ignacio Vidales
Fernndez, estudiante inscrito al programa de doctorado en ciencias del posgrado PICAF
que usted coordina, el cual ha sido corregido despus de la revisin de un servidor y de los
dems asesores externos (Dr. Miguel A. Gmez Lim y Dr. Joel E. Lpez Meza) que integran
el comit tutorial.
Por lo anterior, como tutor de esta tesis, autorizo para que el Ing. Vidales Fernndez enve el
documento para su ltima revisin por parte de Ud. y el Dr. Roberto Lezama Gutirrez, y de
esta manera contine con los trmites correspondiente al examen de grado.
Sin ms por el momento y agradeciendo de antemano su atencin, reciba un cordial saludo.
At e n t a me n t e
C.c.p. Ing. Ignacio Vidales Femndez.
135
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL LPN
UNIDAD IRAPUATO
KM. 9.6 LIBRAMIENTO NORTE CARRETERA IRAPUATO - LEON
APDO. POSTAL 629, C.P 36500, IRAPUATO, GTO. MEXICO
Tels. : Conmutador (4) 6 23 96 00, Direccin 6 24 59 09, Fax Administracin 6 24 58 46
Compras 6 24 56 57, Biotecnologa 6 24 59 96, Ingeniera Gentica 6 24 58 49, Coordinacin Recursos Materiales 6 23 96 91
Dr. Alfonso Pescador Rubio
Coordinador del PICAF
PRESENTE 9 de Octubre de 2002
De mi mayor consideracin:
Por este conducto me permito informar que he revisado el trabajo de tesis titulado del Ing.
IGNACIO VIDALES FERNANDEZ titulado "Efecto de los reguladores del crecimiento en
los procesos de organognesis y embriognesis somtica de aguacate (Persea americana,
Mill.)" y lo he encontrado enteramente satisfactorio. Por ello, por este medio doy mi visto
bueno para que puedan continuar los trmites de titulacin.
Atentamente
136
Morelia, Mich. 9 de octubre de 2002.
DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO
COORDINADOR DEL PICAF EN
LA UNIVERSIDAD DE COLIMA
PRESENTE.
Por este conducto hago de su conocimiento que la tesis intitulada EFECTO
DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOS PROCESOS DE
ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA DE AGUACATE (Persea
americana MILL.) presentada por el C. IGNACIO VIDALES FERNANDEZ ha sido
revisada y aprobada por un servidor. Asimismo, aprovecho la oportunidad para
comentarle que no existe inconveniente de mi parte para que el C. Vidales siga
con los tramites correspondientes para la presentacin de su examen de Grado.
Sin otro particular por el momento, me despido de Usted envindole un
cordial saludo.

Km 9.5, Carretera Morelia-Zinapcuaro, La Palma, Tarmbaro, Mich.
Tel. y Fax: (443) 295-80-29
137
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F. C. R. A.
PR E SENTE.
En atencin a que. el M. C. IGNACIO VIDALES FERNNDEZ, alumno egresado
del Doctorado en Ciencias, rea de ciencias agrcolas y forestales, ha realizado todas, las correcciones al
manuscrito de tesis que present para su revisin, me dirijo respetuosamente a usted para informarle
que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de. organognesis
y embriognesis somtica de aguacate (Pernea americana Mi1I.)", rene todas las caractersticas
necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF,
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT.
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
C.C.P. ARCHIVO.
A PR/Anglica*
138
UNIVERSIDAD DF COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTICACION Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
Oficio No. 072/02
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F- C. B. A.
PRESENTE.
En atencin a que el M. C. IGNACIO VIDALES FERNNDEZ, alumno egresado
del Doctorado en Ciencias, rea de ciencias agrcolas y forestales, ha realizado todas las correcciones al
manuscrito de tesis que present para su revisin, me dirijo respetuosamente a usted para informarle
que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crec lento en tos procesos de organogness
y embriognesis somtica de aguacate (Persia americana Mill.)", rene todas las caractersticas
necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TCNICO DEL PICAF,
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.
C.C.P. ARCHIVO.
APR/Anglica*