Tcnicas de diagnstico para deteccin de bacterias que afectan papa destinada a semilla

Rosaima Garca Betty Paz Franci Urbina Misrael Monsrha

Estandarizacin de Protocolos de los Laboratorios de Servicio Fitopatolgicos: Caso produccin de semilla de Papa . Mrida, Noviembre, 2013

Por qu se dificulta la deteccin de Las bacterias?

Son microorgansismos unicelulares de tamao muy pequeo (0,5 y 5 m). Son procariotas, no tienen el ncleo definido ni presentan en general, orgnulos membranosos internos. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Se estima que se pueden encontrar en torno a 40 millones de clulas bacterianas en un gramo de tierra y un milln de clulas bacterianas en un mililitro de agua dulce. En total, se calcula que hay aproximadamente 5 1030 bacterias en el mundo. Ms de 2000 especies identificadas, 10% aproximadamente son fitopatgenos.
A-Monotrico; B-Lofotrico; C-Anfitrico; D-Peritrico.

Principales familias y gneros de bacterias sealadas como causantes de Enfermedades en Papa

FAMILIA PSEUDOMONACEAE GENERO
Pseudomonas/Ralstonia, Bukholderia.
TINCIN DE GRAM

(-) (-)
(+)

ENTEROBACTERIACEAE Erwinia/Pectobacterium/
Dickeya

MICROBACTERIACEAE

Corynebacterium/ Clavibacter,

STREPTOMYCETACEAE

Streptomyces

(+)

Tcnicas de diagnsticos de Bacterias

Expresin de Sntomas: Preparaciones Microscpicas y Pruebas de flujos. Diagnstico por Medios diferenciales

Histopatologa- Uso de Microscopa Tcnicas Bioenzimticas PCR (Biologa Molecular): An no se ha estandarizado, est en proceso.

Mtodo: Observacin Visual, Diagnstico por Sntomas

Daos Vasculares: Dao en Ralstonia, Clavibacter, mdula, taponamiento del Pectobacterium . haz vascular, pudricin de tubrculos. Dentro del Tallo verdadero o tubrculos: Pudricin del tallo o pata negra, marchitez, colapso, pudricin blanda Pectobacterium

Ahuecamiento del Tallo o tubrculos Daos superficiales en superficies de tubrculos, sarna, acorchamiento.

Diskeya
Streptomyces

Prueba Rpida del flujo bacteriano desde una rama de papa

Marchitez bacteriana de la planta y pudricin parda de tubrculos de papa por Ralstonia solanacearum

Prueba Rpida del flujo bacteriano desde una rama de papa

Marchitez por efecto de pata negra de la planta y pudricin blanda de tubrculos de papa por Pectobacterium carotovora

Sarna Comn en papa (Streptomyces scabies). Sntomas muy severos

Actualmente, se slo se usa este mtodo como rutina y se combina con preparaciones microscocpicas

Dickeya ( Erwinia chrysanthemi ) [Samson et al., 2005]

Dickeya chrysanthemi (Burkholder et al. 1953) Samson et al. 2005 Tallo y Pudricin hueca de la papa

Tcnica de Histopatologa

Ultraestructura de un tallo de Papa, afectado por R. solanacearum. Obsrvese el haz vascular taponado por la pus bacteriana. Este Mtodo se combina con el uso de medios diferenciales como rutina de servicio.

Mtodo: Uso de Medios Diferenciales: Clave Orientadora para Clasificacin Genrica

Algunas Caractersticas Metabolismo Respiratorio Oxidativo Caractersticas de las colonias Gnero TINCIN DE GRAM Colonias blancas de bordes irregulares, muy fludas en el medio Kelman (-)
Psudomonas (Ralstonia) (-)

No fluorescentes en KB. Colonias color crema centro rosado semejante a helado en Kelman +TZC

Metabolismo Respiratorio Fermentativo

Color amarillo en el Medio D3 y Kelman (-)

Dickeya (-)

Kelman Negativo y AN: Color crema a gris, algo traslucida bordes lisos a irregulares semejantes a huevo fritos y una estrellita en Kelman (-). Desarrollo de hoyos en el medio CVP
Colonias Amarilla en el medio YPDA o YPGA. Colonias blancas en AN o Agar -Tirosina

Erwinia/Pectobacterium

Bacterias Corineformes

(+) Corynebacterium/ Clavibacter, Streptomyces scabies (+)

Caractersticas de las colonias: Pectobacterium carotovora

Colonias pequeas, Color blanco a grisceas, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes de lisos a levemente ondulada, lobulados, centro levantadas pronunciadas de color amarillo claro, convexas al inicio espumosas que despus de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-). Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas. AN= Colonias pequeas,planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares BK: Crecimiento abundante, sin pigmentacin, se tornan blanco grisceos despus de varios das.

Actualmente slo se usa el medio Kelma (-) y Keman (+) como rutina de servicio.

Gram (-), Prueba de KOH al 3% Clula en forma de bastn, flagelos periticas Oxidasa negativa, anaerbica facultativa Catalasa positiva Pudricin de rodajas de papa (+). Capacidad Pectoltica: produce hoyos profundos en CVP

Dickeya ( Erwinia chrysanthemi )

Colonias pequeas, Color crema a amarillo claro, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes levemente onduladas,, centro levantados de color amarillo claro, convexas despus de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-). Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas. AN= Colonias pequeas, planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares BK: Crecimiento abundante, sin pigmentacin, se tornan blanco grisceos despus de varios das. De Kado D3

Crecen a 35 C en YDCA
An no se ofrece como servicio, slo se determinan como Erwinias Kelman (-)

Caractersticas de las colonias de R. solanacearum (E.F. Smith).

TZC: Colonias medianas a grandes, color blanco cremoso con una puntuacin rosado en el centro, de forma irregular, semejantes a un helado, visibles a las 48 horas y desarrollo completo a las 72 con choque trmicos de 30 a 22C. Son muy fluidas se deslizan por todo el medio. YDC y Kelman (-): Colonias blancas cremosas, superficie lisas, convexas de bordes irregulares . BK: No producen pigmentos fluorescentes.
Para Servicio se usa como rutina medio Kelman (+) y Kelman (-)

Clulas en forma de varillas rectas o ligeramente curvada, Gram negativa y mviles mediante uno o varios flagelos polares, arobios, oxidasa positiva, catalasa positiva, licuan lentamente la gelatina o no lo hacen (Palleron,1984).

Caractersticas de las colonias de R. solanacearum, mediante el uso del medio especfico TZC (Hayward, 1967, Kelman, 1953 -1954)

Streptomyces scabies
Es un microorganismo filamentoso, hetertrofo. Produce un micelio fragmentado que puede Sub-dividirse asexualmente originando esporas, presenta gran similitud con hongos pero tiene un micelio de menor dimetro (Hooker, 1981). Tiene una estructura celular Procariota, es aerbico en el medio de cultivo produce filamentos y melanina que es un pigmento caf oscuro (Contreras, 2001). Es Gram (+).
Actualmente, no se usa como rutina

Proceso estandarizado para deteccin de dos de las bacterias que afectan la papa

Muestra de planta de papa

Muestra de semilla de papa

Desinfeccin con alcohol isoproplico 80% y flameados. Se Cortan trozos delgados del haz vascular del tubrculo o tallitos

Se coloca en bolsas plsticas gruesas con 20 mL de agua y se macera

Siembra del Macerado en los medios K(-),K (+) o AN

Incubar 48 a 72 horas 28+2

Se observan y seleccionan las colonias en el Estereoscopio

Deteccin de infeccin latente de R. solanacearum a travs de la Tcnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)

Muestra de planta de papa

Muestra de semilla de papa

Desinfeccin: 1% Hipoclorito de Na 5min, se secan se coloca alcohol isoproplico 85% y flamean. Se Cortan trozos delgados del anillo vascular del tubrculo o tallitos 2X1 mm (Inferiro a 0,50g/tubrculo)

Se coloca en bolsas plsticas gruesas con 20 mL de agua y se macera

Preparacin de muestras de plantas y semilla de papa

0,5 mL SMSA 1X +0,5 mL del extracto en eppendorf de 1,5L. Incubar en caldo de enriquecimiento 48 horas 28+2 se agitan 2 veces/da

Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el servicio

Deteccin de infeccin latente de R. solanacearum a travs de la Tcnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)

La Reaccin enzimtica se observa a travs de una coloracin purpura en las muestras positivas con diferentes intensidades de claro a oscuro (Morado).

Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el servicio

Deteccin de bacterias de Muestras de suelo

Muestra de suelo

Se Tamiza

Tomar 5 g

50 mL de agua

Agitar 2 horas a 100 RPM

La tcnica de extraccin de la muestra, dilucin seriada y siembra en plato agar (Medios Generales Y/o Selectivos)

Deteccin de R. solanacerum en suelos por ELISA-DAS

Reaccin Final de la Prueba de ELISA-DAS

Proceso de extraccin de suelo y enriquecimiento para la deteccin de R. solanacearum en suelo mediante ELISA-DAS

Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el servicio

Pasos de la Prueba de ELISA-DAS