EDICIN N 67 - 2005

Introduccin a tcnicas de biologa molecular y de ingeniera gentica

Las tcnicas de la biotecnologa moderna Uno de los objetivos principales de la biotecnolog a !oderna es lograr "#e #na c$l#la realice #na tarea espec %ica & 'til de !anera predecible & controlable( )or eje!plo* "#e las c$l#las de la planta de !a + prod#+can #na n#eva prote na "#e sea capa+ de eli!inar a insectos "#e se ali!entan de ella* es decir #na prote na insecticida( Esto ser a 'til &a "#e per!itir a red#cir el #so de insecticidas "# !icos & a#!entar a la prod#ctividad para el agric#ltor( En la act#alidad* la biotecnolog a !oderna per!ite lograr este tipo de !a +( De ,ec,o* est- a#tori+ado en la .rgentina & se lo deno!ina !a + /t 0ver C#aderno N12 & 113( Es #n !a + transg$nico "#e o%rece #na sol#ci4n e%ectiva contra el barrenador del tallo* #n insecto "#e constit#&e la principal plaga de los c#ltivos de !a + en la .rgentina( 5C4!o se obtiene #n organis!o transg$nico6 5C#-les son las t$cnicas "#e se e!plean para lograrlo6 7os cient %icos "#e trabajan en el desarrollo de prod#ctos biotecnol4gicos e!plean t$cnicas espec %icas( 7a !a&or a de estas t$cnicas per!iten est#diar bio!ol$c#las* en partic#lar .DN* .8N & prote nas* & se las deno!ina t$cnicas de biolog a !olec#lar( )or otra parte* se deno!ina ingenier a gen$tica a las t$cnicas "#e se #san espec %ica!ente para trans%erir genes de #n organis!o a otro & constr#ir %rag!entos de .DN reco!binante 0co!bina .DN de di%erentes organis!os3( .s * es posible no s4lo obtener las prote nas reco!binantes de inter$s sino ta!bi$n !ejorar c#ltivos & ani!ales( Principios de las tcnicas de trabajo con cidos nucleicos 7as t$cnicas de biolog a !olec#lar & de ingenier a gen$tica se basan en #na caracter stica partic#lar "#e tienen los -cidos n#cleicos9 las bases . 0adenina3* : 0ti!ina3* C 0citosina3 & ; 0g#anina3 "#e %or!an parte de las !ol$c#las de .DN & de .8N tienen la capacidad de ,ibridar con bases co!ple!entarias( Es decir* las bases al en%rentarse p#eden %or!ar enlaces entre s sig#iendo sie!pre la sig#iente regla9 . se #ne con : & C se #ne con ;(

Estr#ct#ra de #na !ol$c#la de .8N de trans%erencia 0.8Nt3 con regiones de bases co!ple!entarias 0en c rc#los rojos3( 7a !ol$c#la de .8N* si bien !a&or!ente es #na 'nica ,ebra* tiene la posibilidad de aparearse con otra* e incl#so de plegarse & %or!ar regiones co!ple!entarias dentro de la !is!a !ol$c#la(
"El Cuaderno de Por Qu Biotecnologa" es una erramienta didctica creada y desarrollada por el e!uipo pedaggico del Programa Educati"o Por Qu Biotecnologa# $u reproduccin est autori%ada bajo la condicin de !ue se aclare la autora y propiedad de este recurso pedaggico por parte del Programa Educati"o Por Qu Biotecnologa#

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.s * si #n investigador b#sca est#diar #n gen de inter$s* basta con conocer al !enos #na parte de s# sec#encia* para poder constr#ir #na porci4n co!ple!entaria "#e per!ita <pescar= de alg'n !odo a ese gen de inter$s( Esa porci4n pe"#e>a de -cido n#cleico se deno!ina <sonda= & al sinteti+arla en el laboratorio se le s#ele poner alg#na !arca "#e per!ita vis#ali+arla l#ego %-cil!ente 0por eje!plo* %l#orescencia3* co!o se representa en la sig#iente i!agen(

?onda de .DN !arcada "#e ,ibrida con #na sec#encia de .DN co!ple!entaria( @#ente9 <7as sondas de -cidos n#cleicos= por 8odol%o Aettstein en Ciencia Bo&* Col#!en 1 -N 20- ?etie!bre Doct#bre EFF2

Gtro principio s#b&acente en las t$cnicas de biolog a !olec#lar es "#e el .DN* debido a s# estr#ct#ra "# !ica & !olec#lar* es !#c,o !-s estable "#e el .8N* por lo c#al la !a&or a de las t$cnicas !-s %-cil!ente !anip#lables son con .DN( )or 'lti!o* otro principio de las t$cnicas es "#e se #sa lo "#e nat#ra dio( Es decir "#e las en+i!as "#e se #san para cortar & pegar %rag!entos de .DN* o para sinteti+ar %rag!entos de .DN* provienen de organis!os( Estas en+i!as se !ejoran para "#e trabajen e%iciente!ente en las condiciones de laboratorio( Etapas en la obtencin de un organismo transgnico 7a obtenci4n de #n transg$nico i!plica la participaci4n de #n organis!o "#e dona el gen de inter$s & #n organis!o receptor del gen "#e eHpresar- la n#eva caracter stica deseada( )ara el caso partic#lar de la prod#cci4n de #na variedad de !a + "#e resista el ata"#e de insectos* el organis!o dador es la bacteria del s#elo deno!inada /acill#s t,#ringiensis 0/t3 de la c#al se eHtrae el gen "#e deter!ina la s ntesis de la prote na insecticida* & el organis!o receptor del gen es la planta de !a +( 7as etapas del trabajo son b-sica!ente cinco9 E( Corroborar "#e eHiste #n gen "#e codi%ica para la caracter stica de inter$s( 2( Clonar el gen de inter$s( 2( Iodi%icar el gen para "#e %#ncione !ejor en el organis!o receptor( 1( :rans%erir el gen al organis!o receptor( 5( Caracteri+ar el organis!o receptor trans%or!ado( b. contin#aci4n se detalla cada #na de estas etapas & las t$cnicas "#e invol#cran( &' Corroborar !ue e(iste un gen !ue codi)ica para la caracterstica de inters C#ando se enc#entra #na caracter stica en #n organis!o "#e res#lta interesante para trans%erir a otro organis!o debe veri%icarse "#e es prod#cto de #n gen( )ara veri%icar "#e la caracter stica de inter$s est- codi%icada en el .DN & "#e no es res#ltado de la interacci4n con el !edioa!biente* se aplican t$cnicas de gen$tica 0ver C#adernos N 10 & 1E3( ?i la caracter stica se atrib#&e a #na prote na* "#e
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es prod#cto directo de #n gen* ser- !-s sencillo trans%erir esa caracter stica a #n organis!o "#e no la tiene( *' Clonado del gen Una ve+ "#e se deter!in4 "#e el organis!o donante posee #n gen "#e codi%ica para la caracter stica de inter$s* los bi4logos !olec#lares se lan+an a la tarea de conseg#ir ese gen* es decir9 <clonar= el gen( Clonar #n gen signi%ica tenerlo p#ro en el t#bo de ensa&os* o !ejor a'n* dentro de #n vector 0#na !ol$c#la !a&or de .DN "#e per!ite g#ardar %rag!entos de .DN en %or!a estable & pr-ctica por !-s tie!po3( 7a tarea de clonar invol#cra varias t$cnicas "#e se describen a contin#aci4n9 i3 EHtracci4n de .DN( 7as eHtracciones de .DN de todos los organis!os g#ardan cierta si!ilit#d & consisten en ro!per las c$l#las para liberar s# contenido & separar el .DN liberado del resto de los co!ponentes cel#lares( ii3 /'s"#eda de #n gen entre la !e+cla de genes del .DN( ?i se conoce #na pe"#e>a porci4n de la sec#encia del gen "#e se est- b#scando* es posible constr#ir #na sonda "#e per!ita <pescar= el %rag!ento de .DN "#e contiene esa !is!a sec#encia( Una ve+ aislado ese %rag!ento se lo est#dia !-s detallada!ente( 7a t$cnica de )C8 0siglas en ingl$s de 8eacci4n en Cadena de la )oli!erasa3 per!ite a!pli%icar la cantidad de .DN & esto %acilita el clonado del gen de inter$s( 7a t$cnica de )C8 se representa en la sig#iente il#straci4n9

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E(plicacin de la imagen9 la t$cnica de )C8 per!ite obtener* a partir de #na sola !ol$c#la de .DN* !illones de copias de #n %rag!ento de .DN partic#lar( 7a base de esta t$cnica consiste en "#e la en+i!a poli!erasa de .DN c#!pla s# %#nci4n9 sinteti+ar .DN a partir de #n pe"#e>o %rag!ento lla!ado cebador* & de los n#cle4tidos 0.* C* ; & :3( 7as n#evas !ol$c#las de .DN sinteti+adas en cada ciclo sirven de !olde para ciclos sig#ientes( )or lo tanto* la )C8 es #na reacci4n de a!pli%icaci4n de %rag!entos de .DN en %or!a eHponencial & al %inal del ciclo 2510 en el t#bo de ensa&os eHisten !illones de copias del %rag!ento de inter$s(

Una ve+ ter!inada la )C8* se reali+a #na t$cnica conocida co!o <electro%oresis en gel de agarosa= para vis#ali+ar los !illones de %rag!entos de .DN de inter$s* co!o !#estra la sig#iente i!agen9

Electro)oresis en gel de agarosa# Esta t$cnica consiste en ar!ar #n gel de agarosa* con pe"#e>os ,#ecos en #n eHtre!o donde se deposita 0<sie!bra=3 el contenido del t#bo de )C8( El gel es so!etido a corriente el$ctrica de !odo "#e el .DN* "#e es #na !ol$c#la cargada negativa!ente* se despla+a por el gel ,acia el polo positivo( C#anto !-s pe"#e>o es el %rag!ento de .DN !-s r-pido se despla+a & llega ,asta el eHtre!o op#esto( .l preparar el gel se agrega la s#stancia bro!#ro de etidio "#e se intercala entre las bases del .DN & per!ite vis#ali+arlo al ser il#!inado con l#+ UC( 7as bandas l#!inosas corresponden a los %rag!entos de .DN a!pli%icados(

iii3 ?ec#enciaci4n9 Una ve+ "#e se vis#ali+4 el res#ltado del )C8 en el gel de agarosa* la <bandita= del gel "#e contiene el .DN de inter$s se recorta & se p#ri%ica el .DN( 7#ego se reali+a la sec#enciaci4n "#e consiste en conocer la cantidad & el orden en "#e se #bican los n#cle4tidos en el %rag!ento de .DN anali+ado( .ct#al!ente se reali+a en #n sec#enciador a#to!-tico #tili+ando n#cle4tidos !arcados %l#orescente!ente* "#e son le dos por #n l-ser acoplado a #na co!p#tadora( iv3 Constr#cci4n del vector reco!binante9 Esta etapa consiste en <recortar & pegar= .DN para insertar el gen de inter$s dentro de #n vector 0son en general !ol$c#las de .DN circ#lares3( )ara recortar el .DN se #tili+an en+i!as de restricci4n 0ver El C#aderno 213 & para pegar %rag!entos de .DN se #tili+an en+i!as ligasas( Co!o !#estra la i!agen el vector abierto & el %rag!ento de inter$s
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se agregan al t#bo de ensa&os en presencia de la en+i!a ligasa( .l %rag!ento de .DN dentro del vector se deno!ina <inserto= & el n#evo vector se conoce co!o <vector reco!binante=(

8epresentaci4n de los pasos de restricci4n & ligaci4n para clonar #n %rag!ento de .DN en #n vector

+' ,odi)icar el gen 7a ventaja de tener el gen clonado en #n vector* es "#e se p#ede trans%erir a #na bacteria "#e* al !#ltiplicarse en el laboratorio* ta!bi$n !#ltiplica al vector "#e porta( De esta %or!a se logra tener !illones de copias del vector reco!binante para poder !odi%icar el inserto "#e lleva dentro( Iodi%icar el inserto signi%ica agregarle pe"#e>as sec#encias de .DN* !ediante el #so de ligasas* necesarias para "#e el gen %#ncione correcta!ente en el organis!o receptor( )or eje!plo9 si se clona #n gen /t de #na bacteria para l#ego ponerlo en !a +* se debe agregar #n pro!otor "#e %#ncione bien en plantas* es decir* "#e per!ita "#e las c$l#las vegetales eHpresen la prote na /t( El pro!otor es #na regi4n %#nda!ental del gen &a "#e deter!ina c#-ndo & d4nde se eHpresar- el gen( -' .rans)erir el gen al organismo receptor El gen de inter$s se p#ede introd#cir en c$l#las vegetales o ani!ales & dar l#gar a la %or!aci4n de #n organis!o gen$tica!ente !odi%icado 0G;I3 o transg$nico( 7a introd#cci4n de n#evos genes por ingenier a gen$tica en plantas origina los lla!ados c#ltivos transg$nicos o gen$tica!ente !odi%icados 0G;I3( En la prod#cci4n de estos c#ltivos ,a& #na pri!era etapa en la "#e se introd#ce el gen de inter$s en las c$l#las vegetales( Este proceso ta!bi$n se deno!ina trans%or!aci4n( En !#c,as especies vegetales 0especial!ente en las dicotiled4neas3 es posible introd#cir genes a trav$s de #na bacteria del s#elo* lla!ada .grobacteri#! t#!e%aciens 0ver C#aderno N EJ3( )ara las !onocotiled4neas se ,a desarrollado #n !$todo alternativo* deno!inado <bo!bardeo con !icropart c#las= 0ver C#aderno N 2J3( 7a seg#nda etapa consiste en regenerar #na planta co!pleta a partir de la 'nica c$l#la trans%or!ada( El res#ltado es #na planta co!pleta "#e lleva el gen de inter$s en cada #na de s#s c$l#las( )or 'lti!o se reali+a el !ejora!iento por cr#+a!iento para trans%erir el gen incorporado a variedades de alto rendi!iento(
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EHisten varias t$cnicas para trans%erir genes a c$l#las de !a! %eros con el objetivo de "#e se integre al geno!a 0ver El C#aderno N 173( Una de ellas es la !icroin&ecci4n del .DN de inter$s directa!ente en #n 4v#lo %ec#ndado( 7os cigotos as obtenidos son l#ego i!plantados en el 'tero de #na !adre adoptiva* o receptora* "#e ,a sido preparada ,or!onal!ente para poder llevar adelante la gestaci4n( Gtra t$cnica consiste en trans%erir el gen de inter$s a las c$l#las de #n e!bri4n de !a! %ero "#e proli%eran in vitro( C#ando el e!bri4n sig#e s# desarrollo en el 'tero de #na !adre receptora* se %or!a #n ani!al con c$l#las transg$nicas( /' Caracteri%ar el organismo receptor trans)ormado# Una ve+ obtenido el G;I* se debe de!ostrar* entre otras cosas* si tiene #na 0o !-s3 copias del transg$n* & c4!o & en "#$ tejidos se eHpresa el gen( )ara lograrlo se eHtrae el .DN del organis!o & se lo anali+a( 7a t$cnica de )C8* &a eHplicada* per!ite a!pli%icar el transg$n* si es "#e est- en el geno!a del organis!o* & es #na t$cnica r-pida para veri%icar si el organis!o ,a sido trans%or!ado o no( )ara esti!ar c#-ntas copias del gen se insertaron en el geno!a del organis!o se #tili+a la t$cnica deno!inada ?o#t,ern /lotting "#e se representa en la sig#iente il#straci4n9

8epresentaci4n es"#e!-tica de la t$cnica de ?o#t,ern /lot( En este eje!plo se anali+a la presencia de #n cierto gen en .DN de tres individ#os( Esta t$cnica consiste en eHtraer .DN del organis!o en est#dio* %rag!entar el .DN en %or!a aleatoria con en+i!as de restricci4n* so!eter los %rag!entos de .DN a electro%oresis en gel de agarosa* & trans%erir los %rag!entos de .DN desde el gel a #na !e!brana 0de nitrocel#losa o n&lon3( 7#ego* para detectar c#-ntas copias del transg$n "#edaron integradas al geno!a del organis!o* se #tili+an sondas !arcadas 0radioactiva!ente* con %l#orescencia* # otros !$todos3( 7a !e!brana se ba>a en #na sol#ci4n "#e contiene la sonda & se <revela= 0co!o #na radiogra% a3 para ver si "#ed4 !arca en alg'n %rag!ento de .DN( En la il#straci4n las tres !#estras de .DN poseen al !enos #na copia del gen trans%erido(

)ara anali+ar en "#$ tejido* !o!ento & cantidad se eHpresa el gen se anali+a la presencia del .8N !ensajero & de la prote na codi%icados por el transg$n 0prote na reco!binante3* !ediante t$cnicas espec %icas deno!inadas Nort,ern blot 0para el .8N!3* & Aestern blot & E7I?. 0para las prote nas3(

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0plicaciones de las tcnicas de biotecnologa moderna Basta el !o!ento se ,an #tili+ado las t$cnicas de biolog a !olec#lar & de ingenier a gen$tica para prod#cir* entre otros prod#ctos9 Cac#nas* co!o la de la ,epatitis /K @-r!acos* co!o la ins#lina & la ,or!ona del creci!iento ,#!anoK En+i!as para disolver !anc,as* co!o las "#e se #san en los detergentes en polvoK En+i!as para la ind#stria ali!enticia* co!o las e!pleadas en la elaboraci4n del "#eso & en la obtenci4n de j#gos de %r#taK )lantas resistentes a en%er!edades(

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