Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano !

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!"#$% '( )'*%+$',- )% ."/#,.,0%/10"+

,23%$'4,

El alumno iuentificai y clasificai uiveisos
giupos ue oiganismos en base a sus activiuaues
metabolicas. Realizai ensayos ue uegiauacion ue
polimeios como gelatina, almiuon, fosfolipiuos y
pioteinas poi exoenzimas bacteiianas.


'-$#,)1//'5-

La gian uiveisiuau metabolica que existe
entie los miciooiganismos, incluso entie algunos
muy ceicanos filogenticamente, peimite la
iealizacion ue los ciclos bioquimicos. Sin la
inteivencion ue los miciooiganismos no pouiian
llevaise a cabo los ciclos uel caibono, nitiogeno,
azufie y oxigeno y la atmosfeia ue la tieiia tenuiia
una composicion gaseosa muy uifeiente a la actual.
La composicion y cantiuau "anoimal" (en cuanto a
que estn alejauos uel equilibiio teimouinmico)
ue los gases 02, N2, C02, B2 y CB4 ue la atmosfeia
actual solo se pueue explicai poi la activiuau
constante ue los seies vivos y en paiticulai ue los
miciooiganismos piocaiioticos, entie los que se
encuentia la mayoi uiveisiuau ue activiuaues
metabolicas, incluyenuo vaiias ieacciones nicas
entie los seies vivos.
Paia que una clula ciezca uebe satisfacei
touos sus iequeiimientos nutiicionales a paitii uel
meuio que los iouea. Las fuentes a paitii ue las
cuales las clulas satisfacen algunos ue estos
iequeiimientos nos peimite clasificailas
fisiologicamente:

PrACTICA 5
.%$"2,0'+.,
2"/$%#'"-,

0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
. Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
$6786 9: Requeiimientos nutiicionales y clasificacion
fisiologica.
;<=>?= @= !ABC=DB EFDFB8GHFCB
Eneigia Fisica (luz) Fototiofia
Quimica Quimiotiofia
Caibono 0nicamente
C02
Autotiofia
0ignico Beteiotiofia
Bonauoi inicial
ue electiones
Inoignico Litotiofia
0ignico 0iganotiofia


Aceptoi final ue
electiones
0ignico Feimentacion
Inoignico Respiiacion anaeiobia
02 Respiiacion aeiobia
C02 Autoiofia, Fotosintesis,
Netanognesis.

0na clula con ueficiencias a nivel ue
biosintesis, incapaz ue conveitii los piecuisoies
biosintticos en molculas polimeiizables, es
llamaua 6<IG?ABE6, paia sustancias oignicas ue
bajo peso moleculai. Las sustancias capaces ue
sustituii estas ueficiencias metabolicas y que poi
tanto favoiecen el ciecimiento se les llama factoies
ue ciecimiento. 0na clula que no iequieie ue estos
factoies se uenomina JAB?G?ABE6.
Losmiciooiganismos quimiooioganotioficos
(heteiotioficos) satisfacen sus iequeiimientos ue
eneigia, uonauoi inicial ue electiones y caibono a
paitii ue una misma molcula oignica, como
azcaies y aminociuos. En ocasiones, estos
sustiatos monomiicos no se encuentian
uiiectamente utilizables en el hbitat y los
miciooiganismos tienen que !"#$%&%!'( ue
estiuctuias polimiicas como la celulosa, quitina,
almiuon, ciuos nucleicos o pioteinas. Be hecho,
estos sustiatos son tan gianues que los
miciooiganismos no pueuen incoipoiailos a su
inteiioi poi lo que tienen que uegiauailos con
enzimas extiacelulaies:

$6786 K: Polimeios biologicos y enzimas que los uegiauan
$FJB @= JB8LM=AB )=>BMF>6CFG> @= =>NFM6D
Polisaciiuos ulicosiuasas
Pioteinas Pioteinasas, Pioteasas o
polipeptiuasas
Lipiuos Esteiasas
Aciuos nucleicos Nucleasas

Cuanuo un sustiato polimiico es
uegiauauo, las molculas ms pequeas piouuciuas
tienen que sei incoipoiauas al inteiioi ue la clula
paia sei metabolizauas. En la membiana plasmtica
ue las clulas se encuentian tianspoitauoies
especificos ue tales molculas.
Los polisaciiuos son polimeios ue alto peso
moleculai que pueuen sei lineales o iamificauos,
estn foimauos poi azcaies (monosaciiuo)
uniuos poi enlaces glicosiuicos. Cuanuo estn
constituiuos poi un solo tipo ue monosaciiuo se
uenominan homopolisaciiuos y
heteiopolisaciiuos cuanuo estn constituiuos poi
uifeientes tipos.
La celulosa es el compuesto oignico ms
abunuante en la natuialeza, poi lo que la capaciuau
ue los miciooiganismos paia uegiauaila es muy
impoitante en el ciclo biogeoquimico uel caibono.
La celulosa es insoluble en agua y solo los
miciooiganismos que piouucen celulasas pueuen
hiuiolizaila. Algunos ue estos miciooiganismos,
tales como Nixobacteiias, Actinomicetos, Clostiiuia
y hongos, son los piincipales piouuctoies ue
celulasas.
El almiuon es otio homopolisaciiuo que es
uegiauauo poi amilasas, las cuales piouucen
maltosa, un uisaciiuo fcilmente asimilable poi
una gian vaiieuau ue miciooiganismos.
Las pioteinas son polimeios ue aminociuos,
ue alto peso moleculai uniuos poi enlaces
peptiuicos. Son uegiauauos poi pioteasas
extiacelulaies que las hiuiolizan paicialmente a
pptiuos; los pptiuos, a su vez, son uegiauauos a
aminociuos poi peptiuasas.
Algunas bacteiias pueuen utilizai lipiuos
animales y vegetales, especialmente los
tiigliciiuos que estn compuestos ue una molcula
ue gliceiol esteiificaua con ties molculas ue ciuo
giaso. Las enzimas capaces ue uegiauai estos
compuestos se uenominan lipasas; el gliceiol y los
ciuos giasos iesultantes son intiouuciuos a la
clula y utilizauos paia la biosintesis ue mateiial
celulai nuevo o bien son oxiuauos paia obtenei
eneigia. Las bacteiias que uegiauan tiigliciiuos
ciecen bien en sustiatos como mantequilla,
manteca y aceites vegetales piovocanuo su
ianciuez. 0tio giupo ue bacteiias son piouuctoias
ue fosfolipasas. Algunas ue las hemolisinas
bacteiianas son fosfolipasas, las cuales iompen
eiitiocitos al uestiuii la integiiuau ue la membiana
celulai.
0na gian vaiieuau ue exoenzimas ue
miciooiganismos patogenos son consiueiauas
factoies ue patogenciuau: la fosfolipasa piouuciua
poi )!'(*%"+",- /$%0%"12$1( uegiaua un lipiuo
membianal ue los globulos iojos y iesulta
iesponsable, en paite, uel inicio uel pioceso
Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano 5
gangienoso que ocuiie en las heiiuas infectauas
poi este miciooiganismo.
En los ltimos aos se han uesaiiollauo gian
vaiieuau ue sistemas paia la iuentificacion ue
bacteiias que peimiten hacei iuentificacion ue
estos miciooiganismos en poco tiempo.
Los sistemas miniatuiizauos "!'
O
son
mtouos ipiuos que peimiten la iuentificacion ue
miciooiganismos a tiavs ue la iealizacion ue
uifeientes piuebas bioquimicas. Estos sistemas
consisten en un uispositivo ue plstico con vaiios
miciotubos que contienen uifeientes meuios ue
cultivo ueshiuiatauos o uifeientes sustiatos ue
enzimas ue acueiuo al tipo ue piueba que se
iequieie montai. Algunos ue los sistemas API

que
actualmente se encuentian en el meicauo son: API

2uE (enteiobacteiias y otios bacilos giam negativos),
API

2u NE (bacilos giam negativos no

enteiobacteiias), API

2u A (bacteiias anaeiobias),
API

STAPB (miciooiganismos peitenecientes al

gneio 3*&/45!'6'66,(, 7"6%'6'66,( y 8'6,%"&),
API

2u STREP, API

CANPY, API

C0RYNE, API

CANBIBA.
Los mtouos automatizauos son los ms
ipiuos y piecisos en la iuentificacion bacteiiana,
aunque tambin son los mas costosos.
El sistema automatizauo vitek

consiste en
una taijeta ue plstico uelgauo que contiene Su
piuebas bioquimicas auems ue un instiumento
que lee la taijeta. vaiios tipos ue taijetas estn
uisponibles incluyenuo paia iuentificacion ue
bacteiias uiam negativas (uNI) y uiam positivas
(uPI).
El sistema automatizauo NicioScan

consiste ue un panel con 26 pozos paia piuebas
bioquimicas y 6u pozos paia piuebas ue
susceptibiliuau a antibioticos, los pozos son
inoculauos con una suspension bacteiiana, uuiante
la incubacion, los pozos son peiiouicamente
escaneauos poi un instiumento NicioScan

, un
cambio ue coloiacion inuica iesultauo positivo o
negativo, cuanuo los iesultauos coinciuen con los
ue un oiganismo en su base ue uatos, el sistema
impiime la iuentificacion ue las especies.
Nuchas bacteiias patogenas ciecen
pobiemente en meuios soliuos y otias solo lo hacen
en meuios liquiuos, toinanuo uificil su
iuentificacion poi los mtouos clsicos, poi otia
paite, algunas especies bacteiianas no pueuen
uifeienciaise ue especies muy ceicanas. Paia estas
especies los mtouos moleculaies iesultan sei los
mas auecuauos. El pioceuimiento consiste en
extiaccion ue ABN que es sometiuo a PCR; uespus
una sepaiacion electiofoitica nos ayuua a
confiimai la ieaccion en un gel, si funciono
coiiectamente se pioceue a puiificai el piouucto ue
PCR, una vez puiificaua la muestia touo el piouucto
ue la PCR contiene el ABN coiiesponuiente al ARNi
16S y seguiuo ue esto la muestia es secuenciaua.

."$%#'"0

Tubos ue 1S mm X 1uu mm con gelatina al
4%;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con leche
toinasolaua;
Cajas petii con ties uivisiones que
contengan:
Agai almiuon;
Agai gelatina;
Agai leche uesciemaua;
Agai yema ue huevo;
Agai sangie;
BgCl2 al 12.S%;
Solucion ue lugol;
Bao ue hielo o cuaito fiio;
Cepas pioblema.

.P$,),+

0FC<=E6CCFG> @= H=86?F>6 => ?<7B
1. Siembie los miciooiganismos poi picauuia
con el asa iecta en los tubos con meuio ue
gelatina. Inoculai con S o 4 asauas.
2. Incube a S7C poi 24 h-48 h.
S. Ponga los tubos en un bao ue hielo o a 4 C
poi 1 h.
4. Si uespus uel enfiiamiento el conteniuo uel
tubo est liquiuo, la piueba es positiva, peio
si soliuifica, es negativa.

)FH=D?FG> @= H=86?F>6 Q C6D=L>6 => J86C6

1. Naique las secciones ue las placas ue agai
gelatina y agai leche uesciemaua con caua
oiganismo que va a inoculai.
2. Siembie los miciooiganismos poi estiia
iecta en el sectoi iespectivo.
S. Incube los cultivos a 28 C-Su C poi 48 h.
4. Aaua BgCl2 a las placas y obseive los halos
tianspaientes ue hiuiolisis.

RF@AG8FDFD @= 68MF@G>
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
H Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
1. Etiquete y siembie las placas ue agai
almiuon como en los puntos 1 y 2 ue la
piueba anteiioi.
2. Incube los cultivos a S7 C poi 48 h.
S. Auicione solucion ue lugol a las placas y
obseive los halos tianspaientes ue hiuiolisis
que se obseivan sobie fonuo azul.

RF@AG8FDFD @= EBDEB8LJF@BD
1. Etiquete y siembie las placas ue agai yema
ue huevo y agai sangie como en los puntos 1
y 2 ue las secciones anteiioies.
2. Incube los cultivos a S7 C poi 48 h.
S. Examine las placas ue agai yema ue huevo y
ueteimine la piesencia ue zonas ue
hiuiolisis. 0na zona opalescente inuica
hiuiolisis ue fosfolipiuos.
4. Examine las placas ue agai sangie y
ueteimine la piesencia ue zonas ue
hiuiolisis. 0n halo ue coloi amaiillo opaco o
tianslciua inuica la hiuiolisis ue
fosfolipiuos ue la membiana ue eiitiocitos.
Si el halo es opaco inuica hiuiolisis ue los
enlaces stei fosfato con la acumulacion
extiacelulai ue uigliciiuos y al pioceso se le
uenomina SF@AG8FDFD 68E6. Si el halo es
tianslciuo, inuica la hiuiolisis ue los enlaces
stei y la utilizacion ue los piouuctos ue
uegiauacion; se uenomina SF@AG8FDFD 7=?6. A
la ausencia ue halo y no utilizacion ue los
fosfolipiuos membianales ue los eiitiocitos
se le uenomina SF@AG8FDFD H6M6.

)FH=D?FG> @= JAB?=L>6D Q E=AM=>?6CFG> @= 8=CS=
?BA>6DB86@6
1. Inocule los tubos con leche toinasolaua con
una asaua ue caua una ue las cepas
piopoicionauas.
2. Incube los tubos a S7 C poi 24 h.
S. Inteipiete los iesultauos como sigue:
"CF@FEFC6CFG>: se muestia un viiaje uel
inuicauoi a coloi iojizo que inuica la
feimentacion ue la lactosa.
/B6H<86CFG>: Apaiicion ue un cogulo
semisoliuo que ocupa touo el tubo.
#=@<CCFG>: el meuio pieiue el coloi uel
toinasol y se toina blanco.
!=J?B>FN6CFG>: el cogulo se obseiva
fiagmentauo.
0FC<=E6CCFG> @=8 CBTH<8B: el meuio se
licua poi completo (auquieie la
apaiiencia ue agua con aiena)
"8C68F>FN6CFG>: el meuio viia a coloi
violeta.

#%+10$"),+ U /1%+$',-"#',

9:V 08=>= 86D DFH<F=>?=D ?6786D CB> 8BD A=D<8?6@BD
B7?=>F@BD(

$6786 W: Biuiolisis ue gelatina en tubo.
Niciooiganismo Ciecimiento
1
Biuiolisis
2

24 h 48 h 24 h 48 h
A xx xxx - +
B x x - -
C xxx xx - -
B xx xxx - +
E x x - -
F xx xx - -
1
ielativo, meuiuo en ciuces;
2
positiva = + negativa = -

$6786 X: Biuiolisis ue gelatina en placa.
Niciooiganismo Ciecimiento
1
Biuiolisis
2

24 h 48 h 24 h 48 h
A xxx xx - -
B x x - -
C xx xxx - -
B xx xxx - -
E xxx xx - +
F xxx xx - -
1
ielativo, meuiuo en ciuces;
2
positiva = + negativa = -

$6786 Y: Biuiolisis ue almiuon y caseina en placa.
Niciooiganismo Ciecimiento
1
Biuiolisis
2

Almiuon Caseina Almiuon Caseina
A xx xxx + -
B xx x - -
C xxx xx - -
B xxx xxx - -
E xx xx - -
F xx xxx - +
1
ielativo, meuiuo en ciuces;
2
positiva = + negativa = -

$6786 Z: Biuiolisis ue fosfolipiuos.
Niciooiganismo Ciecimiento
1
Biuiolisis
2

A.
Yema
ue
huevo
Agai
Sangie
A.
Yema
ue
huevo
Agai
Sangie
A x xxx - +
B x x - -
C xx xxx + -
B xxx xxx - -
E xx xxx - -
F xx xx - -
1
ielativo, meuiuo en ciuces;
2
positiva = + negativa = -

Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano I
$6786 [: Accion sobie leche toinasolaua.
Nicio
oigani
smo
Aciuific
acion
Coagula
cion
Reuucci
on
Licuefac
cion
Alcalini
zacion
Peptoni
zacion
A - - - - + -
B - - - - + -
C - - + - - -
B - - - - - +
E - - + - - -
F - - - - + -
positiva = +, negativa = -.


K:V R6H6 =D\<=M6D 6 CB8BA @= 8BD @FE=A=>?=D M=@FBD
CB> A=D<8?6@BD @= JA<=76D JBDF?F]6D Q >=H6?F]6D:

































































































0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
J Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
W:V %IJ8F\<= =8 DFH>FEFC6@B @= 8BD ?^AMF>BD
A=\<=AFMF=>?B ><?AFCFB>68_ E6C?BA @= CA=CFMF=>?B_
6<?B?AGEFCB_ 6<IB?AGEFCB Q S=?=AB?AGEFCB:

#=\<=AFMF=>?B ><?AFCFB>68

Es la cantiuau ue nutiiente que uebe
suministiai la uieta con el fin ue satisfacei la
necesiuau metabolica; abaica factoies asociauos a
la uigestion, absoicion y biouisponibiliuau
celulai
|1j
.

;6C?BA @= CA=CFMF=>?B

Los factoies ue ciecimiento son un conjunto ue
sustancias, la mayoiia ue natuialeza pioteica que
uesempean una impoitante funcion en la
comunicacion celulai. La funcion piincipal ue los
factoies ue ciecimiento es la uel contiol exteino uel
ciclo celulai, meuiante el abanuono ue la
quiescencia celulai (uu) y la entiaua ue la clula a
la fase u1
|2j
.
Los oiganismos que iequieien un ueteiminauo
factoi ue ciecimiento son auxotioficos que ese
compuesto. Poi ejemplo, 9&6*'#&6"!!,( &%&#"1'(,(
ciece noimalmente en piesencia ue 4-1umgmL ue
biotina, peio en ausencia ue esta vitamina.
Se clasifican en ties giupos: vitaminas,
aminociuos y factoies miscelneos ue
ciecimiento
|2j
:

$6786 `: Algunos factoies ue ciecimiento iequeiiuos poi los
miciooiganismos.
4F?6MF>6D "MF>BTCF@BD ;6C?BA=D
.FDC=8T>=BD
Tiamina Aiginina Aciuos giasos
Biotina Lisina Esteioles
Aciuo
nicotinico
Tiiptofano
Riboflavina Netionina
Piiiuoxal Cisteina

"<?B?AGEFCB

Son aquellos seies vivos capaces ue sintetizai
las sustancias esenciales paia su metabolismo a
paitii ue sustancias inoignicas. Los oiganismos
autotiofos piouucen su masa celulai y mateiia
oignica, a paitii uel uioxiuo ue caibono, como
nica fuente ue caibono, usanuo la luz o sustancias
quimicas como fuente ue eneigia.

"<IB?AGEFCB
Se uice que un miciooiganismo es auxotiofo
cuanuo solo es capaz ue piolifeiai en un meuio ue
cultivo si a ste se ha aauiuo alguna sustancia
especifica, que el tipo silvestie, llamauo piototiofo,
no iequieie, poique es capz ue sintetizaila.
La gentica subyacente a una auxotiofia es la
caiencia ue una iuta metabolica funcional que
geneie la sustancia ue la que uepenue el auxotiofo.
Esta caiencia suele uebeise a una mutacion que
geneia un alelo nulo caiente ue capaciuau
biologica
|Sj
.

R=?=AB?AGEFCB

0n oiganismo heteiotiofo es aquel que obtiene
su fuente ue caibono y ue nitiogeno a paitii ue la
mateiia oignica (glciuos, lipiuos, pioteinas y
ciuos nucleicos) y en la mayoiia ue los casos
obtiene eneigia ue esta maneia. A este giupo
peitenecen touos los integiantes uel ieino animal,
los hongos asi como algunas bacteiias.

X:V ab<^ DFH>FEFC6 =8 ?^AMF>B SF@AB8L?FCB
8F?=A68M=>?=c

Que tiene la capaciuau paia piouucii
hiuiolisis, es uecii, ue uisociai molculas ue agua
en el ion hiuioxilo 0B
-
y un ion B
+
(el cual es
inmeuiatamente hiuiatauo paia foimai el ion
hiuionio BS0
+
).
En pocas palabias, que piovoca el
iompimiento ue un enlace meuiante hiuiolisis.


Y:V Las enzimas extiacelulaies que uegiauan
pioteinas se llaman JAB?=6D6D
|4j
las que iompen
polisaciiuos H8FCBDF@6D6D
|4j
y las que uegiauan
lipiuos son 8FJ6D6D
|4j
.


Z:V /B>?=D?= E68DB d;e B ]=A@6@=AB d4e 6 86D DFH<F=>?=D
6D=]=A6CFB>=D(

| 4 j Nuchas enzimas extiacelulaies son
hiuioliticas, peio no touas las enzimas hiuioliticas
son extiacelulaies.

| 4 j Las peptiuasas son enzimas extiacelulaies que
hiuiolizan pioteinas ue alto peso moleculai.

| 4 j Las glicosiuasas hiuiolizan enlaces stei en
los polisaciiuos.

Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano K
| ; j Las membianas biologicas son sensibles a las
lipasas.


[:V 0n ejemplo ue polisaciiuo estiuctuial lo
constituye 86 \<F?F>6. 0n ejemplo ue polisaciiuo
nutiicional es =8 H8<CGH=>B.

8.- La caseina es una pioteina ue oiigen 6>FM68, y
la gelatina es ue oiigen ]=H=?68.

9.- La uescomposicion ue los alimentos poi
uegiauacion ue tiigliciiuos piovoca JAB@<CCFG>
@= =>=AHL6.




!"#$% ''( 1$'0'f"/',- )% /"#2,R')#"$,+ U "/'),+ ,#*g-'/,+



,23%$'4,

El alumno iealizai piuebas bioquimicas
paia ueteiminai la habiliuau ue los
miciooiganismos paia uegiauai y feimentai
caibohiuiatos con la piouuccion ue un ciuo o un
ciuo y gas.

'-$#,)1//'5-

La iuentificacion ue miciooiganismos en
base a su estiuctuia colonial y micioscopica no es
concluyente, poi lo que se tiene que iecuiiii a la
iuentificacion fisiologica. Paia ello existen un gian
nmeio ue piuebas metabolicas. El metabolismo es
la suma ue touos los piocesos quimicos que
ocuiien uentio ue un inuiviuuo y paia su estuuio se
uiviue en 6>67B8FDMB y C6?67B8FDMB: En el
piimeio se analizan las ieacciones bioquimicas que
suceuen en la clula paia foimai maciomolculas y
el segunuo iepiesenta las ieacciones que estn
involuciauas en la conveision ue sustiatos a foimas
ms simples y, geneialmente, ms oxiuauas con lo
que se obtiene la eneigia iequeiiua poi el
anabolismo.
Los ties piincipales piocesos que conuucen
a la obtencion ue eneigia y su conveision en ATP
son: la E=AM=>?6CFG>, en la cual se obtiene ATP poi
fosfoiilacion a nivel ue sustiato, la A=DJFA6CFG>,
uonue el ATP se obtiene poi fosfoiilacion oxiuativa
y la EB?BDL>?=DFD, uonue se foima ATP poi
fotofosfoiilacion.
La feimentacion es un pioceso anaeiobico
en el cual tanto los uonauoies como los aceptoies
ue electiones son compuestos oignicos,
aminociuos y otios ms. Existen vaiios tipos ue
feimentaciones efectuauas poi miciooiganismos.
Los piouuctos ue la feimentacion ue caibohiuiatos
son piincipalmente ciuos oignicos, alcoholes,
cetonas y C02.
$6786 h Tipos ue feimentaciones y miciooiganismos que las
iealizan.
$FJB @=
E=AM=>?6CFG>
!AB@<C?BD
JAF>CFJ68=D
.FCABBAH6>FDMBD
Alcoholica Etanol y C02 Algunas levauuias y
:5-'-'1&s
Bomolctica Aciuo lctico 9&6*'#&6"!!,( y
3*%$/*'6'66,(
Beteiolctica Aciuo lctico,
etanol y C02
Lactobacillus,
Leuconostoc
Aciuo mixta 2,S-
butanouiol,
butanol,
succinato,
lactato,
acetato,
foimiato, B2 y
C02
34"2$!!&; 3&!-'1$!!&;
8!$#("$!!&;
<(64$%"64"& 6'!"
Butiiica Butiiato,
acetato, B 2 y
C02
)!'(*%"+",-
#,*5%"6,-
Piopionica Piopionato,
acetato, C02
=%'/"'1"#&6*$%",-;
)!'(*%"+",-
/%'/"'1"6,-
Actica Acetato )!'(*%"+",- &6$*"6,-;
>6$*'#&6*$%",-.


."$%#'"0

Tubos ue 1S mm X 1uu mm con S ml ue
caluo glucosauo;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con S ml ue
caluo malonato;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con campana
ue Buiham, con S ml ue caluo base, iojo ue
fenol y glucosa, sacaiosa y manitol;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con meuio
inclinauo ue Kliglei;
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
L Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con meuio
inclinauo ue citiato ue Simmons;
Reactivo inuicauoi iojo ue metilo;
Reactivo ue K0B-cieatina;
Reactivo ue a-naftol;
Cepas pioblema.

.%$,),+

;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD => ?<7BD @=
)<AS6M
1. Inocule con una asaua ue caua
miciooiganismo los tubos ue Buiham con el
caluo iojo ue fenol uifeientes glucosa,
sacaiosa y manitol. Tenga cuiuauo ue no
agitai el tubo ue feimentacion.
2. Incube a S7 C poi 24 h. Es impoitante no
sobie-incubai los tubos uebiuo a que se pueue
piovocai una confusion al momento ue hacei
la lectuia uebiuo a fenomenos ue
alcalinizacion uel meuio poi acumulacion ue
amonio.
S. 0bseive el iesultauo inuicanuo paia caua una
ue las cepas utilizauas con los uifeientes
caibohiuiatos lo siguiente:
Piouuccion ue ciuo: la piueba es positiva
si el inuicauoi viia a amaiillo y negativa si
no hay viiaje.
Piouuccion ue gas: la piueba es positiva si
se foima una buibuja que uesplaza el
liquiuo uentio ue la campana y negativa si
el tubo o campana contina lleno ue
liquiuo.
4. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.

;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD => M=@FB @=
i8FH8=A
1. Inocule poi picauuia y en la supeificie ue los
tubos ue Kligei caua una ue las cepas
inuicauas.
2. Incube los tubos a S7 C poi 24 h
S. 0bseive el iesultauo e inteipietailo como
sigue:
Feimentacion ue glucosa: viiaje uel
inuicauoi a amaiillo en la supeificie uel
tubo.
Piouuccion ue gas: foimacion ue buibujas
en el meuio ue cultivo
Piouuccion ue B2S: foimacion ue un
piecipitauo negio en el tubo ue cultivo
Alcalinizacion: el inuicauoi toma un coloi
ue iojo hacia pipuia.
4. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.

;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD: !A<=76D @=
ABjB @= M=?F8B Q @= 4BH=D !ABDk6<=A
1. Inocule caua cepa en uos tubos ue caluo
glucosauo. Naique caua tubo como NR y vP
iespectivamente.
2. Incube los tubos a S7 C poi 24 h.
S. Aaua al tubo maicauo como NR, S gotas ue
ieactivo ue iojo ue metilo sin agitai. La
piesencia ue un anillo iojo estable en la
paite supeiioi uel tubo es una piueba
positiva ue iojo ue metilo. La piueba es
negativa si no se foima el anillo iojo.
4. Aaua al tubo maicauo como vP, 6 gotas ue
ieactivo ue a-naftol y 2 gotas ue K0B-
cieatina y agite suavemente. Bjelo ieposai
ue 2u min a Su min. La piueba positiva ue
voges Pioskauei se ua poi la apaiicion ue un
coloi iojo en el tubo (inuica la piouuccion ue
acetil-metilcaibinol).

1?F8FN6CFG> @= TCF@BD BAHT>FCBD
1. Siembie un tubo con agai-citiato ue
Simmons poi estiia abieita en la supeificie y
uno ue caluo malonato con una asaua.
2. Incube los tubos a S7 C poi 24 h
S. 0bseive el iesultauo. La piueba es positiva
cuanuo hay ciecimiento y el coloi uel
inuicauoi viia a azul y negativa si no hay
ninguna ue estas seales.
4. Registie los iesultauos en la tabla inuicaua.

#%+10$"),+ U /1%+$',-"#',

9:V ">B?= => 86 DFH<F=>?= ?6786 8BD A=D<8?6@BD @= 86D
JA<=76D 7FB\<LMFC6D A=68FN6@6D => 86 JATC?FC6:

$6786 9l: Begiauacion y feimentacion ue caibohiuiatos y
ciuos oignicos.
Piueba A B C B E F


Buiham
ulucosa

Aciuo - - - - - -
uas - + - - - -
Sacaiosa Aciuo - + + + - -
uas - - - - - -
Nanitol Aciuo - - - - - -
gas - - - - - -

Kliglei
ulucosa - + - + + +
Alcalinizacion + - + - - -
uas - - - - - -
Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano M
B2S - - - - - -

0tias
RN - - - + - -
vP - - - - - -
Citiato + - - - - +
Nalonato
*
- - - - - -
Piueba positiva = +, piueba negativa = -.
*
En touos los tubos se obseivo ciecimiento peio en ninguno hubo
viie a azul

K:V '>@F\<= C<68 =D =8 E<>@6M=>?B @= C6@6 <>6 @= 86D
JA<=76D 7FB\<LMFC6D A=68FN6@6D:

;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD => ?<7BD @=
)<AS6M

El caluo iojo ue fenol es usauo paia uifeienciai
miembios ue <1*$%'#&6*$%"&6$&$ y uistinguiilos ue
otias bacteiias uiam-negativas.
La piouuccion ue ciuo a paitii ue la
feimentacion ue los caibohiuiatos ieuuce el pB poi
uebajo uel iango neutio uel inuicauoi y cambia el
coloi uel meuio a amaiillo. La uesaminacion ue los
aminociuos ue la peptona piouuce amoniaco
(NBS) lo que eleva el pB y vuelve iosa el meuio. La
piouuccion ue gas, tambin ue la feimentacion, es
inuicauo poi una buibuja en el tubo ue Buiham
uonue el caluo ha siuo uesplazauo
|6j
.

;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD => M=@FB @=
i8FH8=A

En el meuio ue cultivo, la peptona ue caine y la
tiipteina, apoitan los nutiientes auecuauos paia el
uesaiiollo bacteiiano. La lactosa y la glucosa son
los hiuiatos ue caibono feimentables. El tiosulfato
ue souio es el sustiato necesaiio paia la piouuccion
ue ciuo sulfhiuiico, el citiato ue hieiio y amonio,
es la fuente ue iones Fe
S+
, los cuales se combinan
con el ciuo sulfhiuiico y piouucen sulfuio ue
hieiio, ue coloi negio. El iojo ue fenol es el
inuicauoi ue pB, y el cloiuio ue souio mantiene el
balanceosmotico.
Poi feimentacion ue azcaies, se piouucen
ciuos, que se uetectan poi meuio uel inuicauoi
iojo ue fenol, el cual viia al coloi amaiillo en meuio
ciuo. El tiosulfato
ue souio se ieuuce a
sulfuio ue hiuiogeno
el que ieacciona
luego con una sal ue
hieiio geneianuo el
tipico sulfuio ue
hieiio ue coloi
negio
|Sj
.
;=AM=>?6CFG> @= C6A7BSF@A6?BD: !A<=76D @=
ABjB @= M=?F8B Q @= 4BH=D !ABDk6<=A

- #BjB @= M=?F8B d.#e

Esta piueba siive paia ueteiminai la
capaciuau ue un miciooiganismo paia piouucii y
mantenei estables los piouuctos teiminales ciuos
ue la feimentacion ue la glucosa y vencei la
capaciuau amoitiguauoia uel sistema. La piueba
iojo ue metilo es cuantitativa paia la piouuccion ue
ciuo y iequieie que los miciooiganismos
piouuzcan ciuos fueites a paitii ue la glucosa, ue
foima que el pB uel meuio uescienua a menos ue
4.4. Esta uistincion se hace a tiavs uel inuicauoi
iojo ue metilo
|6j
.


;FH: 9 Piueba iojo ue metilo. A la izquieiua <(64$%"64"& 6'!"
(NR-positivo) y uel lauo ueiecho <1*$%'#&6*$% &$%'2$1$( (NR-
negativo).


- 4BH=DV!ABDk6<=A d4!e

La piueba ue voges-Pioskauei es usaua paia
uistinguii entie miembios ue la familia
<1*$%'#&6*$%"&6$&$ y uifeienciailos ue otios uiam-
negativos. Esta piueba iuentifica oiganismos
capaces ue piouucii acetoina y 2,S-butanouiol a
paitii ue la feimentacion ue la glucosa.
Auicionanuo el ieactivo vP al meuio uespus ue
la incubacion oxiua la acetoina (si esta piesente) a
uiacetilo que a su vez ieacciona con la guaniuina
piesente en la peptona paia piouucii el coloi iojo.


;FH: K Reaccion ue la piueba ue voges-Pioskauei.
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
!4 Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano

1?F8FN6CFG> @= TCF@BD BAHT>FCBD

- /F?A6?B

Algunas bacteiias pueuen suministiai eneigia
en ausencia ue feimentacion o piouuccion ue ciuo
lctico empleanuo citiato como nica fuente ue
caibono. En las bacteiias, el uesuoblamiento uel
citiato compienue un sistema enzimtico. Esta
enzima se uenomina citiasa (citiato oxalacetato-
liasa) o citiato peimeasa. La enzima iequieie un
cation bivalente paia su activiuau, que es
suministiaua poi el magnesio o el manganeso
|Sj
.
El agai citiato ue Simmons es un meuio
uefiniuo que contiene citiato ue souio como nica
fuente ue caibono y amonio como nica fuente ue
nitiogeno. 0n miciooiganismo que utiliza citiato y
sales ue amonio como nicas fuentes ue caibono y
nitiogeno, iespectivamente, ua como iesultauo
amoniaco que alcaliniza el meuio. El inuicauoi ue
pB, azul ue biomofenol, cambia ue veiue a pB
neutio (6.9) a azul a pB mayoies que 7.6.
|6j



;FH: W En piesencia ue la enzima citiato peimeasa, el citiato es
conveitiuo a piiuvato. El piiuvato entonces es conveitiuo a
una vaiieuau ue piouuctos uepenuienuo uel pB uel meuio
ambiente.

- .68B>6?B

0na ue las muchas ieacciones enzimticas uel
ciclo ue Kiebs es la oxiuacion ue succinato a
fumaiato. Esta ieaccion iequieie la enzima
succinato ueshiuiogenasa y la ieuuccion ue la
coenzima FAB a FABB2.
El malonato (ciuo malonico) es muy similai al
succinato paia iemplanzailo como sustiato en la
ieaccion. Esta inhibicion competitiva ue succinato
ueshiuiogenasa, en combinacion con la
subsecuente acumulacion ue succinato en la clula,
cieiia el ciclo ue Kiebs y mata al oiganismo a
menos que pueue feimentai o utilizai malonato
como nica fuente ue caibono.
El caluo ue malonato es el meuio usauo paia
hacei esta ueteiminacion. Si el oiganismo utiliza
malonato, el meuio se alcalinizai y el inuicauoi
cambiai ue veiue a azul
|7j
.


;FH: X Inhibicion competitiva ue succinato. La fijacion ue
malonato a la enzima succinato ueshiuiogenasa evita la
fijacion ue succinato y poi lo tanto la conveision ue succinato
a malonato.


!"#$% '''( .%$"2,0'+., )% ".'-,"/'),+


,23%$'4,

El alumno ueteiminai la habiliuau ue los
miciooiganismos paia metabolizai aminociuos
meuiante piuebas bioquimicas.

'-$#,)1//'5-

Los miciooiganismos auems ue iequeiii
una fuente ue caibono y una ue eneigia, necesitan
una fuente ue nitiogeno paia constiuii su piopio
mateiial celulai. Esta fuente ue nitiogeno pueue
sei oignica (pioteinas, aminociuos, bases
nitiogenauas), o bien inoignica (nitiogeno
moleculai, amonio, nitiitos o nitiatos). Bentio uel
metabolismo ue los aminociuos existen algunas
enzimas capaces ue uescaiboxilai, uesaminai y
Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano !!
uesulfuiai aminociuos o uegiauailos
completamente. La piesencia o ausencia ue uichas
enzimas son ciiteiios ue iuentificacion.
La uescaiboxilacion la sufien aminociuos
bsicos como la lisina, oinitina y aiginina y las
enzimas iesponsables se uenominan
uescaiboxilasas. El pioceso es anaeiobico,
iiieveisible y iequieie ue un cofactoi uenominauo
fosfato ue piiiuoxal.
Existen tambin las ieacciones
uenominauas ue uesaminacion. En el caso ue la
aiginina, la uesaminacion piouuce citiulina y
amonio.
La uegiauacion ue aminociuos tales como
cisteina o metionina lleva a la piouuccion ue ciuo
sulfhiuiico. La enzima que libeia el giupo
sulfhiuiilo ue estos aminociuos se uenominan
cisteinasa y metiona-ieuuctasa iespectivamente.

-B?6( Touas las piuebas bioquimicas paia sei
valiuauas necesitan tenei testigos apiopiauos.
Estos testigos son: a) un meuio sin inoculai e
incubauo bajo las mismas conuiciones que los
pioblemas, b) un testigo positivo, que el mismo
meuio inoculauo con una cepa ue iefeiencia que se
conoce ua iesultauo positivo y c) un testigo
negativo que es el mismo meuio inoculauo con una
cepa la cual se conoce ua un iesultauo negativo.

."$%#'"0

Tubos ue 1S mm X 1uu mm con caluo
tiiptona;
Tubos ue 1S mm x 1uu mm con meuio SIN;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con meuio ue
LIA;
Reactivo ue Kovacs o Ehilich;
Papel toinasol iosa;
Cepas pioblema.

.%$,),+

!AB@<CCFG> @= TCF@B D<8ESL@AFCB = F>@B8
1. Siembie poi picauuia en el meuio ue SIN caua
una ue las cepas inuicauas.
2. Incube los tubos a S7 C uuiante 24 h.
S. 0bseive el iesultauo e inteipiete como sigue:
Piouuccion ue B2S: Piesencia ue un
piecipitauo negio
Noviliuau: tuibiuez en iegiones alejauas ue
la picauuia ue inoculacion.
Piouuccion ue inuol: aauii ue S gotas a S
gotas uel ieactivo ue Kovacs o Ehilich. La
apaiicion ue un coloi iojo en la supeificie
uel meuio inuica una piueba positiva.
4. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.
!AB@<CCFG> @= 6MB>F6CB = F>@B8
1. Inocule con una asaua los tubos ue caluo uiea
con caua una ue las cepas inuicauas.
2. Coloque una tiia ue papel toinasol en la boca
uel tubo sujetnuolo con el tapon ue algouon,
sin que toque el meuio ue cultivo.
S. Incube los tubos a S7 C uuiante 24 h.
4. 0bseive el viie uel papel toinasol (ue iosa a
azul) que inuica la libeiacion ue amoniaco.
S. Aaua ue S gotas a S gotas uel ieactivo ue
Kovacs o Ehilich como en la seccion anteiioi.
6. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.
!AB@<CCFG> @= 8FDF>6V@=DC6A7BIF86D6
1. Inocule poi picauuia y estiia un tubo con
meuio ue LIA con caua una ue las cepas
inuicauas.
2. Incube los tubos a S7 C poi 24 h.
S. Inteipiete los iesultauos como sigue:
Bescaiboxilacion positiva: coloi pipuia
en el fonuo uel tubo.
Bescaiboxilacion negativa: coloi amaiillo
en el fonuo uel tubo.
Besaminacion positiva: coloi iojo naianja
en la supeificie uel tubo.
Besaminacion negativa: sin cambio ue
coloi en la supeificie.
Piouuccion ue B2S: piesencia ue un
piecipitauo negio.
4. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.


#%+10$"),+ U /1%+$',-"#',

9:V #=HFD?A= 8BD A=D<8?6@BD B7?=>F@BD => 86D
@FE=A=>?=D JA<=76D @= M=?67B8FDMB @= 6MF>BTCF@BD
=> 86 DFH<F=>?= ?6786(

$6786 99: Piuebas bioquimicas paia iuentificai metabolismo
bacteiiano ue aminociuos.
Piueba A B C B E F

SIN
B2S - - - - - -
Inuol - - - - - -
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
!. Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
Noviliuau + + + + + -
Caluo
1

uiea
Amoniaco
2

Inuol - - - - - -

LIA
Becaiboxilacion + - + - + +
Besaminacion - - - - - -
B2S - - - - - -
Piueba positiva = +, piueba negativa = -.
1
El caluo tiiptona fue cambiauo poi el caluo uiea.
2
No se iealizo uebiuo a que no se contaba con papel toinasol.



;FH: Y Resultauos ue las piuebas bioquimicas aplicauas.
Aiiiba, el meuio SIN (moviliuau), abajo a la izquieiua el meuio
caluo uiea uespus ue aauii el ieactivo ue Kovacs paia
ueteiminai piouuccion ue inuol y poi ltimo el meuio LIA
uonue no se piesenta uesaminacion en ningn tubo peio si
uescaiboxilacion.

K:V '>@F\<= 86D A=6CCFB>=D \<= D= 88=]6> 6 C67B =>
C6@6 <>6 @= 86D JA<=76D 7FB\<LMFC6D \<= D=
A=68FN6AB> => 86 JATC?FC6:

.=@FB +'.

- !AB@<CCFG> @= RK+

La ieuuccion ue sulfuio a B2S es una activiuau
anaeiobica y pueue sei iealizauo poi la bacteiia en
uos maneias uifeientes, uepenuienuo ue la enzima
piesente
|9j
.
* La pioteina cisteina uesulfuiasa cataliza la
conveision uel aminociuo cisteina a piiuvato.
m La enzima tiosulfato ieuuctasa cataliza la
ieuuccion ue sulfuio al final ue la cauena
tianspoitauoia ue electiones ue la iespiiacion
anaeiobia.
Ambos sistemas piouucen gas sulfuio ue hiuiogeno
(B2S). Cuanuo la ieaccion ocuiie en el meuio SIN, el
B2S se combina con el hieiio uel meuio paia
foimai sulfuio ue hieiio (FeS), un piecipitauo
negio.

H
2
S + FeSO
4
!H
2
SO
4
+ FeS
(s)










;FH: Z A la ueiecha <(64$%"64"& 6'!"
(B2S-negativo) y uel lauo ueiecho
=%'*$,( -"%&#"!"( (B2S-positivo.)


- !AB@<CCFG> @= F>@B8

La piueba ue inuol iuentifica bacteiias capaces
ue piouucii inuol usanuo la enzima tiiptofanasa.
Esta piueba es iealizaua usanuo el meuio SIN (SIN
es un acionimo ue Sugai Inuole Notility)
La piueba ue inuol est basaua en la foimacion
ue un complejo iojo cuanuo el giupo inuol
(piesente en el tiiptofano) ieacciona con el giupo
aluehiuo uel p-uimetilaminobenzaluehiuo, el cual
iepiesenta el piincipio activo uel ieactivo ue
Kovacs
|9j
.


;FH: [ El ieactivo ue Kovacs es aauiuo al meuio uespus ue la
incubacion. Si el oiganismo es inuol-positivo, un coloi iojo es
piouuciuo poi esta ieaccion.


.=@FB C68@B <A=6

- !AB@<CCFG> @= 6MB>F6CB

Esta piueba peimite veiificai si la bacteiia
uegiaua la uiea a paitii ue las enzimas hiuioliticas
llamauas uieasas. Las sustancias piouucto ue la
hiuiolisis alcalinizan el meuio hacienuo viiai el
inuicauoi iojo ue fenol a un iojo giosella.

H
2
N !CO! NH
2
ureasa
" # "" 2NH
3
+CO
2


Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano !5
- !AB@<CCFG> @= F>@B8

vei Fig. 7


.=@FB 0'"

- )=DC6A7BIF86CFG>

La feimentacion ue la glucosa (touas las
<1*$%'#&6*$%"&6$&$ feimentan glucosa) vuelve
amaiillo el meuio uebiuo a la acumulacion ue
piouuctos finales ciuos. El bajo pB y la piesencia
ue aminociuos inuuce en oiganismos caiboxilasa-
positivos la piouuccion ue la enzima.
La uescaiboxilacion ue los aminociuos cambia
el coloi uel meuio ue cultivo a moiauo
|8j
.


;FH: ` Bescaiboxilacion ue aminociuos.


- )=D6MF>6CFG>

La uesaminacion ue la lisina pueue ocuiiii en
las bacteiias peitenecientes a los gneios =%'*$,( y
=%'?"+$16"&.
Si el miciooiganismo piouuce lisina
uesaminasa, el iesultauo ue la ieaccion ue
uesaminacion piouucii compuestos que
ieaccionain con el citiato ue amonio fiiico y
geneiai un coloi iojo.
En este caso el giupo amino uel aminociuo se
tiansfieie a la enzima (lisina uesaminasa), paia
geneiai el cetociuo coiiesponuiente y la enzima
aminaua
|1uj
.

aminocido+enzima !! "cetocido+enzima " NH
2


- !AB@<CCFG> @= RK+

El sulfuio ue hiuiogeno (B2S) es piouuciuo
en el meuio LIA (Lysina Iion Agai) poi la ieuuccion
anaeiobica uel tiosulfato. Los iones fiiicos en el
meuio ieaccionan con el B2S paia foimai un
piecipitauo negio en el fonuo uebiuo al sulfuio
feiioso
|Sj
.

Reaccion ulobal

Bacteria + Na
2
S
2
O
3
!H
2
S
(g)

H
2
S
(g)
+ Fe
3+
!FeS
(s)






!"#$% '4( #%+!'#"/',-


,23%$'4,

El alumno ueteiminai la habiliuau ue los
miciooiganismos paia obtenei electiones poi el
pioceso ue iespiiacion con uifeientes sustiatos.

'-$#,)1//'5-

La iespiiacion es un pioceso ue fosfoiilacion
oxiuativa, asociaua a una cauena ue electiones,
geneia un giauiente electioquimico, el cual es
utilizauo poi la ATP sintetasa paia acoplai ATP. La
capaciuau iespiiatoiia se encuentia ampliamente
uistiibuiua entie los miciooiganismos.
Touos los eucaiiotes, con excepcion uel
giupo ue los micioespoiiuios (nicos que no tienen
mitoconuiias) tienen capaciuau ue iespiiai usanuo
al oxigeno como aceptoi final ue electiones. Como
uonauoies ue electiones usan compuestos
oignicos como el succinato, NABB y FABB que
piovienen uel metabolismo ue azcaies o
aminociuos. El azul ue metileno acta como un
aceptoi aitificial ue electiones el cual pasa ue su
foima oxiuaua (azul) a su foima ieuuciua (incoloio)
cuanuo se evita su ieoxiuacion poi el oxigeno uel
aiie, utilizanuo paia este pioposito una capa ue
aceite mineial.
Los piocaiiotes, auems ue contai con
iespiiacion aeiobica, algunos giupos poseen
tambin la capaciuau ue iespiiai anaeiobicamente
y pueuen usai N0
S-
, N0
2-
, (S04)
2-
, C02, S, Fe
S+
o
fumaiato como aceptoies finales ue electiones.
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
!H Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano
Entie los piocaiiotes litotioficos, los uonauoies ue
electiones pueuen sei molculas oignicas (como
las ya uesciitas) o inoignicas entie las que se
encuentian B2, B2S y NBS.

."$%#'"0%+

Cajas ue Petii con agai nutiitivo;
Tubos ue 16 mm X 1Su mm estiiles;
Tubos ue 1S mm X 1uu mm con S ml ue
caluo nitiato;
Pipetas ue 1ml, Sml y 1u ml estiiles;
Niciopipetas ue 1uuumly 2uu ml;
Puntas estiiles paia miciopipetas;
Natiaz eilenmeyei con Su ml ue leche
estiil con glucosa al u,S%;
Solucion ue azul ue metileno al u,1%;
Aceite mineial estiil;
Reactivo ue ciuo sulfanilico;
Reactivo ue a-naftil amina;
Agua oxigenaua al 1u%;
Reactivo ue oxiuasa;
Tiias ue papel filtio;
Cepas pioblema.


.%$,),+

#=@<CCFG> @= 6N<8 @= M=?F8=>B
1. Naique una seiie ue tubos ue 16 mm X 1Su
mm uel 1 al 4.
2. Aaua u,S ml ue azul ue metileno al matiaz
con leche
S. Aaua a caua tubo la leche, suspension
bacteiiana y aceite, ue acueiuo al oiuen que
se seala en la siguiente tabla:

$<7B 9 K W X Y
Leche estiil con azul
ue metileno
4,S
ml
4,u
ml
S,S
ml
S,u
ml
2,S
ml
Suspension
bacteiiana
u u,S
ml
1,u
ml
1,S
ml
2,u
ml
Bomogenizai suavemente el conteniuo ue caua tubo
Auicionai aceite
mineial
u,S
ml
u,S
ml
u,S
ml
u,S
ml
u,S
ml

4. Incube touos los tubos en bao maiia a S7 C
y anote el tiempo que taiuan en uecoloiaise.
S. Anote los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.
#=@<CCFG> @= >F?A6?BD 6 >F?AF?BD
1. Siembie 1uu ml ue caua uno ue los cultivos ue
las cepas en caluo nitiato. uuaiue un tubo sin
inoculai como testigo.
2. Incube touos los tubos a S7 C poi 24 h.
S. Beteimine la piesencia ue nitiitos aauienuo
a caua tubo S gotas ue u-naftol amina y S
gotas ue ciuo sulfanilico.
4. 0na coloiacion iojo lauiillo inuica la
piesencia ue nitiitos (foimacion ue un
complejo uiazoico).
!A<=76D @= CF?BCABMB BIF@6D6 Q C6?686D6
1. Siembie en una caja ue agai nutiitivo poi
estiia abieita las cepas inuicauas.
2. Incube a S7 C poi 24 h.
S. Paia la piueba ue la oxiuasa, tiansfieia una
asaua ue caua cepa a una tiia ue papel filtio.
Aaua al papel una gota ue ieactivo ue
oxiuasa, o aplique un uisco que contenga el
ieactivo. El sistema citociomo oxiuasa se
encuentia poi lo geneial en oiganismos
aeiobios y los hace capaces ue utilizai el
oxigeno como aceptoi final ue electiones y
piouucii B202. Los miciooiganismos que
poseen esta enzima, en piesencia uel 02 y uel
ieactivo uesaiiollan un complejo ue coloi
pipuia.
4. Bespus ue tomai la muestia paia la piueba
ue oxiuasa, aaua sobie el ciecimiento ue las
cepas, unas gotas ue B202. La mayoiia ue los
miciooiganismos aeiobios y anaeiobios
facultativos tienen una enzima llamaua
catalasa, la cual uescompone el agua
oxigenaua, evitanuo la acumulacion ue este
metabolito toxico. La apaiicion ue buibujas en
el cultivo, uespus ue la auicion uel ieactivo,
inuica una piueba positiva.
S. Registie los iesultauos en la tabla
piopoicionaua.

#%+10$"),+ U /1%+$',-"#',

9:V #=HFD?A= 8BD A=D<8?6@BD B7?=>F@BD => 86D
@FE=A=>?=D JA<=76D A=68FN6@6D @<A6>?= 86 JATC?FC6 =>
86 DFH<F=>?= ?6786(

$6786 9K: Piuebas bioquimicas paia ueteiminai el aceptoi final ue
electiones en el pioceso ue iespiiacion.
Tubo
(=@&,%$2"1'(&)
1 2 S 4 S
Azul ue
metileno
- - - - -
Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano !I
Piueba positiva = +, piueba negativa = -.


Cepa
Piueba
Reuuccion
ue N0S
-

0xiuasa Catalasa
A - +- +
B + + +
C - - +-
B + + +
E - - +
F - - +
Piueba positiva = +, piueba negativa = -.



;FH: h Resultauos ue las piuebas bioquimicas.


K:V '>@F\<= 86D A=6CCFB>=D \<= D= 88=]6AB> 6 C67B =>
C6@6 <>6 @= 86D JA<=76D A=68FN6@6D

#=@<CCFG> @= 6N<8 @= M=?F8=>B

La cauena iespiiatoiia ue las bacteiias se
localiza en la membiana plasmtica y es fcilmente
accesible a los aceptoies ue electiones. Si se
inteiiumpe la oxigenacion uel cultivo ue una
bacteiia y se incoipoia un inuicauoi ieuox, como
aceptoi aitificial ue electiones, es posible estimai
cualitativamente la activiuau metabolica ue esa
poblacion bacteiiana, poi el cambio ue coloi uel
inuicauoi.
0no ue estos aceptoies es el azul ue metileno,
en su foima oxiuaua es ue coloi azul, peio al iecibii
electiones, es este caso, ue componentes ue la
cauena iespiiatoiia bacteiiana, se ieuuce y pasa a
su foima incoloia
|9j
.


;FH: 9l Reaccion ue la ieuuccion uel azul ue metileno.

#=@<CCFG> @= >F?A6?BD 6 >F?AF?BD

El caluo ue nitiato es un meuio inuefiniuo ue
extiacto ue caine, peptona y nitiato ue potasio. 0n
tubo inveitiuo ue Buiham es colocauo en caua
meuio paia atiapai la poicion ue cualquiei gas
piouuciuo. En contiaste con mucho meuios
uifeienciales no incluye inuicauoi
|7j
.

,IF@6D6
La piueba ue la oxiuasa es usaua paia
iuentificai bacteiias que contengan la enzima
citociomo c oxiuasa
"#$
.

;FH: 9K Esta piueba esta uiseaua paia iuentificai la piesencia
ue citociomo c oxiuasa. Esto es posible uebiuo a que
citociomo c oxiuasa tiene la habiliuau nica ue no solamente
oxiuai a citociomo c, sino tambin ue catalizai su ieuuccion
poi un agente ciomognico ieuuciuo llamauo tetiametil p-
fenileneuiamina.

/6?686D6

La enzima catalasa se encuentia en la mayoiia ue
las bacteiias aeiobias y anaeiobias facultativas que
contienen citociomo, la excepcion piincipal es el
3*%$/*'6'66,(
|Sj
.

H
2
O
2
catalasa
! " !! H
2
O+O
2
#
0niveisiuau ue uuanajuato - BCNE
!J Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano

Si se ueja acumulai el peioxiuo ue
hiuiogeno, es toxico paia las bacteiias y piovoca su
mueite. La catalasa uescompone el peioxiuo ue
hiuiogeno u oxiua los sustiatos secunuaiios, sin
embaigo, no tiene accion contia otios peioxiuos
|Sj
.

;FH: 99 Si el nitiato es ieuuciuo a nitiito, se foimai ciuo
nitioso (BN02) en el meuio. Entonces, el ciuo nitioso
ieaccionai con el ciuo sulfanilico paia foimai ciuo
uiazosulfanilico, el cual ieacciona con el u-naftolamina paia
foimai p-sulfobenceno-azo- u-naftolamina es cual es iojo.


,2+%#4"/',-%+ U )'+/1+'5-

Paia logiai la iuentificacion ue un
miciooiganismo es necesaiio aplicai un conjunto
ue tcnicas y pioceuimientos, los cuales se pueuen
clasificai ue acueiuo a
|11j
:

Ciiteiios macioscopicos (moifologia)
Ciiteiios micioscopicos (tincion uifeiencial)
!A<=76D 7FB\<LMFC6D
Tipificacion con fagos
Piuebas seiologicas
Beteccion moleculai

Basta ahoia, a las seis bacteiias
seleccionauas se les han uesciito sus caiacteiisticas
moifologicas y micioscopicas. Auems, en caua ue
stas bacteiias ha siuo evaluauo su iequeiimiento
ue oxigeno y en base a los iesultauos se puuieion
clasificai en aeiobias, anaeiobias, etc.
Sin embaigo, stos pioceuimientos nos
uicen poco aceica ue las ielaciones filogenticas
entie las bacteiias. Poi lo tanto, el siguiente paso
que se uebe ue iealizai paia apioximaise a la
iuentificacion ue un miciooiganismo es la
aplicacion ue piuebas bioquimicas.
Las piuebas bioquimicas, las cuales estn
basauas en las activiuaues metabolicas enzimticas
ue los miciooiganismos, son ampliamente
utilizauas paia uifeienciai las bacteiias, incluso las
que estn estiechamente ielacionauas pueuen sei
sepaiauas en especies uifeientes.
En est pictica se evaluo la capaciuau ue
los miciooiganismos paia uigeiii maciomolculas,
su habiliuau paia metabolizai caibohiuiatos y
aminociuos asi como la capaciuau ue obtenei
electiones ue uifeientes
sustiatos paia usailos
en su pioceso ue
iespiiacion.
Respecto a las
bacteiias seleccionauas,
aquellas que fueion
maicauas como A, B, B y
F, se seleccionaion uel
meuio ue cultivo
Czapeck (muestia ue suelo), especial paia el
ciecimiento ue actinomicetos; y las colonias ue
bacteiias iotulauas como C y E fueion tomauas uel
meuio A-NvT.
Suponienuo que las bacteiias tomauas uel
meuio Czapeck, son piecisamente actinomicetos, a
ieseiva ue que esto sea incoiiecto, se sabe que son
aeiobios estiictos y cuanuo se aplica la piueba ue la
oxiuasa peimite ponei ue manifiesto el sistema
citociomo-oxiuasa, que se encuentia en oiganismos
ue este tipo. Los iesultauos ue sta piueba uieion
positivo en B y B, en cuanto a la colonia A el
iesultauo no fue concluyente, la colonia F fue
negativa.
Respecto a la piueba ue la catalasa, touas las
bacteiias piouujeion hiuiogeno uebiuo a la
uescomposicion uel peioxiuo ue hiuiogeno, aunque
en uifeientes piopoiciones. Poi lo tanto, algunas ue
stas bacteiias pouiian sei ue los gneios nocaiuia
y stieptomyces (catalasa-positivos) peitenecientes
al filo actinomicetos. Estas bacteiias se encuentian
abunuantemente en suelos iealizanuo la fijacion ue
nitiogeno atmosfiico
|12j
. Auems, los iesultauos
ue la piueba ue ieuuccion ue nitiatos (positiva en B
y B) aumenta las posibiliuaues ue sta suposicion,
tomanuo en cuenta que los actinomicetos tienen la
capaciuau ue ieuucii nitiatos a nitiitos.
Buiante el uesaiiollo ue la pictica no se
utilizaion piuebas ue iefeiencia o testigo, lo cual
uificulto, hasta cieito punto, la coiiecta
inteipietacion visual ue las piuebas.
En la piueba ue ieuuccion ue metileno se
uso una cepa ue =@ &,%$2"1'(& y en los cinco tubos
no se obseivo ningn cambio uebiuo a que esta
bacteiia es aeiobica y al coitaile el suministio ue
Laboiatoiio ue Niciobiologia Pictica 1. Netabolismo Bacteiiano !K
oxigeno, auicionauo una capa ue aceite mineial,
ste miciooiganismo se muiio.

/,-/01+',-%+

Los ensayos bioquimicos son piuebas
simples que se uesaiiollan paia uemostiai
caiacteiisticas bioquimicas ue las bacteiias como
piesencia o ausencia ue una activiuau enzimtica,
giupo ue enzimas o vias metabolicas, a paitii ue un
sustiato que se incoipoia en un meuio ue cultivo y
que la bacteiia al ciecei tiansfoima o no. Poi lo
tanto, conocienuo stas caiacteiisticas bioquimicas
se pueue logiai la iuentificacion en gneio o
especie ue los miciooiganismos compaianuo las
similituues con caiacteiisticas bioquimicas ya
iepoitauas.

#%;%#%-/'"+

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Life Sciences Institute, 7ma Edicin, (1998), Espaa, pp 118.
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[10]
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