INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS

ESTANDARIZACIN DEL MTODO MICROBIOLGICO ESTABLECIDO EN LA NOM NOM-115-SSA1-1994 1994 PARA LA CUANTIFICACIN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS

ANTEPROYECTO DE TESIS

Que para obtener el grado de

LICENCIADO EN TECNOLOGA DE ALIMENTOS

Presenta

YAHAIRA ZARAHI AURORA NIEBLA GIL

CD. OBREGN, SONORA

Junio de 2013

El presente trabajo de investigacin se llev a cabo, en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa de Instituto Tecnolgico de Sonora siendo asesorado por el Dr. Ernesto Uriel Cant Soto.

AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS.
A Dios,Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos, adems de su infinita bondad y amor. Al cual le estoy muy agradecido por permitirme vivir la vida, superando obstculos y disfrutando buenos momentos.

A todos aqullos que contribuyeron en mi formacin acadmica y profesional: a mis profesores, que compartieron conmigo sus conocimientos a lo largo de mi educacin universitaria en especial a Ral H., Ana M.R., Vctor P., Sal R., Israel S., Tambin especialmente a mi asesor de tesis Dr. Ernesto Cant Soto, por su motivacin y apoyo para realizar mi tesis, a mis revisores, M.I Anacleto Flix Fuentes y Dr. Olga Nydia Campas Baypoli Gracias por todo su apoyo, a mis maestros de laboratorio de microbiologa, Ing. Andrs Fco. Chvez A. e Ing. Alberto delfn, gracias por sus consejos, enseanzas, regaos y sobretodo amistad.
A mi madre, Eva Angelina Niebla Gil, Porque a pesar de enfrentarse a un mundo tan difcil y sola, no dudaste en siempre darme lo mejor. Por tener siempre la fortaleza de salir adelante sin importar los obstculos, por haberme formado como una mujer de bien, por ser la mujer que me dio la vida y me enseo a vivirla. Por tus palabras de aliento en todo momento, por sus consejos, sus valores, por la motivacin constante que me ha permitido ser una persona de bien, pero ms que nada, por su amor. No hay palabras para agradecerte tanto GRACIAS MAM. A mi abuela, Evangelina Gil de Niebla, por todas tus enseanzas a lo largo de mi vida, tus consejos, regaos, por tus eternos pleitos conmigo que tanto amo t.q.m
. mi viejita mula.

A mi abuelo, Jorge Niebla Martnez ,Porque has sido y sers siempre un ejemplo incuestionable de fortaleza, integridad, profesionalismo, sabidura y responsabilidad, por apoyarnos incondicionalmente a mi madre y sobre todo a m, en mi crecimiento profesional, por haber sido mi padre siempre, y
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por qu s que donde quiera que ests, aun estas pendiente de nosotras, TE AMO PAPI. A mi familia Niebla Gil, por sus palabras de aliento y sus buenos deseos, por siempre estar pendientes de mi GRACIAS. A Mi Novio, Jess Cristhian Lpez Salazar, que ha sido gran

compaero a lo largo de mi carrera y uno de los principales pilares para la culminacin de la misma, que con su apoyo constante, regaos, por su amor incondicional y estar sobre todo en las buenas y en las malas, ha sido amigo y compaero inseparable, fuente de sabidura, calma y consejo en todo momento. A todos mis amigos y compaeros de la universidad, en especial a Yuriko, Aracely, Francisco, Daniel, Valeria, Diego, Can, Gaby, Italia, Joel, Ivn, Cesar, Zavala, Hctor, a los SALTAS 2011-2012 gran equipo, a mis compaeros de laboratorio Alan, Noelia, Jos lus, Gaby, Quiroz, Claudia, Sofa, a mis queridos hermanos postizos Carlos y Jos Mara Armenta, que bonito que todos ustedes estn presentes en esta etapa de mi vida tan importante, por su apoyo en las buenas y malas experiencias que vivimos juntos GRACIAS TOTALES.

Yahaira Zarahi Aurora Niebla gil.

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NDICE DESCRIPCIN AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS... NDICE GENERAL.... NDICE DE TABLAS. NDICE DE FIGURAS... RESUMEN...... I 1.1 1.2 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2 1.5 II 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 INTRODUCCIN Antecedentes Planteamiento del problema.......................................................... Justificacin Objetivos Objetivos generales Objetivos especficos Hiptesis MARCO TERICO........................................................................ Alimento Alimentos seguros Alimentos crudos Alimento y sanidad. Contaminacin de alimentos Agentes contaminantes. Contaminacin qumica. Contaminacin fsica. Partculas de tierra y polvo. Insectos Contaminacin biolgica. Manipulador de alimentos Contaminacin cruzada. Bacterias. Pgina i iii vi vii viii 1 1 3 4 4 4 4 5 6 6 6 7 8 8 9 10 10 11 11 12 12 13 13
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2.2.8 2.2.9 2.3 2.3.1 2.4 2.4.1 2.5 2.5.1 2.5.1.1 2.5.2 2.5.3 2.5.3.1 2.5.4 2.5.5 2.5.6 2.5.7 III 3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.4 3.5 3.5.1 3.5.1.1 3.5.2 3.6 3.6.1

Virus. ... Parsitos. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) Principales enfermedades producidas por alimentos. Patgeno... Toxiinfeccin, intoxicacin alimentaria Staphylococcus aureus.. Caractersticas del microorganismo. ... Morfologa. Caractersticas de la enfermedad. Epidemiologa. Fuente del microorganismo. ... Contaminacin a los alimentos. ... Alimentos involucrados. Factores que contribuyen a la contaminacin. Tratamiento. MATERIALES Y MTODOS Zona de estudio.. Periodo de muestreo Toma de muestras.. Alimentos... Transporte de muestras.. Anlisis microbiolgicos.............. Gestin de materiales y reactivos... Medios y reactivos. Patgenos... Procedimiento para la preparacin de medios de cultivo Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos(NOM-115-SSA1-1994). . Medio de Baird-Parker (100 mL)

14 14 14 16 17 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 24 25 25 25 26 26 28 28 28 28 29 29 29 30
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3.6.1.1

3.6.1.2 3.7 3.7.1 3.7.2 3.8

Caldo de infusin cerebro-corazn (BHI)... Preparacin de medios de cultivo para pruebas bioqumicas. Plasma de conejo. .. Termonucleasa. .. Procedimiento para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. . RESULTADOS Y DISCUSIN... Estandarizacin del mtodo microbiolgico Resultados microbiolgicos en alimentos Cuenta total de Staphylococcus aureus en alimentos Resultados de pruebas bioqumicas de cepas sospechosas de Staphylococcus aureus en alimentos............................................ CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA CONSULTADA.

33 33 33 33 34 38 38 40 40 41 43 44 45

IV 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2

V VI VII

NDICE DE TABLAS Tabla 1 2 3 4 5 6 7 Descripcin Factores que contribuyen a los brotes de ETA.............. Ejemplos de patgenos de las cuatro clases................. Calendario de muestreo................................................. Muestras de alimentos analizados................................. Medio de cultivo o reactivo utilizados para la determinacin de S. aureus en alimentos.. Cepas ATCC utilizadas en el estudio. UFC por probar de acuerdo a colonias sospechosas de S. aureus. Resultados de la estandarizacin de la metodologa para determinar S. aureus por el mtodo Baird-Parker. Resultados de Staphylococcus aureus en alimentos, (UFC/g)....... Pruebas bioqumicas y tincin al Gram, del anlisis de Presencia de Staphylococcus aureus en alimentos..... Pgina 16 18 26 26 29 29 35 39 40 41

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NDICE DE FIGURAS Figura 1 2 descripcin Zona de estudio.................................................................... Alimentos a analizar de cafetera Galope ubicado en ITSON campus centro.......................................................... Esquema para la separacin de yema de huevo para enriquecimiento de agar Baird-Parker.................................. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos.......................................................................... Pgina. 25 27 32 37

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RESUMEN En casi la totalidad de los productos los nutrientes no estn libres sino combinados, y estos deben ser biodisponibles para que sean digeridos por el organismo, adems el alimento debe ser inocuo; es decir que estos no contengan sustancias peligrosas que puedan causar dao cuando sean ingeridas (Adrin y Frangne, 1990). El Instituto Tecnolgico de Sonora (ITSON) cuenta con comedores estudiantiles en sus campus que prestan sus servicios e instalaciones a alrededor de 16 mil estudiantes, los cuales en su mayora consumen alimentos preparados por el personal que en cada uno de los comedores labora. El objetivo fue estandarizar un mtodo microbiolgico en base a la NOM-115-SSA1-1994 para la deteccin y cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos. El trabajo de investigacin se desarroll en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa de la Direccin de Recursos Naturales del Instituto Tecnolgico de Sonora y en el comedor El Galope del Campus Centro. El mtodo montado y estandarizado fue el de Baird-Parker establecido en la NOM-115-SSA1-1994. Se realizaron 3 pruebas para la estandarizacin del mtodo en el periodo de septiembre a octubre del 2012, para un total de n=6 muestras del testigo positivo (Staphylococcus aureus) y negativo (Staphylococcus epidermidis); de la misma manera se realizaron 9 muestreos comprendidos en el periodo de Octubre 2012 a Febrero del 2013, para un total de n=18 muestras de alimento (n=9 muestras de lechuga y n=9 de ensalada de pollo). Para la estandarizacin del mtodo se realizaron pruebas por tres das utilizando la prueba de la coagulasa y la termonucleasa en los testigos como determinantes para establecer el correcto funcionamiento del mtodo tal como lo establece la NOM-115-SSA1-1994; los resultados mostraron que el mtodo fue debidamente estandarizado y que presenta repetitividad. El 100% de las muestras de lechuga y ensalada estudiadas resultaron negativos para la prueba de determinacin de Staphylococcus aureus. Los alimentos preparados y servidos en el comedor estudiantil Galope del ITSON Unidad Centro, son aptos para el consumo humano en lo que respecta a este patgeno de alto riesgo de intoxicacin.
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I.INTRODUCCIN. 1.1 Antecedentes En las ltimas dcadas, ha crecido la preocupacin de la poblacin por la higiene y seguridad de los alimentos; los porcentajes actuales muestran que las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) ligadas al manejo inadecuado de estos ya sea en establecimientos de servicio o en hogares se han vuelto un problema de gran importancia. Las ETAs han sido asociadas a los alimentos contaminados consumidos fuera del hogar. Sin embargo algunos estudios revelan que ocurre ms comnmente en hogares y son causados comnmente por el manejo inadecuado de los alimentos y por contaminacin cruzada (Navarro et al., 2012). Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen uno de los principales problemas de salud pblica, reconocindose cada vez ms la importancia de sus repercusiones sobre la salud, el comercio internacional de alimentos y economa. Esto particularmente en la ltima dcada, ha propiciado una nueva dimensin en los programas de inocuidad de alimentos, una revisin de las polticas de inocuidad y la implementacin de las medidas para la prevencin de enfermedades, basadas en mecanismos que impliquen una mayor y ms efectiva integracin de las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) se define como enfermedades de naturaleza txica o infecciosa causada por la ingestin de alimentos contaminados (Torres y Castillo, 2002). El manipulador de alimentos puede influir decisivamente en la salud de los consumidores, provocando una contaminacin de los alimentos que maneja, ya sea motivada por prcticas de manipulacin incorrectas o debido a una falta de higiene personal, de los utensilios, superficies, equipos, etc., empleados para el desarrollo de su trabajo. En este sentido, es necesario destacar que el mantenimiento de alimentos es la base de la prevencin de peligros, ya que de estos se pueden derivar enfermedades relacionadas con el consumo de alimentos. (Armadaet al., 2007).
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Los alimentos son de gran importancia para el ser humano, sin embargo, la prevencin y el control de los padecimientos producidos por patgenos transmitidos por los alimentos, constituye un verdadero reto para el equipo de salud, ya que en la produccin y el consumo de los alimentos se mezclan, el modo de produccin con sus diversos tipos de nutrientes, el desarrollo social en forma de tecnologa y la cultura como maneras de satisfacer las necesidades humanas (Torres y Castillo, 1999). La higiene que se tenga en la preparacin de los alimentos y en el servicio de estos es de fundamental importancia, pues muchos de los problemas de la salud (como diarreas, parsitos intestinales, dolores de estmago, mala digestin, dolores de cabeza, etc.) se le atribuye al consumo de ciertos alimentos, no son ms que efectos de la mala higiene, con que han sido preparados, servidos y consumidos. A pesar de todos los controles y medidas aplicadas a los alimentos, es imposible impedir que se sigan produciendo intoxicaciones e infecciones que tienen origen en los alimentos. Esto ocurre por acciones inadecuadas al exponer al alimento a circunstancias en las que pueden sufrir alteraciones que perjudiquen su calidad y/o su higiene alimentaria, pudiendo convertirse en un peligro para el consumidor. El mayor peligro de los alimentos es el desarrollo de los grmenes, pues tienen la facilidad de multiplicarse contaminando as los alimentos de una forma muy rpida, para ello debe verse favorecido por ciertos factores como temperatura, Humedad, Composicin del alimento, tiempo y manipulacin de estos e incluso por contaminacin cruzada; para evitar este tipo de contaminacin, es muy importante erradicar una serie de malos hbitos con la concientizacin y la formacin del manipulador (Armendriz, 2010). Los organismos locales y estatales de salud son, a menudo, los primeros en detectar el surgimiento de un brote epidmico y en iniciar una investigacin. Estos organismos de salud pblica juegan dos papeles fundamentales para mantener la

seguridad de los alimentos y detectar brotes epidmicos de enfermedades de transmisin alimentaria (FDA, 2009). La atencin sanitaria de los alimentos son un capitulo fundamental, sin embargo, la prevencin y el control de los padecimientos producidos por patgenos transmitidos por alimentos, constituye un verdadero reto para los equipos, ya que la produccin y consumo de los alimentos se mezclan (Torres y castillo, 1999). El gnero Staphylococcus actualmente tiene ms de 20 especies, muchas de ellas se han implicado como agentes casuales de enfermedades en el hombre y los animales. De estas especies, Staphylococcus aureus (S. aureus) es la causa principal de intoxicaciones alimentarias en el hombre as como de algunas infecciones extrainstestinales. S. aureus produce algunos compuestos extracelulares, las enterotoxinas son responsables de los sntomas de la

intoxicacin estafiloccicas, siendo la coagulasa y la termonucleasa ambas relacionadas con la produccin de enterotoxinas y tiles como pruebas de identificacin del microorganismo (Torres y Castillo, 1999). 1.2 Planteamiento del problema. Debido al alto nmero de personas (estudiantes , personal acadmico y administrativo) que acuden a los establecimientos expendedores de alimentos del Instituto Tecnolgico de Sonora, es necesario incrementar el nmero de indicadores microbiolgicos que se realizan en el monitoreo sanitario de los alimentos para asegurar la inocuidad de los mismos; por ello establecer especficamente la metodologa para la cuantificacin de S. aureus es de especial importancia por las implicaciones de salud que la presencia del patgeno en los alimentos puede tener. Lo anterior conlleva al siguiente cuestionamiento: Ser factible el montaje y estandarizacin de las metodologa Baird-Parker para la cuantificacin del patgeno en alimentos en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa?, la calidad sanitaria de las ensaladas crudas preparadas y servidas
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en el comedor El Galope Unidad Centro sern aptas para consumo humano respecto a este indicador sanitario? 1.3 Justificacin. En la actualidad los ritmos de vida de las personas han cambiado, por esto mismo la demanda hacia los alimentos ya preparados es an mayor, con esto ha crecido la preocupacin de la poblacin por el consumo de alimentos en buen estado, limpios y saludables. Sin embargo en algunos establecimientos como restaurantes, comedores, fondas, etc., no se cuentan con las medidas sanitarias adecuadas para la manipulacin de los alimentos, por ello han surgido enfermedades transmitidas por alimentos contaminados; actualmente el Instituto Tecnolgico de Sonora (ITSON) cuenta con comedores estudiantiles que prestan sus servicios e instalaciones a alrededor de 16 mil estudiantes, los cuales en su mayora consumen alimentos preparados por el personal que en cada uno de los comedores estudiantiles labora, por esto es de suma importancia el evaluar la calidad microbiolgica de los alimentos, para as garantizar la calidad de estos alimentos y la salud de los estudiantes. De encontrar algn problema, poder as informar a los responsables de los establecimientos, para corregir cualquier anomala que se est presentando en la preparacin de los alimentos. 1.4 Objetivos. 1.4.1 Objetivos generales. Estandarizar un mtodo microbiolgico en base a la NOM-115-SSA1-1994 para la deteccin y cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos. 1.4.2 Objetivos especficos. Montar el mtodo Baird-Parker para la identificacin y cuantificacin de S. aureus en ensaladas crudas expendidas en el comedor El Galope del ITSON Campus Centro.

Determinar la presencia de S. aureus en al menos 18 muestras de alimentos frescos (lechuga y ensaladas) procedentes del comedor El Galope con el fin de establecer su calidad sanitaria. 1.5 Hiptesis. Debido a los materiales, equipos e infraestructura con los que se cuenta en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa ubicado en el edificio 600 planta baja del ITSON Campus Centro, ser factible la estandarizacin del mtodo para el aislamiento y cuantificacin en alimentos de S. aureus.

II. MARCO TERICO

2.1 Alimento. Se entiende por alimento toda sustancia, elaborada, semielaborada o bruta, que se destina al consumo humano, incluyendo las bebidas, el chicle y cualesquiera otras sustancias que se utilicen en la fabricacin, preparacin o tratamiento de los alimentos, pero no incluye los cosmticos ni el tabaco ni las sustancias utilizadas solamente como medicamentos (FAO,1997). La alimentacin humana est constituida tanto por alimentos brutos como por productos alimentarios elaborados, los alimentos son fuentes a partir de los cuales el organismo obtiene los nutrientes. En casi la totalidad de los productos los nutrientes no estn libres sino combinados, y estos deben ser biodisponibles para que sean digeridos por el organismo, adems el alimento debe ser inocuo; es decir que estos no contengan sustancias peligrosas que puedan causar dao cuando sean ingeridas, otras de las caractersticas que debe cumplir el alimento es que sea atractivo a los sentidos para que de esta manera el consumidor lo acepte (Adrin y Frangne, 1990; Garca et al., 2002). Los alimentos constituyen la satisfaccin de una necesidad humana, el hambre, de ah que la prctica de salud pblica y la atencin sanitaria de los alimentos sea un capitulo fundamental, sin embargo, la prevencin y el control de los padecimientos producidos por patgenos trasmitidos por alimentos constituyen un verdadero reto para el equipo de salud, ya que en la produccin y en el consumo de alimentos se mezclan, el modo de produccin de sus diversos tipos de nutrientes, el desarrollo social de forma tecnolgica y la cultura como manera de satisfacer las necesidades humanas (Torres y Castillo, 2002).

2.1.1 Alimentos seguros. Es aquel que est libre de contaminacin por bacterias, virus, parsitos, sustancias qumicas o agentes fsicos externos. Un alimento seguro es llamado tambin inocuo. Con el fin de proteger la salud de la poblacin, el estado
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establece normas para controlar la calidad de los alimentos. Los alimentos contaminados pueden convertirse en los principales vehculos de incorporacin de sustancias dainas al ser humano. Por ello es necesario cuidar su calidad higinica (FAO, 2003). La poblacin en general suele pensar que un alimento seguro, es aquel que representa un riesgo cero, mientras que el fabricante es el que cree que representa un riesgo aceptable. La elaboracin de alimentos seguros es responsabilidad de cuantos intervienen en la cadena de obtencin y en la empresa alimentaria, no obstante es responsabilidad del microbilogo de alimentos y este debe conocer solo los microorganismos que ms frecuentemente se presentan en los ingredientes alimentarios, el efecto de descomposicin del alimento y de las fases del proceso que ejercen en la supervivencia de las clulas microbianas, para aconsejar convenientemente los regmenes de trabajo (procesado) ms adecuados. La produccin de alimentos seguros requiere: control de materia prima, control del diseo y del proceso del producto, buenas prcticas de higiene durante la produccin, procesado, manipulacin, distribucin, almacenado, venta, preparacin y utilizacin, un enfoque preventivo dado que es limitada la eficacia del anlisis microbiolgico del producto terminado. Por lo tanto, la produccin de alimentos seguros exige la colaboracin de todo el personal, de aqu la exigencia de diversos planes de gestin de seguridad, como las Buenas Prcticas de Higiene, Buenas Prcticas de Fabricacin, Gestin Total de Calidad y Anlisis de Peligros y Puntos Crticos que deben ponerse en marcha. La elaboracin de alimentos seguros, en toda su amplitud, forma parte del control de calidad y del aseguramiento o garanta de la calidad (Forsythe, 2003).

2.1.2 Alimentos crudos. Contienen microorganismos de forma natural, y pueden constituir una va de contaminacin de otros alimentos, especialmente los ya cocinados, si no se toman las debidas precauciones, especialmente en lo referente a los utensilios de cocina y a las manos de los manipuladores.
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Aunque prcticamente todos los alimentos se pueden contaminar, hay algunos que por sus caractersticas constituyen unos medios de cultivo ideales para el desarrollo microbiano. Son alimentos con alto contenido en nutrientes y humedad. Las carnes crudas son especialmente peligrosas en este sentido, ya que adems de contener de forma natural ms microorganismos que otros alimentos, estos se multiplican con extraordinaria rapidez si no se refrigeran de inmediato. El pescado, los huevos, la leche y derivados de todos ellos son igualmente alimentos de riesgo. Otros alimentos no son tan susceptibles de contaminarse. A este grupo pertenecen los alimentos con un alto contenido en azcares (mermelada y miel), Grasas (mantequilla), sal (salazones), as como los que contienen poco agua (legumbres, frutos secos y pastas) (Verd y Marin, 2005).

2.1.3 Alimento y sanidad. Saneamiento es el control de los factores en el ambiente que afectan la salud pblica (Torres y Castillo, 1999), y aunque los alimentos deben disfrutarse y ser saludables, a veces provocan enfermedades. Por lo tanto, la sociedad encarga a instituciones u organizaciones que definan el nivel de proteccin que debe lograrse para asegurar la salud y seguridad del pblico (ICMSF, 2002). Cuando haya un problema de seguridad alimentaria o se desea mejorar esta, la determinacin del riesgo puede describir la magnitud del problema para decidir si se acta y que acciones deberan adoptarse. Un criterio microbiolgico determina la aceptabilidad de un alimento basndose en la ausencia o presencia de un determinado nmero de microorganismos (ICMSF, 2002).

2.2 Contaminacin de alimentos. El ser humano es uno de los principales causantes de la contaminacin de los alimentos. La contaminacin generalmente se produce durante la manipulacin de los alimentos. Las manos son la principal fuente de contaminacin, porque a
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travs de ellas se pueden introducir microorganismos muy dainos para el ser humano. Un alimento contaminado es aquel que contiene microorganismos como bacterias, hongos, parsitos, virus; o toxinas producidas por los microorganismos. Un alimento tambin puede estar contaminado por la presencia de sustancias extraas (tierra. Trozos de palo, pelo) o txicas, tales como detergentes, insecticidas o productos qumicos(FAO, 2003). En la superficie de las plantas en crecimiento existe una flora microbiana tpica que se puede contaminar por el aporte de microorganismos de procedencia extraa. De igual forma, los animales poseen una flora microbiana superficial tpica ms de una flora intestinal, eliminan microorganismos en sus excreciones y secreciones, contaminndose tambin por microorganismos de procedencia extraa. Sin duda, tanto las plantas como los animales que padecen enfermedades parasitarias albergan al patgeno que producen la enfermedad. La contaminacin de los alimentos por el aire puede tener importancia tanto por razones higinicas como por razones econmicas. Los microorganismos patgenos, en especial los que producen enfermedades respiratorias, pueden ser transmitidos a los empleados por el aire, o bien pueden contaminar a los alimentos (Frazier, et. al., 2003). La contaminacin de los alimentos puede producirse por causas biolgicas y fsicas, y siempre constituye la expresin de un fenmeno no deseado que convierte al alimento en un material txico (Verd y Marin, 2005).

2.2.1 Agentes contaminantes. Se refiere a las bacterias, parsitos o virus que se encuentran en los alimentos y que son capaces de producir una enfermedad.La aparicin de la enfermedad va a depender del agente involucrado, de las defensas propias del individuo y de la dosis infectante. Esta ltima es el nmero de microorganismos presentes en el
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alimento; para algunos agentes slo basta un nmero muy pequeo para producir la enfermedad y en otros la cantidad necesaria para producir la enfermedad es muy alta. La contaminacin de los alimentos puede ser de diferente origen: biolgica, qumica o fsica:

Agentes biolgicos: bacterias y sus toxinas; parsitos; virus; insectos; plantas y animales venenosos. Agentes qumicos: plaguicidas; detergentes; metales como mercurio o plomo; medicamentos: colorantes y aditivos no autorizados. Agentes fsicos: el polvo, la tierra, palos, cualquier materia extraa. (FAO, 2003).

2.2.2 Contaminacin qumica. Los contaminantes qumicos, se pueden producir por manipulacin inadecuada o por empleo de materias primas contaminadas.Los animales se pueden contagiar por pesticidas, mediante la ingesta de forrajes con restos de estos productos o, a travs de recipientes contaminados(Equipo Vrtice, 2011). Los laboratorios de anlisis de sustancias extraas en las fbricas de elaboracin de alimentos as como en los establecimientos de restauracin y preparacin de alimentos necesitan estar informados de cualquier problema de seguridad alimentaria que se haya comunicado para que pueda investigarlo y evitar problemas en el futuro. Los consumidores se benefician de esta prevencin, ya que cualquier incidente de contaminacin no se repetir (Vaclavik, 2002).

2.2.3 Contaminacin fsica. Los peligros fsicos del suministro de los alimentos son cualquier objeto extrao encontrado en los alimentos que pueden contaminarlo. Puede ser debido a la
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recoleccin o alguna fase de elaboracin, o puede ser intrnseco al alimento, como huesos en el pescado, huesos en las frutas, cscaras de huevos e insectos o partes de insectos. Los animales o cultivos que crecen en campos abiertos estn sujetos a contaminacin fsica. Los peligros fsicos pueden llegar a los alimentos debido a varias incidencias que varan desde maquinaria defectuosa a error humano. Un directivo inteligente evita la posibilidad de contaminacin fsica 10 siguiendo las buenas prcticas de fabricacin, y usando su habilidad de observacin (Vaclavik, 2002). Cuando se habla de contaminante fsico,se refiere a todo aquello que es ajeno al alimento en si, como trozos de metal, vidrio, papel, polvo, plstico, efectos personales, insectos, etc. Y que, accidentalmente, durante la elaboracin se ha mezclado con los alimentos(Equipo Vrtice, 2011). La contaminacin fsica puede ser peligrosa para la salud del consumidor, causar traumas psicolgicos o descontentos. Se debe prevenir cualquier posibilidad de que lleguen a los alimentos objetos fsicos (Vaclavik, 2002).

2.2.3.1 Partculas de tierra y polvo. En el suelo hay microorganismos procedentes de excrementos de animales, residuos slidos, aguas residuales, etc., que pueden alcanzar fcilmente los alimentos de origen agrcola. Por ello, es importante lavar frutas y verduras antes de su preparacin. El polvo puede ser tambin un vehculo de contaminacin por microorganismos para los alimentos no protegidos, en especial cuando se trabaja en ambientes donde la limpieza de los locales no se realiza por aspiracin y no se utiliza agua con desinfectantes adecuados.

2.2.3.2 Insectos. Dentro de este grupo, son las moscas los principales vehculos de contaminacin alimentaria, ya que podran transportar microorganismos adheridos a los pelos de
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las patas, procedentes de heces fecales, basuras y otros objetos contaminados, en donde aquellas se han posado.

2.2.4 Contaminacin biolgica. Los contaminantes de tipo biolgicos son microorganismos como bacterias, virus y parsitos, que actan atacando los alimentos. Muchos alimentos (carne, huevos, pescados, crustceos, frutos secos, productos lcteos, gelatinas, pastas, etc.)son muy sensibles a los contaminantes biolgicos debido, principalmente, al alto contenido proteico de los mismos, que los convierte en una importante fuente de nutrientes para los microorganismos ya que, stos necesitan para su existencia y desarrollo sustancias nutritivas y unas condiciones favorables de humedad y temperatura. La fuente ms comn de contaminacin por bacterias es el hombre, debido a una inadecuada higiene personal. El manipulador de alimentos mostrar sntomas claros de su enfermedad pero otras veces, tendr grmenes patgenos en su organismo sin que aparezcan los sntomas. La contaminacin bacteriana es el factor que ms incide sobre los alimentos provocando la mayora de las infecciones e intoxicaciones alimentarias. Por ello, es necesario conocer la estructura y fisiologa de las bacterias, virus y parsitos (Equipo Vrtice, 2011)

2.2.5 Manipulador de alimentos. Toda persona que manipule directamente alimentos envasados o no envasados, equipo y utensilios utilizados para los alimentos, o superficies que entren en contacto con los alimentos y que se espera, por tanto, cumpla con los requerimientos de higiene de los alimentos (FAO, 2002).

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Est demostrada la relacin existente entre una inadecuada manipulacin de los alimentos y la produccin de enfermedades transmitidas a travs de estos, incidiendo de manera directa sobre la salud de la poblacin. Las medidas ms importantes que tendr que poner en prctica un manipulador son las de tipo higinica, por el elevado porcentaje de casos en que el manipulador es el responsable de estas enfermedades, por no seguir normas bsicas en su trabajo diario (Equipo vrtice, 2009).

2.2.6 Contaminacin cruzada. La contaminacin cruzada se produce cuando se manejan alimentos crudos y cocinados sin la debida separacin ni diferenciacin de utensilios (Armendriz, 2008). Este mecanismo de contaminacin es el problema ms frecuente durante la preparacin y almacenamiento de alimentos y consiste en poner en contacto materiales contaminado con alimentos listos para consumir. Este tipo de contaminacin se puede dar durante la preparacin, conservacin, transporte, almacenamiento y en el servicio de alimentos(Navarro et al., 2012). Es uno de los factores ms descuidados y difciles de corregir en los manipuladores de alimentos (Armendriz, 2008).

2.2.7 Bacterias. Las bacterias son los principales organismos implicados en las enfermedades de origen alimentario y son, por lo tanto, la principal preocupacin microbiolgica de microbilogos de las industrias procesadoras de alimentos y otros responsables de producir alimentos seguros. Las bacterias pueden causar enfermedades de origen alimentario como infecciones, intoxicaciones o infeccin medidas por toxinas (Vaclavik, 2002).
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2.2.8 Virus. Un elemento gentico que contiene RNA o DNA, que se replica en las clulas, pero que tiene un estado extracelular. Adems de las bacterias, los virus pueden ser responsables de que el suministro de alimento no sea seguro y de enfermedades de origen alimentario. Los virus no se multiplican en los alimentos, como lo hacen las bacterias pero pueden permanecer en el alimento si el cocinado es insuficiente y, posteriormente, infectar a los individuos que lo ingieran. Es posible que se produzca contaminacin de algunas zonas del alimento, por lo tanto solo enferma los individuos que consumen la porcin contaminada de los alimentos (Vaclavik, 2002).

2.2.9 Parsitos. Organismo capas de multiplicarse en un hospedador y producirle dao (Madigan, 2008). Los parsitos son microorganismos diminutos que dependen de los hospedadores vivos para vivir y alimentarse. Los productos de cerdo poco cocinados pueden contener el parsito Trichinella spiralis que provoca enfermedades sintomticas como fiebre y tencin muscular (Vaclavik, 2002).

2.3 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs). Normalmente el trmino intoxicacin alimentaria, aplicado a enfermedades producidas por microorganismos, se utiliza en un sentido muy amplio para designar tanto a las enfermedades producidas por la ingestin de toxinas elaboradas por los microorganismos, como para designar a aquellas otras debidas a la infeccin del hospedador a travs del tracto intestinal. Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAS) de origen microbiano y parasitario, son las causadas por el consumo de agua o comida contaminada por microorganismos patgenos, parsitos o sus toxinas. La contaminacin de los
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alimentos puede ser endgeno, o bien ocurrir en algn punto de su transformacin. Por lo tanto, el agente etiolgico debe existir en los animales, vegetales o medio ambiente donde se almacena, maneja o procesa alimento (Frazier y Westhoff, 2003). La ETA son el resultado de la interaccin entre un agente etiolgico de tipo biolgico, qumico o fsico y un hospedero que es susceptible. La transmisin se produce en forma primaria por la ingestin del alimento o agua que contiene el agente con capacidad de producir dao. El ambiente que rodea a los alimentos desde su origen como alimento primario hasta que llega al consumidor luego de varios procesos de transformacin ejerce una influencia decisiva para obtener un alimento inocuo, libre de contaminantes que puedan daar la salud (Torres y Castillo, 2006). Las ETAs pueden ser: Toxi-infecciones: un microorganismo se desarrolla dentro del cuerpo de la persona y produce toxinas. Intoxicaciones: son producidas por la ingestin de toxinas. Fuente: Forsythe, 2003. Las medidas de intervencin para el control y prevencin de las ETAs estn dirigidas al control de las contaminaciones, de los reservorios y de las fuentes de contaminacin. El anlisis de peligros existentes en los alimentos es la piedra angular para la prevencin de ETA durante la preparacin de los mismos. Los peligros se clasifican en biolgicos, qumicos y fsicos y su presencia en los alimentos hace que los mismos no sean inocuos (Tabla 1) (Forsythe, 2003).

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Tabla 1. Factores que contribuyen a los brotes de ETAs. Factor contribuyente Factores relativos al crecimiento microbiano Almacenamiento a temperatura ambiente Preparacin mucho antes del consumo Enfriamiento inadecuado Preparacin de cantidades muy grandes Tiempo de retencin de calor inadecuado Aprovechamiento de restos de comida Descongelacin y almacenamiento incorrectos Factores relacionados con la supervivencia microbiana Recalentamiento inadecuado Tratamiento trmico deficiente Factores relacionados con la contaminacin Alimentos procesados sin enlatar contaminados Empleados de empresas alimentarias Contaminacin cruzada Alimentos crudos contaminados Limpieza deficientes de equipo Fuentes inseguras Alimentos enlatados contaminados Fuente: Forsythe, 2003. 2.3.1 Principales enfermedades producidas por alimentos. Muchos microorganismos que causan ETAs son transferidas por va fecal-oral, esto debido a la mala higiene del personal que maneja los alimentos. Por lo tanto, conociendo esta va de contaminacin, podemos lograr su control con el uso de las buenas prcticas de higiene, el uso de adecuados sanitizantes, etc. 19 12 11 7 7 5 2 17 13 43 41 32 22 12 5 4 Porcentaje

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2.4 Patgeno. Numerosas especies de microorganismos colonizan el cuerpo de los seres humanos en grandes cantidades y rara vez producen sntomas de enfermedad, como por ejemplo las cepas benignas de la bacteria Escherichia coli que habita normalmente en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, en el caso de algunos microorganismos, como el virus de la gripe o el bacilo de la fiebre tifoidea, la infeccin habitualmente causa una enfermedad. Cualquier microorganismo con potencial para causar enfermedad se conoce con el nombre de patgeno. Esta definicin no slo incluye a los microorganismos que generalmente causan enfermedad si ingresan en el cuerpo sino tambin a los que pueden colonizarlo sin producir enfermedad durante la mayor parte del tiempo pero que causan enfermedad si las defensas corporales se debilitan o si el microorganismo accede al lugar "equivocado". Estos ltimos tipos de patgenos se conocen como patgenos oportunistas. Los patgenos pueden dividirse en cuatro clases: bacterias, virus, hongos, estos son grupos de microorganismos relacionados, y parsitos internos, que son un conjunto heterogneo de protozoos unicelulares invertebrados multicelulares (tabla 2). En el caso de algunos patgenos esto exige la eliminacin completa pero en el de otros es suficiente limitar el tamao y la localizacin de la poblacin patgena dentro del husped humano.

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Tabla 2. Ejemplos de patgenos de las cuatro clases. Tipo de patgeno Ejemplos Salmonella enteritidis Bacterias Mycobacterium tuberculosis de la viruela Virus de la gripe ( influenza) VIH Epidermophyton floccosum Candida albicans Enfermedades Intoxicacin alimentaria tuberculosis viruela gripe sida Tia Muguet, candidiasis sistmica Parsitos Typanosoma brucel Enfermedad del sueo Leishmania donovani Plasmodium falciparum Leishmaniasis Paludismo Ascariasis Esquistosomiasis

Hongos

Protozoos

Vermes Fuente: Parham, 2005

Ascaris lumbricoides Schistosoma mansoni

2.4.1 Toxiinfeccin, intoxicacin alimentaria. Desarrollo y multiplicacin de una bacteria dentro del husped con efecto patgeno debido a la liberacin y actividad de una toxina. Los niveles de afectacin tras el consumo de un alimento contaminado por un microorganismo patgeno son diversos. Lo que puede hacer la diferencia entre la tolerancia o dao a la salud es que existen diferentes niveles de susceptibilidad de enfermarse (Navarro et al., 2012).

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2.5 Staphylococcus aureus. La intoxicacin estafiloccica se encuentra dentro de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ms importantes en el mbito mundial. De todos los brotes de intoxicacin alimentaria (BIA) que se presentan, en promedio el 20% se deben al consumo de alimentos contaminados con enterotoxinas producidas por bacterias del gnero Staphylococcus y Staphylococcus aureus (Torres y Castillo, 1999). La enfermedad estafilocccica transmitida por alimentos resulta de la ingestin de enterotoxinas termoestables preformadas por una cepa toxignica de Staphylococcus aureus que se encarg de la contaminacin y desarrollo en el alimento. Generalmente ocurre en brotes, predominantemente en verano y el organismo responsable es generalmente aislado de personas involucradas en la preparacin de alimentos. (Navarro et al., 2012). principalmente por la especie

2.5.1 Caractersticas del microorganismo. El gnero Staphylococcus es un miembro de la familia Micrococcaceae y consiste en coco Gram positivo, catalasa positiva que generalmente presenta metabolismo de la glucosa oxidativo y fermentativo. Las clulas de Staphylococcus muestran un arreglo caracterstico en racimos como consecuencia del modo de divisin y algunos producen pigmentos carotenoides de color amarillo o dorado. El gnero Staphylococcus actualmente tiene ms de 20 especies, de ellas muchas se han implicado como agentes causales de enfermedades en el hombre y los animales. De estas especies, Staphylococcus aureus es la causa principal de intoxicaciones alimentarias en el hombre as como de algunas infecciones extra intestinales.(Torres y Castillo, 1999). Staphylococcus aureus produce compuestos extracelulares como coagulasa, nucleasas y lipasas, entre otras, donde las enterotoxinas son responsables de los sntomas de la intoxicacin estafiloccica, siendo la coagulasa y la termonucleasa
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ambas relacionadas con la produccin de enterotoxinas y tiles como pruebas de identificacin de microorganismos (Torres y Castillo, 1999).

2.5.1.1 Morfologa. S. aureus es un coco inmvil de 0.5 a 1 m de dimetro, que se divide en tres planos para formar grupos de clulas irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los cocos aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas. Los racimos irregulares son caractersticos de extendidos tomados de cultivos que se desarrollan en medios slidos, mientras que en otros cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en cadenas cortas. Unas pocas cepas producen una cpsula o capa de baba que incrementa la virulencia del microorganismo. S. aureus es un microorganismo Gram positivo pero las clulas viejas y los microorganismos fagocitados se tien como Gram negativos (Torres y Castillo, 1999).

2.5.2 Caractersticas de la enfermedad. La intoxicacin estafiloccica se caracteriza por nuseas, vmito, calambres abdominales y ocasionalmente diarrea sin la presencia de fiebre, adems se puede presentar malestar general y dolor de cabeza. Estos signos y sntomas pueden aparecer entre los 30 min y las 8 h despus de haber consumido el alimento pero comnmente el periodo de incubacin de esta enfermedad es de dos a cuatro horas. Esta intoxicacin no es considerada como una enfermedad grave, sin embargo, se han llegado a presentar algunas muertes; su grado de severidad va a depender de la cantidad de enterotoxina ingerida, el estado inmunolgico del individuo que la consume y de su edad, por esto no se cuenta con un dato especifico de la cantidad de enterotoxina necesaria para producir la intoxicacin aunque se han estimado cantidades que van desde los 100ng de toxina.

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Se requiere saber cules alimentos se consumieron previamente, lo que ayuda al diagnstico, ya que existen alimentos donde se enfermedad (Torres y Castillo, 1999). propicia el desarrollo del estafilococo y son los que frecuentemente se involucran en este tipo de

2.5.3 Epidemiologa. La intoxicacin estafiloccica se desconoce en la mayora de los pases aunque es una de las cuatro ETA ms importantes en trminos del nmero total de casos o brotes que ha ocasionado, aunque es alta en relacin con la causada por otros agentes conocidos como: parsitos, virus, sustancias qumicas, plantas y animales venenosos y otras bacterias como Clostridium perfringens, clostridium botulinum, Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Shigella spp., Bacillus cereus, etc., aunque en un alto porcentaje de los brotes se desconoce la identidad del agente etiolgico. Los patgenos anteriores sealados tienen una mortalidad alta, a diferencia de la intoxicacin estafiloccica donde la mortandad es baja. En Mxico la informacin disponible durante los aos 1980-1989 revela que la intoxicacin estafiloccica, la enfermedad puede ocurrir a lo lardo de todo el ao, pero se presenta con mayor frecuencia durante los meses ms calurosos (Torres y Castillo, 1999).

2.5.3.1 Fuente del microorganismo. Se encuentra principalmente en el aire, polvo, agua, seres humanos, animales, aguas negras, pisos y ropa.El hombre es la fuente ms importante de los estafilococos y es el principal reservorio. Los animales tambin los albergan y sirven como reservorios, siendo los bovinos los ms importantes. La fuente principal de Staphylococcus aureus es la nariz del humano, aunque tambin se encuentra en la piel, las manos, heridas infectadas, ombligo, perineo, quemaduras, tracto urogenital y gastrointestinal, acn, garganta, cabello, axilas y
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heces. Se encuentra en las yemas de los dedos, los que se relaciona con el hbito de tocarse la nariz, frecuentemente. Aproximada mente 15 al 35% de los adultos que albergan a estafilococo en las fosas nasales son portadores persistentes, mientras que la incidencia de portadores ocasionales es del 15 al 50% (Torres y Castillo, 1999).

2.5.4. Contaminacin a los alimentos. El hbito de tocarse con las manos, el rostro, mientras se estn elaborando productos alimenticios, incrementa el riesgo de contaminacin de alimentos con el microorganismo. El equipo contaminado tambin se ha relacionado como fuente del microorganismo; otra forma de contaminacin de los alimentos es a partir de la leche proveniente de vacas con mastitis o por ejemplo en los productos crnicos la contaminacin se puede dar desde el sacrificio de los animales ya que estos son ampliamente manipulados (Torres y Castillo, 1999).

2.5.5 Alimentos involucrados. Para que un alimento pueda ser involucrado en un brote de intoxicacin alimentaria, ste debe ser un buen medio de cultivo que permita el crecimiento del estafilococo y permanecer cierto tiempo en condiciones adecuadas de temperatura, que permitan el desarrollo y produccin de las enterotoxinas. Por ejemplo, en algunos productos, como los vegetales cocidos, el Staphylococcus aureus crece bien, ya que en productos crudos el microorganismo es inhibido por la biota normal. Existen reportes ocasionales de brotes donde se involucraron productos vegetales cocidos y papas fritas. Productos enlatados como duraznos, hongos, jamn y sardinas contaminados antes de ser sometidos al proceso de enlatado, tambin han ocasionado brotes. Alimentos fermentados elaborados a partir de carne, leche y vegetales, as como productos deshidratados y de pastelera, se han reportado como responsables de brotes.

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Los alimentos involucrados en los brotes de intoxicacin estafiloccica varan con cada pas, de tal manera que en los Estados Unidos, Inglaterra, Gales y Checoslovaquia son principalmente las carnes rojas (jamn) y las de aves (pollo y pavo); mientras que en Espaa son la mayonesa y los alimentos aderezados con ella. En Checoslovaquia, adems, los productos lcteos tambin juegan un papel importante en esta ETA, siendo responsables de casi el 38% de los brotes. En Mxico, en cambio, los alimentos principalmente involucrados son los quesos y otros derivados lcteos (29%), los pasteles rellenos de crema (16%) y la leche en polvo (14%). Los alimentos involucrados en brotes en los distintos pases, las condiciones climticas, costumbres alimenticias, etc., resaltan la importancia de llevar a cabo estudios epidemiolgicos que permitan conocer los alimentos y los factores que se involucran en la presentacin de brotes y no inferir que lo que sucede en un pas obligatoriamente se deber presentar en otro diferente(Mota y Fernndez, 2012). Entre los alimentos implicados contaminados ms frecuentemente, se encuentran: ensaladas de papas huevos, pastelera, jamn, pollo, cremas heladas (Navarro et al., 2012).

2.5.6 Factores que contribuyen a la intoxicacin. Son varios los factores que intervienen en la presentacin de brotes. En primer trmino pueden sealarse las temperaturas de conservacin, por negligencia o descuido, debido principalmente a fallas en los sistemas de refrigeracin o congelacin. Otro factor es el equipo contaminado, ste representa un peligro cuando hay deficiencias de limpieza o desinfeccin, as como los utensilios para la elaboracin de alimentos. Un factor ms se refiere a las deficiencias en la higiene personal. La mayora de estos problemas podran evitarse por parte de quienes manejan o preparan los alimentos, ya sea en una industria o lugar de elaboracin. En pases que cuentan con todos los recursos para una buena conservacin de los alimentos, as como para ofrecer la capacitacin para dar un adecuado manejo a los productos, la intoxicacin estafiloccica es una de las principales ETAs, lo
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que refleja una deficiente conservacin y manipulacin de los alimentos. Por lo anterior, es conveniente resaltar que no basta con tener los recursos materiales y econmicos, si los individuos que tienen bajo su responsabilidad la elaboracin de los alimentos no logran entender el papel relevante que juegan al tener en sus manos la salud de los consumidores (Mota y Fernndez, 2012).

2.5.7 Tratamiento. Debido a lo benigno de la enfermedad y su corta duracin, generalmente no se necesita tratamiento. Sin embargo, en casos muy severos, se requiere de hospitalizacin, a causa de la deshidratacin y vmito profuso; en estos casos la terapia incluye la recuperacin de los lquidos y electrolitos perdidos (Torres y Castillo, 1999).

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III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Zona de estudio. Las muestras de alimentos crudos se recolectaron en la institucin, especficamente en el comedor estudiantil Galope ubicado en ITSON campus centro (figura 1), para posteriormente ser analizadas en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa de la DES de Recursos Naturales del Instituto Tecnolgico de Sonora campus centro.

Ubicacin del Comedor estudiantil Galope

Figura 1. Zona de estudio.

3.2 Periodo de muestreo. Se realizaron nueve muestreos en el periodo del 22 de octubre de 2012 al 12 de febrero de 2013, como se muestra en la tabla 3:

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Tabla 3. Calendario de muestreo.

Muestreo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tabla 4. Muestras de alimento analizadas.

Fecha 22-Octubre-2012 30-Octubre-2012 06-Noviembre-2012 14-Noviembre-2012 21-Noviembre-2012 28-Noviembre-2012 04-diciembre-2012 29-Enero- 2013 12-febrero-2013

Muestra 1 2

Alimento Lechuga (L) Ensalada de pollo (E)

3.3 Toma de muestras. Para la recoleccin y transporte de muestras se siguieron las especificaciones indicadas por la Secretara de Salubridad y Asistencia, como se describe a continuacin.

3.3.1 Alimentos. La toma de muestra para alimentos se realiz en base a los lineamientos establecidos en PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. El procedimiento para la toma de muestra, depende del tipo de producto y de la finalidad del examen; en el punto 8.1.5 se establece que es necesario que el
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personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar ste. Para muestreo asptico debe utilizar: bata, cofia y cubre boca., as mismo se especifica en el procedimiento 8.1.8 para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea normalmente. Para el anlisis y la recoleccin de la muestra sern utilizados materiales como una bolsa y un contenedor de alimento no estriles (Figura 2); para esta actividad, los alimentos se deben trasladar bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 C; y deben de mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben de iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin segn la NOM-109-SSA1-1994.

Figura 2. Alimentos analizados de cafetera el Galope ubicado en ITSON Unidad

centro.

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3.4 Transporte de muestras. Las muestras recolectadas fueron transportadas en una hielera a una temperatura aproximada de 4 C al Laboratorio de Investigacin en Microbiologa del Instituto Tecnolgico de Sonora (Unidad Centro) para posteriormente realizar los anlisis correspondientes en un tiempo no mayor a 6 horas.

3.5 Anlisis microbiolgicos. Los anlisis microbiolgicos se realizan con diversos fines, por ello es muy importante considerar cules son los objetivos del anlisis, ya que este determina el tipo de anlisis (un indicador o un patgeno), el mtodo, la muestra, la interpretacin de resultados y las acciones a adoptar (ICMSF, 2002). En este apartado se describen los procedimientos que se llevaran a cabo para la realizacin del anlisis microbiolgico de S. aureus en muestras de alimentos (crudos) del comedor el Galope del Instituto Tecnolgico de Sonora Unidad Centro.

3.5.1 Gestin de materiales y reactivos. 3.5.1.1 Medios y reactivos. La NOM-115-SSA1-1994 indica los medios y reactivos que se utilizaron para la estandarizacin del mtodo, as como para la determinacin, identificacin y cuantificacin de S. aureus en alimentos. En la tabla 5 se describen los reactivos utilizados, as como marcas comerciales y nmeros de catlogo.

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Tabla 5. Medio de cultivo o reactivo utilizados para la determinacin de S. aureus en alimentos. Medio o Reactivo Caldo de soya tripticaseina. Telurito de potasio Cloruro de sodio ACS Agar Base Baird parker Infusin Cerebro Corazn Plasma coagulasa Toluidina azul O Trizma base acido desoxirribonucleico Cloruro de calcio Marca BD DIFCO Sigma- Adrich Fermont BD DIFCO BD DIFCO Remel Sigma-Aldrich Sigma Sigma Sigma-Aldrich No. catalogo 211825 SLBC5989 925301 1364745 1223285 R21051 MKBN0172V 5LBB9465V 105K7025V SLBD4254

3.5.2 Patgenos. Acorde a lo establecido en el punto 9.11 de la NOM-115-SSA1-1994, se utilizaron cepas ATCC como testigos positivo y negativo del mtodo (tabla 7). Tabla 6. Cepas ATCC utilizadas en el estudio. Cepa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis ATCC 11632 12228

Nota: cada una de las cepas se utiliz por tres generaciones, para mantener su pureza.

3.6 Procedimiento para la preparacin de medios de cultivo. 3.6.1. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en

alimentos(NOM-115-SSA1-1994).

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3.6.1.1 Medio de Baird-Parker (100 mL). Formula 95 mL Medio base (agar Baird- Parker) 1 mL Solucin de telurito de potasio 5 mL Emulsin de yema de huevo Preparacin. Cuando el medio base est a 45 C, agregar los dems ingredientes y mezclar. Colocar de 15 a 20 mL del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 has. a temperatura de 0 a 5 C. Frmula para 950 mL de agar Baird - Parker. Digerido pancretico de casena= 10.0g Extracto de res= 5.0g Extracto de levadura= 1.0g Glicina= 12.0g Piruvato de sodio= 10.0g Cloruro de litio= 5.0g Agar= 20.0g *Ajustar y/o suplementar para satisfacer los criterios de rendimiento. pH final. 6.90.1. Solucin de Telurito de potasio Formula 1 g Telurito de potasio 100 mL Agua Preparacin Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solucin puede ser almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5 C.

Solucin salina isotnica

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Formula 0.85g Cloruro de sodio 100 mL Agua Preparacin Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 C durante 15 min.

Preparacin Emulsin de yema de huevo Lavar con agua y jabn los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solucin de tintura de yodo (solucin alcohlica al 2%) o sumergirlos en solucin de cloruro mercrico (1:1000), o bien utilizando cloro al 2% o alcohol etlico desnaturalizado al 70%. Enjuagar con agua estril y secar con gasa estril. En campana de flujo laminar o en condiciones aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y completar a 90 mL con solucin salina isotnica. Verter la emulsin a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estril y agitar fuertemente para formar la emulsin; filtrar a travs de gasa. Ejemplo figura 3. Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su preparacin.

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Figura 3. Esquema para la separacin de yema de huevo para enriquecimiento de agar Baird-Parker.

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3.6.1.2 Caldo de infusin cerebro-corazn (BHI). Formula por litro. Infusin 200g= 7.7g Corazn de buey infusin= 9.8g Peptona de proteasa= 10.0g Dextrosa= 2.0g Cloruro de sodio= 5.0g Fosfato disdico= 2.5g *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. pH final: Preparacin Disolver los ingredientes en agua y calentar ligeramente si es necesario. Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121C 1. 7.4 0,2.

3.7 Preparacin de medios de cultivo para pruebas bioqumicas. 3.7.1 Plasma de conejo. Plasma de conejo (Remel, No. catalogo: REF-R21051) Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar cido etilendiaminotetractico (EDTA) en solucin al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estril en proporcin de 1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada.

3.7.2 Termonucleasa. Agar DNA azul de toluidina "O" Formulacin en gramos por 100 mL: cido desoxirribonucleico 0.03g (DNA de timo de carnero Sigma D-1501) Agar 1g Cloruro de calcio anhidro 0.01 M, 0.1 mL Cloruro de sodio 1.0 g
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Azul de toluidina "O" 0.1M, 0.3 mL (PM 305.83) Solucin reguladora de Tris 0.05 pH 9 100 mL (PM 121.14)

Preparacin. A 100 mL de solucin reguladora de tris agregar todos los reactivos excepto el azul de toluidina. El DNA disgregarlo lo mejor posible para facilitar su incorporacin. Calentar a ebullicin hasta disolver el DNA y el agar (NO SOBRECALENTAR), enfriar a 45C y adicionar el azul de toluidina, mezclar completamente y distribuir en frascos en porciones pequeas. Es recomendable que sean 4 o mltiplos de 4 ya que no es conveniente recalentar cada vez que se preparan los portaobjetos con el medio.Los frascos deben taparse con tapn de hule y parafilm. A cada portaobjetos se le debe adicionar 4 mL del medio, dejar solidificar y realizar los pocitos con una pipeta Pasteur a la que se le retira la punta hasta la altura que aproximadamente nos quede de un dimetro de 0.2 mm. Para la prueba guardar el portaobjetos en una caja de Petri con algodn hmedo para evitar que se seque el medio durante la incubacin a manera de una cmara hmeda.

3.8 Procedimiento para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. a) A partir de la muestra realizar diluciones decimales hasta 10-5 (NOM-110-SSA11994). b) Utilizando diferentes pipetas bacteriolgicas de 1 mL para cada dilucin, depositar 0.1 mL de las diluciones sobre la superficie de placas de agar BairdParker enriquecido. c) Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar con varillas de vidrio estriles acodadas, utilizando una para cada dilucin.

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d) Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido totalmente por el agar. e) Invertir las placas e incubar de 24 a 48 horas a 35C 2 C. f) Despus de 24 horas seleccionar las placas que muestren de 20 a 200 colonias circulares aisladas, contar y marcar todas aquellas que aparezcan negras y brillantes con o sin ligero borde blanco y rodeado por zona clara en el fondo del medio opaco y con un dimetro entre 1 a 3 mm. g) Incubar las placas por 24 horas ms e incluir en el cmputo las colonias nuevas que renan las caractersticas ya sealadas. h) Seleccionar la caja que contenga entre 50 a 150 colonias tpicas y sembrar el nmero de colonias de acuerdo a la Tabla 5, cada una en dos tubos con caldo infusin cerebro-corazn (uno para la prueba de coagulasa y otro para la prueba de termonucleasa), e incubarlos a 35C 2C durante 18 a 24 horas. Tabla 7. UFC por probar de acuerdo a colonias sospechosas de S. aureus. No. de colonias sospechosas en placa Menos de 50 51-100 101-150 Colonias por probar 3 5 7

i) A las cepas seleccionadas realizar un frotis y teirlo con la tcnica de Gram. j) Practicarle las pruebas de termonucleasa y coagulasa. k) Prueba de coagulasa. 1) Agregar a 0.2 mL del cultivo de caldo infusin cerebro-corazn 0.2 mL de plasma de conejo. 2) Incubar en bao de agua a 35C 2 C y observar la formacin del coagulo en intervalos de 1 hora hasta cumplir 6 horas; si no hay formacin de coagulo, observar 24 horas ms y considerar la prueba positiva si hay formacin de coagulo firme.

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l) Prueba de la termonucleasa. A la otra serie de tubos sembrados en caldo infusin cerebro-corazn practicar la prueba de la termonucleasa. 1) En un porta objetos con 3 a 4 mL de agar DNA azul de toluidina "O" se hacen orificios de 2 mm de dimetro. Para la prueba guardar el portaobjetos en una caja de Petri con algodn hmedo para evitar que se seque el medio durante la incubacin a manera de una cmara hmeda. 2) Calentar cultivos de S. aureus seleccionado en bao de agua a ebullicin durante 10 minutos. 3) Colocar una gota de cada cultivo en cada uno de los pozos e incubar a 37C en cmara hmeda durante 4 horas. Si es positiva la prueba tendr presencia de un halo color rosa alrededor de los orificios (indican hidrolisis del DNA). Si la prueba es negativa, dejar incubado hasta las 24 horas. 4) Computar el contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el nmero de colonias, la dilucin seleccionada para el recuento y el volumen inoculado. Por ejemplo: Si la dilucin seleccionada para el cmputo final es el 10-3 y se contaron 144 colonias, analizar 7 segn Tabla 1. Si de ellas resultan 5 positivas a la prueba de coagulasa y termonucleasa el clculo final ser: Clculos: 7 colonias ------------------------------- 5 positivas. 144 colonias ---------------------------------- x X= 103 colonias positivas (en la dilucin 10-3 de la placa inoculada con 0.1 mL) Redondear la cifra a dos dgitos significativos. 103 -------------------------------100 Como 0.1 mL de la dilucin 10-3 corresponde a 1 mL de la dilucin 10-4 multiplicar el nmero de colonias por la inversa de esta dilucin. 100 x 1/10-4 = 100 x 10-4 = 1,000.000 Cuenta de S. aureus: UFC/g o mL.
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Si tanto la prueba de coagulasa como de termonucleasa son negativas para todas las colonias probadas informar: Cuenta de S. aureus = menos de 100 UFC/g o mL.

Figura 4. Mtodo para la determinacin de S. aureus en alimentos.

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IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

A continuacin se presentan y discuten los resultados obtenidos en el presente estudio. 4.1 Estandarizacin del mtodo microbiolgico. Los laboratorios de anlisis trabajan con mtodos estandarizados que les permiten obtener resultados que son replicables del microorganismo a medir, de forma tal que se pueda definir la capacidad ptima de medida, y la efectividad de la tcnica, entendida sta como la incertidumbre de medida ms pequea que un laboratorio puede conseguir. Dentro de los procedimientos de calidad de un laboratorio, est por una parte el valorar la repetitividad interna y por otra contrastar sus resultados con controles positivos. La forma de evaluar este ltimo requerimiento es participando en ejercicios de intercomparacin. Los organismos de acreditacin y certificacin tanto en el mbito nacional como internacional, recomiendan la participacin en este tipo de ejercicios interlaboratorios, ya que constituyen un medio independiente por el cual se puede evaluar objetivamente y demostrar la fiabilidad y precisin de los datos obtenidos. En la tabla 6, se muestran los resultados del proceso de estandarizacin del mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos: Se corrieron muestras de tres das (alimento crudo estril) mediante el mtodo Baird-Parker establecido en la NOM-115-SSA1-1994 utilizando las cepas: Staphylococcus aureus (ATCC 11632) como testigo positivo y Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) como testigo negativo, tomado como base para la estandarizacin del mtodo la determinacin de las pruebas de la coagulasa y la termonucleasa; los resultados se observan en la tabla 8. Las muestras se inocularon antes de iniciar cada una de las corridas del estudio con 0.1 mL de las cepas antes descritas, las cuales se mantuvieron en caldo tripticasa de soya y en incubacin a 37C.
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Los resultados de la cuenta total viable de S. aureus se reportan en la tabla 6, de la misma manera se observa que el 100% de las muestras cumplen con las caractersticas establecidas en la norma en cuanto a la prueba de la coagulasa y termonucleasa. Tabla 8. Resultados de la estandarizacin de la metodologa para determinar S. aureus por el mtodo Baird-Parker.
Testigo (t) S. aureus 1 t(+) S. epidermidis t(-) S. aureus 2 t(+) S. epidermidis t(-) S. aureus 3 t(+) S. epidermidis t(-) 7 CGP 7 7 + + CGP CGP 7 7 + + CGP CGP Conteos en UFC/g 7 + + CGP

Repeticiones

Coagulasa

Termonucleasa

Tincin Gram

t (+)= testigo positivo, t (-)= testigo negativo, CGP= Cocos Gram positivo Los mtodos oficiales se requieren para asuntos legales por ello es importante contar con un mtodo estandarizado (NOM-115-SSA1-1994) para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos para verificar la inocuidad que deben tener, as como comparar sus resultados con un laboratorio acreditado o reconocido por la Secretara de Salud para realizar el monitoreo pertinente es importante ya que se garantiza con ello la validez de los resultados emitidos por el laboratorio, as como comprobar que el mtodo a estandarizar, es preciso en todas sus repeticiones.
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4.2 Resultados microbiolgicos en alimentos. 4.2.1 Cuenta total de Staphylococcus aureus en alimentos. Como se muestra en la tabla 9, en los resultados del conteo para lechuga y ensalada resultaron negativos para la prueba de determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos, sin embargo al realizar el anlisis en los alimentos, se obtuvieron colonias tpicas de el patgeno de inters, pero al realizar la pruebas bioqumicas determinantes ( termonucleasa y coagulasa), dieron negativo. Por los resultados obtenidos (ausencia de Staphylococcus aureus) podemos decir que el personal de la cafetera galope sigue las medidas de higiene necesarias para la elaboracin y conservacin de los alimentos que ah se expenden. Para el testigo positivo (Staphylococcus aureus) se obtuvo un promedio de 64,169,000,000 UFC/g, siendo el lmite superior 10,920,000,000 UFC/g y el inferior de 4,340,000,000 UFC/g, para el testigo negativo (Staphylococcus epidermidis), donde se obtuvo un promedio de 41,503,000,000 UFC/g, siendo el lmite superior 9,093,000,000 UFC/g y el inferior de 5,068,000,000 UFC/g. Tabla 9. Resultados de Staphylococcus aureus en alimentos, (UFC/g). Muestreo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 L UFC/g -100 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 E UFC/g -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 S. aureus testigo (+) UFC/g 7,973,000,000 6,601,000,000 7,861,000,000 7,441,000,000 10,920,000,000 8,127,000,000 5,222,000,000 5,684,000,000 4,340,000,000 S. epidermidis testigo (-) 6,917,166,667 6,917,166,667 6,917,166,667 7,161,000,000 9,093,000,000 7,210,000,000 6,902,000,000 6,069,000,000 5,068,000,000

UFC: Unidades Formadoras de Colonias; L: Lechuga; E: Ensalada.

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4.2.2 Resultados de pruebas bioqumicas de cepas sospechosas de Staphylococcus aureus en alimentos. Tabla 10. Pruebas bioqumicas y tincin al Gram, del anlisis de presencia de Staphylococcus aureus en alimentos. N de cepas N de cepas Muestreo analizadas T1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 7 7 7 7 7 7 7 7 7 T2 analizadas L 3 3 3 3 3 3 3 3 3 E L Coagulasa E T1 + + + + + + + + + T2 L Termonucleasa E T1 + + + + + + + + + T2 L CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN Tincin Gram E CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN CGN T1 CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP T2 CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP CGP

L: Lechuga; E: Ensalada; T1= testigo 1(Staphylococcus aureus (+)); T2= testigo 2 (Staphylococcus epidermidis (-)). CGN: Cocos Gram negativos; CGP: Cocos Gram positivos.

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Como se observa en la tabla 10, se realizaron pruebas bioqumicas a las colonias sospechosas de Staphylococcus aureus en alimentos, as mismo tincin Gram para conocer su morfologa. Segn la NOM-115-SSA1-1994, se seleccionan en placas que presenten menos de 50 colonias sospechosas, 3 colonias por probar; se seleccionan en placas que presenten ms de 150 colonias sospechosas, 7 colonias por probar, para realizar las pruebas confirmativas de Staphylococcus aureus, termonucleasa, coagulasa y tincin Gram. Para las muestras de alimentos analizadas hubo ausencia de Staphylococcus aureus, esto debido a las buenas prcticas de higiene con las que se elaboran en la cafetera. En la misma forma se inocularon cepas conocidas de Staphylococcus aureus ATCC-11632 y Staphylococcus epidermidis ATCC-12228 como testigos positivo y negativo, respectivamente.

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V. CONCLUSIONES

De acuerdo a los anlisis realizados y los resultados obtenidos se concluye lo siguiente: Se mont el mtodo Baird-Parker para la identificacin y cuantificacin de S. aureus en ensaladas crudas expendidas en el comedor El Galope del ITSON Campus Centro, con respecto a la estandarizacin del mtodo microbiolgico en base a la NOM-115-SSA1-1994 para la deteccin y cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos, en el Laboratorio de Investigacin en Microbiologa ubicado en el edificio 600 planta baja del ITSON Unidad Centro. Para los alimentos analizados el 100% de las muestras tuvieron ausencia de Staphylococcus aureus. Los alimentos preparados y servidos en el comedor Galope del ITSON Unidad Centro son aptos para el consumo humano, sin embargo debern mejorarse las condiciones sanitarias del personal que ah labora.

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VI. RECOMENDACIONES Debido a los resultados obtenidos se sugiere seguir trabajando como hasta a hora ya que los alimentos preparados en comedor Galope se encontraron en excelentes condiciones durante los periodos de muestreo, sin embargo no estn de ms las siguientes recomendaciones: Usar uas cortas y limpias Utilizar cofia y cubre boca correctamente Laborar con ropa limpia Evitar el uso de cadenas, anillos, pulseras o algn tipo de estos implementos. Cuidar la higiene personal del manipulador de los alimentos. Cuidar la adecuada preparacin y el almacenamiento, as como la prevencin de la contaminacin cruzada. Cuidar siempre las temperaturas de almacenamiento de los alimentos. Lavarse bien las manos con agua y jabn y sanitizar antes de comenzar a preparar alimentos un alimento as como despus de ir al bao. Evitar que personal que se encuentre enfermo de cualquier tipo de influenza, problemas bronquiales, estomacales y alergias, y as tenga acceso a la manipulacin y preparacin de alimentos que en el establecimiento se expiden. Concientizar al personal para que comprenda la importancia de la higiene en los alimentos as como el manejo adecuado de estos, por medio de capacitacin. Realizar pruebas interlaboratorio, para la comprobacin de resultados del mtodo. Seguir con los estudios de la calidad sanitaria de este establecimiento para continuar monitorendolo y asegurar que se estn llevando a cabo y aplicando las buenas prcticas de higiene.

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VII. BIBLIOGRAFA DE CONSULTA Armada Domnguez, L., & Ros Oliver, C. (2007). Manipulador de alimentos. La importancia de la higiene en la elaboracin y servicio de comida (2da ed.). Editorial Vigo. Armendriz Sanz, J. L. (2008). Seguridad e higiene en la manipulacin de alimentos. Madrid: Editorial Paraninfo. Caldern y Pascual, V., & Pascual Anderson, M. d. (1999). Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas (2da ed.). Madrid: Ediciones Daz de Santos. Diario Oficial de la Federacin. NOM-093-SSA1-1994, prcticas de higiene y sanidad de alimentos que se ofrecen en los establecimientos fijos.

Diario Oficial de la Federacin. NOM-109-SSA1-1994, procedimiento para toma y manejo de la muestra de los anlisis microbiolgicos. Diario Oficial de la Federacin. NOM-110-SSA1-1994, preparacin de dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Diario Oficial de la Federacin. NOM-115-SSA1-1994, Mtodo para la

determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. FAO (2003). Educacin en alimentacin y nutricin para la enseanza bsica. SantiagoChile. Recuperado en Febrero de 2013 disponible en: http://www.fao.org/docrep/014/am401s/am401s.pdf FAO (2002) Cdigo internacional recomendado de prcticas - principios generales de higiene de los alimentos. Recuperado en Febrero de 2013 disponible en: http://www.fao.org/docrep/005/y1579s/y1579s02.htm
45

FDA (2009) Informacin sobre alimentos. Lo que usted debe saber sobre la respuesta del gobierno ante los brotes epidmicos de enfermedades de transmisin alimentaria. Recuperado en Febrero de 2013 disponible en:
http://www.fda.gov/downloads/Food/ResourcesForYou/Consumers/UCM180372.pd

Forsythe, S. (2003). Alimentos seguros: Microbiologa. Madrid: Acriibia. Frazier, W., & Westhoff, D. (2003). Microbiologa de los alimentos (4ta ed.). Mxico D.F.: Interamericana S.A de C.V. Madigan, M., Martinko, J., & Parker, J. (2008). Biologa de los microorganismos (10ma ed.). Madrid: Pearson. Mataix Verd, J., & Carazo Marn, E. (2005). Nutricin para educadores (2da ed.). Madrid: Ediciones Daz de Santos.

Mota de la Garza Lydia y Fernndez Elizabeth. (2012). Intoxicacin estafiloccica por alimentos. Recuperado en Febrero de 2013, disponible en:http://www.alimentacion.org.ar/index.php?option=com_content&view=article&id=991:int
oxicacion-alimentaria-por-staphylococcus-aureus&catid=38:publicacionesespecializadas&Itemid=56

Navarro Hidalgo, V., & Torres Vitela, M. R. (2012). Manejo higinico y conservacin de alimentos en refrigeradores. Guadalajara. Parham, P. (2006). Inmunologa (2da ed.). Madrid: Mdica Panamericana. Torres Vitela Mara del refugio y Castillo Alejandro. 1999. Agentes patgenos transmitidos por alimentos, volumen I. 1ra edicin. Editorial U. de G., Guadalajara Jalisco.
46

Torres, M.R., Castillo, A. (2002). Agentes patgenos transmitidos por alimentos. Volumen II. Universidad de Guadalajara. Torres, V., & Castillo, A. (2006). Microbiologa de alimentos. Guadalajara: Smate.

Vrtice, E. (2009). Aplicacin de normas y condiciones higinico-sanitarias en restauracin. Mlaga: Editorial Vrtice. Vrtice, E. (2011). Diettica y manipulacin de alimentos. Mlaga: Editorial Vrtice.

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