UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA ESCUELA DE QUMICA BIOLGICA DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA BIOQUIMICA I DOCUMENTO

DE APOYO PRACTICA No.2 ESPECTROFOTOMETRA La espectroscopia UV-Visible estudia el fenmeno de adsorcin de la radiacin UV Visible de molculas orgnicas e inorgnicas. La regin visible, a la que es sensible el ojo humano, se localiza entre los 380 y 780 nm.

La absorcin de la radiacin ultravioleta o visible por molculas orgnicas e inorgnicas, generalmente se produce por la excitacin de los electrones de enlace, por lo tanto, la longitud de onda de los mximos de absorcin se puede relacionar con los enlaces de las especies absorbentes. Los mtodos espectroscpicos se basan en la capacidad de las sustancias de absorber (o emitir) radiacin electromagntica. stos se pueden emplear para determinar la concentracin de un reactivo o producto durante una reaccin. La figura 1 muestra los componentes bsicos de un espectrofotmetro. Espectrofotmetro Los aparatos de medida de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan Espectrofotmetros. El aparato detecta la cantidad de luz transmitida o absorbida a travs de la solucin en la celda y la compara con la que se transmite o absorbe a travs de una solucin de referencia denominada blanco. La lectura en la escala ya est convertida en absorbancia.

FIGURA 1.

Todo espectrofotmetro cuenta con los siguientes elementos:

Fuente de luz: un filamento de tungsteno que funciona mediante una fuente de alimentacin estabilizada proporcionando una radiacin de intensidad constante el tiempo suficiente para asegurar una buena reproducibilidad de las lecturas de absorbancia. Selector de longitud de onda: se trata de una sencilla red de difraccin, que permite separar la longitud de onda. Tras seleccionar la longitud de onda la radiacin pasa a travs de un controlador de luz, que consiste en una abertura en forma de V que se introduce o saca del haz para controlar la intensidad de luz que incide en la fotocelda. Celda: Que contiene a la solucin generalmente hecha de un material transparente que no absorbe la luz. Su longitud y capacidad vara segn el equipo y diseo. Las hay de paredes cilndricas o planas. Detector: a ste llega la radiacin tras pasar por un filtro y por la muestra. Se trata de un fototubo de medida. Se basa en el efecto fotoelctrico de los metales que al irradiarlos generan electrones. Escala de medida: La seal elctrica del detector una vez amplificada se registra bien en una escala analgica o en una pantalla digital que proporcionan los valores de Transmitancia y/o Absorbancia.

INTRODUCCION TEORICA

FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRA
Introduccin : La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y se basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un compuesto y su concentracin. Cuando se hace incidir luz monocromtica (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede estar en fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para formar una solucin. Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que muestra la cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagntico, es decir, a una determinada longitud de onda de la energa radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la que absorbe otro compuesto (Fig. 1)

Absorbancia (A)

Longitud de Onda (nm) Fig. 1 Espectro de absorcin de dos compuestos diferentes. El mtodo espectrofotomtrico se rige por dos leyes fundamentales : Ley de Lambert y Ley de Beer. 1.- Ley de Lambert. : Esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio homogneo, la disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida diminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente el espesor del medio absorbente (Fig. 2):

P0

B
Fig. 2. Ley de Lambert La siguiente relacin matemtica da cuenta de esta ley: P / P0 = e kb Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida b : Espesor del medio absorbente k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio. 2.- Ley de Beer : La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a travs de un medio homogneo (Fig. 3).

P0 c
Fig. 3. Ley de Beer

La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra a continuacin : P / P0 = e -kc donde : Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida c : Concentracin de la solucin k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de concentracin de la solucin, y frecuentemente, de la naturaleza del medio. Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer log P0 / P = a b c A = log P0 / P = - log T donde : a : Absortividad c : Concentracin de la solucin b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta) P/Po= T : Transmitancia A=abc

la luz incidente, de la

Los trminos absorbancia y transmitancia son definidos a continuacin Transmitancia (T) : Es la razn entre la luz monocromtica transmitida (P) por una muestra y la energa o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energa radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda. T = P / P0 = 10-abc %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razn de la luz transmitida por la muestra y la luz transmitida por un estndar arbitrario. Este estndar puede ser el liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analtico (solucin que contiene todos los componentes de la solucin problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estndar no es necesariamente 100%, es necesario especificar el estndar con el cual la muestra es comparada. Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energa radiante absorbida por una sustancia pura o en solucin. Matemticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia.T, transmitancia expresada como fraccin decimal %T, transmitancia expresada como porcentaje. A = - log T = 2 log %T Pero. T = P / P0 = 10-abc Luego A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc A = abc Esta ecuacin indica que la absorbancia es una funcin lineal de la concentracin, donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la concentracin c est expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b en centmetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ) . Luego A= bc Mediciones de transmitancia y absorbancia. Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparacin entre la muestra problema y un estndar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.

Seleccin de longitud de onda de trabajo. La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es mxima, y recibe la denominacin de Lambda mximo (max). Para seleccionar el max., se hace un espectro de absorcin o curva espectral, y que consiste en una grfica de la absorbancia de una solucin de la sustancia absorbente de concentracin adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el max. (Fig.4).

1 3 2

max = 1

En este caso

(nm)
Fig. 4 . Curva espectral
Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro electromagntico (380 a 800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las mediciones se realizan en la regin ultravioleta del espectro electromagntico (200 a 380nm).

Curva de Calibracin. Uno de los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin de una muestra problema, es el mtodo de la curva de calibracin. Esta curva de calibracin es una grfica que relaciona la concentracin de al menos cinco soluciones de estndar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda mxima ( max) (Fig. 5).

C Fig. 5. Curva de Calibracin

Una vez obtenida la grfica se determina la funcin matemtica que presenta dicha recta a travs del tratamiento estadstico de regresin de los mnimos cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentracin de un analito. La siguiente ecuacin matemtica corresponde a dicha funcin:

A=mc+n

(Ecuacin 1)

A : Absorbancia. n : Intercepto de la recta m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y el espesor b de la cubeta. 8

Luego se mide la absorbancia de la solucin problema y se interpola su valor en la grfica o se reemplaza en la ecuacin (1), para obtener el valor de concentracin del analito. La concentracin de la solucin problema debe estar comprendida en el rango de concentracin que comprende la curva de calibracin. Si la concentracin de la solucin problema es menor que la concentracin del estndar ms diluido, debe usarse el mtodo de adicin estndar, que consiste en adicionar un volumen determinado de un estndar concentrado a la solucin problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de calibracin. En el caso contrario, si la concentracin del analito es mayor que la concentracin del estndar ms concentrado la solucin problema deber ser diluida.

Amuestra

Cmuestra
Fig. 6. Interpolacin Grfica

Al hacer la curva de calibracin, se debe emplear la longitud de onda de mxima absorbancia (max.), para obtener una recta con la mxima pendiente y as tener mayor sensibilidad y precisin al hacer las mediciones. La medicin de la absorbancia de la solucin problema debe hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibracin.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alomar, D. & Fuchslocher, R. (1998). Fundamentos de la Espectroscopa de Reflectancia. Agro sur, 26(1), 88-104. Castellano, W. & Longman, W. (1997). Fisicoqumica. Chang, R. (2000). Basic principles of Spectroscopy. New York. Mc-Graw-Hill. Laidler, K. & Meiser, J. (1997). Fisicoqumica. CECSA. Levine, I. (1996). Fisicoqumica. Mc Graw Hill.