Sfilis venrea

Obtencin y transporte de las muestras clnicas y procesamiento microbiolgico para el tratamiento de una enfermedad.
Luis Gerardo Ramrez Guardado Microbiologa y Parasitologa Dr. Leopoldo Portillo Gmez Universidad de Guadalajara Centro Universitario de Ciencias de la Salud

ndice
Sfilis Venrea ......................................................................................................................................................... 1

Requisitos para la toma de la muestra .............................................. Error! Bookmark not defined.2

Material necesario para la toma de la muestra ...................................................................................... 13

Procedimiento para la toma de la muestra .............................................................................................. 14

Caracteristicas que tiene que cumplir muestra ..................................................................................... 18

Estudio microbiologico .................................................................................................................................... 19

Cultivo .................................................................................................................................................................... 20

Diagnostico microbiologico............................................................................................................................ 21

Interpretacion de los resultados .................................................................................................................. 22

Estudios inmunologicos y/o moleculares ................................................................................................ 23

Interaccion ............................................................................................................................................................ 31

Bibliografia ........................................................................................................................................................... 32

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Luis Gerardo Ramrez Guardado Microbiologa y Parasitologa Dr. Leopoldo Portillo Gmez Universidad de Guadalajara Centro Universitario de Ciencias de la Salud

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Obtencin y transporte de las muestras clnicas y procesamiento microbiolgico para el tratamiento de una enfermedad. 1.- Descripcin de la enfermedad
La sfilis es una enfermedad de transmisin sexual causada por una bacteria. Infecta el rea genital, los labios, la boca o el ano y afecta tanto a los hombres como a las mujeres. Por lo general se adquiere por contacto sexual con una persona que la tiene. Tambin puede pasar de la madre al beb durante el embarazo. La etapa temprana de la sfilis suele causar una llaga nica, pequea e indolora. Algunas veces, causa inflamacin de los ganglios linfticos cercanos. Si no se trata, generalmente causa una erupcin cutnea que no pica, frecuentemente en manos y pies. Muchas personas no notan los sntomas durante aos. Los sntomas pueden desaparecer y aparecer nuevamente. Las llagas causadas por la sfilis facilitan adquirir o contagiar el VIH durante las relaciones sexuales. Si est embarazada, la sfilis puede causar defectos congnitos o abortos. En casos raros, la sfilis causa problemas de salud serios e incluso la muerte.

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Si se detecta a tiempo, la enfermedad se cura fcilmente con antibiticos. El uso correcto de preservativos de ltex disminuye enormemente, aunque no elimina, el riesgo de adquirir y contagiarse la sfilis.

2.- Agente etiolgico

El agente etiolgico de la sfilis venrea es la bacteria Treponema pallidum, esta bacteria pertenece a la familia Spirochaetaceae. Es una espiroqueta delgada enroscada (0.1 a 0.2 x 6 a 20 m) con extremos rectos puntiagudos. En cada uno de ellos se insertan tres flagelos periplsmico. No es capaz de desarrollarse en cultivos acelulares. Se pude lograr un crecimiento limitado en clulas epiteliales de conejo, pero a replicacin es lenta (30 horas) y slo se puede mantener durante unas pocas generaciones. No puede ser cultivada in vitro pues T. pallidum no realiza el ciclo de los cidos tricarboxlicos y depende de las clulas anfitrionas para todas las purinas y pirimidinas y la mayor parte de los aminocidos. Es microaerfila, en extremo sensible a la toxicidad por el oxgeno. La secuenciacin de su genoma completo ha demostrado que carece de genes para la produccin de catalasa o superxido dismutasa, enzimas que ayudan contra especies reactivas de oxgeno. Es excesivamente delgada para ser visualizada al microscopio ptico en las muestras teidas con Gram o con Giemsa. Sin embargo, las formas mviles de T. pallidum son observables a microscopio de campo oscuro o mediante tincin con Ac especficos anti treponema marcados con colorantes fluorescentes.

3.- Mecanismos de transmisin

T. pallidum es transmitida por tres vas; sexual, materno-fetal y trasfusin sangunea. Para ser transmitida va sexual, el paciente debe de estar en el primer estadio de la enfermedad producida por T. pallidum, pues las lesiones ulcerativas que se presentan en los genitales (principalmente) contienen una gran cantidad de bacterias, fcilmente diseminables.

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La transmisin materno-fetal se da tanto durante el primer y segundo estadio de la enfermedad producida por T. pallidum. La transmisin en el primer estadio se da al momento del parto, por el contacto con mucosas y tejido infectado. La transmisin durante el segundo estadio de la enfermedad se da va placentaria-umbilical, pues es precisamente en este estadio que la infeccin comienza a diseminarse a travs de los vasos sanguneos, causando una espiroquetemia, y para esta bacteria es fcil atravesar la barrera placentaria, hacia el sistema circulatorio del producto. La transmisin por trasfusin sangunea se da igual durante el segundo estadio de la enfermedad. Una vez que la enfermedad llega al tercer estadio (Sfilis terciaria; neurosfilis tarda, cardiosfilis y enfermedad gomatosa) esta deja de ser infecciosa, y la bacteria no es transmisible.

4.- Epidemiologia
Es una enfermedad que se ha difundido por todo el mundo. La mayor incidencia se manifiesta en los jvenes de 18 a 25 aos de edad. Los grupos de alto riesgo son: prostitutas, homosexuales, marinos y, en general, cuando se practica la promiscuidad sexual. El ser humano es el nico hospedero natural de T. pallidum, y esta bacteria muere rpidamente por desecacin en el medio ambiente, o ante la accin de cualquier desinfectante. Es ms contagiosa en fases precoces de la enfermedad. En Estados Unidos es la tercera enfermedad venrea ms comn. El riesgo de contraer la enfermedad por un solo contacto sexual es de alrededor del 10%. En Mxico ha descendido la incidencia, que en 1960 era de 70 casos por cada 100,000 habitantes. Actualmente se estima que es menor de 10 por cada 100,000 pobladores, pero se debe considerar que muchos casos no son notificados a las autoridades sanitarias.

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5.- Casos reportados por la Secretaria de Salud en 2011

Por fuente de notificacin Se reportaron 2,793 casos nuevos de enfermedad de los cuales: 2,209 reportados por Secretara de Salud 374 reportados por el IMSS-Ord 20 reportados por el ISSSTE 34 reportados por el IMSS-Op 3 reportados por el DIF 3 reportados por PEMEX 13 reportados por la SEDENA 1 reportado por la SEMAR 138 reportados por otras instituciones

De estos 2,793 casos; 1,449 de los afectados fueron mujeres y los restantes 1,344 varones. Por grupos de edad
Grupo de edad 14 59 10 14 15 19 20 24 25 44 Nmero de casos 2 6 15 292 543 1, 426 Grupo de edad 45 49 50 59 60 64 65 ms Ign Nmero de casos 203 197 57 51 1

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Por mes

6.- Mecanismos de virulencia Adhesinas (TP0155, TP0483, TP0136).- Protenas que median la adhesin a las clulas epiteliales, matriz extracelular y fibronectina en la piel. Pallilisina.- Unin y degradacin de laminina y fibringeno. MMP-1.- Degrada el colgeno. TpN47.- Expresin de molculas de adhesin. Induce la produccin de IL-12, IL-1, IL-6, TNF-. TpN17.- Infiltracin de PMNs en un tejido. TpF1.- Produccin de IL-10 y TGF-. Hemolisinas.- Posiblemente asociadas a dao tisular. Hialuronidasa.- Facilita la infiltracin peri vascular.

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Capa de fibronectina.- Proteccin contra la opsonizacin y fagocitosis. Protenas de transporte.- Captan los metabolitos y nutrimentos que requiere la bacteria. 7.- Patognesis de la enfermedad T. pallidum es transmitida sexualmente a travs de microabrasiones en las membranas mucosas o la piel y entra rpidamente al torrente sanguneo para diseminarse a otros tejidos. Para iniciar la infeccin, T. pallidum se adhiere a las clulas epiteliales y a los componentes de la matriz extracelular de la piel y mucosas. Varias protenas median la adherencia, incluidas TP0155 y TP0483 las cuales se unen a la fibronectina de la matriz y a ambas formas de fibronectina soluble y en matriz, respectivamente. TP0136 tambin se une a la fibronectina humana. TP0751 es una protena que se une a laminina, protena de mayor concentracin en la membrana basal, y a fibringeno, protena que forma cogulos que sirven para contener a las bacterias y evitar su diseminacin. TP0751 tambin degrada laminina y fibringeno utilizando su regin de proteasa dependiente de zinc, mecanismo que facilita la diseminacin de T. pallidum en tejidos cercanos y torrente sanguneo. T. pallidum se replica en el sitio de inoculacin, dividindose una vez cada 30 horas, produciendo una respuesta inflamatoria local que resulta en la aparicin de un chancro indoloro 3 a 6 semanas despus de la infeccin. En cada chancro, las espiroquetas proliferantes son rodeadas por clulas del sistema inmune, como linfocitos T CD8+/CD4+, clulas plasmticas, y macrfagos, que producen IL-12 e IFN-, lo que indica una respuesta inmune sesgada por Th 1. La necrosis tisular y ulceracin ocurren por vasculitis de pequeos vasos, y el trfico de clulas del sistema inmune produce una linfadenopata indolora. Entre 3 y 8 semanas el chancro sana, indicando que la zona est libre de T. pallidum, sin embargo, para este punto la bacteria ya se ha esparcido sistemticamente a mltiples rganos y tejidos, preparando el escenario para la sfilis secundaria. T. pallidum atraviesa las estrechas uniones entre clulas endoteliales de los vasos sanguneos, infiltrndose en los espacios perivasculares donde se acumulan una gran cantidad de treponemas y clulas del sistema inmune. T. pallidum es capaz de utilizar la transcitosis para esparcirse a travs del

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endotelio. Induciendo la produccin de MMP-1 degrada el colgeno y le facilita a la bacteria la entrada y salida al torrente sanguneo, resultando en una diseminacin sistmica. Pasados 3 meses de la infeccin, los sntomas de sfilis secundaria aparecen. A pesar de que T. pallidum tiene caractersticas estructurales clsicas de bacterias Gram negativas, no tiene lipopolisacrido, un potente glucolpido pro inflamatorio, y no produce ninguna toxina conocida. Por lo tanto, la mayora de los sntomas y dao tisular relacionados a la sfilis son debido a las respuestas inmune e inflamatoria por parte del hospedero. La exposicin a T. pallidum y su lipoprotena TpN47 induce la expresin de molculas de adhesin, como ICAM-1, VCAM-1, y E-Selectina, las cuales tienen una importancia fundamental en la adhesin de clulas del sistema inmune a las paredes del endotelio vascular para la migracin hacia los sitios de infeccin. Los pacientes con sfilis secundaria presentan una respuesta inmune localizada en la piel, mediada por monocitos, macrfagos, linfocitos T coadyuvantes y citotxicos, y clulas dendrticas. Esta respuesta proinflamatoria se da por los residuos lipdicos de las mltiples lipoprotenas de T. pallidum. La interaccin de TpN47 con el TLR2 en la superficie de los macrfagos induce la produccin de IL-12. Cuando las clulas dendrticas son expuestas a T. pallidum o a TpN47 pura, liberan una gran variedad de citocinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6, IL-2 y TNF-, y expresan molculas de maduracin, incluidas CD54, CD83 y MHC II. Las lipoprotenas de T. pallidum tambin estimulan a macrfagos y clulas dendrticas por la unin a CD14, que inicia la transduccin de seales activadoras a travs del heterodmero TLR1/TLR2. La miniferritina TpF1estimula a los monocitos humanos a que liberen IL-10 y TGF-, citocinas clave que promueven la diferenciacin de clulas Treg y posiblemente permitan que T. pallidum permanezca en el hospedero por un largo periodo de tiempo. La respuesta inmune humoral produce anticuerpos que participan en la opsonizacin y en la neutralizacin/inmovilizacin mediada por complemento. Los macrfagos eliminan a T. pallidum de

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los sitios de infeccin mediante fagocitosis del organismo opsonizado, anclndose a la Fc de IgG e IgM. En esta etapa inician las manifestaciones clnicas de la neurosfilis, a pesar que es considerada un signo de la sfilis terciaria. A pesar de la respuesta inmune montada por el hospedero que resulta en la destruccin eficaz de T. pallidum de los sitios de infeccin primaria y secundaria, algunas treponemas permanecen en varios tejidos sin producir signos o sntomas clnicos, lo que se determina etapa de latencia. Es en esta etapa en la que T. pallidum puede intermitentemente invadir el torrente sanguneo e infectar a un feto en desarrollo durante el embarazo, sin embargo la transmisin por va sexual es rara. T. pallidum es capaz de evadir la respuesta inmune adaptativa por variacin antignica de las protenas bacterianas de membrana, consistente con la resistencia a la fagocitosis por parte de las treponemas que sobrevivieron a la destruccin bacteriana en la primer lesin. En algunas personas, la infeccin latente crnica puede reactivarse y producir una sfilis terciaria, la cual ocurre de aos a dcadas despus de la infeccin inicial y afecta mltiples rganos.

Nodulacin

Inoculacin
Inflamacin tisular

Ulceracin

Multiplicacin local Diseminacin sangunea

Diseminacin a tejidos Espiroquetemia

Lesin sea, articular y nerviosa

Diseminacin generalizada

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Inoculacin (Contacto sexual o transfusin sangunea).

Adhesin a clulas epiteliales y matriz extracelular, mediado por TP0155, TP0483, TP0136 y TP0751.

Multiplicacin local.

Infiltracin de los espacios perivasculares. Degradacin de colgeno por accin de MMP-1. Entrada y salida al torrente sanguneo facilitada (espiroquetemia).

Chancro duro (vasculitis, necrosis tisular y linfadenopata indolora).

Arribo de linfocitos T CD8+/CD4+, clulas plasmticas, y macrfagos. Produccin de IL-12 e IFN-. Respuesta inflamatoria local.

TpN47 induce respuesta inmune generalizada, por parte de clulas dendrticas, macrfagos. Respuesta humoral mediante IgG e IgM.

Eritema maculopapuloso, condiloma plano, fiebre, mialgia, erupcin cutnea, cefalea (Sfilis secundaria) Neurosfilis asintomtica o sintomtica

TpF1 estimula la produccin de IL-10 y TGF-, estimulando linfocitos T reguladores, deteniendo as la respuesta inmune.

Neurosfilis sintomtica (Neurosfilis temprana) Meningitis, neuritis craneal y enfermedad vasculomenngea

Sfilis terciaria Neurosfilis tarda; paresia general Enfermedad gomatosa Sfilis cardiovascular

Sfilis latente. Variacin antignica para futura evacin de la respuesta inmune adaptativa

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8.- Manifestaciones clnicas Las manifestaciones clnicas de la sfilis se dividen en tres estadios: primario, secundario y terciario. Las manifestaciones clnicas de la sfilis primaria aparecen, aproximadamente, dos semanas despus del contagio, y estas incluyen: Chancro; lcera pequea e indolora en genitales, boca, piel o recto (en el sitio de inoculacin). Este chancro sana por si mismo 3 a 6 semanas despus de su aparicin. Linfadenopata indolora; inflamacin de los ganglios linfticos cercanos al sitio de aparicin del chancro Despus la bacteria sigue duplicndose dentro del hospedero sin producir sintomatologa alguna, hasta el siguiente estadio. Los sntomas de la sfilis secundaria aparecen 6 semanas despus de la desaparicin del chancro y suelen ser: Sarpullido, usualmente en palmas de las manos y plantas de los pies. Placas mucosas (llagas) dentro o alrededor de la boca, vagina y pene. Condiloma plano en genitales o pliegues de la piel. Anorexia

Cuatro a doce meses despus del inicio de la enfermedad aparecen: Siflides; ppulas indoloras, no pruriginosas e induradas. Afectaciones viscerales; seas, hepticas, musculares, articulares, adenopatas.

Estos sntomas suelen ir acompaados de malestar general y fiebre. Las manifestaciones clnicas de la sfilis terciaria aparecen 10 a 30 aos despus de haberse contagiado y no haber recibido tratamiento debido, dependern de los rganos que estn afectados. Varan ampliamente y son difciles de diagnosticar. Los sntomas suelen ser:

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Afecciones cardiovasculares; aneurismas o enfermedad valvular. Neurosfilis; meningitis, demencia, enfermedad vasculomenngea, neuritis craneal, paresia general. Osteomielitis Enfermedad gomatosa Nevus, osteomas y hepatomas

La sfilis latente es el perodo de la enfermedad en que el agente etiolgico se encuentra en la persona infectada, sin producir sntomas ni signos clnicos. Las pruebas serolgicas, s detectan anticuerpos frente al treponema. Se denomina a la sfilis primaria y secundaria como sfilis benigna, ya que cursa con lesiones curables que no dejan cicatriz. La sfilis tarda es grave, cursa con lesiones destructivas y, aunque se pueden curar con tratamiento correcto, deja secuelas graves. 9.- Tratamiento La penicilina es el frmaco de eleccin para tratar la sfilis. El antimicrobiano: penicilina benzatina de accin prolongada se usa durante las fases iniciales de la sfilis, mientras que penicilina G se recomienda para la sfilis terciaria. En los pacientes alrgicos a la penicilina se pueden administrar como alternativas tetraciclina y doxiciclina. La penicilina constituye el nico tratamiento de la neurosfilis; por tanto, se debe desensibilizar a los pacientes alrgicos a este antibitico. Lo mismo es aplicable a las mujeres gestantes, las cuales no deben tratar con tetraciclinas. El uso de eritromicina y otros macrlidos, se ha descrito como un fracaso, por tanto no hay que emplear estos frmacos. En la sfilis primaria, el tratamiento es de 2.4 millones de unidades de penicilina benzatina 600,000 unidades de penicilina procana por da, durante 8 das.

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En la sfilis latente, emplear 2.4 millones de unidades de penicilina benzatina semanales, durante tres semanas 600,000 unidades de penicilina procana diariamente, durante dos semanas. 10.- Profilaxis No se dispone de una vacuna, pero en la actualidad se llevan investigaciones y experimentaciones con un inmungeno en conejos. La prevencin de la sfilis slo se basa en los cuidados durante las relaciones sexuales. La quimioprofilaxis aplicada despus de un contacto con alguien que se sospecha puede ser infectante no es totalmente confiable.

Requisitos para la toma de la muestra

Para el diagnstico de sfilis se realizan pruebas de microscopia o serolgicas/inmunolgicas. Antes de realizar la toma de muestra hay que considerar el estadio de avance en el que se encuentra la enfermedad y los siguientes criterios en el paciente. Si se tomar un exudado seroso del chancro con pocas clulas sanguneas o una puncin ganglionar, se solicita al paciente: No asear las heridas No haber tomado antimicrobianos previo a la toma de la muestra No es necesario el ayuno

Para toma de sangre las indicaciones son las mismas, con la excepcin que se solicita el aseo en el paciente. Si se realizar una puncin para obtener LCR, el paciente no debe de tener presin intracraneal aumentada o dficit en la coagulacin, esto por riesgo incrementado de hernia cerebral o sangrado local.

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Material necesario para la toma de la muestra

Para pruebas serolgicas e inmunolgicas es necesaria la extraccin de sangre, el material necesario es: Aguja descartable estril de calibre 18 a 21 G (Gauge) para adultos o 21 a 23 G para nios. Jeringa y tubos de plstico sin anticoagulante Torniquete Alcohol 70% y gasa Gasa seca y cinta adhesiva Guantes de ltex, guardapolvo y protectores faciales de bio-seguridad Gradilla de tubos de ensayo Descartador de agujas y de residuos biolgicos Solucin de lavandina (55 g/l Cl libre) diluida al 1:10 en agua.

Tener a la mano etiquetas para la rotulacin de los tubos. Si la muestra va a ser transferida, utilizar tubos con tapa preferentemente y evitar los de rosca. En el rtulo, indicar el nombre del paciente, la edad y el servicio en el que se encuentra. Indispensable especificar anlisis a realizarse para evitar errores. Hora de la toma de la muestra; pues hay que considerar que hay pruebas para las cuales el tiempo transcurrido entre la toma y la realizacin de la prueba es de suma importancia para la interpretacin de los resultados. Para obtener suero, se requiere adems de: Centrfuga con o sin refrigeracin (cuando se usa una refrigerada colocar la temperatura a 20- 25C.)

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Tubos, tapas para tubos y gradilla (si se derivara la muestra, utilizar de preferencia tubos con tapa a rosca). Guantes de ltex, guardapolvo y gafas protectoras. Pipetas y propipetas. Etiquetas adhesivas (son preferibles etiquetas numeradas que puedan ser transferidas del tubo con la muestra al tubo receptor del suero). Descartador

En la sospecha de neurosfilis, o afecciones del SNC se toma una muestra de LCR, para esta se necesita de: Agujas (el uso de 20 G o menor puede reducir la frecuencia de dolor de cabeza) Estilete Tres tubos y gradilla Tintura de yodo al 2% Gasa y cinta adhesiva Guantes de ltex , guardapolvo y protectores faciales de seguridad Descartadores de aguja y de residuos biolgicos

Procedimiento para la toma de la muestra

Exudado seroso: Limpiar la lesin con gasa y agua estril para retirar secreciones secas o costras; secar y frotar con gasa hasta que comience a sangrar, absorber y esperar que exude una serosidad amarilla poco o nada sanguinolenta. Tomar la gota apoyando sobre ella un portaobjeto limpio o utilizar un ansa estril para transferirla al portaobjeto y cubrir con un cubreobjetos. Extraccin de sangre:

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Rotular el tubo de recoleccin para identificar la muestra. El paciente deber sentarse y apoyar el antebrazo en el apoya brazos. Cerrar la mano en forma de puo para que las venas sean ms prominentes. Las venas mayores superficiales del antebrazo son las ms frecuentemente utilizadas. Palpar la trayectoria de la vena con el dedo ndice. Limpiar el rea de venipuncin con una gasa embebida en alcohol y dejar que se seque la zona. Aplicar un torniquete entre 7 y 9 centmetros del sitio de puncin, procurando que la estasis venosa sea mnima. Ensamblar la aguja a la jeringa y sacarle el capuchn Agarrar firmemente con el pulgar, a 3 - 5 cm por debajo de la zona de puncin para mantener tensa la piel. Con el bisel hacia arriba, realizar la puncin. Sacar el torniquete tan rpido que fluya la sangre. Llenar la jeringa a la velocidad del flujo sanguneo de 0,5 ml por segundo, desplazando el mbolo hacia fuera.

Indicar al paciente que abra la mano, colocar una gasa seca sobre el sitio de puncin, aplicar una suave presin sobre la gasa y lentamente retirar la aguja. Indicarle al paciente que se sostenga la gasa con la otra mano. Sacar la aguja con el descartador de aguja (no recolocar el capuchn). Traspasar la sangre apoyando el pico de la jeringa sobre la pared del tubo para que escurra. La velocidad debe ser similar a la de extraccin. Debe evitarse la formacin de espuma. Descartar la jeringa y colocar el tubo en la gradilla. Regresar al paciente, presionar suavemente la gasa y colocar una cinta adhesiva. Indicar al paciente que permanezca con el vendaje al menos 15 minutos.

Para obtener suero: Luego de la extraccin de sangre, dejar el tubo en posicin vertical durante 20-30 minutos como mnimo a temperatura ambiente (23 a 29C) para que se forme el cogulo.

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Cuando se haya formado, en lo posible centrifugar la muestra dentro de los 60 minutos posteriores a la extraccin a 1000-1200 r por 10 5 minutos. Si la centrfuga est equipada con porta tubos con tapa de seguridad se deben utilizar.

Si un tubo se rompe durante la centrifugacin, retirar los tubos que no estn rotos con un papel empapado de desinfectante y desinfectarlos externamente. Empapar los porta tubos con un desinfectante, retirarlos y sumergirlos en la solucin desinfectante. No intentar remover los tubos rotos del interior de los porta tubos hasta que no hayan sido sumergidos al menos por 10 minutos en solucin de lavandina 1:10. Desinfectar el interior de la centrfuga.

Al finalizar la centrifugacin si se est trabajando en una cabina de seguridad biolgica (CSB), clase I o II, destapar el tubo. Si se est trabajando en un lugar del laboratorio fuera de la CSB, usar gafas protectoras y cubrir la tapa con papel absorbente y suavemente abrir el tubo. Luego descartar el papel y la tapa.

Pipetear y transferir el suero libre de clulas a un tubo rotulado, cerrar el tubo. No pipetear con la boca. Si el tubo se encuentra contaminado superficialmente, limpiarlo con solucin de lavandina diluida 1:10.

Descartar el tubo conteniendo el cogulo. Como medida de precaucin, las muestras de suero pueden ser calentadas 20 minutos a 56C en un bao de agua sin que esto afecte los resultados de las pruebas de sfilis. Calentar pequeos volmenes de suero reduce la infectividad del HIV a niveles menores de los detectables. La modalidad de calentar el suero no debe alterar o remplazar la adherencia a las precauciones universales. El calentamiento del suero puede descartar su uso para realizarle las pruebas de deteccin de anticuerpos HIV-1.

Mientras se calientan los sueros, rotular los tubos de transferencia. Los sueros deben estar a temperatura ambiente antes del calentamiento y de realizarles las pruebas (10-30 minutos). Conservar los sueros refrigerados (2-8), si se demorara ms de 4 horas en realizarles las pruebas. Si se realizar mas all de los 5 das, congelarlos a -20C. Evitar repetidas congeladas y descongelados de los sueros.

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Plasma: El procesamiento y manejo del plasma es idntico al del suero pero con las siguientes excepciones: El plasma puede ser retenido en el tubo de recoleccin si la prueba se realizara inmediatamente. De otro modo, el plasma deber ser removido de los elementos celulares. Las muestras recolectadas con anticoagulante pueden ser centrifugadas a los pocos minutos de ser recolectada. El plasma debe ser usado dentro de las 48 hs. Guardar el plasma refrigerado (2-8C) si la demora es superior a 4 hs para hacerles las pruebas. Las muestras de plasma debern estar entre 23 y 29 C en el momento del ensayo. Las muestras de plasma no deben ser calentadas.

Puncin para LCR Mantener el paciente en forma de ovillo recostado de un lado, sobre una superficie firme con la espalda en el borde de la mesa. La espalda deber estar en plano vertical con respecto a la superficie de la mesa. Desinfectar el sitio con tintura de yodo al 2% Insertar la aguja con el estilete en L3-L4 ms abajo para los adultos. En nios pequeos el cono medular se extiende ms abajo que en los adultos; insertar la aguja con estilete en L4L5 o ms abajo. Una vez alcanzado el espacio subaracnoideo, remover el estilete. Recolectar 1-2ml de fluido en cada uno de de los tres tubos. Para reducir el riesgo de dolor de cabeza, el paciente deber permanecer en posicin decbito ventral varias horas despus de la puncin lumbar. Realizar la determinacin de protenas de acuerdo al procedimiento estndar. Recuento celular: deber ser hecho dentro de las 2hs de la puncin lumbar. Centrifugar a 1000-1200 x g por 10 o 5 minutos y transferir a un tubo limpio y rotulado.

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Si se demorar ms de 4 horas en realizar las pruebas, conservar los LCRs refrigerados (28). Si se realizaran mas all de los 5 das, congelarlos a -20C. Evitar congelados y descongelados repetidos de los LCRs.

Las muestras debern estar a temperatura ambiente, entre 23 a 29C en el momento de la prueba. No calentar el LCR antes del ensayo

Caractersticas que tiene que cumplir la muestra

Las muestras para microscopa deben de ser tomadas directamente de la lesin cutnea, y la secrecin obtenida no debe de estar mezclada con sangre. Criterio de aceptacin de muestras de suero y plasma: Para que una muestra sea aceptada no deber contener partculas que interfieran en la lectura de los resultados Las muestras excesivamente hemolisadas, contaminadas con bacterias, quilosas o turbias, son inadecuadas para los ensayos. Una muestra est demasiado contaminada cuando al colocar un papel impreso por detrs del tubo, no se puede leer a travs de l. No todas las muestras inadecuadas debern ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicrselo al mdico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden mdica, entonces deber ser informada la condicin de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretacin de los resultados. Criterio de aceptacin de muestras de LCR Para que una muestra de LCR sea aceptada no deber contener partculas que interfieran en la lectura de los resultados. Para la prueba de VDRL-LCR, son adecuadas las muestras de LCR con trazas de sangre (> 0,8 L de sangre /1ml de LCR), en cambio son inadecuadas para los otros ensayos.

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Son inadecuadas para la VDRL-LCR las muestras ligeramente rojas (rosa) (> 3 L de sangre/1ml de LCR). No todas las muestras inadecuadas debern ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicrselo al mdico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden mdica, entonces deber informarse la condicin de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretacin de los resultados.

Los sueros pueden conservarse hasta una semana en refrigerador (2 a 8 C), el plasma puede emplearse solo hasta 24 horas despus de la extraccin. Los estudios de microscopia deben de realizarse inmediatamente pues las treponemas no resisten al traslado, y los cuerpos inmviles pueden ser confundidos con restos tisulares al momento de la observacin. El momento ideal para la toma de sangre es una vez que aparece el eritema generalizado, pues es indici que las treponemas ya estn o estuvieron en sangre, permitiendo as la deteccin de anticuerpos especficos. La puncin para LCR se realiza en personas que han presentado sntomas de sfilis secundaria para descartar afeccin de SNC, o en aquellos pacientes que ya presentan el dao, para diagnosticar neurosfilis.

Estudio microbiolgico
Dado que T. pallidum es demasiado delgado para visualizarlo con microscopa ptica, se debe de emplear la microscopa de campo oscuro o tcnicas especiales de tincin fluorescente. El diagnstico de sfilis primaria o secundaria se puede hacer rpidamente durante el examen con un microscopio de campo oscuro de los exudados de las lesiones cutneas. Esta prueba slo es fiable cuando el material clnico con espiroquetas que se mueven activamente se examina de manera inmediata por un especialista en microscopia con experiencia.

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No se debe examinar el material recogido de las muestras bucales y rectales debido a su contaminacin con espiroquetas bucales no patgenas. Debido a las limitaciones de la microscopa de campo oscuro, una prueba de mayor utilidad es la prueba de anticuerpos fluorescentes directos. Se utilizan anticuerpos treponmicos marcados con fluorescena para teir las bacterias. Se emplean un reactivo de anticuerpos monoclonales especfico para los treponemas patgenos, de forma que se puedan valorar las muestras rectales y orales. Las espiroquetas inmviles se tien tambin, de forma que no es preciso estudiar las muestras nada ms obtenerlas.

Cultivos
No se debe tratar de cultivar T. pallidum en condiciones in vitro debido a la incapacidad del microorganismo de crecer en cultivos artificiales.

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Diagnostico microbiolgico
Paciente posiblemente infectado Recoleccin de la secrecin de las lesiones Anlisis serolgico o inmunolgico para descartar sfilis

Presenta chancro o lesiones cutneas?

No

Microscopa a campo oscuro R E P E T I R 2 V E C E S

AFD

No S

Treponemas mviles?

Se observan, por inmunofluorescencia directa, treponemas?

Pruebas no treponmicas

An negativo?

No

Positiva

Negativa

S No Pruebas treponmicas

Positiva

Negativa

Sfilis venrea

No es Sfilis

Falso Positivo

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Interpretacin de los resultados

Microscopa de Campo Oscuro El T. pallidum presenta 8-14 espiras indeformables, es de movilidad lenta, se identifica como un espiral delgado, rgido y con 3 tipos de movimientos: rotacin sobre su eje (como un tirabuzn), flexin en el centro y traslacin. En los chancros recientes suelen verse numerosos treponemas en el preparado, estos disminuyen o desaparecen al envejecer la lesin. Si el primer portaobjeto fuera negativo, insistir con 2 tomas ms. Interpretacin: la demostracin de treponemas con morfologa y motilidad caractersticas del T. pallidum constituye un diagnstico positivo de sfilis en cualesquiera de sus fases, independientemente del resultado de la reaccin serolgica. La imposibilidad de encontrar la bacteria no excluye un diagnstico de sfilis. Anticuerpos fluorescentes directos Desparramar en un portaobjeto formando un crculo de 1 cm de ancho, aproximadamente 10 l del material y secar al aire. Si es posible preparar 4 portaobjetos de cada espcimen. Fijar los extendidos en acetona por 10 min. o con metanol 100 % por 10 seg. o con calor suave. Cubrir cada extendido con conjugado diluido (aprox. 30 l), y colocar en cmara hmeda a 35- 37 C por 30 min. Nota: con el anticuerpo monoclonal, adicionar azul de Evans que puede prepararse como una solucin al 0,05 % en PBS. Lavar los extendidos con PBS, y cubrir con PBS por 10 min. Hacer un lavado final con agua destilada. Secar con papel de filtro, colocar una gota de lquido de montaje y colocar un cubreobjetos. Colocar los portaobjetos en una cmara oscura y leer entre las 4 horas.

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Examinar en microscopio de fluorescencia con objetivo de 40X y con un objetivo de inmersin de 100X para confirmacin.

Criterio

de

informe:

Se

observaron

por

inmunofluorescencia

directa,

treponemas

inmunolgicamente especficos para T. pallidum.

Estudios inmunolgicos y/o moleculares

VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) Es una reaccin de floculacin, donde el antgeno utilizado est compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponmica mide anticuerpos antilipdicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el husped en respuesta al material lipdico liberado de las clulas husped daadas en la infeccin por T. pallidum y material lipdico de la superficie celular treponmica. VDRL CUALITATIVA, EN SUERO En un anillo de 14 mm de la placa, depositar con pipeta 50 l de suero calentado. Aadir 1 gota (1/60 de ml) de suspensin de antgeno (previamente resuspendida) sobre cada suero, con una aguja no descartable calibrada sin bisel de calibre 18. Rotar las placas durante 4 minutos a 180 +/- 2 rpm sobre un rotador mecnico. Leer la reaccin al microscopio con ocular de 10X y objetivo de 10X. Informar el resultado como: o REACTIVO: formacin de flculos medianos o grandes. o DBIL REACTIVO: pequeos flculos. o NO REACTIVO: ausencia de floculacin o ligeramente rugoso.

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VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO Todos los sueros que produzcan resultado reactivo, dbil reactivo o no reactivo ligeramente rugoso en la reaccin de VDRL en placa, deben analizarse de nuevo cuantitativamente hasta un ttulo en dilucin final. Las diluciones de suero que deben analizarse son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. En casos especiales continuar hasta 1:256. Para cada muestra a ser testada, colocar 50 l de NaCl al 0,9 % en los crculos 2 a 5. Colocar 50 l del suero a testar en los crculos 1 y 2. Mezclar la solucin salina y el suero en el crculo 2 utilizando la pipeta automtica, por aspiracin y eliminacin, 8 veces. Evitar la formacin de burbujas. Transferir 50 l del crculo 2 (1:2) al crculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 3 (1:4) al crculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 4 (1:8) al crculo 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 l. Resuspender suavemente la suspensin antignica. Sosteniendo el frasco del antgeno en posicin vertical, dispensar 1 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (1/60 ml) de la suspensin antignica dentro de cada crculo de prueba con una aguja no descartable sin bisel de calibre 18. Rotar 4 minutos a 180 +/- 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. Anotar los resultados en trminos de la mayor dilucin de suero que produzca un resultado reactivo Si la ms alta dilucin probada es reactiva, proceder como sigue: o Preparar una dilucin de la muestra por adicin de 100 l del suero a 1,5 ml de NaCl al 0,9 %. Mezclar. o Colocar 50 l de la solucin de NaCl 0,9 % en los crculos 2, 3, 4 y 5 de la placa. o Colocar 50 l de la dilucin en los crculos 1 y 2. o Con la misma pipeta, realizar diluciones seriadas dobles a partir del crculo 2 y completar la prueba como se describi antes en los pasos 3 a 6.
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o Leer los resultados como se describi previamente. VDRL CUALITATIVA CON LCR En una concavidad de la placa de aglutinacin depositar 50 l de LCR con pipeta automtica. Aadir una gota (10 l) de suspensin de antgeno sensibilizada con una aguja de calibre 21 o 22. Agitar la placa durante 8 minutos a 180 +/- 2 rpm en un rotador automtico. Leer la reaccin al microscopio con ocular y objetivo de 10X. Informar el resultado como: o REACTIVO: flculos definidos de cualquier grado. o NO REACTIVO: Sin flculos o muy ligera rugosidad. VDRL CUANTITATIVA CON LCR Se practican reacciones cuantitativas con todos los LCR que resulten Reactivos en la reaccin cualitativa. Para cada muestra a ser testada, colocar 50 l de NaCl al 0,9 % en los crculos 2 a 5. Colocar 50 l del LCR a testar en los crculos 1 y 2. Mezclar la solucin salina y el suero en el crculo 2 utilizando la pipeta automtica, por aspiracin y eliminacin, 8 veces. Evitar la formacin de burbujas. Transferir 50 l del crculo 2 (1:2) al crculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 3 (1:4) al crculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 l del crculo 4 (1:8) al 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 l. Resuspender suavemente la suspensin antignica. Sosteniendo el frasco del antgeno en posicin vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (10 l) de la suspensin antignica dentro de cada crculo de testeo con una aguja de calibre 21 22.

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Rotar 8 minutos a 180 +/- 2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. Anotar los resultados en trminos de la mayor dilucin de LCR que produzca un resultado reactivo.

A causa del antgeno utilizado, esta prueba reacciona frente a otras patologas: colagenopatas, parasitosis, drogadiccin o en determinadas condiciones fisiolgicas como embarazo, vejez, etc. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad. UNHEATED SERUM REAGIN (USR, PRUEBA DE SUERO NO CALENTADO) La USR es una prueba microscpica, no-treponmica y de floculacin en placa. El antgeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crnicas. La prueba de micro floculacin USR usa una suspensin de antgeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscpicamente y es rpido y fcil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensin antignica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente. Interpretacin de los Resultados: La prueba de USR es una gran ayuda en el diagnstico de sfilis. Para arribar al diagnostico definitivo de sfilis, el profesional combina los resultados de la USR con otras pruebas serolgicas, exmenes de campo oscuro, signos y sntomas clnicos y factores de riesgo. Sin alguna otro soporte para el diagnostico de sfilis, un resultado de USR reactivo, puede deberse a causas que no correspondan con una infeccin por treponema patgeno. El valor predictivo de una USR en el diagnstico de sfilis se incrementa cuando se combina con una prueba treponmica reactiva.

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La prueba reactiva puede sugerir infeccin pasada o presente con Treponema patgeno aunque tambin podra ser una reaccin falso positiva. Las reacciones falso positivas pueden deberse a un error de laboratorio como as tambin a anticuerpos sricos que no estn relacionados con Treponemas patgenos. Los errores tcnicos son detectados por la prueba USR no reactiva sobre una segunda muestra srica. Un resultado reactivo de USR debido a infeccin no relacionada u otros factores, es identificada por los resultados de una prueba treponmica no reactiva simultnea.

La prueba USR no reactiva sin evidencia clnica de sfilis, puede sugerir una infeccin sifiltica pasada, infeccin con tratamiento efectivo u ocasionalmente, una infeccin de larga evolucin. Una prueba no reactiva USR con evidencia clnica de sfilis puede deberse a sfilis primaria temprana; sfilis secundaria, como resultado de una reaccin de prozona; y a algunos casos de sfilis tarda. Si se sospecha reaccin de prozona, debera repetirse la prueba con diluciones del suero del paciente 1:16 antes de determinar que la muestra de suero es no reactiva. Una prueba USR no reactiva no excluye una sfilis en perodo de incubacin.

Cuando se realiza la prueba USR cuantitativa en pacientes con sfilis, una subida de cuatro veces el ttulo (1:4 a 1:16) en una muestra seriada puede sugerir una infeccin, una reinfeccin o un fallo de tratamiento; una disminucin de 4 veces el ttulo (1:64 a 1:16) despus del tratamiento para sfilis temprana (estadio primario o secundario), usualmente sugiere que la terapia fue adecuada.

Todos los resultados de USR cualitativa reactivos, deberan ser cuantificados hasta un punto final y su ttulo informado. De forma infrecuente, se pueden observar ttulos altos de USR en pacientes con coinfeccin por HIV-1 y altos ttulos falsos positivos en pacientes con linfomas.

OTRAS PRUEBAS NO TREPONMICAS Con la excepcin del antgeno de VDRL, los antgenos de las pruebas no treponmicas estn estabilizados por el agregado de sal disdica de EDTA, adems de cloruro de colina para eliminar la necesidad de inactivar el suero por calentamiento. Las pruebas no treponmicas se dividen en procedimientos microscpicos y macroscpicos.

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Microscpicos VDRL (venereal disease research laboratory) USR (unheated serum reagin)

Los procedimientos ya han sido descritos anteriormente. Macroscpicos RPR (rapid plasma reagin) o En esta prueba, se le agregan partculas de carbn al antgeno para facilitar la visualizacin de la floculacin. TRUST (toluidine red unheated serum test) o Esta prueba difiere de la anterior en que se agregan partculas de pintura pigmentada al antgeno. En ambas pruebas, las partculas quedan atrapadas en el complejo antgeno-anticuerpo formado con el suero. Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponmicas

Sensibilidad (%) por estadio de sfilis no tratada (rango) Especificidad Prueba Primaria VDRL RPR USR TRUST 78 (74-87) 86 (77-99) 80 (72-88) 85 (77-86) Secundaria 100 100 100 100 Latente 96 (88-100) 98 (95-100) 95 (88-100) 98 (95-100) No-sfilis Tarda % (rango) 98 (96-99) 98 (93-99) 99 99 (98-99

71 (34-94) 73 -

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MHA-TP Valoracin cualitativa: Colocar 25 l de cada suero de prueba absorbido en dos celdillas contiguas de la placa de micro hemaglutinacin (96 hoyos fondo en U). Con una pipeta automtica aadir 75 l de la dilucin de trabajo de clulas sensibilizadas (antgeno) a cada celdilla de las hileras A, C, E y G (reaccin de suero absorbido). Aadir 75 l de la dilucin de trabajo de clulas no sensibilizadas a cada una de las celdillas de las hileras B, D, F y H (suero control absorbido). La dilucin srica final en cada celdilla de prueba y control es de 1:80. Preparacin de sueros control Reactivos y No Reactivos: Preparacin de los reactivos control: Agitar suavemente la bandeja y cubrir con una bandeja vaca. Incubar la bandeja a temperatura ambiente durante 4 horas, por lo menos. El perodo de incubacin puede extenderse toda la noche. Hacer la lectura de las caractersticas de sedimentacin de los glbulos rojos.

Criterio de Informe: REACTIVO: Capa celular lisa que cubre todo el fondo de la celdilla o un rea menor de la celdilla. NO REACTIVO: Fondo compacto bien definido en el centro de la celdilla. TP-PA El mtodo utiliza como soporte partculas de gelatina sensibilizadas con Treponema pallidum patgeno. El principio de la reaccin se basa en que las partculas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos contra TP en suero/plasma humano.

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Interpretacin de los resultados: Colocar suavemente la micro placa sobre un lector de placa, comparar los patrones de aglutinacin con los de los reactivos control e interpretar segn el siguiente criterio: Patrn de aglutinacin Partculas concentradas en forma de botn en el centro del hoyo con un suave crculo marginal externo Partculas concentradas en forma de anillo compacto con un contorno externo redondeado y liso Anillo grande definido con un margen externo desparejo y aglutinacin perifrica Partculas aglutinadas extendidas cubriendo el fondo del hoyo uniformemente (++) Reactivo (+) Reactivo () No concluyente Lectura (-) Interpretacin No reactivo

FTA-Abs Es una tcnica de inmunofluorescencia indirecta utilizada como ensayo confirmatorio para sfilis. El suero del paciente, el cual es diludo1:5 en sorbente (un extracto de cultivo de Treponema phagedenis, Treponema reiter), es colocado sobre un crculo de una placa que contiene fijado T. pallidum subespecie pallidum. Si el suero del paciente contiene anticuerpos anti T. pallidum - IgG e IgMestos se unirn a los treponemas. A continuacin se agrega un anti gamma humana marcada con isocianato de fluorescena que se unirn a estos anticuerpos y como resultado se observar, con microscopa de fluorescencia, espiroquetas con morfologa tpica fluorescente de color verde limn. Interpretacin de los resultados: El ensayo de FTA-Abs no debe utilizarse como un procedimiento de tamizaje. Su mayor valor es distinguir un verdadero positivo de una prueba no treponmica (VDRL, USR, RPR, TRUST), de un resultado falso positivo. Tambin permite establecer el diagnstico de sfilis latente o tarda.

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Una prueba de FTA-Abs reactiva: Confirma la reactividad de una prueba no treponmica utilizada como primera prueba para sfilis. Sugiere infeccin actual o pasada con treponemas patognicos. Tambin puede apoyar el diagnstico de sfilis tarda o latente tarda, en aquella pequea proporcin de casos donde las pruebas no treponmicas ya son negativas, pero se sospecha la infeccin por la presentacin clnica o por una historia consecuente con sfilis. Un resultado no reactivo de FTA-Abs sugiere que un resultado reactivo de un ensayo no treponmico es una falsa reaccin positiva.

Interaccin

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Bibliografa
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