Вы находитесь на странице: 1из 111

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

SEGUNDA SECCION SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL


NORMA Oficial Mexicana NOM-056-ZOO-1 5, E!"ecificaci#ne! $%cnica! "a&a la! "&'e(a! )ia*n+!$ica! ,'e &ealicen l#! la(#&a$#&i#! )e "&'e(a! a"&#(a)#! en -a$e&ia .##!ani$a&ia/ Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural. N! MA !"#$#A% ME&#$ANA N!M-'()-*!!-+,,(, ES-E$#"#$A$#!NES .E$N#$AS -A A %AS - UE/AS D#AGN!S.#$AS 0UE EA%#$EN %!S %A/! A.! #!S DE - UE/AS A- !/AD!S EN MA.E #A *!!SAN#.A #A. 1! GE M! EN! $!%%AD!, Director General 1urdico de la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, con 2undamento en los artculos 3( 2racci4n #5 de la %ey !rg6nica de la Administraci4n -78lica "ederal, 9o. 2racciones #, ### y 5, +: 2racci4n 5###, +3 y +) de la %ey "ederal de Sanidad Animal; +o., 3< 2racci4n ##, 9' 2racciones ### y &#, 9+ y 9= de la %ey "ederal so8re Metrologa y Normali>aci4n; +: 2racciones &&#& y &&& del eglamento #nterior de esta De?endencia, y CONSIDERANDO 0ue es atri8uci4n de la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, 2omentar la ?roducci4n ?ecuaria mediante la a?licaci4n de las medidas >oosanitarias tendientes a ?re@enir, controlar y erradicar en2ermedades y ?lagas de los animales, con la 2inalidad de ?roteger la salud de Astos y la del Bom8re. 0ue los ser@icios de diagn4stico que reali>an los la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria, contri8uyen a resguardar la reali>aci4n de los ?rogramas sanitarios. 0ue las ?rue8as diagn4sticas que reali>an los la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria, de8en estar de8idamente reguladas con la 2inalidad de ?ro?orcionar a los usuarios un ser@icio de calidad. 0ue se requiere Bomologar los ?rocedimientos tAcnicos de las ?rue8as diagn4sticas que reali>an los la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria a 2in de que garanticen su re?eti8ilidad y re?roduci8ilidad. 0ue ?ara alcan>ar los o8Ceti@os seDalados en los ?6rra2os anteriores, con 2ecBa +3 de octu8re de +,,= se ?u8lic4 en el Diario Oficial de la Federacin , el -royecto de Norma !2icial Mexicana N!M-'()-*!!+,,(, Es?eci2icaciones tAcnicas ?ara las ?rue8as diagn4sticas que realicen los la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria, iniciando con ello el tr6mite a que se re2iere la %ey "ederal so8re Metrologa y Normali>aci4n; ra>4n ?or la cual, con 2ecBa + de Culio de +,,< se ?u8licaron las res?uestas a los comentarios reci8idos en relaci4n a dicBo ?royecto. 0ue en @irtud del resultado del ?rocedimiento legal antes indicado, se modi2icaron los di@ersos ?untos que resultaron ?rocedentes y ?or lo cual, se ex?ide la ?resente Norma !2icial Mexicana N!M-'()-*!!-+,,(, Es?eci2icaciones tAcnicas ?ara las ?rue8as diagn4sticas que realicen los la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. INDICE +.:.3.9.(.).!8Ceti@o y cam?o de a?licaci4n e2erencias De2iniciones y a8re@iaturas Dis?osiciones generales #denti2icaci4n de a8eCas a2ricanas 5arroasis de las a8eCas

(Primera Seccin) =.<.,.+'.++.+:.+3.+9.+(.+).+=.+<.En2ermedad de NeEcastle #n2luen>a a@iar Salmonelosis a@iar

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Diagn4stico taxon4mico de garra?atas /rucelosis 8o@ina y ca?rina a8ia .u8erculosis 8o@ina En2ermedad de AuCes>Fy "ie8re ?orcina cl6sica Sanciones $oncordancia con normas internacionales Dis?osiciones transitorias

1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1. %a ?resente Norma es de o8ser@ancia en todo el territorio nacional y tiene ?or o8Ceto esta8lecer las es?eci2icaciones tAcnicas de las ?rue8as diagn4sticas que de8en o8ser@ar los la8oratorios de ?rue8as en materia >oosanitaria que sean a?ro8ados ?or la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural. 1. . %a @igilancia del cum?limiento de esta Norma corres?onde a la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural y a los go8iernos de los estados en el 6m8ito de sus res?ecti@as circunscri?ciones territoriales, de con2ormidad con los acuerdos que se suscri8an. 1.!. %a a?licaci4n de las dis?osiciones ?re@istas en esta Norma com?ete a la Direcci4n General de Salud Animal, as como a las delegaciones estatales de la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, en el 6m8ito de sus res?ecti@as atri8uciones y circunscri?ciones territoriales. . Referencia" -ara la correcta a?licaci4n de esta Norma se de8en consultar las siguientes normas o2iciales mexicanas: N!M-''+-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la 5arroasis de las A8eCas. N!M-'':-*!!-+,,9, Acti@idades tAcnicas y o?erati@as a?lica8les al ?rograma nacional ?ara el control de la a8eCa a2ricana. N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. N!M-''(-*!!-+,,3, $am?aDa Nacional contra la Salmonelosis A@iar. N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. N!M-'+3-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de NeEcastle, ?resentaci4n @elogAnica. N!M-'+,-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. N!M-'3+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la .u8erculosis /o@ina G Mycobacterium bovisH. N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los Animales.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

N!M-'99-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la #n2luen>a A@iar. N!M-'++-SSA:-+,,3, Norma !2icial Mexicana ?ara la -re@enci4n y $ontrol de la !. Definicione" y abreviat#ra" -ara e2ectos de la ?resente Norma se entiende ?or: !.1. Abeja$ insecto Bimen4?tero Apis mellifera s?. !. . Abeja africani%ada$ es el insecto conocido como Apis mellifera en cualquier 2orma de desarrollo y que incluye caractersticas genAticas de las es?ecies a2ricana y euro?ea. !.!. Abeja obrera$ a8eCa Bem8ra re?roducti@amente incom?leta. !.&. Abeja reina$ es la a8eCa Bem8ra sexualmente desarrollada, cuya 2unci4n ?rinci?al es de?ositar Bue@os 2Artiles en las celdas del ?anal y regir la @ida de la colonia. !.'. Ai"lamiento viral$ ?rue8a diagn4stica reali>ada ?or un la8oratorio a?ro8ado ?ara la $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de NeEcastle, consiste en la inoculaci4n de muestras ?rocedentes de a@es en em8ri4n de ?ollo, ?ara el aislamiento e identi2icaci4n del @irus de la en2ermedad de NeEcastle. !.(. Alojamiento para animale" en proce"o de pr#eba"$ local dedicado exclusi@amente ?ara la ?ermanencia tem?oral de animales de la8oratorio u otras es?ecies animales em?leados en desarrollo de ?rue8as yIo an6lisis, el cual de8e cum?lir con los requisitos necesarios ?ara un trato Bumanitario. !.). An*li"i"$ o?eraci4n tAcnica que consiste en la determinaci4n de una o @arias caractersticas de un ?roducto, ?roceso o ser@icio, con 8ase en un ?rocedimiento es?ec2ico. !.+. Anapla"mo"i"$ en2ermedad in2ecciosa no contagiosa del ganado, caracteri>ada ?or anemia ?rogresi@a, 2ie8re e ictericia y en ocasiones a8ortos y muerte en los animales, ocasionada ?or Anaplasma marginale, ricFettsia que es transmitida ?or artr4?odos como moscas, mosquitos, t68anos, garra?atas, o 8ien, ?or o8Cetos contaminados como instrumental de ciruga y aguCas. !.,. Antic#erpo"$ son inmunoglo8ulinas 2ormadas en res?uesta a la introducci4n de sustancias que, una @e> dentro del organismo, son reconocidas ?or Aste como ex4genas. Su ?ro?iedad caracterstica es que se cam8ian en condiciones 2isiol4gicas, con la sustancia que induCo su 2ormaci4n. !.1-. Ant./eno$ sustancia que ?uede inducir una res?uesta inmunitaria. !.11. Ant./eno 0 polivalente$ ?roducto 8iol4gico constatado y autori>ado ?or la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, utili>ado ?ara la detecci4n serol4gica de a@es ?ortadoras de -ulorosis GS. pullorumH y .i2oidea A@iar G S. gallinarumH a ni@el de cam?o, com?uesto ?or las siguientes ce?as: ce?a intermedia - 9 ce?a est6ndar - ++ ce?a @ariante - == ce?a @ariante - =, ce?a @ariante - :), !.1 . Apiario$ es el conCunto de colmenas instaladas en un lugar determinado. !.1!. A1S1$ ?rue8a de aglutinaci4n r6?ida en ?laca Gcon sangre com?letaH ?ara S. pullorum y S. gallinarum. !.1&. 2abe"io"i"$ en2ermedad ?arasitaria del ganado causada ?or Babesia bovis y Babesia bigemina, trasmitida ?or garra?atas del gAnero Boophilus, que in2ecta a los eritrocitos, mani2estada ?or anemia, a8ia.

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

ocasionalmente Bemoglo8inuria y 2ie8re. En casos agudos se ?resenta muerte s78ita y en algunas ocasiones signos ner@iosos. !.1'. Boophilus$ garra?ata de un Bos?edero, transmisor de la 8a8esiosis y ana?lasmosis a los animales domAsticos y sil@estres. Existen cinco es?ecies reconocidas a ni@el mundial de las cuales boophilus microplus (B. microplus) y Boophilus annulatus (B. annulatus) est6n distri8uidas en MAxico, encontr6ndose de manera simult6nea en la regi4n centro sur. B. microplus se encuentra con mayor 2recuencia y a8undancia en las >onas tro?icales 8aCas, donde coexisten con Amblyomma cajennense; B. annulatus so?ortan menor tem?eratura y Bumedad y se locali>an en la ?arte norte del ?as ?rinci?almente en el norte de Sinaloa, $oaBuila, Nue@o %e4n, /aCa $ali2ornia, Durango y 1alisco. !.1(. 2a"tidor$ marco yIo cuadro de madera con alam8res so8re el cual se 2iCa la cera estam?ada ?ara la 2ormaci4n del ?anal. !.1). Cad*ver$ cuer?o de un organismo animal des?uAs de su muerte. !.1+. Campa3a"$ las cam?aDas nacionales esta8lecidas a tra@As de las normas o2iciales mexicanas. !.1,. Cepa" de alta pato/enicidad$ son aquellas ce?as de @irus de la #n2luen>a A@iar, que inoculadas mediante 2luido alantoideo o culti@o celular en ocBo ?ollos susce?ti8les Gli8res de ?at4genos es?ec2icosH de cuatro a ocBo semanas de edad, causan una mortalidad ?or lo menos el =(J de las a@es dentro de ocBo das su8secuentes a la inoculaci4n de las mismas. !. -. Cepa" de baja pato/enicidad$ son aquellas ce?as de @irus de #n2luen>a A@iar, que inoculadas mediante 2luido alantoideo en ocBo susce?ti8les Gli8res de ?at4genos es?ec2icosH de cuatro a ocBo semanas de edad in2ectados con 2luido alantoideo o culti@o celular, ?ueden causar una mortalidad menor al =(J de las a@es dentro de ocBo das su8secuentes a la inoculaci4n de las mismas. !. 1. Colmena$ aloCamiento de una colonia o 2amilia de a8eCas. !. . Con"tancia de re"#ltado" de pr#eba" o an*li"i"$ documento que ?resenta los resultados o8tenidos de las ?rue8as yIo an6lisis reali>ados y otra in2ormaci4n rele@ante deri@ada de los mismos. !. !. Direccin$ la Direcci4n General de Salud Animal. !. &. De"infeccin$ utili>aci4n de medios 2sicos o qumicos ?ara la destrucci4n de microorganismos o gArmenes. !. '. EA$ en2ermedad de AuCes>Fy. !. (. NC$ en2ermedad de NeEcastle. !. ). EN4$ en2ermedad de NeEcastle ?resentaci4n @elogAnica. !. +. Enfermedade" tran"mitida" por /arrapata"$ la 8a8esiosis y la ana?lasmosis. !. ,. Enfermedad de A#je"%5y6 tambi7n conocida como p"e#dorrabia$ en2ermedad in2ectocontagiosa de origen @iral, altamente transmisi8le, que a2ecta ?rinci?almente a los ?orcinos, ocasionando disminuci4n en la 2ertilidad, a8ortos, mortinatos, signos res?iratorios en cerdos en crecimiento, as como alta mortalidad de cerdos C4@enes y de otras es?ecies susce?ti8les. !.!-. E8#ipo para laboratorio de pr#eba"$ conCunto de a?aratos yIo instrumentos mec6nicos, elActricos, mec6nico-elActricos yIo com?utari>ados que son utili>ados ?ara lle@ar a ca8o algunos ?rocedimientos de ?rue8as o la totalidad de Astas. !.!1. E"terili%acin$ ?rocedimiento que tiene ?or o8Ceto la destrucci4n total de microorganismos, que se ?uede lle@ar a ca8o ?or mAtodos 2sicos o qumicos. De8e ser @eri2icado ?or ?rue8as de esterilidad a?ro?iadas ?ara cada caso. !.! . Fl#ido$ sustancia lquida o gaseosa que ?or sus caractersticas 2isicoqumicas no tiene 2orma ?ro?ia, sino que ado?tan la del ?roducto que las contienen.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"

!.!!. Fiebre 1orcina Cl*"ica6 ante" denominada 9Clera 1orcino9$ en2ermedad altamente contagiosa, causada ?or un @irus de la 2amilia toga@iridae, de curso generalmente agudo, ?ero que ?uede tener una ?resentaci4n at?ica. En la ?resentaci4n t?ica los cerdos ?ueden ?resentar anorexia, 2ie8re de 9+K$ o m6s, tem8lores musculares, ?ostraci4n, consti?aci4n intestinal que alterna con ?eriodos de diarrea, secreci4n muco?urulenta en los oCos y eritema en la ?iel. En los estudios 2inales de la en2ermedad ?uede o8ser@arse trastornos ner@iosos, ?ar6lisis y ?or 7ltimo la muerte. !.!&. F1C$ 2ie8re -orcina $l6sica. !.!'. Infe"tacin$ es la ?resencia de garra?atas o ecto?ar6sitos en los animales. !.!(. :aboratorio aprobado$ la8oratorio reconocido ?or la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural ?ara reali>ar ?rue8as o an6lisis es?ec2icos en materia >oosanitaria. !.!). :aboratorio de pr#eba" o an*li"i"$ aquella instalaci4n que o?era en una localidad es?ec2icamente determinada, que dis?one del equi?o necesario y el ?ersonal cali2icado ?ara e2ectuar ?rue8as y an6lisis en materia >oosanitaria. !.!+. ;7todo de pr#eba o an*li"i"$ ?rocedimiento tAcnico es?ec2ico ?ara la reali>aci4n de una ?rue8a o an6lisis. !.!,. ;#e"tra$ es?Acimen que re?resenta las caractersticas de un todo. !.&-. ;#e"tra"$ sangre, suero, teCidos, 4rganos, lecBe y lacticinios u otros que se relacionen con la /rucelosis y que sean de2inidos ?or la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, con el ?ro?4sito de ser anali>ados mediante ?rue8as de diagn4stico ?ara identi2icar la ?resencia de la en2ermedad. !.&1. 1anal$ estructura 2ormada ?or celdas de cera, que sir@en como de?4sito de alimentos o que aloCa cras. !.& . 1ar*"ito$ organismo que @i@e a ex?ensas del Bos?edero del cual o8tiene ?rotecci4n y sustento. 5i@e en el interior o so8re la su?er2icie del indi@iduo que lo al8erga. !.&!. 1recipitacin$ es una reacci4n de identi2icaci4n que conser@a unidas las molAculas solu8les de antgeno ?or acci4n de los anticuer?os; lo cual ?roduce un ?reci?itado @isi8le, que contiene tanto el antgeno como el anticuer?o. !.&&. 1arvada$ conCunto de a@es, ?ara 2ines de esta Norma se consideran aquellas de a@es ?rogenitoras o re?roductoras. !.&'. 1r#eba$ ?rocedimiento ?ara identi2icar un constituyente, descu8rir cam8ios de una 2unci4n o esta8lecer la naturale>a @erdadera de un trastorno. !.&(. Reactivo$ sustancia em?leada ?ara ?roducir una reacci4n o descu8rir la ?resencia de otra sustancia. !.&). Repetibilidad y reprod#cibilidad de pr#eba" o an*li"i"$ concordancia entre los resultados de mediciones sucesi@as de la misma muestra, e2ectuadas con la a?licaci4n de la totalidad de las condiciones siguientes: Mismo mAtodo de ?rue8a o an6lisis. Mismas caractersticas del instrumento de medici4n. Mismas condiciones de uso. e?etici4n en ?eriodos cortos. Misma muestra. !.&+. Salmonelosis A@iar:

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

En2ermedad 8acteriana contagiosa, cuyos agentes causales son S. pullorum que ?roduce la -ulorosis y S. gallinarum que ?roduce la .i2oidea A@iar. !.&,. Secretar.a$ la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural.

!.'-. <a=onom.a$ clasi2icaci4n sistem6tica de los seres @i@os, 8as6ndose en las di2erencias que existen entre ellos. !.'1. >FC$ Unidades "ormadoras de $olonias. !.' . 4arroa"i"$ en2ermedad ?arasitaria externa de las a8eCas ocasionada ?or el 6caro Varroa jacobsoni. !.'!. ?*n/ano$ a8eCa macBo. &. Di"po"icione" /enerale" %os la8oratorios de ?rue8as en materia >oosanitaria dedicados al diagn4stico tendr6n reconocimiento o2icial de la Secretara, en aquellas tAcnicas en que demuestren su ca?acidad o?erati@a con2orme a los dict6menes del $omitA de E@aluaci4n ?ara la A?ro8aci4n de %a8oratorios de -rue8as en Materia *oosanitaria. De con2ormidad con las dis?osiciones de la Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, L$riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitariaL, los la8oratorios de ?rue8as en materia >oosanitaria de8en em?lear los mAtodos y ?rocedimientos ?rescritos en esta Norma !2icial Mexicana, de acuerdo a las ?rue8as yIo an6lisis ?ara la cual el la8oratorio 2ue a?ro8ado. '. Identificacin de abeja" africana" .tulo #denti2icaci4n taxon4mica de a8eCas a2ricani>adas. !8Ceti@o Diagn4stico mor2omAtrico de a8eCas mel2eras a2ricani>adas mediante tAcnicas microsc4?icas y com?utari>adas. $am?o de a?licaci4n El mAtodo es utili>ado ?ara el diagn4stico de a2ricani>aci4n en enCam8res de a8eCas mel2eras, en a?iarios y en la certi2icaci4n de criaderos de a8eCas reinas. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'':-*!!-+,,9, Acti@idades tAcnicas y o?erati@as a?lica8les al ?rograma nacional ?ara el control de la a8eCa a2ricana. Generalidades A ?artir de la introducci4n de la a8eCa a2ricana en MAxico, se esta8leci4 la metodologa ?ara el diagn4stico de a2ricani>aci4n de a8eCas en di@ersos la8oratorios de mor2ometra en nuestro ?as. Actualmente la determinaci4n se reali>a ?ara certi2icar criaderos de reinas como +''J euro?eas o determinar el grado de Bi8ridismo en una colonia. El diagn4stico se reali>a ?or los mAtodos denominados "a8is y Daily. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.$om?utadora -$-A. :<) o su?erior. Estu2a 8acteriol4gica. Micr4metro en marco ?ara dia?ositi@a. Microsco?io estereosc4?ico.

Lunes 22 de febrero de 1999 (.).=.<.Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.eacti@os +.:.3.9.Agua destilada AlcoBol ='J "ucsina 86sica :J Midr4xido de ?otasio +'J $aCa de -etri. $risol de ?orcelana. $u8reo8Cetos :9 x 9' mm. Gotero. -a?el secante. -incel de cerda 2ina. -in>as de ?unta 2ina. -ortao8Cetos. -latina. -royector de dia?ositi@as.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

-royector ?ara microsco?io com?uesto. at4n digitali>ador ?ara com?utadora.

egla de ?l6stico trans?arente de (' cm. Monturas ?ara dia?ositi@a. -laca de ?orcelana con exca@aciones.

$ondiciones am8ientales %as regulares de un la8oratorio de ?rue8as. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. %a muestra de a8eCas una @e> reci8ida en la8oratorio e identi2icada, se retira del 2rasco contenedor y se ?rocede a reali>ar el diagn4stico. -rocedimiento El ?rocedimiento ?ara el diagn4stico de a2ricani>aci4n ?uede ser de "a8is #, "a8is ## y Daily y su a?licaci4n de?ende de los resultados encontrados en cada uno de ellos dando inicio siem?re ?or "a8is #. 1.@ "a8is # Se toman die> a8eCas y se de?ositan so8re un ?a?el secante, el cual a8sor8er6 el lquido conser@ador so8rante.

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Se toma con cuidado una a8eCa y se des?rende el ala anterior i>quierda G@ista dorsalH desde la 8ase del ala Gmicrosco?ioH, ?rocurando no rom?er o desgarrar el ala. Esto se 2acilita si se utili>an dos ?in>as de ?unta 2ina G?in>as de reloCeroH. Una ?ara suCetar la regi4n del t4rax y la otra ?ara des?render el ala. -ara com?ro8ar que las alas Ban sido 8ien des?rendidas se o8ser@an en un microsco?io estereosco?io y de8e a?reciarse claramente la canaladura de la @ena costal del ala y la ?arte distal del 8orde del ala com?leta. $uando un ala estA mal des?rendida o rota se desecBa y se toma la del lado derecBo. Se toman las die> alas delanteras i>quierdas ya des?rendidas, com?letas y 8ien diseccionadas. Se montan so8re un cu8reo8Cetos de :9 & 9' mm, Aste se cu8re con un segundo cu8reo8Ceto, y se ?ega con di7rex ?or la ?arte angosta, Asta de8e de quedar en 2orma de 8isagra. %as alas de8en tener la misma orientaci4n ?rocurando que queden lo m6s ?egadas ocultas ?osi8le y tam8iAn intercaladas ?ara que cuando se tomen las medidas la 7ltima no quede muy a8aCo, tam8iAn se ?uede colocar en los dos cu8res cinco alas ?or cu8re lo cual quita m6s tiem?o y material. Se sellan en los extremos con di7rex y se enmarcan en una montura o marco ?ara dia?ositi@as. Estas molduras ?ueden ser de cart4n o ?l6stico. %as monturas de8en lle@ar el n7mero del caso o muestra. -re@io a la lectura del tamaDo de las alas se reali>a el aCuste del ?royector que consiste en: Se 2iCa el lente micromAtrico en un cu8reo8Cetos, y se monta en una montura. %a montura con el ocular micromAtrico se ?royecta en la ?ared. %a ?royecci4n en la ?ared se mide con una regla de cincuenta centmetros Basta que el centmetro ?royectado del ocular milimAtrico, equi@alga a los cincuenta centmetros; si se aCusta a (' cm, el resultado de las medidas se multi?lica ?or dos. El aCuste, se ?uede Bacer acercando o retirando el ?royector de la ?ared. El ?royector no de8e mo@erse o la lectura resultar6 2alsa y de ser ?osi8le se de8er6 2iCar ?or alg7n medio. $uando el aCuste estA terminado se monta la ?rimera muestra. .eniendo la ?rimera dia?ositi@a con las die> alas se ?rocede a e2ectuar las mediciones. -ara ello se coloca la regla en el centro de la canaladura de la @ena costal, y se tra>a una lnea recta Basta la ?arte m6s distal del ala, se mide la distancia se @a anotando el resultado, y se ?rocede con las mediciones de las restantes dia?ositi@as. $uando se tienen las mediciones de las cinco o die> alas, se introducen Astas en el ?rograma de com?utadora ?re@iamente cargado seg7n se indica en 24rmulas ?ara el c6lculo de resultados. Si el resultado del an6lisis es dudoso, las muestras de8en tra8aCarse ?ara reali>ar el segundo ni@el de com?leCidad, que es en este caso "a8is ##. .@ "a8is ## Este mAtodo consiste en el des?rendimiento cuidadoso del tercer ?ar de ?atas de las a8eCas, teniendo en cuenta que se tomaron estas estructuras de un solo lado y se tendr6 como com?lemento la ela8oraci4n del "a8is #. Una @e> des?rendidas las estructuras ?ara el "a8is # se ?roceder6 a tomar las mismas die> a8eCas ?ara el des?rendimiento del tercer ?ar de ?atas, teniendo como ayuda unas ?in>as de reloCero de ?unta 2ina. Na des?rendidas las ?atas se Bace una se?araci4n de Asta, eliminando la coxa y el troc6nter, quedando la ti8ia y el 2Amur que son los segmentos ?rinci?ales que nos interesa en este caso. %os segmentos 8ien de2inidos se colocan ordenados en un tro>o de di7rex unido a un cu8reo8Cetos de :9 & 9: mm, ?ara luego ser 2iCados totalmente en el cu8reo8Cetos. Montadas las estructuras se ?rocede a Bacer la medici4n de igual 2orma que en el "a8is #. %os datos resultantes de este ?rocedimiento se introducen en el ?rograma de com?utadora como en el caso anterior. !.@ Daily

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%as muestras de8en conser@arse en alcoBol al ='J. Se toma una a8eCa y se des?rende con la ayuda de unas ?in>as desde la 8ase del ala anterior, ala ?osterior, tercer ?ata ?osterior Gno im?orta el lado, siem?re y cuando sean todas las estructuras del mismo ladoH y el tercer esternito a8dominal, todas las ?artes se colocan en una caCa -etri con alcoBol al ='J. En el microsco?io estereosc4?ico se Bace un corte inclinado en el ala anterior con el 8istur de tal 2orma que no cortemos la canaladura de la @ena costal del ala, ?osteriormente se Bace un corte a la ala ?osterior en lnea recta antes de la lnea de uni4n. Se des?rende una ?ata ?osterior, los segmentos 5, #5, ### y ##, del tarso, estas ?ie>as se desecBan. Se des?rende el ?rimer segmento del tarso, si queda adBerido algo de teCido muscular se corta con el 8istur. Se des?rende la coxa y el troc6nter con mucBo cuidado, tratando de no cortar la ?arte terminal del 2Amur. Al tercer esternito a8dominal se le quita el teCido que tiene adBerido con la ayuda de un ?incel 2ino, tratando de no rasgar los es?eCos. Al ala ?osterior se le corta con el 8istur la 8ase. El esternito se coloca en un crisol de ?orcelana con +' ml de Bidr4xido de ?otasio al +'J, se ?one a calentar en una ?latina y cuando em?ie>a a Ber@ir se retira y se deCa en2riar. Se la@a ?er2ectamente con agua destilada ?ara quitar el exceso de Bidr4xido de ?otasio. Se coloca el esternito en una ?laca de ?orcelana con exca@aciones y se le agregan unas gotas GBasta cu8rirloH de 2ucsina 86sica al :J. Se ta?a con una ?laca de @idrio y se deCa teDir durante :' minutos. Se le quita el exceso de colorante con alcoBol al ='J, si es necesario se deCa un ?oco m6s de tiem?o, se ?one a secar en el ?a?el secante. Se montan en el ?ortao8Ceto en un extremo se ?onen seis gotas de 86lsamo de $anad6 ?ara colocar el 2Amur y la ti8ia G8ien do8ladasH y ?osteriormente el 8asitarso colocando el cu8reo8Cetos de :: & :: tratando que quede ?er2ectamente adBerido sin que se arruguen ni se do8len los es?eCos y que no se 2ormen 8olsas de aire. En el mismo ?ortao8Cetos se acomodan el ala anterior ?osterior el tercer esternito Glas ?artes 8landasH. El 2Amur y la ti8ia G?artes durasH se cu8ren con 86lsamo de $anad6 y se coloca un cu8reo8Cetos tratando de que no se 2ormen 8ur8uCas. Se ?one a secar en una estu2a a 9' grados centgrados durante :9 Boras. Si alguna ?arte no est6 com?leta o durante la disecci4n se desgarra, se desecBan todas las dem6s ?artes de esta a8eCa y se re?ite el ?rocedimiento con una nue@a a8eCa de la muestra. Se de8e tener cuidado al maneCar @arias muestras de no me>clar ?arte de una a8eCa con otra. %os crisoles, caCas de -etri y las ?lacas de tinci4n con exca@aciones, se de8en marcar con el n7mero de la muestra res?ecti@a con la que se est6 tra8aCando en este momento se de8e usar un crisol, una caCa de -etri y una ?laca de tinci4n con exca@aci4n ?or a8eCa. Una @e> que se Ba ?re?arado el ?ortao8Cetos con las estructuras, se de8e identi2icar marcando la orilla de la laminilla con el mismo n7mero que ?osee la muestra original. -ara inicio de las lecturas de8er6 ?re?ararse la com?utadora ?ersonal, la cual est6 conectada al rat4n digitali>ador y reci8e las seDales de la estructura de la a8eCa que se est6 midiendo. %a com?utadora de8er6 cargarse con el ?rograma en /AS#$ que ?ermite reali>ar las lecturas y anali>ar los datos. Se monta la ?re?araci4n en la ?latina del microsco?io y se Bace ?asar el Ba> de lu> ?royect6ndose la ?re?araci4n en la ta8la o 8ase del microsco?io de ?royecci4n. %a medici4n se reali>a digitali>ando so8re la ?royecci4n en la ta8la con el rat4n digitali>ador los ?untos a continuaci4n en el siguiente orden: aH %argo del ala anterior G2igura +H en sus estructuras de la canaladura Bacia la ?arte distal G?untos + y :H, ancBo del ala comen>ando de adelante Bacia atr6s G?untos 3 y 9H. 8H %argo del ala ?osterior midiendo G2igura :H desde la ?rimera @ena Basta la ?arte distal G?untos ( y )H, ancBo del ala ?osterior G?untos = y <H.

1&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

cH $ontar los Bamulos GcerdasH del ala anterior e introducir el n7mero en la com?utadora G2igura :H. dH Digitali>ar el sitio donde a?arecen los 6ngulos del ala anterior G2igura +H en el orden indicado de mayor a menor G+' a :3H. eH -ata ?osterior derecBa G2igura 3H medir el largo de la ti8ia G?untos :9 y :(H. Medir el largo del 2Amur en la misma 2igura G?untos :) y :=H. 2H /asitarso ?osterior derecBo G2igura 9H medir el largo del 8asitarso G?untos :< y :,H. Medir el ancBo del 8asitarso G?untos 3' y 3+H gH .ercer esternito a8dominal G2igura (H. AncBo del esternito G?untos 3: y 33H. AncBo de los es?eCos G?untos 39 y 3(H. %argo del es?eCo G?untos 3) y 3=H. Distancia entre los es?eCos G?untos 3< y 3,H. %as mediciones anteriores se reali>an en las +' muestras ?re?aradas. Al tArmino de la dAcima lectura a?arece en ?antalla la ?regunta si se desea introducir m6s in2ormaci4n. Al escri8ir que no, se introducen ?osteriormente datos de identi2icaci4n de la muestra. $omo as?ecto 2inal en el ?rograma a?arece en ?antalla la ?ro8a8ilidad de a2ricani>aci4n. "4rmulas ?ara el c6lculo de resultados .odos los c6lculos son reali>ados ?or com?utadora, sin em8argo, ellos son medias del tamaDo de las estructuras anali>adas y c6lculo de Des@iaciones est6ndar. El an6lisis estadstico de ?ro8a8ilidad de a2ricani>aci4n tanto en "a8is # y ## como en Daily, se o8tiene mediante el ?rograma de com?utadora en /AS#$ ?ara el diagn4stico mor2omAtrico ?ro?orcionado ?or el -rograma Nacional ?ara el $ontrol de la A8eCa A2ricani>ada o ?or el $entro Nacional de Ser@icios de $onstataci4n en Salud Animal. #nter?retaci4n de los resultados Escalas com?arati@as * O Es mayor o igual a cero * O Entre - '.+ a - :., * O Es menor de -3.' y Basta -).' #ndices de re?roducti8ilidad y re?eti8ilidad Su?erior al ,(J /i8liogra2a Milne, -.S. +,9<. Acarine Disease o2 /ees. 1. Minist. Agric. "isB. (9:9=3-3==. .tulo Diagn4stico de la acariosis traqueal en a8eCas mel2eras !8Ceti@o Detectar la ?resencia del 6caro traqueal Acarapis woo i en a8eCas mel2eras. $am?o de a?licaci4n Diagn4stico de 6caros traqueales en a8eCas reinas suCetas a certi2icaci4n ?ara mo@ili>aci4n en MAxico. Documentos conexos a consultarse EU !-EA S!S-E$M!SA A" #$ANA

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

11

Norma !2icial Mexicana N!M-'':-*!!-+,,9, Acti@idades tAcnicas y o?erati@as a?lica8les al ?rograma nacional ?ara el control de la a8eCa a2ricana. Generalidades %a tAcnica ?ara la detecci4n de la acariosis traqueal de las a8eCas 2ue desarrollada ?or el /ritisB Ministery o2 Agriculture, "isBeries and "ood, en +,(), y es la em?leada, con algunas modi2icaciones ?or el USDA, de8ido a que es un mAtodo sencillo, requiere un mnimo de destre>a y tiem?o, unos 3' a )' s. ?or a8eCa, es econ4mica, ?or requerir de un mnimo de equi?o, tiene la @entaCa de que se ?ueden examinar las a8eCas indi@idualmente, ya que el grado de in2estaci4n ?uede di2erir considera8lemente entre las a8eCas de una colmena, y logra detectar in2estaciones iniciales, al extraer la tr6quea ?rotor6cica y su inserci4n con el ?rimer ?ar de es?ir6culos tor6cicos, lo cual asegura la @isuali>aci4n de cualquier 6caro que se ?udiera encontrar en la entrada de las tr6queas. Equi?o e instrumentos +.:.Materiales +.:.3.9.eacti@os Acido l6ctico $ondiciones am8ientales De la8oratorio no se requieren medidas de 8ioseguridad. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Se de8er6 solicitar al remitente que se muestree el +'J de las colmenas. De cada colonia o colmena es recomenda8le tomar en un 2rasco correctamente identi2icado con el nom8re del a?iario y n7mero de la colmena unas +' a8eCas ?or caC4n, colectadas ?re2erentemente de la ?iquera, lo cual garanti>ar6 incluir a8eCas adultas de edad BomogAnea. El 2rasco de colecta de8er6 contener alcoBol al ='J como ?reser@ador. -rocedimiento +.- Se sostiene a la a8eCa ?or el a8domen, con los dedos ?ulgar e ndice G2igura +H. :.- $on unas ?in>as de ?unta muy 2ina Gde reloCeroH, se des?renden la ca8e>a y el ?rimer ?ar de ?atas, ?ara ex?oner el mesot4rax. 3.- $on los dedos lateralmente, se eCerce una ligera ?resi4n Bacia adelante del t4rax, a manera de incluir el teCido asociado con el sistema traqueal. 9.- $on las ?in>as se des?renden el ?rimer anillo tor6cico de quitina, donde se locali>an las tr6queas, cuidando de no rom?erlo. (.- $on las ?in>as se coloca el anillo tor6cico en un ?ortao8Cetos, re?itiendo la misma o?eraci4n, con o8Ceto de incluir Basta cinco anillos tor6cicos en un mismo ?ortao8Cetos, lo cual agili>a la o8ser@aci4n. AguCas de disecci4n %6?i> graso -in>as de disecci4n de ?unta 2ina o de reloCero -ortao8Cetos %6m?ara de restirador Microsco?io estereosc4?ico

12

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

).- Se agrega una gota de 6cido l6ctico, a cada anillo tor6cico, ?ara aclarar el teCido y Bacer @isi8les las tr6queas. DeCar transcurrir uno a dos minutos -tiem?o requerido ?ara des?render los cinco anillos restantes-, el 6cido l6ctico ya aclar4 el teCido y las tr6queas son 26cilmente @isi8les. $oloque el ?ortao8Cetos 8aCo el microsco?io de disecci4n, utilice el lente de menor aumento G+'&H. =.- $on ayuda de dos aguCas de disecci4n, se se?aran Bacia un lado, con cuidado, las tr6queas del anillo de quitina. Desde este momento ya es ?osi8le determinar si las tr6queas est6n in2estadas. Examine el as?ecto de las tr6queas y o8ser@e si Bay 6caros, en es?ecial cerca del ori2icio estigm6tico. Si Astos existen el diagn4stico ser6 ?ositi@o. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados: En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados. El diagn4stico e identi2icaci4n ?ositi@o, lo constituye la ?resencia de 6caros en las tr6queas G"igura :H, ya que Acarapis woo i, es el 7nico 6caro traqueal de las a8eCas. %as tr6queas sanas ?resentan el as?ecto de cordones 8lanco-nacarados 2lexi8les y trans?arentes. $uando encontramos la tr6quea sin 6caros, ?ero existen ligeras mancBas color ocre o negras, en la misma, es indicio de que estu@o ?arasitada, sin em8argo, el diagn4stico ?ositi@o es la locali>aci4n del 6caro en las tr6queas. El re?orte del diagn4stico ?uede ex?resarse en tArminos de: Negati@a o in2estaci4n nula O cero 6caros. -ositi@a O cuando se encuentre el 6caro en cualquier tr6quea o tr6quea necrosada. En caso de que se desee conocer el ?orcentaCe de in2estaci4n de las a8eCas, en 8ase al n7mero de 6caros encontrados en am8as tr6queas, se ?ueden designar rangos de in2estaci4n de acuerdo a la regi4n y el clima. Algunos rangos seDalan in2estaci4n nula O cero 6caros; 8aCa O menos de +( 6caros y alta O m6s de +( 6caros o tr6quea necrosada. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Su?erior al ,(J es?erando con cuidado la clari2icaci4n de las muestras en el 6cido l6ctico. /i8liogra2a /ailey, %. G+,<+H Money /ee -atBology. Academic -ress, %ondres. .tulo Diagn4stico de la Nosemiasis de las a8eCas mel2eras. !8Ceti@o Detecci4n de es?oras de !osema apis mediante el examen microsc4?ico en a8eCas mel2eras. $am?o de a?licaci4n. Esta tAcnica tiene a?licaci4n en a8eCas mel2eras y es en es?ecial utili>ada ?ara la detecci4n de es?oras de !osema en a8eCas reinas en mo@ili>aci4n suCetas a la certi2icaci4n sanitaria. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'':-*!!-+,,9, Acti@idades tAcnicas y o?erati@as a?lica8les al -rograma Nacional ?ara el $ontrol de la A8eCa A2ricana. Generalidades El agente causal de la Nosemiasis, !osema apis es un ?ar6sito microsc4?ico del "hylum "roto#oa , que se caracteri>a ?or la 2ormaci4n de es?oras que son estadios de resistencia del ?ar6sito. %as es?oras de

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

!osema apis son cor?7sculos o@alados de a?roximadamente 9 a ) micras de largo ?or : a 9 de ancBo. En el interior de la es?ora existen dos n7cleos y un 2ilamento. Este 2ilamento lle@a el nom8re de 2ilamento ?olar y es =' @eces m6s largo que la es?ora. El tiem?o de @ia8ilidad de las es?oras de?ende de las condiciones a las cuales son ex?uestas, ?ueden ?ermanecer @ia8les ?or mucBos meses en Beces secas so8re los ?anales de cra, ?ero ?ierden su @ia8ilidad en ?ocos das si son ex?uestas a la lu> solar. %as es?oras son 26cilmente destruidas ?or calentamiento o ?or la acci4n de 2umigantes es?ec2icos, ?ero resisten tem?eraturas in2eriores a +' grados centgrados ?or @arios aDos. Equi?o e instrumentos +.:.Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.eacti@os Agua destilada $ondiciones am8ientales %as regulares de un la8oratorio de ?rue8as. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. %a muestra de a8eCas una @e> reci8ida en la8oratorio e identi2icada se retira del 2rasco contenedor y se ?rocede a su diagn4stico. -rocedimiento El diagn4stico de esta en2ermedad de las a8eCas se 8asa en la detecci4n de la es?ora que se ?resenta en insectos in2ectados, mismo que ?uede reali>arse mediante un mAtodo ?r6ctico y sencillo denominado examen r6?ido o 8ien mediante el mAtodo de $antEell. aH Examen r6?ido: Un examen r6?ido ?uede ser BecBo remo@iendo el intestino de la a8eCa en2erma, o8ser@ando si est6 distendido y Baciendo en seguida un 2rotis de su contenido directamente en un ?ortao8Cetos con una gota de agua. !tro examen m6s com?leCo ?uede ser BecBo de acuerdo con la tAcnica de $antEell. 8H MAtodo de $antEell: Asa 8acteriol4gica $u8reo8Cetos +< x +< Gotero Mortero de ?orcelana -in>as de ?unta 2ina o de reloCero -ortao8Cetos .ami> de .'99 mm. .iCeras 5aso de ?reci?itado de ('' ml. $6mara de Neu8auer Microsco?io com?uesto con o8Ceti@os +', 9' y +''&

1!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

.omar :( a8eCas de cada muestra y colocarlas so8re un ?a?el a8sor8ente ?ara que se sequen. Se?arar los a8d4menes de las a8eCas con una tiCera y colocarlos en un mortero con ?istilo que contenga + ml de agua destilada ?or a8eCa, o sea un total de :( ml. #niciar el macerado con cerca de ( ml y agregar Basta :' ml m6s de agua ?osteriormente, con ello se lograr6 un 8uen macerado. .anto el mortero como el ?istilo de8en estar 8ien lim?ios antes del uso. Al 2inali>ar el macerado se tami>a la sus?ensi4n lograda con un tami> de .'99 mm, reci8iAndolo en un @aso de ?reci?itado. El 2rotis se ?re?ara colocando so8re el ?ortao8Cetos una gota de la sus?ensi4n 2iltrada. $olocar un cu8reo8Cetos so8re la gota de la sus?ensi4n. Examinar el 2rotis en un microsco?io con aumento de ?or lo menos 9''&. %as es?oras de !osema apis son 26cilmente @istos ?or ser cor?7sculos 8rillantes y muy re2ringentes. %as es?oras son o@aladas y miden 9 a ) micrones de largo ?or : a 9 micras de ancBo. El conteo de las es?oras se ?uede reali>ar mediante dos mAtodos. El ?rimero es una modi2icaci4n del mAtodo de conteo de gl48ulos roCos en un Bemocit4metro, el cual consta de un cu8reo8Cetos y una c6mara es?ecial que o?era con un @olumen es?ec2ico de 2luido antes del uso, la c6mara de8e estar 8ien lim?ia en agua con detergente y se enCuaga con agua corriente, luego se ?asa en alcoBol etlico. "inalmente se seca con una 2ranela lim?ia. Agitar 8ien la sus?ensi4n con el ?istilo; se toma un ?oco con un gotero de la misma y se coloca una gota 8aCo el cu8reo8Cetos del Bemocit4metro Basta llenar ?or ca?ilaridad. Se de8e tener cuidado de llenar 7nicamente la c6mara de Bemocit4metro. -ara asegurar la cantidad exacta de lquido que se requiere, tam8iAn se de8e asegurar la ausencia de 8ur8uCas 8aCo el cu8reo8Cetos. Es?erar tres minutos ?ara ?ermitir la sedimentaci4n de las es?oras antes de iniciar el conteo. Durante 3 minutos, 8uscar un 6rea de conteo y en2ocar con o8Ceti@o de 9'&. %a cuadrcula de la c6mara est6 di@idida en gru?os de +) cuadros y cada gru?o est6 enmarcado ?or lneas do8les. Se cuentan todas las es?oras enmarcadas en las lneas do8les, incluyendo en el conteo a todas las es?oras que toquen a las lneas do8les del lado i>quierdo y su?eriores de cada 8loque, ?ero no a las que toquen las lneas do8les in2eriores y a las del lado derecBo del 8loque. -recauciones que de8en tomarse ?ara e@itar errores: +.- Agitar la sus?ensi4n antes de ser colectada la muestra con el asa de ?latino, ?ara asegurar una distri8uci4n uni2orme de las es?oras. :.- "lamear el asa antes de ser usada en cada muestra. 3.- Usar una c6mara ?ara cada muestra. 9.- No de8e reali>arse el conteo si Bay 8ur8uCas ?resentes o si existe una distri8uci4n ?oco uni2orme de las es?oras en la c6mara. (.- -ermitir la sedimentaci4n de las es?oras durante 3 minutos antes de iniciar el conteo. ).- E2ectuar el conteo antes de que la muestra em?iece a e@a?orarse de la c6mara. "4rmulas ?ara el c6lculo de resultados -ara o8tener un 8uen ?romedio, se cuentan las es?oras de ( 8loques, los 9 de las esquinas y el central de la c6mara, totali>ando <' cuadros. %a siguiente ecuaci4n ?uede ser usada ?ara determinar el n7mero de es?oras ?or a8eCa. !o. total e esporas conta as en $% cua ros & 9 & +') O No. de es?orasIa8eCa <' #nter?retaci4n de los resultados

Lunes 22 de febrero de 1999 -

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1"

De acuerdo con 1aycox, la se@eridad de la en2ermedad se estima como sigue: No. de es?oras Gmillones ?or a8eCaH

#ntensidad de la in2ecci4n. NU%A MUN %#GE A %#GE A EGU%A SEM#SE5E A SE5E A #ndices de re?roducti8ilidad y re?eti8ilidad Su?erior al ,(J. /i8liogra2a

'.'+ - +.'' +.'' - (.'' (.'' - +'.'' +'.'' - :'.'' MAS DE :'.''

DE 1ong D. +,<'. Varroa jacobsoni, Sur@ey .ecBniques, %ea2let No. +',, Uni@ersity !2 Maryland, U.S.A. Gu>m6n M. E. +,<+. $ontri8uci4n al estudio de la nosemiasis de las a8eCas. .esis ?ro2esional, MAxico, D.". 1aycox E. 1aycox E. . +,==, %a8oratory Diagnosis o2 /ee Deseases. -u8lication M-)<<. Uni@ersity !2 #llinois. . +,<', Estimation o2 tBe se@erity o2 nosema in2ection. Unedited 8ulletin. Uni@ersity o2 #llinois.

SBimanuFi M. and $antEell G.E. +,=<. Diagnosis !2 Money /ee Deseases -arasites And -ests, USDA. Manual Ar<-me-<=. /elts@ille Maryland, U.S.A. (. 4arroa"i" de la" abeja" .tulo Diagn4stico de Varroa &acobsoni en a8eCas mel2eras. !8Ceti@o Diagn4stico del 6caro Varroa jacobsoni en Apis melis adultas o en cras. $am?o de a?licaci4n %a metodologa descrita es ?ara ser a?licada en los la8oratorios de ?rue8as que reali>an el diagn4stico de en2ermedades ?arasitarias de las a8eCas y en ?articular el de Varroa jacobsoni. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''+-*!!-+,,9, $am?aDa nacional contra la @arroasis de las a8eCas. Generalidades El 6caro Varroa jacobsoni, un ecto?ar6sito o8ligado de las a8eCas, originalmente con2inado a la a8eCa mel2era asi6tica Apis cerana, Ba sido diagnosticado recientemente en MAxico. El 6caro en desarrollo se alimenta de Bemolin2a de la lar@a, ?u?a y a8eCas adultas, causando el de8ilitamiento y la mortalidad de las colonias de a8eCas. $on o8Ceto de lle@ar a ca8o una detecci4n o?ortuna de la @arroasis, una de las m6s gra@es ?lagas de la a?icultura, los a?icultores de8er6n incluir en el examen rutinario de la colmena, una ins?ecci4n @isual detallada de la cra y a8eCas adultas en 8usca del 6caro y de los signos de la in2estaci4n: a8eCas con

1#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

a8domen corto y alas con mal2ormaciones. Uno de los 2actores que contri8uyen a la dis?ersi4n de la ?laga, es la 2alta de conocimiento de las mismas, ?or lo que a continuaci4n se ?resentan los mAtodos de diagn4stico com7nmente em?leados en otros ?ases. Equi?o e instrumentos: +.:.3.Materiales: +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.eacti@os: +.:.3.AlcoBol del ='J o Soluci4n con agua Ca8onosa 5aselina o aceite @egetal .iras ?l6sticas con 2lu@alinato o 2lumetrina AguCas de disecci4n ABumador ?ara colmena /astidores con malla mosquitero en 8ase al tamaDo del ?iso de la colmena /olsas de ?l6stico de 3' ?or :' cm. $artulina 8lanca del tamaDo de la colmena $oladera "rasco de @idrio o ?l6stico Na@aCa o cucBillo -in>a de reloCero o ?incel No. : Marcador indele8le MasFin ta?e de + ?ulgada %6m?ara de restirador %u?a Microsco?io estereosc4?ico

$ondiciones am8ientales %as regulares de un la8oratorio de ?rue8a. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra No se requiere un acondicionamiento es?ecial, la muestra al reci8irse se registra y se ex?one ?ara su an6lisis de?endiendo de si @iene en cartulina, alcoBol o ?anal. -rocedimiento El diagn4stico de Varroa se 8asa en la identi2icaci4n de la Bem8ra adulta del 6caro la cual es @isi8le a sim?le @ista, so8re las a8eCas adultas, en las uniones ca8e>a-t4rax-a8domen, entre los segmentos a8dominales, y en las celdas de la cra. %os macBos y nin2as son m6s ?equeDos, de color 8lanco ?erlado y no son 26ciles de detectar mediante una ins?ecci4n @isual, ya que ?ermanecen dentro de las celdas de la cra o?erculada. Existen @arios mAtodos 2sicos y qumicos, ?ara detectar la ?resencia de Varroa en la cra y en las a8eCas adultas. -ara ello se recomienda examinar el (J de las colmenas del a?iario.

Lunes 22 de febrero de 1999 aH Examen de la cra o?erculada:

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1$

Se recorta un cuadro de +' & +' cm con unas celdas de cra o?erculada, ?ara extraer la cra y examinarla en 8usca del 6caro. Si se examina la cra de >6nganos, se tienen mayores ?ro8a8ilidades de detectar una in2estaci4n 8aCa, de8ido a la ?redilecci4n de Varroa ?or Asta. El ?orcentaCe de celdas in2estadas se o8tiene de di@idir el n7mero de celdas examinadas, entre el n7mero de celdas con 6caros y se multi?lica ?or +''. 8H Examen de las a8eCas adultas ?or agitaci4n. Se colectan unas 3'' a ('' a8eCas adultas de la c6mara de cra, ?ara someterlas a una agitaci4n durante unos : minutos en una soluci4n Ca8onosa o alcoB4lica al ='J, y ?ro@ocar el des?rendimiento de los 6caros que se encuentren adBeridos a las a8eCas. %as a8eCas se se?aran con una coladera y la soluci4n se 2iltra con una tela de color 8lanco, donde se contrastar6n 26cilmente los 6caros. El ?orcentaCe de in2estaci4n de la colmena, se o8tiene de di@idir el n7mero de 6caros entre el n7mero de a8eCas examinadas y multi?licado ?or +''. Se recomienda ?racticar este examen cada dos meses. Esta tAcnica ?ermite muestrear grandes cantidades de a8eCas en corto tiem?o y detecta ni@eles de in2estaci4n 8aCos, de8ido a que incluye a8eCas C4@enes y nodri>as, ?re2eridas ?or Varroa. cH Examen de los detritus de la colmena. Se recomienda a?licar un tratamiento con un acaricida, ?ara des?render los 6caros que se encuentren adBeridos a las a8eCas adultas. -re@io al tratamiento, se coloca en el ?iso de la colmena, una cartulina 8lanca con grasa o @aselina ?ara que se adBieran los 6caros, y un 8astidor de malla de alam8re, ?ara e@itar que los 6caros sean remo@idos ?or las a8eCas aseadoras. A las :9 Boras se retira la BoCa y se o8ser@an los detritus con una lu?a, en 8usca del 6caro. Este mAtodo se recomienda a?licarlo a ?rinci?ios de ?rima@era y 2ines de @erano, cuando no Bay, o Bay ?oca cra y no est6 siendo colectado el nActar. Si existe cra es necesario deso?ercularla ?ara que no constituya un re2ugio de 6caros. Este mAtodo ?uede detectar ni@eles de in2estaci4n 8aCos. %os 6caros ?ueden encontrarse en las tram?as ?ara ?olen, ?or lo que es con@eniente ins?eccionarlas. "4rmulas ?ara el c6lculo de los resultados. No. de celdas in2estadas No. de celdas examinadas & +'' O J de in2estaci4n en ?anal de cra

No. de 6caros encontrados No. de a8eCas adultas examinadas

& +'' O J de in2estaci4n en a8eCas adultas

#ndices de re?roducti8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue el mAtodo descrito con reacti@os semeCantes. /i8liogra2a Milne, -.S. +,9<. Acarine Disease o2 /ees. 1. Minist. Agric. "isB. (9:9=3-3==. ). Enfermedad de NeAca"tle .tulo Aislamiento del @irus de la En2ermedad de NeEcastle GEN$H, ?or inoculaci4n en em8ri4n de ?ollo. !8Ceti@o Aislar el @irus de la EN$ en em8riones de ?ollo, inoculados con muestras de material 8iol4gico de a@es sos?ecBosas de estar in2ectadas con @irus de la EN$. $am?o de a?licaci4n - Diagn4stico de casos clnicos.

1%

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

- !8tenci4n de la constancia de ?ar@adas y granCas li8res de la En2ermedad de NeEcastle @elogAnico. - Muestreo @irol4gico en regiones, estados o >onas en ?roceso de erradicaci4n, ?ara su li8eraci4n. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'+3-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de NeEcastle. Manual o2 Standards 2or Diagnostic tests and 5accines, !#E, -ars, "rancia +,,:. Generalidades %a ?rue8a se utili>a ?ara el aislamiento del @irus de la EN$. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).=.<.,.Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.+9.Algod4n $aCas de -etri $u8re8ocas Gorros -in>as .iCeras -laca de @idrio ?ara la ?rue8a de aglutinaci4n yIo micro?laca de 2ondo en LUL -un>4n ?ara ?er2orar em8ri4n de ?ollo .u8os ?ara centr2uga estAriles 5iales estAriles -untas ?ara micro?i?eta .u8os de ensayo "iltros con mem8rana de nitrocelulosa con ?oro de '.:: micr4metros 1eringas de (, de +' ml e insulnicas de + ml. /alan>a granataria $am?ana de 2luCo laminar o mecBeros $entr2uga clnica o re2rigerada Micro?laca 2ondo en PUQ $ron4metro Momogenei>ador, mortero y ?istilo de ?orcelana o mortero de .en8roecF #ncu8adora ?ara em8ri4n de ?ollo Micro?i?eta de :( a :'' microlitros !@osco?io

Lunes 22 de febrero de 1999 eacti@os eacti@os y soluciones. +.:.AlcoBol al ='J.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

19

-egamento 8lanco, ?ara2ina o 8arni> ?ara uDas GselladoresH.

3.Soluci4n desin2ectante: Midr4xido de Sodio en soluci4n acuosa al :J, cloro soluci4n acuosa al :J, cloruro de 8en>alconio. 9.Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH estAril ?M =.:-=.9 o caldo de 2os2ato de tri?tosa estAril. (.Sus?ensi4n de ?enicilina G s4dica +'' ''' U.#.Iml y sul2ato de estre?tomicina :'' mgIml. /iol4gicos: +.:.3.Em8riones de ?ollo, li8res de ?at4genos es?ec2icos, de , a ++ das de incu8aci4n. Suero testigo ?ositi@o contra el @irus de la EN$. Sus?ensi4n de gl48ulos roCos de ?ollo al '.(J en -/S.

$ondiciones am8ientales .em?eratura am8iente ideal de +< a :'K$, en condiciones de esterilidad y delimitando el cam?o de tra8aCo con mecBeros. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. Muestras ?ro8lema: encA2alo, tr6quea, ?ulm4n, 8a>o y tonsilas cecales. %os 4rganos de8en estar em?acados en 2orma indi@idual, en congelaci4n con o sin -/S. %os Biso?os cloacales yIo traqueales de8en trans?ortarse inmersos en -/S con ?enicilina estre?tomicina al +J. -rocedimiento +.- #noculaci4n de em8riones. aH -esar dos gramos de cada una de las muestras ?ro8lema y colocarlas en un mortero de ?orcelana o en un triturador de teCidos ti?o .en8roecF ?ara ser macerada. Se recomienda usar morteros congelados ?ara que la muestra se adBiera al mortero y se 2acilite la maceraci4n. -ara 2acilitar el macerar tr6quea y ?ulm4n los 4rganos se ?ueden cortar en ?equeDos tro>os con tiCeras. Se ?uede utili>ar arena estAril como material a8rasi@o. .odo el ?roceso de8e reali>arse en un 6rea estAril y las muestras de8en la@arse con -/S m6s anti8i4tico antes de ser ?rocesadas si Astas no 2ueron o8tenidas en condiciones estAriles. 8H ADadir -/S estAril m6s +J de anti8i4tico Gen una ?ro?orci4n +:+', eCem?lo: + g de 4rgano m6s , ml de soluci4nH. $entri2ugar a :('' r?m durante :' minutos como mnimo, con la 2inalidad de o8tener el so8renadante li8re de contaminantes y estructuras celulares. -ara o8tener meCores resultados se recomienda 2iltrar. -ara la ?rue8a se recomienda utili>ar un mnimo de ( em8riones ?or in4culo, con ( controles ?ositi@os y ( negati@os cH e@isar los Bue@os em8rionados ?ara certi2icar edad, @ia8ilidad y locali>ar al em8ri4n; en el extremo o?uesto al lugar donde se encuentra el em8ri4n, se de8e delimitar la c6mara aArea, deline6ndola con l6?i> ?ara des?uAs, marcar el ?unto de inoculaci4n, que de8e estar locali>ado a una distancia a?roximada de 3 mm ?or encima del lmite de la c6mara aArea.

2&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

dH Desin2ectar el cascar4n con alcoBol al ='J e inocular con '.: ml de la sus?ensi4n con una Ceringa insulnica Ginoculaci4n en la c6mara alantoideaH. Sellar con resistol 8lanco o ?ara2ina incu8ar a 3=K$. e@isar con el o@osco?io a los em8riones cada :9 Brs. durante (-= das, si durante este ?eriodo alg7n em8ri4n Ba muerto se de8e o8tener el lquido alantoideo y reali>ar la ?rue8a de Bemoaglutinaci4n en ?laca yIo micro?laca. Em8riones que mueran antes de :9 Boras se considera muerte ?or traumatismo, contaminaci4n 8acteriana o toxicidad. :.- -rue8a de Bemoaglutinaci4n en ?laca. aH $olocar en una ?laca de @idrio ?re@iamente desin2ectada, de '.'( a '.+ ml de lquido alantoideo, el cual se o8tiene como se indica en el ?unto +.d. 8H Agregar soluci4n de gl48ulos roCos al (J y me>clar reali>ando mo@imientos de rotaci4n durante +-: min. %a aglutinaci4n de gl48ulos roCos indica un resultado ?ositi@o a la ?rue8a. -ara constatar que la Bemoaglutinaci4n 2ue de8ida al @irus de la EN$ es necesario reali>ar la ?rue8a de inBi8ici4n de la Bemoaglutinaci4n con suero testigo ?ositi@o contra la En2ermedad de NeEcastle. cH $olocar la misma cantidad Gde '.'( a '.+ mlH de lquido alantoideo y suero testigo ?ositi@o contra la En2ermedad de NeEcastle, me>clar reali>ando mo@imientos de rotaci4n durante +-: minutos, ?osteriormente aDadir gl48ulos roCos al (J y me>clar nue@amente. Si el lquido alantoideo es ?ositi@o al @irus de la EN$, se inBi8ir6 la Bemoaglutinaci4n con el suero testigo ?ositi@o contra la En2ermedad de NeEcastle. En el caso de que sea negati@o, la Bemoaglutinaci4n se ?resentar6. En este 7ltimo caso, es necesario reali>ar dicBa tAcnica con suero testigo ?ositi@o contra la #n2luen>a a@iar M(N:. Es im?ortante seDalar que la acti@idad Bemoaglutinante y la inBi8ici4n de la Bemoaglutinaci4n se ?ueden reali>ar en micro?laca, ya que el mAtodo es m6s sensi8le. %a Bemoaglutinaci4n que se o8ser@a en la ?rue8a de ?laca des?uAs de < minutos ?uede de8erse a contaminaci4n 8acteriana. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados Si la ?rue8a de Bemoaglutinaci4n es ?ositi@a, de8e re?etirse el ?rocedimiento con suero Bi?erinmune y si se sigue o8ser@ando Bemoaglutinaci4n, la muestra ?ro8lema se considera negati@a a la EN$. Si no existe Bemoaglutinaci4n la muestra es ?ositi@a. $uando desde la ?rimera @e> no Bay Bemoaglutinaci4n, la ?rue8a y ?or lo tanto la muestra son consideradas negati@as a la EN$. Si el 2luido es ?ositi@o a EN$, el ti?o de ce?a aislada se ?odr6 identi2icar con 8ase al tiem?o que tard4 en matar al em8ri4n, utili>ando la clasi2icaci4n americana. Cepa @elogAnica mesogAnica lentogAnica #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a un ,'J si se sigue el mAtodo descrito con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. A la8oratory Manual 2or tBe #solation and #denti2ication o2 a@ian ?atBogens. American Association o2 A@ian -atBologists. .Bird Edition. USA. +,<,. +. Infl#en%a aviar Cla"ificacin americana BCora"D :9-9< 9<-=: R =: Cla"ificacin e#ropea BCora"D 9'-)' )'-,' R ,'

Lunes 22 de febrero de 1999 .tulo

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

21

Aislamiento del @irus de #n2luen>a a@iar G#AH ?or inoculaci4n en em8ri4n de ?ollo. !8Ceti@o Aislamiento del @irus de #n2luen>a a@iar y su identi2icaci4n ?ara e2ectuar un diagn4stico concluyente. $am?o de a?licaci4n El ?rocedimiento se em?lear6 en el aislamiento del @irus de #n2luen>a a@iar en a@es en2ermas o muertas de ?ar@adas con signos clnicos y lesiones a la necro?sia que sugieran la ?resencia de #n2luen>a A@iar. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'99-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la #n2luen>a A@iar. Generalidades %a inoculaci4n en em8riones de ?ollo de , a ++ das de incu8aci4n, se utili>a en el aislamiento e identi2icaci4n del @irus de #n2luen>a A@iar, de8ido a la susce?ti8ilidad que estos em8riones ?resentan ?ara la re?licaci4n del @irus. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).=.<.,.+'./alan>a granataria $am?ana de 2luCo laminar o mecBeros $entr2uga clnica o re2rigerada $ron4metro Momogenei>ador, morteros y ?istilo de ?orcelana o mortero de .em8roecF #ncu8adora ?ara em8ri4n de ?ollo Microsco?io 4?tico, microsco?io in@ertido o estereosc4?ico Micro?i?eta de :( a :''Sl Micro?lacas de ,) ?o>os 2ondo en LUL !@osco?io.

Materiales +.:.3.9.(.).=.<.$aCas de -etri $u8re8ocas "iltros con mem8rana de nitrocelulosa ?oro de '.:: Sm. Go?cionalH. Gorros 1eringas insulnica, de ( y +' ml Micro?i?eta de :( a :'' Sl. -in>as -untas ?ara micro?i?eta

22

(Primera Seccin) ,.+'.++.+:.+3.-

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

-un>4n ?ara ?er2orar em8ri4n de ?ollo .iCeras .u8os de centr2uga .u8os de ensayo 5iales estAriles.

eacti@os eacti@os y soluciones: +.:.3.9.AlcoBol ='J Anticoagulante de Alsea@er $aldo in2usi4n de cere8ro y cora>4n. -egamento 8lanco, ?ara2ina o 8arni> ?ara uDas GselladoresH.

(.Soluci4n desin2ectante: Midr4xido de Sodio en soluci4n acuosa al :J, cloro soluci4n acuosa al :J, cloruro de 8en>alconio ). Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH estAril ?M =.:-=.9 o caldo de 2os2ato de tri?tosa estAril. =. Sus?ensi4n de ?enicilina G s4dica +'',''' U.#.Iml y sul2ato de estre?tomicina :'' mgIml. /iol4gicos. +.:.3.9.Sus?ensi4n de gl48ulos roCos de ?ollo al '.(J. Em8riones de ?ollo li8res de ?at4genos es?ec2icos de , a ++ das de incu8aci4n. Suero ?ositi@o contra el @irus de #n2luen>a a@iar M(N:. Suero ?ositi@o contra el @irus de la En2ermedad de NeEcastle.

$ondiciones am8ientales .em?eratura am8iente ideal de +< a :'K$, en condiciones de esterilidad y delimitando el cam?o de tra8aCo con mecBeros. $on medidas de 8ioseguridad e2icientes. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Muestras ?ro8lema: tr6quea, ?ulm4n, 8a>o y riD4n. %os 4rganos de8en estar em?acados en 2orma indi@idual, en congelaci4n con o sin -/S. %os Biso?os cloacales yIo traqueales de8en trans?ortarse inmersos en -/S con ?enicilina estre?tomicina al +J. +.- -re?araci4n del in4culo: aH -esar los 4rganos y Bacer una sus?ensi4n al :'J en el caldo in2usi4n de cora>4n y cere8ro o -/S. 8H .riturar en el Bomogenei>ador o con un mortero. El Bomogenei>ado se trans2iere a un tu8o de centr2uga. $entri2ugar durante +( minutos a (,''' r.?.m. cH $olectar el so8renadante y agregar anti8i4ticos: (,''' a +',''' U.#. de ?enicilina y +' a +'' mg de estre?tomicina ?or mililitro de in4culo o 2iltrar con mem8ranas de nitrocelulosa. dH DeCar actuar a los anti8i4ticos durante 3' minutos, conser@ando la muestra en re2rigeraci4n.

Lunes 22 de febrero de 1999 :.- #noculaci4n de em8riones de ?ollo:

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

aH e@isar los em8riones de ?ollo ?ara certi2icar la edad, @ia8ilidad y locali>ar el em8ri4n; en el extremo o?uesto al lugar donde se encuentra el em8ri4n se de8e delimitar la c6mara de aire y marcar el ?unto de inoculaci4n, Aste de8e estar locali>ado del lado o?uesto al em8ri4n y a una distancia a?roximada de 3 mm ?or encima del lmite de la c6mara de aire. 8H Desin2ectar el cascar4n con alcoBol al ='J y ?er2orarlo en el ?unto marcado. cH #nocular cuando menos ( em8riones ?or cada in4culo, a?licando '.: ml @a ca@idad alantoidea. dH Sellar los em8riones e incu8ar a 3=K$ durante ( a = das. e@isar con el o@osco?io cada :9 Boras.

%os em8riones que mueran durante a las :9 Boras ?ostinoculaci4n de8en descartarse. Esta mortalidad ?uede de8erse a contaminaci4n 8acteriana, toxicidad o traumatismo. %a em8riones muertos a las 9< Boras se re2rigeran y ?osteriormente se colecta el lquido amnioalantoideo. 3. #denti2icaci4n del @irus de la #.A.: aH En una caCa de -etri se colocan 3 gotas de lquido alantoideo colectado en di2erentes 6reas y se?aradas su2icientemente una de otra. A una de las gotas se le agrega un @olumen igual de suero testigo ?ositi@o contra el @irus de #n2luen>a A@iar; en la siguiente, suero testigo ?ositi@o contra el @irus de la En2ermedad de NeEcastle y en la tercera solamente soluci4n salina. Se ?ermite e2ectuar la reacci4n antgeno-anticuer?o durante ( minutos. 8H Se agrega una gota de la sus?ensi4n de eritrocitos de ?ollo a cada una de las me>clas y se agita manualmente en 2orma circular durante + minuto. "4rmulas de c6lculo En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados !8ser@ar al microsco?io. Des?uAs de ( minutos los eritrocitos en la me>cla de soluci4n salina y lquido amnioalantoideo de8e ?resentar aglutinaci4n de eritrocitos. Esto indica la ?resencia de un @irus Bemoaglutinante. En la me>cla del suero testigo ?ositi@o contra #n2luen>a A@iar y el lquido alantoideo conteniendo el @irus Bemoaglutinante, no de8e existir aglutinaci4n de eritrocitos, esto signi2ica que los anticuer?os 8loquean la acti@idad Bemoaglutinante del @irus de #n2luen>a A@iar, con2irmando la ?resencia de Aste. $on el suero testigo ?ositi@o contra la En2ermedad de NeEcastle la acti@idad Bemoaglutinante del @irus no de8e inBi8irse. Si el resultado es negati@o de8en de e2ectuarse ?rue8as de ?reci?itaci4n en agar ?ara determinar la ?resencia de las ?rotenas de la en@oltura @iral comunes ?ara todos los @irus de #n2luen>a A@iar. Si la ?rue8a de inmunodi2usi4n en gel es ?ositi@a de8er6 determinarse el su8ti?o de Bemoaglutinina y neuraminidasa ?resentes en el @irus aislado utili>ando los sueros es?ec2icos de re2erencia. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a un ,'J si se sigue el mAtodo descrito con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a o re2erencia: Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. A la8oratory Manual 2or tBe #solation and #denti2ication o2 a@ian ?atBogens. American Association o2 A@ian -atBologists. .Bird Edition. USA. +,<,. :.- Manual o2 Standards 2or Diagnostic .est and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:.

2!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Manual de .Acnicas de Diagn4stico ?ara #n2luen>a A@iar. %a8oratorio de diagn4stico de la $omisi4n MAxico-Estados Unidos ?ara la ?re@enci4n de la 2ie8re a2tosa y otras en2ermedades ex4ticas de los animales. MAxico, +,,(. Memagglutination and Memagglutination-#nBi8ition 2or #n2luen>a A@iar. A@iar Section N5S%. .tulo -rue8a de inmunodi2usi4n en gel de agar G#GAH ?ara diagn4stico de #n2luen>a A@iar G#AH. !8Ceti@o Determinar la ?resencia de anticuer?os contra el @irus de la #n2luen>a a@iar. #denti2icar el antgeno li?o?roteico de la en@oltura del @irus de la #n2luen>a a@iar. $am?o de a?licaci4n Determinar la ?resencia de anticuer?os contra antgenos de gru?o del @irus de la #n2luen>a A@iar, en a@es @acunadas o que Ban su2rido esta en2ermedad. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'99-*''-+,,(, $am?aDa Nacional contra la #n2luen>a A@iar. Generalidades %a #GA es la migraci4n concurrente de un antgeno y un anticuer?o a tra@As de una matri> de gel de agar. $uando el antgeno y los anticuer?os se ?onen en contacto se com8inan, 2ormando lneas de ?reci?itaci4n @isi8les. Equi?o e instrumentos +.:.3.Material +.:.eacti@os eacti@os y soluciones: +.:.3.9./iol4gicos: +.Antgeno solu8le del @irus de #n2luen>a A@iar ?ara #GA. Agarosa grado reacti@o ?ara electro2oresis o agar no8le. $loruro de sodio. Na$l "os2ato de sodio di86sico anBidro. "os2ato de sodio mono86sico anBidro. NaM:-!9 Na:M-!9 $aCas de -etri, +'' x +( mm. -untas ?ara micro?i?eta. %6m?ara de o8ser@aci4n en 2ondo oscuro. Micro?i?eta de +'' microlitros. Saca8ocados de ( mm.

:.Suero testigo ?ositi@o contra el @irus de #n2luen>a A@iar G2actor ?ara re2or>ar las lneas de ?reci?itaci4nH.

Lunes 22 de febrero de 1999 $ondiciones am8ientales De la8oratorio, con medidas de 8ioseguridad.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

2"

-re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Muestras de sueros sos?ecBosos. -rocedimiento aH -re?arar agarosa al +J en soluci4n salina 2os2atada '.+( M con un ?M =.:, adicionando <.(J de cloruro de sodio. 8H "undir la agarosa mediante e8ullici4n o en autocla@e durante +' minutos a +:'K$. cH Distri8uir :' ml de agarosa 2undida en caCas de -etri de +'' x +( mm. DeCar que el agar solidi2ique desta?ando ?arcialmente las caCas de -etri durante + Bora. .a?ar y conser@ar en re2rigeraci4n. dH Utili>ando la ?lantilla saca8ocados, cortar el n7mero de gru?os de ?o>os necesarios ?ara los sueros que se Ban de ?rocesar. eH $on una c6nula y un as?irador quitar el agar que se Ba se?arado al cortar los ?o>os. 2H $on la c6nula Bacer una marca ?r4xima al ?o>o que se denominar6 ?o>o numero +, los dem6s ?o>os se enumeran en el sentido de las manecillas del reloC. gH #denti2icar y Bacer una relaci4n exacta de los sueros que se someten a la ?rue8a. BH %lenar el ?o>o central con el antgeno y los ?o>os ?eri2Aricos con los sueros, coloc6ndolos en el siguiente orden: iH $on la micro?i?eta de +''Sl, se colocan en los ?o>os +, 3 y (, :(Sl de suero ?ositi@o GcontrolH en cada uno, y en los ?o>os :, 9 y ), :(Sl de suero ?ro8lema. Se em?lea una ?unta ?ara micro?i?eta ?or cada suero. CH Una @e> colocados los sueros, la caCa de -etri se ta?a y se deCa a tem?eratura am8iente durante :9 Boras, des?uAs de las cuales se e2ectuar6 la lectura. "4rmulas de c6lculo En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de los resultados El suero ?ositi@o Gde re2uer>oH siem?re 2ormar6 una lnea de ?reci?itaci4n equidistante res?ecto al ?o>o central GantgenoH. Si la reacci4n de los sueros ?ro8lema es ?ositi@a, se 2orman lneas de ?reci?itaci4n que se unir6n con las del suero control ?ositi@o dando lugar a lneas de identidad total. %os resultados o8tenidos son cualitati@os. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a un ,'J si se sigue el mAtodo descrito con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. A la8oratory Manual 2or tBe #solation and #denti2ication o2 a@ian ?atBogens. American Association o2 A@ian -atBologists. .Bird Edition. USA. +,<,. :.- Manual o2 Standards 2or Diagnostic .est and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:.

2#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Manual de .Acnicas de Diagn4stico ?ara #n2luen>a A@iar. %a8oratorio de diagn4stico de la $omisi4n MAxico-Estados Unidos ?ara la ?re@enci4n de la 2ie8re a2tosa y otras en2ermedades ex4ticas de los animales. MAxico, +,,(. .tulo #nBi8ici4n de la Bemoaglutinaci4n G#MH ?ara el diagn4stico de la #n2luen>a a@iar G#AH. !8Ceti@o Determinar la ?resencia y cuanti2icar anticuer?os es?ec2icos contra el @irus de la #n2luen>a A@iar ?resentes en el suero, sangre a8sor8ida en ?a?el 2iltro o yema de Bue@o de a@es @acunadas o que Ban su2rido una in2ecci4n con este @irus. $am?o de a?licaci4n !?erati@o de control y erradicaci4n de la #n2luen>a a@iar en MAxico. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'99-*''-+,,(, $am?aDa Nacional contra la #n2luen>a A@iar. Generalidades %a #M es la interacci4n de anticuer?os es?ec2icos con la Bemoaglutinina Bom4loga del @irus de la #A, e@itando la aglutinaci4n de los eritrocitos de ?ollo. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.Materiales +.:.3.9.$ontenedores de ?l6stico ?ara reacti@os "rascos de ?l6stico o @idrio con ta?4n de 8aquelita 1eringas de ( y +' ml. Micro?lacas con 2ondo en PUQ o con 2ondo en P5Q Agitador ?ara micro?lacas $entr2uga clnica Es?ectro2ot4metro #ncu8adora ?ara em8ri4n de ?ollo %ector ?ara micro?lacas Microaglutinosco?io Micro?i?eta multicanal con @olumen aCusta8le de +'' a :'' Sl. Micro?i?eta multicanal con @olumen aCusta8le de :( a (' Sl. !@osco?io -otenci4metro o tiras de ?a?el indicador de ?M -un>4n ?ara ?er2orar el em8ri4n de ?ollo e2rigerador domAstico.

Lunes 22 de febrero de 1999 (.).=.eacti@os eacti@os y soluciones: Micro?lacas con 2ondo ?lano -untas ?ara micro?i?etas .u8os de ensayo.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

2$

Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH, ?M de =.: a =.9. ?re?arada de la siguiente 2orma: Soluci4n A: Na:M-!9 anBidro '.+( M G:+.3 gH T Na$l <.( g T + l de agua destilada. Soluci4n /: NaM:-!9 anBidro '.+( M G+,.' gH T Na$l <.( g T + l de agua destilada. Soluci4n de tra8aCo: Soluci4n A G<' mlH T soluci4n / G:' mlH con lo cual queda aCustada a un ?M de =.: a =.9. :.- Diluyente ?ara el antgeno: Se em?lea la soluci4n de tra8aCo adicionada con '.':J de al87mina sArica 8o@ina. 3.- Anticoagulante de Alsea@er ?ara la muestra de sangre de ?ollo de donde se o8tendr6n los eritrocitos utili>ados en la ?rue8a. Dextrosa :'.( g T citrato de sodio '.< g T 6cido ctrico '.(( g T cloruro de sodio 9.: g T + l de agua destilada. Esterili>ar en autocla@e a +''K$ durante +( minutos. /iol4gicos: +.- Mue@os em8rionados de ?ollo de , a ++ das de incu8aci4n. :.- Eritrocitos de ?ollo la@ados a una concentraci4n 2inal de '.(J en -/S, los cuales se ?rocesan de la siguiente manera: aH Se colecta una muestra de sangre de un ?ollo sano con el anticoagulante de Alsea@er G@I@H. 8H Se la@an los eritrocitos en un tu8o ?ara centr2uga colocando un @olumen de sangre con Alsea@er y llenando el tu8o con -/S. cH #n@ertir el tu8o @arias @eces ?ara sus?ender ?er2ectamente los eritrocitos. dH $entri2ugar la sangre de ('' a <'' r?m, durante +' minutos. eH Eliminar el so8renadante y la ca?a de leucocitos Gca?a 8lancaH. 2H %lenar nue@amente el tu8o con la -/S. gH e?etir el ciclo de la@ado y centri2ugaci4n : @eces m6s. -osteriormente, diluir los eritrocitos a una concentraci4n 2inal de '.(J en -/S sin al87mina. 3.- Suero testigo ?ositi@o contra el seroti?o de @irus que se utili>a en la ?rue8a. 9.- Antgeno @iral GM(N:H inacti@ado. .itulaci4n del antgeno: aH #nocular Bue@os em8rionados de ?ollo de , a ++ das de incu8aci4n con '.+ ml de una diluci4n +'-3 de la ce?a @iral, @a ca@idad alantoidea.

2%

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

8H #ncu8ar los Bue@os inoculados a 3(-3)K$ ?or 3 das. e@isarlos diariamente; descartar los muertos dentro de las ?rimeras :9 Boras. e2rigerar los Bue@os con em8riones a7n @i@os a 9K$ durante toda la nocBe y cosecBar el 2luido alantoideo G"AH de todos los Bue@os Gcon em8riones @i@os o muertosH. cH #nacti@ar el @irus con 8eta-?ro?iolactona G/-%H a una concentraci4n 2inal de '.'+J ?or : Boras a tem?eratura am8iente, des?uAs deCar toda la nocBe a 9K$. %a sus?ensi4n de @irus de8e ser agitada o me>clada constantemente durante todo el ?roceso de inacti@aci4n. %a /-% es un carcin4geno y de8e ser maneCada cuidadosamente. dH Des?uAs de la inacti@aci4n, aCustar el ?M del "A de =.' a =.: usando 8icar8onato de sodio al +'J GUsualmente se requieren de +-: ml I+'' ml de "AH. eH $om?ro8ar la ausencia de @irus @ia8le en el "A inoculando Bue@os em8rionados de ?ollo, con una diluci4n Ggeneralmente +:+'H de la ?re?araci4n @iral inacti@ada. 2H $entri2ugar el antgeno a +('' r?m, ?or 3' minutos ?ara eliminar los ?reci?itados que ?uedan Ba8erse 2ormado durante el ?roceso de inacti@aci4n. $ondiciones am8ientales. De la8oratorio a tem?eratura 4?tima entre +<-:' K$ con medidas de 8ioseguridad. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. +.- .itulaci4n del antgeno ?or la ?rue8a de Bemoaglutinaci4n GMAH. El ?rinci?io de la MA se 8asa en la ca?acidad de la Bemoaglutinina, una de las dos glico?rotenas ?resentes en la su?er2icie de los ortomixo@irus, de unirse a rece?tores que se encuentran en la mem8rana de los eritrocitos. %a MA se ?roduce cuando la ?ro?orci4n de la Bemoaglutinina @iral y la de eritrocitos es 4?tima, ?ermitiendo la uni4n de @arios eritrocitos adyacentes a una unidad de Bemoaglutinina. Esto tiene ?or o8Ceto detectar y cuanti2icar la ?resencia de @irus Bemoaglutinantes aislados y ?ro?agados en Bue@os em8rionados o en culti@os celulares. .itulaci4n del antgeno ?or MA: aH $olocar (' microlitros de diluyente ?ara el @irus en cada uno de los +: ?o>os de dos 2ilas de una micro?laca con 2ondo en LUL. 8H Agregar (' microlitros en el ?rimer ?o>o de cada 2ila. cH Utili>ando micro?i?eta de (' microlitros, se e2ect7an diluciones %og: seriadas Gde +:: a +:+':9H del antgeno deCando los : 7ltimos ?o>os de cada 2ila sin antgeno ?ara que sir@an como control de eritrocitos. dH Agregar (' Sl de la sus?ensi4n de eritrocitos al '.(J a cada ?o>o y agitar la micro?laca ?ara me>clar los reacti@os. eH $u8rir la micro?laca e incu8ar a tem?eratura am8iente durante 3' minutos. eali>ar la lectura Basta que se 2orme un 8ot4n 8ien delimitado en el 2ondo de los ?o>os control de eritrocitos. #nter?retaci4n de la titulaci4n del antgeno: El ?unto 2inal de la titulaci4n ser6 en la diluci4n m6s alta del antgeno en la que se o8ser@e el +''J de Bemoaglutinaci4n. Se considera que en esta diluci4n existe una unidad Bemoaglutinante GUMAH. %a diluci4n conteniendo las UMA deseadas del antgeno se determina di@idiendo el ?unto 2inal de la MA entre el n7mero de unidades. :.- Muestras de suero. aH #denti2icar con exactitud las muestras ?ro8lema que se someter6n a la ?rue8a.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

29

8H Diluir los sueros en una micro?laca con 2ondo ?lano identi2icada como L?laca de la diluci4n inicialL Gdiluci4n +:(H, de?ositando en todos los ?o>os +'' microlitros de -/S y, ?osteriormente, de?ositar :( microlitros de cada suero en el ?o>o res?ecti@o, siguiendo el orden secuencial de las muestras. ECem?lo: En el ?o>o A+ colocar el suero n7mero +; en el ?o>o A+: el suero n7mero +:; en el ?o>o /+ el suero n7mero +3 y as sucesi@amente Basta el ?o>o M+: en el cual se colocar6 el suero n7mero ,). 3.- Muestras de sangre en ?a?el 2iltro. aH Macer una relaci4n exacta de las muestras que se someter6n a ?rue8a. 8H econstituir las muestras en una micro?laca con 2ondo ?lano identi2icada como L?laca de la diluci4n inicialL Gdiluci4n +:(H. En el extremo de la tira de ?a?el 2iltro en el que se encuentra la muestra, cortar un tro>o de : mm de largo y colocarlo en uno de los ?o>os de la micro?laca G?uesto que el ?a?el mide (' x ( mm, : mm de largo tendr6n una su?er2icie de +' mm: que a8sor8er6n los :( microlitros de la muestra que se requieren ?ara la diluci4n indicada ?re@iamenteH. cH De?ositar +'' microlitros de -/S en cada ?o>o que contenga una muestra. dH Agitar durante + Bora como mnimo. 9.- Muestras de yema de Bue@o. aH #denti2icar ?er2ectamente y ordenar los gru?os de Bue@o que se someter6n a la ?rue8a coloc6ndolos con la c6mara de aire Bacia arri8a. 8H $on un ?un>4n, ?er2orar el ?olo su?erior del cascar4n. cH !8tener '.( ml de la yema, utili>ando una Ceringa de ( ml con aguCa cali8re +9 x 3= mm introduciendo la aguCa a?roximadamente 3 cm a tra@As de la ?er2oraci4n Basta llegar a Asta. dH 5ertir una gota de la yema en un ?o>o de una micro?laca con 2ondo ?lano identi2icada como L?laca de la diluci4n inicialL ?ara reali>ar la diluci4n de inicio G+:(H, utili>ando un ?o>o ?or cada muestra Guna gota de la yema equi@ale a un @olumen de (' microlitrosH. eH Agregar :'' microlitros de -/S en cada uno de los ?o>os que contienen una muestra y agitar durante 3' minutos. Estas micro?lacas con la diluci4n inicial ?odr6n sellarse y conser@arse en congelaci4n ?ara e2ectuar ?rue8as ?osteriores. -rocedimiento -rue8a de la #M G?rue8a tami>H aH $on una micro?i?eta de +: canales, trans2erir :( microlitros de las muestras de cualquiera de los casos antes mencionados, a la lnea de ?o>os A+ al A+: de la micro?laca de la diluci4n inicial Gdiluci4n +:(H a la ?rimera lnea de ?o>os de una micro?laca con 2ondo en LUL en la que se e2ectuar6 la ?rue8a y en la que ?re@iamente se Bayan colocado :( microlitros de -/S ?ara la reali>aci4n de dos diluciones do8les seriadas. 8H Me>clar las muestras y trans2erir :( microlitros de los ?o>os de la lnea A a la /, se me>clan nue@amente y se descartan :( microlitros. En la lnea A la diluci4n quedar6 +:+' y en la lnea / ser6 +::'. cH Esta o?eraci4n se re?ite con los dem6s sueros em?leando : ?o>os ?or cada suero. En cada micro?laca de ?rue8a se de8e tener un suero ?ositi@o y eritrocitos s4lo con -/S como testigos. dH Una @e> e2ectuadas las diluciones agregar :( microlitros del antgeno de #n2luen>a A@iar, diluido en el LDiluyente ?ara el antgenoL, conteniendo 9 UMAI:( microlitros. $u8rir, agitar e incu8ar la micro?laca a tem?eratura am8iente durante 3' minutos. %a diluci4n conteniendo las 9 UMA del antgeno que se requieren ?ara la ?rue8a se determina di@idiendo el ?unto 2inal de la MA entre el n7mero de unidades deseadas. ECem?lo: .tulo del antgenoO:() UMA, unidades deseadasO 9 G:()I9O)9H, Baciendo una diluci4n +:)9 se o8tendr6n 9 UMA en :( microlitros.

&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Des?uAs de agregar la diluci4n del antgeno se de8er6 com?ro8ar el n7mero de UMA utili>adas en la ?rue8a. eH Agregar (' microlitros de la sus?ensi4n de eritrocitos de ?ollo al '.( J a cada ?o>o, cu8rir y agitar la micro?laca e incu8ar a tem?eratura am8iente Basta que los eritrocitos testigo sedimenten Basta 2ormar un 8ot4n 8ien delimitado G3'-9( minutosH. 2H Algunos sueros contienen aglutininas naturales que aglutinan en 2orma ines?ec2ica a los eritrocitos y si no se eliminan ?ueden o8tenerse resultados err4neos G2alsos negati@osH. Estas reacciones ines?ec2icas en las diluciones iniciales ?ueden e@itarse diluyendo los sueros +:+' y em?leando Asta como diluci4n inicial. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados -rue8a de la #M. Esta ?rue8a se lee cuando los eritrocitos testigo sedimenten, 2ormando un 8ot4n circular, con 8ordes 8ien delimitados, en el 2ondo del ?o>o. %a inBi8ici4n de la Bemoaglutinaci4n ?roducida ?or los sueros ?ositi@os tiene un ?atr4n semeCante al de los eritrocitos testigo, un 8ot4n circular con 8ordes de2inidos que se desli>a tomando la 2orma de una gota en el 2ondo del ?o>o, al inclinar la micro?laca en un 6ngulo de 9(K. $uando los sueros son negati@os y no alcan>an a inBi8ir la acci4n Bemoaglutinante del antgeno, los eritrocitos se sedimentan 2ormando una ca?a uni2orme en el 2ondo de los ?o>os. De8er6 e2ectuarse la titulaci4n ?ara determinar el ?unto 2inal de las muestras que resulten ?ositi@as en esta ?rue8a tami>, reali>ando un n7mero mayor de diluciones %og: seriadas. .odos los sueros que ?rodu>can inBi8ici4n de la Bemoaglutinaci4n en la diluci4n +:+' de8en considerarse ?ositi@os. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito, con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a Maemagglutination and Maemagglutination - #nBi8ition 2or A@ian #n2luen>a. A@ian Section, National 5eterinary Ser@ice %a8oratory, USDA. Maemagglutination and Maemagglutination - #nBi8ition .est !22icial. 1ournal o2 tBe Euro?ean $ommunities, No. + +)=I++. Manual de .Acnicas de Diagn4stico ?ara #n2luen>a A@iar. %a8oratorio de diagn4stico de la $omisi4n MAxico-Estados Unidos ?ara la ?re@enci4n de la 2ie8re a2tosa y otras en2ermedades ex4ticas de los animales. MAxico, +,,(. Manual o2 Standards 2or Diagnostic .est and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. MAtodos ?ara Ex?resar las .asas de Anticuer?os. .Brus2ield, M. E?idemiologa 5eterinaria. Ed. Acri8ia. Es?aDa, +,,'. ,. Salmonelo"i" aviar .tulo Aislamiento e identi2icaci4n de Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum. !8Ceti@o

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

Aislamiento e identi2icaci4n de Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum a ?artir de es?ecmenes a@iares. $am?o de a?licaci4n -ara la o8tenci4n de la constancia de ?ar@adas, granCas, em?resas, a@es li8res y en control; as como ?ara el muestreo en regiones o >onas de erradicaci4n tendientes a su li8eraci4n. Documentos conexos a consultarse. Norma !2icial Mexicana N!M-''(-*!!-+,,3, $am?aDa Nacional contra la Salmonelosis A@iar. Generalidades %a salmonelosis de las a@es causada ?or Salmonella pullorum o Salmonella gallinarum es una en2ermedad que a2ecta a las gallinas, ?a@os, ?ollos, ?atos, 2aisanes, guaColotes, a@es de com8ate, a@es de ornato, a@es canoras y a@es sil@estres comerciales en ?roducci4n o crian>a. %a Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural mantiene un ?rograma de cam?aDa ?ara su control, erradicaci4n y li8eraci4n. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).=.Materiales +.:.Asas 8acteriol4gicas /alan>a granataria $ongelador Digestor Estu2a 8acteriol4gica MecBeros Microsco?io 4?tico e2rigerador.

$aCas de -etri de +( x +'' 3.9.(.).=.<.,.+'.++.$Barolas Es?6tulas "rascos de cristal medianos esterili>a8les Gti?o Ger8erH Morteros de ?orcelana -in>as -ortao8Cetos .iCeras .u8os de @idrio cIta?4n de rosca /olsas de ?l6stico, estAriles, ?ara el digestor.

eacti@os Medios de culti@o requeridos ?ara el aislamiento de S. pullorum y S. gallinarum.

(Primera Seccin) aH 8H cH dH -

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

$aldos de enriquecimiento selecti@os y no selecti@os: $aldo tetrationato con @erde 8rillante $aldo tetrationato $aldo selenito Medios de culti@o: Agar Mac$onFey Agar @erde 8rillante Agar &%.-9 Medios ?ara 8ioqumica: $itrato de Simmons %#A M#! S#M .S# Urea "enilalanina Medios ?ara 8ioqumica com?lementarios: $aldo malonato Dulcitol Glucosa con tu8o DurBam %actosa Maltosa .artrato de 1ord6n

/iol4gicos: eH Antisueros requeridos ?ara seroti?i2icaci4n: Antisuero ?oli@alente Ai and 5i. Antisuero som6tico GL!LH gru?o D+ "act +, ,, +:

$ondiciones am8ientales De la8oratorio. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %as muestras de Bgado, 8a>o, @escula 8iliar, o@arios, testculos, tonsilas cecales, ?6ncreas, mAdula 4sea, saco @itelino y em8riones no requieren de un tratamiento es?ec2ico antes de su an6lisis, s4lo su conser@aci4n en re2rigeraci4n en 2rascos o 8olsas estAriles de ?olietileno no m6s de :9 Boras.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%os Biso?os cloacales yIo Biso?os con Beces 2rescas se de8en en@iar en reci?ientes estAriles, BermAticamente cerrados, de8en contener agua ?e?tonada o cualquier otro medio de trans?orte adecuado ?ara el gAnero Salmonella y de8en conser@arse en re2rigeraci4n no m6s de 9< Boras y Astas de8en @enir acom?aDadas de su Bistoria clnica com?leta, con las 2ecBas de toma de muestra y en@o al la8oratorio. %as Barinas de origen a@iar de8en ser remitidas en 8olsas de ?olietileno o 2rascos estAriles. El Bue@o de8e remitirse en contenedores que ?roteCan al Bue@o y en re2rigeraci4n. -rocedimiento MAtodo ?ara el aislamiento de S. pullorum y S. gallinarum: $olocar la muestra en caldo de enriquecimiento en una ?ro?orci4n de +:+' muestra caldo yIo inocular en medios s4lidos. #ncu8ar durante :9 Boras a 3=K$. En caso de ser negati@o el crecimiento a Salmonella sp; resem8rar a las 9< y =: Boras, antes de desecBar el medio lquido de enriquecimiento. #nocular colonias sos?ecBosas a medios ?ara identi2icaci4n 8ioqumica. #ncu8ar durante :9 Brs. a 3=K$. -roceder a la seroti?i2icaci4n. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados Se considera negati@o el resultado cuando des?uAs de sem8rar a las :9, 9< y =: Boras no Bay crecimiento o colonias sos?ecBosas de Salmonella. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. A %a8oratory Manual 2or tBe #solation and identi2ication o2 a@ian ?atBogens. .Bird ed. +,<,. .Be American Association o2 a@ian ?atBologists. .tulo Aglutinaci4n r6?ida en ?laca con suero o sangre com?leta GA-S-H ?ara diagn4stico de salmonelosis a@iar. !8Ceti@o Detecci4n de anticuer?os en a@es ?ortadoras de Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum. $am?o de a?licaci4n -ara la o8tenci4n de la constancia de ?ar@adas ?rogenitoras y re?roductoras li8res de salmonelosis a@iar. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''(-*!!-+,,3, $am?aDa Nacional contra la Salmonelosis A@iar. Generalidades

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Esta ?rue8a ?uede ser a?licada como ?rue8a de cam?o o en el la8oratorio a?ro8ado ?or la Secretara como com?lementaria a la 8acteriol4gica. Equi?o e instrumentos: +.:.Materiales. +.:.AguCa ?ara sangrado Algod4n o toallas desecBa8les Aglutinosco?io met6lico o de madera con 2uente de lu> ?ara 2acilitar la lectura $ron4metro

3.Asa 8acteriol4gica de '.'3 ml, tu8o ca?ilar de @idrio, gotero, ?i?eta graduada o ?i?eta -asteur. 9.(.eacti@os /iol4gicos: Antgeno U ?oli@alente de Salmonella pullorum com?uesto ?or ce?as est6ndar y @ariantes. Sueros testigos ?ositi@os y negati@os. -alillos de madera. -laca de @idrio ?ara la ?rue8a de aglutinaci4n o ?ortao8Cetos.

$ondiciones am8ientales %a tem?eratura 4?tima ?ara lle@ar a ca8o la ?rue8a es de :' a :: grados centgrados, si Asta es mayor ocurrir6 una m6s r6?ida e@a?oraci4n o dar6 aglutinaci4n de ti?o ines?ec2ica; ?or el contrario, si es menor la reacci4n ser6 m6s lenta. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra De8en tomarse las ?recauciones necesarias, ?ara mantener cauti@as las a@es que se @an a muestrear. -ara el caso de muestras de suero, Aste de8e ser conser@ado en condiciones de re2rigeraci4n, con la ?re@ia se?araci4n del co6gulo, las muestras no de8en estar Bemoli>adas. -rocedimiento -uncionar la @ena 8raquial. $olectar una gota de sangre con un asa 8acteriol4gica o tu8o ca?ilar. $olocar la gota en una ?laca de @idrio. Adicionar una gota de '.'3 ml del antgeno U ?oli@alente.

Me>clar la sangre con el antgeno teDido y agitar la ?laca con un ?alillo de madera, utili>ando un ?alillo ?ara cada muestra, mo@er la ?laca con 3 o 9 mo@imientos rotatorios en 2orma manual. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"

El resultado de la ?rue8a se considera ?ositi@o si la aglutinaci4n ocurre entre cero y no@enta segundos des?uAs de me>clar la muestra de sangre o del suero con el antgeno. El resultado de la ?rue8a se considera sos?ecBoso si la aglutinaci4n ocurre entre no@enta y ciento @einte segundos des?uAs de me>clar la muestra de sangre o suero con el antgeno. El resultado de la ?rue8a se considera negati@o si la aglutinaci4n ocurre des?uAs de +:' segundos ?osteriores a la me>cla de la muestra de sangre o suero con el antgeno. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Norma !2icial Mexicana N!M-''(-*!!-+,,3, $am?aDa Nacional contra la Salmonelosis A@iar. $ulture MetBods 2or tBe Detection o2 Animal Salmonellosis and Ari>onosis. A manual o2 tBe American Association o2 5eterinary %a8oratory. Diagnosticians. #oEa States Uni@ersity -ressIAmes +,=). 1-. Dia/n"tico ta=onmico de /arrapata" .tulo Diagn4stico taxon4mico de garra?atas. !8Ceti@o #denti2icaci4n taxon4mica de las garra?atas de mayor im?ortancia en MAxico. $am?o de a?licaci4n %a metodologa aqu descrita es ?ara a?licarse en los la8oratorios de ?rue8as que reali>an el diagn4stico de las in2estaciones ?or garra?ata de uno y tres BuAs?edes comunes en el ganado 8o@ino. En el ?resente a?artado se descri8en 8re@emente las caractersticas mor2ol4gicas de algunos gAneros de garra?atas ?ara su identi2icaci4n. Aunque las cla@es aqu seDaladas no ?ermiten determinar todas las es?ecies que se conocen en nuestro ?as, 8rindan orientaci4n en cuanto a los ti?os de garra?atas ?redominantes en la in2estaci4n de los animales. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'+,-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. Equi?o e instrumentos. +.:.Materiales +.:.3.9.eacti@os: +.AlcoBol ='J $aCas de -etri desecBa8les o de cristal -lastilina AguCa de disecci4n -in>as de reloCero o de disecci4n Microsco?io estereosc4?ico %6m?ara de restirador

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

$ondiciones am8ientales No se requieren en es?ecial. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra No Bay requerimientos. -rocedimiento -ara e2ectos de una adecuada clasi2icaci4n se ex?lican inicialmente los tArminos utili>ados ?ara la taxonoma. Amb#lacro.@ tam8iAn conocido como ?ul@ilo, es un 4rgano adBesi@o que se encuentra en el extremo distal del tarso y sir@e de 8ase a las garras. Se encuentra m6s desarrollado en la 2amilia #xodidae que en la Argasidae. Camero"toma.@ es un re?liegue del idiosoma que sir@e ?ara aloCar el gnatosoma. Cap#cCn.@ es un 8orde del camerostoma que ?uede cu8rir total o ?arcialmente el gnatosoma, encontr6ndose muy desarrollado en el gAnero 'rnitho oros spp, ?erteneciente a la 2amilia Argasidae. Co=a.@ ?equeDas ?lacas muy escleroti>adas de ?osici4n @entral, que re?resentan el ?rimer arteCo de las ?atas. A cada coxa se le une un troc6nter m4@il. Se designan con n7meros romanos de la ?arte anterior a la ?osterior del idiosoma. C#erno".@ ?royecciones quitinosas del 8orde ?osterior de la 8ase del gnatosoma en sus ?orciones laterales. Diente".@ ?royecciones ?equeDas y cur@as, so8re la >ona @entral del Bi?ostoma. E"c#do.@ ?laca dorsal muy esclero>ada, de ?osici4n ?osterior al gnatosoma en las garra?atas duras. $u8re casi ?or com?leto la su?er2icie dorsal del idiosoma del macBo, y a?roximadamente la mitad de esta su?er2icie en la Bem8ra ?oco re?leta. E"cotad#ra.@ Bendiduras o conca@idades ?resentes en las coxas, ?orciones de los miem8ros y ?lacas adanales. E"polone".@ ?royecciones redondeadas y ?untiagudas, ?equeDas o grandes de la su?er2icie o del margen ?osterior de las coxas. %as ?royecciones situadas so8re la cara media se llaman es?olones internos y las de la cara lateral se denominan es?olones externos. Estas estructuras tam8iAn se ?resentan en el extremo distal de los tarsos. E"pina.@ sin4nimo de es?ol4n. E"pina ca#dal.@ ?royecci4n quitinosa del 8orde ?osterior del idiosoma. Fe"tone".@ 6reas rectangulares uni2ormes, se?aradas ?or surcos 8ien ?atentes, que se locali>an en el 8orde ?osterior del idiosoma de mucBos gAneros de garra?atas duras, tanto en macBos como en Bem8ras, ?udiendo ?resentarse le@es o muy marcados seg7n estado de re?leci4n y seg7n el gAnero @aran en n7mero de = a ++. Eenital6 orificio.@ a8ertura externa de los 4rganos sexuales, ?resentes s4lo en el estadio adulto Bem8ras o macBos, ausente en el estadio nin2al y lar@al. En los macBos de la 2amilia #xodidae tiene 2orma de ranura, y en las Bem8ras de la misma 2amilia su 2orma generalmente es de LUL. En es?ecmenes ?oco re?letos se encuentra situado a la altura del :o. ?ar de coxas so8re la lnea media. En los macBos de la 2amilia Argasidae es en 2orma de una semi-luna, y en las Bem8ras es en 2orma de ranura, se encuentra situado a la altura del ?rimer ?ar de coxas. Elob#lo"o.@ tam8iAn conocidos como Anillos o Es2eras, son estructuras circulares locali>adas en las ?lacas estigmatales y @aran en tamaDo y n7mero seg7n gAnero y es?ecie.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

Enato"oma.@ ?orci4n anterior y m4@il del idiosoma de las garra?atas duras G#xodidaeH, que incluye la 8ase del gnatosoma, ?edi?al?os, Bi?ostoma y queliceros. %ocali>ado @entralmente en las garra?atas 8landas GArgasidaeH Fipo"toma.@ estructura que 2orma ?arte del gnatosoma, locali>ado @entralmente y en el que se asientan los dientes, su 2orma ?uede ser en 2orma de ma>o o de ?unta de 2lecBa. :.nea de S#t#ra.@ lnea 8ien ?erce?ti8le del cuer?o de las garra?atas del genero Argas, que marca la se?araci4n entre la su?er2icie dorsal y @entral. ;ameln.@ ?rotu8erancia quitinosa de 2orma es2eroide ?resente en el 8orde interno de los 2estones. Orificio anal.@ a8ertura ?or la cual se desecBan los ?roductos 2inales de la digesti4n. Est6 situado @entralmente so8re la lnea media y ?osterior al 7ltimo ?ar de ?atas. Ornamento".@ di8uCos o estructuras que se locali>an so8re la su?er2icie del escudo o del tegumento. 1ata".@ 4rganos de locomoci4n, 2ormados ?or seis arteCos: coxa, troc6nter, 2Amur, ti8ia, ?retarso y tarso, este 7ltimo lle@a las usa y otras estructuras como el am8ulacro. 1laca e"ti/matal.@ 4rganos res?iratorios en n7mero ?ar, locali>ados a los lados en la su?er2icie del cuer?o de las garra?atas y atr6s del 7ltimo ?ar de coxas en los ixodidos y entre el 3er. y 9o. ?ar de coxas en los arg6sidos. Est6n ?resentes en los estados nin2al y adulto, su 2orma ?uede ser o@al, redonda o en 2orma de coma. 1laca" acce"oria".@ estructuras quitinosas, alargadas, situadas en la ?orci4n ?osterior y @entral del idiosoma al lado externo de las ?lacas adanales. 1laca" adanale".@ de la misma naturale>a y 2orma de las anteriores, se encuentran situadas en ?orci4n ?osterior y @entral del idiosoma a los lados del ori2icio anal. 1edipalpo".@ son estructuras que 2orman ?arte del gnatosoma, est6n en n7meros ?ar y articulados, se locali>an a los lados del Bi?ostoma y los queliceros. 1oro"a"6 *rea".@ de?resiones ?ares que se locali>an en la 8ase del gnatosoma de las Bem8ras de la 2amilia ixodidae 7nicamente. 1rot#berancia.@ cualquier ele@aci4n o ?rominencia en una su?er2icie. G#elicero".@ estructuras ?ares de situaci4n dorsal al Bi?ostoma, sir@en ?ara cortar la ?iel del BuAs?ed y como 4rganos de 2iCaci4n. Repleta.@ agrandamiento o distensi4n de una garra?ata des?uAs de una ingesti4n de sangre. $omo el escudo de las garra?atas Bem8ras de la 2amilia #xodidae es ?arcial, ?ermite esta distensi4n. $uando la garra?ata est6 llena de sangre, el escudo se a?recia como una ?equeDa ?laca en la ?arte anterior del idiosoma. En los Argasidae, el escudo no existe en am8os sexos, ?or lo que, tanto el macBo como la Bem8ra, llegan a agrandarse ?ero no en la misma ?ro?orci4n que las Bem8ras de las garra?atas duras. S#rco Anal.@ se ?resenta en toda la 2amilia ixodidae situado ?osterior al ano a exce?ci4n del gAnero ()o es en el que es ?reanal. <e/#mento.@ la cu8ierta m6s exterior, llamada tam8iAn cutcula, del cuer?o de las garra?atas. 4e"ti/ial.@ rudimentario, de escaso desarrollo. Una @e> que se tiene conocimiento de los nom8res de las di2erentes estructuras externas de una garra?ata, se ?rocede a su identi2icaci4n. En los cuadros que se anexan ?ueden identi2icarse algunas de las ?artes re2eridas en este glosario de tArminos. Equi?o e instrumentos +.%6m?ara ?ara restirador

(Primera Seccin) :.-

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Microsco?io estereosc4?ico o lu?a

Materiales +.:.3.9.eacti@os: +.-rocedimiento Una @e> eliminado el exceso de lquido conser@ador, 2iCar el es?Acimen en ?lastilina. Si la garra?ata est6 re?leta, es aconseCa8le extraer su contenido mediante ?unci4n de la ?arte @entral del #diosoma. El ?rimer reconocimiento de8er6 iniciarse ?or la regi4n dorsal, con el auxilio de una lu?a o microsco?io estereosco?io. $la@es ?ara la identi2icaci4n de Garra?atas.+.- %ongitud de ?edi?al?os.aH $ortos y gruesos. GAneros *ermacentor+ ,hipicephalus y Anocentor . 8H $ortos en 2orma de aisladores de lu>. GAnero Boophilus. cH $ortos y el segundo ?ar de arteCos ensancBados lateralmente en 2orma de cam?ana. GAnero -aemaphysalis. dH %argos y delgados, m6s largos que la 8ase del gnatosoma y el :o. ?ar de arteCos el do8le de largos que de ancBo. GAnero Amblyomma. eH %argos, el :o. y el 3er. ?ar de arteCos m6s o menos de igual medida. GAnero ()o es. 2H No @isi8le dorsalmente en nin2as ni adultas y @isi8les en lar@as. "amilia Argasi ae. :.- Base el .natosoma. aH De 2orma cuadrangular. GAnero *ermacentor y Anocentor . 8H De 2orma Bexagonal ensancBada lateralmente. GAnero Boophilus y ,hipicephalus. cH De 2orma ?entagonal ensancBada en la 8ase y acortado en el @Artice. GAnero Amblyomma. dH De 2orma cuadrangular y ?equeDo. GAnero -aemaphysalis. eH De 2orma ?entagonal ensancBada en sus lados. GAnero ()o es. 2H No @isi8le dorsalmente. "amilia Argasi ae. 3.- Escudo en Bem8ras. aH -equeDo de color ca2A roCi>o sin di8uCos ornamentales. GAnero Boophilus. 8H egular tamaDo, con 8ordes angulados ?uede ?resentar mucBos o ?ocos di8uCos ornamentales en color 8lanco @erdoso. GAnero *ermacentor . AlcoBol etlico al ='J AguCa de disecci4n -a?el 8lanco -a?el secante -lastilina 8lanca

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

cH !cu?a una cuarta ?arte del total del idiosoma con mucBos di8uCos ornamentales. GAnero Amblyomma a exce?ci4n de las es?ecies Amblyomma inornatum y Amblyomma parvum. dH -equeDo en 2orma semicircular sin di8uCos ornamentales. GAnero ()o es. eH -equeDo, de color ca2A roCi>o sin di8uCos ornamentales. GAnero Anocentor , -aemaphysalis y ,hipicephalus G?ueden con2undirse con Boophilus.H 2H $arecen de escudo. "amilia Argasi ae. 9.- Escudo en MacBos. aH De color ca2A roCi>o. GAneros Boophilus+ Anocentor+ -aemaphysalis y 8H Nada, mucBos o ?ocos di8uCos ornamentales en color 8lanco-@erdoso. GAnero *ermacentor . 8H A8undantes di8uCos ornamentales exce?tuando las es?ecies Amblyomma (nornatum y Amblyomma parvum; en colores met6licos, ?lateado, dorado y 8lanco @erdoso. GAnero Amblyomma. cH $arece de di8uCos ornamentales siendo de color ca2A o8scuro. GAnero ()o es y -aemaphysalis. eH $arecen totalmente de escudo. "amilia Argasi ae. (.- "estones. aH %igeramente marcados ocasionalmente en Bem8ras, y no distingui8les 26cilmente en macBos. GAnero Boophilus. 8H -erce?ti8les a sim?le @ista en macBos y Bem8ras ?oco re?letos. GAnero Amblyomma. cH -ueden ser muy marcados en algunas es?ecies o ?oco ?erce?ti8les en otras. GAneros *ermacentor y -aemaphysalis Gen Bem8ras re?letas no se a?reciaH. dH En n7mero de = ?oco ?erce?ti8les. GAnero Anocentor . eH -oco ?erce?ti8les en Bem8ras, ?erce?ti8les en macBos, ?resentando un alargamiento y ensancBamiento ligero en el 2est4n central. GAnero ,hipicephalus. 2H $arecen totalmente. GAnero ()o es. gH No ?resentan. "amilia Argasi ae Estructuras a considerar en la regi4n @entral:+.- /ase del Gnatosoma: No existe mucBa di2erencia de la @ista dorsal. "amilia ()o i ae. #m?lantaci4n @entral. "amilia Argasi ae. :.- -edi?al?os: Al igual que en examen dorsal se @e su 2orma y longitud. "amilia ()o i ae. SemeCante a ?atas. "amilia Argasi ae. 3.- Mi?ostoma: .anto en la 2amilia ()o i ae como Argasi ae ?resenta 2orma de ma>o o de ?unta de lan>a. 9.- !ri2icio Genital: $on macBo y Bem8ra de ()o i ae y Argasi ae. Sin nin2as y lar@as de ()o i ae y Argasi ae. (.- Miem8ros locomotores:

!&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

$on tres ?ares de ?atas, estadios lar@arios de am8as 2amilias. $on 9 ?ares de ?atas, estadios nin2al y adultos en am8as 2amilias. ).- Distri8uci4n de miem8ros: aH #m?lantaci4n a todo lo largo del idiosoma, ocu?ando 3I9 ?artes de su?er2icie @entral en casi todos los gAneros de la 2amilia ()o i ae a exce?ci4n del gAnero ()o es, en el que est6n agru?ados en la ?orci4n anterior ocu?ando una cuarta ?arte. 8H En la 2amilia Argasi ae est6n im?lantados radialmente. =.- $oxas aH El ?rimer ?ar de 2orma triangular a?enas ?erce?ti8le la escotadura en las Bem8ras. GAnero Boophilus. 8H -rimer ?ar de coxas 82idas con escotadura ?ro2unda ?resente. GAneros Amblyomma, *ermacentor y ,hipicephalus. cH -rimer ?ar de coxas con es?ol4n agudo y dirigida su ?unta a la ?arte ?ostero-interna del idiosoma. GAnero ()o es y -aemaphysalis. dH $uarto ?ar, de coxas sin es?ol4n en macBos ni Bem8ras. GAnero Boophilus. eH $uarta coxal con es?ol4n ?erce?ti8le al microsco?io, en los macBos Asta se encuentra muy desarrollada. GAneros *ermacentor y Anocentor . 2H Es?ol4n en la cuarta coxal m6s o menos ?rominente m6s constante en macBos que en Bem8ras. GAnero Amblyomma. gH En la cuarta coxa casi siem?re ?resentan es?ol4n. GAneros ()o es, -aemaphysalis y ,hipicephalus. BH Sin es?olones en las coxas. "amilia Argasi ae. <.- -lacas Adanales y Accesorias: aH Sumamente desarrolladas, siendo las accesorias ligeramente m6s cortas, ?resent6ndose exclusi@amente en macBos. GAnero Boophilus 8H -lacas adanales 8ien desarrolladas, accesorias rudimentarias, ?resentes exclusi@amente en macBos. GAnero ,hipicephalus. ,.- -rolongaci4n caudal: aH Se ?resenta en el 8orde ?osterior del idiosoma de los macBos. Boophilus microplus 8H Se le considera como ?rolongaci4n caudal al a8ultamiento que ?resenta el )o. "est4n. GAnero ,hipicephalus +'.- Mamelones: aH -rotu8erancias quitini>adas locali>adas en el 6ngulo interno de los 2estones, con exce?ci4n del 2est4n central, sumamente desarrollados en Bem8ras. Amblyomma cajenense. 8H Moderadamente desarrollados tanto en macBos como Bem8ras. Amblyomma triste. "4rmulas ?ara el c6lculo de resultados En esta tAcnica no se utili>an.

Lunes 22 de febrero de 1999 #ndices de re?roducti8ilidad y re?eti8ilidad

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

!1

Se considera de un ,(J en tAcnicos 2amiliari>ados con la o8ser@aci4n de garra?atas al microsco?io. /i8liogra2a /alasBo@ N.S. /lodsucFing ticFs G#xodoideaH 5ector o2 disease o2 man and animal. Misc. -u8lic. Entomol. Soc. Am. <, +,=:. Manual on li@estocF ticFs 2or animals disease erradication G+,)(H Di@ision -ersonnel. USDA. N7De>, 1.%. /oo?Bilus micro?lus. %a garra?ata com7n del ganado @acuno. Ed. Memis2erio Sur. Argentina +,<=. Urant>, G.V. A manual o2 acarology. :a. ed !regon State Uni@ersity. USA, +,=<. Anapla"mo"i" bovina .tulo. -rue8a de tarCeta ?ara el diagn4stico de Anaplasma marginale. !8Ceti@o Detectar anticuer?os mediante reacci4n #nmunol4gica secundaria de animales ?re@iamente ex?uestos a A. marginale. $am?o de a?licaci4n Este ?rocedimiento tiene a?licaci4n ?ara la8oratorios de ?rue8as que realicen el diagn4stico serol4gico de la Ana?lasmosis 8o@ina causada ?or Anaplasma marginale. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'+,-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. Generalidades Es una ?rue8a sencilla, 26cil de reali>ar en cam?o y en la8oratorio, con una inter?retaci4n o8Ceti@a; ?ermitiendo o8tener resultados en un mnimo de tiem?o y adem6s no requiere de material altamente es?eciali>ado. Equi?o e instrumentos Un rotor con@encional y tarCetas o ?lacas de @idrio. Materiales +.:.3.eacti@os +.:.3.Antgeno de Anaplasma marginale "actor SArico /o@ino G"S/H Suero control ?ositi@o y Suero control negati@o Micro?i?etas ?ara +( y 3' microlitros o tu8os ca?ilares ?ara +( y :' microlitros -untas A?licadores de madera y un marcador

$ondiciones am8ientales

!2

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Esta ?rue8a de8e reali>arse en condiciones medioam8ientales con tem?eratura de ::K$ a :)K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Se?arar el suero del co6gulo mediante centri2ugaci4n. $olocar en @iales, identi2icar y tra8aCar la muestra. Si no se ?rocesa la muestra inmediatamente, Asta de8er6 congelarse a -=' K$. Acondicionarla a tem?eratura am8iente ?ara su ?rocesamiento, al igual que los reacti@os 8iol4gicos. -rocedimiento +.- En el crculo n7mero uno de la ?laca se de?osita '.'3 ml de suero control ?ositi@o, en el dos suero control negati@o y en los siguientes los sueros ?ro8lema. :.- $on la Ceringa en ?osici4n @ertical se de?osita '.'3' ml de 2actor sArico 8o@ino G"S/H en cada crculo sin me>clarlos. 3.- Agitar sua@emente la sus?ensi4n de antgeno antes de usarla. $on la Ceringa en ?osici4n @ertical de?ositar '.'+( ml en cada uno de los crculos de ?rue8a, sin me>clarlos. 9.- $on un ?alillo lim?io y seco me>clar y dis?ersar cuidadosamente los tres reacti@os 8iol4gicos, llenando com?letamente el crculo de ?rue8a. (.- Se agita la ?laca en un rotor ?or 9 minutos de +'' a ++' rotaciones ?or minuto, e@itando que las muestras se me>clen entre s. ).- Macer la lectura inclinando sua@emente la ?laca so8re una 2uente de lu> 8lanca con 2ondo negro. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados esultado ?ositi@o: aglutinaci4n caracterstica desde ligera ?ero de2inida, Basta marcada o intensa. esultado negati@o: no Bay aglutinaci4n. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad ,(J si se sigue literalmente el mAtodo descrito, con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a Amerault, .E. and o8y, ..!. A ra?id card aglutination test 2or /o@ine ana?lasmosis. 1ournal o2 American 5eterinary Medical Association. +(3 G+:H:+<:<-+<39. +,)(. $Bristen8erry, $.$. and Alley, 1.%. And e@aluation o2 tBe ra?id card aglutination test 2or tBe ana?lasmosis in 2ield diagnosis erradication studies. -roceedings o2 tBe United State Animal MealtB Association. =):<<,3. +,=:. ose, 1.E. Amerault, ..E. and o8y, ..!. oles o2 conglutinin com?lement and anti8ody si>e in card aglutination test 2or 8o@ine ana?lasmosis. American 1ournal o2 5eterinary esearcB. 3(: ++9=-++('. .tulo "iCaci4n de com?lemento ?ara el diagn4stico de Ana?lasmosis. !8Ceti@o

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

Detecci4n de anticuer?os en un animal ?re@iamente in2ectado con Anaplasma marginale mediante la acti@aci4n de la @a cl6sica del com?lemento. $am?o de a?licaci4n Este ?rocedimiento tiene a?licaci4n ?ara la8oratorios de ?rue8as que realicen el diagn4stico serol4gico de la Ana?lasmosis 8o@ina causada ?or Anaplasma marginale. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'+,-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. Generalidades Esta ?rue8a de mayor sensi8ilidad que la de tarCeta 8usca la identi2icaci4n de Anticuer?os del ti?o #gG ?roducto de la ex?osici4n del animal al agente. %a ?rue8a se reali>a 8aCo condiciones de la8oratorio y a di2erencia de la de tarCeta no ?uede ser e2ectuada en cam?o. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.Material +.:.3.9.(.eacti@os: +.:.3.9.(.Antgeno de Anaplasma marginale ?ara 2iCaci4n de com?lemento seg7n USDA. $om?lemento GSuero de $o8ayoH. Gl48ulos roCos de carnero. Memolisina. Soluci4n amortiguadora de 5eronal: "rascos 5iales de 3 y 9 ml. Gradillas ?ara tu8os de +3 x +'' mm. Micro?lacas ?ara Bemaglutinaci4n -untas desecBa8les ?ara micro?i?eta .u8os de ensayo de +3 x +'' mm. /aDo Mara Es?ecto2ot4metro lu> @isi8le Micro?i?etas de +' a +'' y de +'' a +''' l. e2lector de ?unto de sedimentaci4n

Acido (-( dietil 8ar8it7rico. $loruro de calcio anBidro $loruro de magnesio anBidro $loruro de sodio, (,( dietil 8ar8iturato de sodio ).=.Soluci4n de Alse@er Sueros controles ?ositi@o y negati@o a anticuer?os contra A. marginale

!!

(Primera Seccin) <.Sueros ?ro8lema.

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

$ondiciones am8ientales %as de cualquier la8oratorio de inmunologa a tem?eratura am8iente. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Descongelar los sueros o retirar del re2rigerador, lle@arlos a tem?eratura am8iente. -rocedimiento .omar de la muestra ?ro8lema +'' l., se le adiciona 9'' l de soluci4n amortiguadora de 5eronal GSA5H logrando una diluci4n de +:(. El o@ino seleccionado se sangra :9 Boras antes de correr la ?rue8a, la sangre se o8tiene con soluci4n de Alse@er. -re?araci4n de los Gl48ulos oCos GGrH de carnero al :J con SA5:

aH En tu8os graduados de +( ml se agrega una cantidad de sangre con Alse@er, si es necesario se adiciona m6s Soluci4n Amortiguadora de 5eronal GSA5H, se centri2uga a :''' r?m ?or +' minutos, transcurrido este tiem?o al sedimento de Gr se le retira el so8renadante as como la 2ina ca?a de leucocitos Gse sugiere reali>ar este ?aso con ?i?eta ?ara retirar los gl48ulos 8lancosH, los Gr se resus?enden con SA5 y se centri2ugan : @eces m6s, ?ero en la tercera la@ada se de8e tomar el tamaDo del ?aquete de Gr. Generalmente se consideran 3, ml de SA5 y uno del -aquete de Gr, ?ara o8tener una soluci4n al :J.

8H -ara con2irmar el ?aso anterior se lee en un es?ectro2ot4metro. Se toma de la soluci4n al :J de Gr '.) ml y se agregan 3.9 ml de agua destilada ?ara ?roducir lisis de los Gr; se llenan las cu8etas del es?ectro2ot4metro y se tiene que leer a (9) nan4metros, de8er6 utili>arse SA5 ?ara aCustar a cero el es?ectro2ot4metro. %ectura de '.)'' W '.''( en la escala de Densidad !?tica GD!H son ace?ta8les. -ara corregir la lectura de D! di2erentes Bay que aDadir SA5, el @olumen 2inal requerido de la sus?ensi4n ?uede ser determinado de acuerdo a la siguiente 24rmula: 5: O Donde: 5+: 5olumen original de la sus?ensi4n de Gr, la cual el es?ectro2ot4metro dar6 una lectura GD!H. 5:: 5olumen 2inal requerido ?ara dar una densidad 4?tica de '.)'' D!: Densidad !?tica. Se diluye el suero +:(, en tu8os de ensaye, donde se agrega +'' microlitros de suero y 9'' microlitros de SA5, lo mismo se reali>a con los sueros controles ?ositi@o y negati@o. Se incu8a el suero diluido a ()K$ ?or 3' minutos, en 8aDo Mara con el 2in descom?lementar. .erminada la incu8aci4n se retiran del 8aDo Mara y se toma :( microlitros del suero descom?lementado y se le agregan a los ?o>os de una micro?laca ?ara Bemaglutinaci4n, cada suero ?ro8lema se de8e de?ositar en : ?o>os cercanos y di2erentes, deCando toda la columna +: de la micro?laca ?ara los controles. -osteriormente de?ositar los sueros ?ro8lemas en todos los ?o>os, se agrega el Antgeno GAgH Anaplasma marginale diluido +:9', :( microlitros de este Ag a cada ?rimer ?o>o, deCando el segundo sin Ag. 5+ & D! '.)''

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

!"

A los segundos ?o>os sin Ag se le adiciona :( microlitros de SA5. -osteriormente antes de agregar el com?lemento se de8e colocar los controles de nuestra ?rue8a en la columna +:, de la siguiente manera: $!%UMNA +: A Ag SA5 $X SM / Ag ST $X SM $ Ag S$X SM D SA5 STA$ $X SM E SA5 S-A$ $X SM " SA5 SA5 $X SM G SA5 SA5 SA5 SA5 M SA5 SA5 SA5 SA5IG

ST: SUE ! -!S#.#5! S-: SUE ! NEGA.#5! SM: S#S.EMA MEM!%#.#$! $X: $!M-%EMEN.! SA5:S!%U$#!N AM! .#GUAD! A DE 5E !NA% A$: AN.#$!M-%EMEN.A #!S G : G%!/U%!S Donde: A. $ontrol de Antgeno /. $ontrol de Suero -ositi@o $. $ontrol de Suero Negati@o D. $ontrol de Suero -ositi@o Anticom?lementario E. $ontrol de Suero Negati@o Anticom?lementario ". $ontrol del $om?lemento G. $ontrol del Sistema Memoltico M. $ontrol de los Gl48ulos oCos !1!S

Se agrega a todos los ?o>os :( microlitros de com?lemento diluido +:::, exce?tuando a los ?o>os G+: y M+:, los cuales se les adiciona :( microlitros de SA5. N!.A: este ?aso es crtico en la ?rue8a, ?or lo que se recomienda que realice lo m6s r6?idamente. Se incu8a a 3=K$ ?or )' minutos. +' minutos antes de 2inali>ar el ?eriodo de incu8aci4n, se ?re?ara el sistema Bemoltico el cual se lle@a a ca8o me>clando una ?arte de sus?ensi4n de Gr al :J m6s otra ?arte de Bemolisina diluida +:+('', se deCa incu8ar ?or +' minutos. .ranscurridos estos tiem?os de incu8aci4n, se retiran del 8aDo Mara tanto las micro?lacas como el sistema Bemoltico, ?osteriormente se de?ositan (' microlitros a cada ?o>o exce?tuando el ?o>o M+: al cual se le adiciona :( microlitros de SA5 m6s :( microlitros de la sus?ensi4n de Gr al :J.

!#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Se incu8a 3' minutos a 3=K$ en 8aDo Mara. #nter?retaci4n de resultados -!S#.#5!: Existe sedimentaci4n de los Gl48ulos roCos, Gr, ?or lo que se o8ser@a un ?unto roCo. NEGA.#5!: %isis total de los Gr, a?ariencia trans?arente /i8liogra2a Manual de #nmunologa. /autista, G. . y Morilla. Ed. Diana. MAxico +,<9. Uuttler, U.%., D5M, Adams, %. G. and .odoro@ic .A. $om?arisons o2 tBe com?lement-2ixation and indirect 2luorescent anti8ody reaction in tBe detection o2 8o@ine 8a8esiasis. American 1ournal o2 5eterinary esearcB:+(3-+(), +,== .tulo "rotis delgado y grueso de sangre e im?rontas de 4rganos ?ara el diagn4stico de Ana?lasmosis y /a8esiosis 8o@inas. !8Ceti@o #denti2icar mediante 2rotis delgado de sangre teDido y o8ser@ado al microsco?io com?uesto gl48ulos roCos ?arasitados ya sea ?or Anaplasma marginale o Babesia s??. $am?o de a?licaci4n Este ?rocedimiento tiene a?licaci4n en la8oratorios de ?rue8a en materia >oosanitaria que reali>an el diagn4stico directo de Bemo?ar6sitos como un a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la Garra?ata. Generalidades Detecci4n de las di2erentes 2ormas ?ar6sitas en que se ?resentan Babesia s??. y Anaplasma marginale dentro de los eritrocitos de la muestra de sangre de 8o@ino ?re@iamente in2ectado en 2ase aguda. Documentos conexos a consultarse N!M-'+,-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. Equi?o e instrumentos +.:.Materiales +.:.3.9.(.).eacti@os +.Aceite de #nmersi4n $aCas de Uo?len -i?etas de + y ( ml -ortao8Cetos -ro?i?etas .u8os ca?ilares 5iales de +' o +( ml. $ontador manual Microsco?io com?uesto

Lunes 22 de febrero de 1999 :.3.-

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

!$

$olorante de VrigBt o de Giemsa. Metanol

$ondiciones am8ientales No son necesarias condiciones es?eciales. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Mantener la sangre a tem?eratura am8iente y Bomogenei>arla antes de tomar la muestra. -rocedimiento A ?artir de la muestra de sangre con anticoagulante se ela8ora un 2rotis: "rotis delgado Utili>ar ?ortao8Cetos lim?ios y secos Gmantener @I@ en alcoBol y AterH. Se coloca una gota de sangre en el extremo de una laminilla. $on otra laminilla en ?osici4n inclinada, colocada en 6ngulo de 3( grados se Bace correr Bacia el otro extremo. Al o8tener un 2rotis 2ino y BomogAneo secar inmediatamente al aire y se 2iCa en alcoBol metlico a8soluto. -ara ello la laminilla se coloca de cara Bacia arri8a y se cu8re con el alcoBol es?erando a que se e@a?ore, ?osteriormente se a?lica la tAcnica de tinci4n deseada Giemsa o VrigBt. "rotis de gota gruesa Utili>ar ?ortao8Cetos lim?ios y secos, identi2icar claramente en uno de los extremos con el n7mero de animal y 2ecBa. $olocar en el centro una gota de sangre, mediante un mo@imiento de rotaci4n 2ormar una ?elcula de l cm. de di6metro con ayuda de un ?alillo. Secar al aire o al calor a ('-)' grados centgrados. .eDir con Giemsa o VrigBt. $on2ecci4n de im?rontas de 4rganos Utili>ar ?ortao8Cetos lim?ios y secos. $uidar de no ensuciar el material. Seleccionar un tro>o ?equeDo de 4rgano. $ontactar el ?ortao8Ceto con la su?er2icie del 4rgano reciAn cortada, donde Bay ?equeDos ca?ilares de sangre. Secar al aire e identi2icar claramente. .eDir con Giemsa o VrigBt. .inci4n de VrigBt +.- -ara conseguir los meCores resultados Bay que teDir los 2rotis en cuanto se Bayan secado al aire, sin deCar transcurrir m6s de una Bora y ?ara e@itar la ?reci?itaci4n se 2iltra el colorante antes de usarse. :.- $olocar el ?ortao8Cetos con la muestra Bacia arri8a 3.- $u8rir el 2rotis con + ml de colorante ?or 9 minutos. 9.- 5irar aDadiendo so8re el colorante : ml de agua destilada, me>clando BomogAneamente ?ara conseguir una meCor tinci4n y deCar re?osar ( minutos Basta o8ser@arse una ?elcula met6lica @erdosa. (.- 0uitar el colorante al cBorro de agua Gde gri2o o destiladaH ?rimero sua@e, luego m6s 2uerte, Basta que Baya desa?arecido todo exceso de colorante. El la@ado durar6 de ( a 3' segundos. ).- El 2rotis se seca ?or e@a?oraci4n. El colorante que Baya quedado en el dorso del ?ortao8Cetos se lim?ia con una gasa Bumedecida con alcoBol. =.- Se o8ser@a al microsco?io con o8Ceti@o de inmersi4n. .inci4n de Giemsa +.- Diluir +:+ el colorante con soluci4n amortiguadora +( minutos antes de utili>arlo. :.- "iCar los 2rotis en metanol a8soluto durante ( minutos. Secar al aire.

!%

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

3.- $u8rir com?letamente el 2rotis con el colorante diluido durante < minutos, 2orm6ndose una ?elcula met6lica. 9.- %a@ar @igorosamente con agua corriente. (.- DeCar secar. ).- !8ser@ar al microsco?io con o8Ceti@o de inmersi4n. #nter?retaci4n de resultados esultado ?ositi@o: !8ser@aci4n del o los ?ar6sitos en sus di2erentes 2ases de desarrollo dentro del eritrocito. esultado negati@o: !8ser@aci4n de eritrocitos li8res de ?ar6sitos. /i8liogra2a Mematologa 5eterinaria. ScBalm. 2abe"io"i" bovina .tulo #nmuno2luorescencia indirecta ?ara el diagn4stico de Babesia bigemina y Babesia bovis. !8Ceti@o Detectar anticuer?os mediante reacci4n inmunol4gica ?rimaria de animales ?re@iamente ex?uestos a B. bigemina y B. bovis. $am?o de a?licaci4n Este ?rocedimiento tiene a?licaci4n ?ara la8oratorios de ?rue8as que realicen el diagn4stico serol4gico de la ?iro?lasmosis 8o@ina causada ?or B. bigemina y B. bovis. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'+,-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la Garra?ata Boophilus s??. Generalidades Es una ?rue8a sencilla de alta sensi8ilidad y es?eci2icidad, de 26cil ?re?araci4n y conser@aci4n del antgeno. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).=.Materiales Agitador magnAtico /alan>a granataria $entr2uga #ncu8adora Microsco?io de inmuno2luorescencia -otenci4metro Ultracongeladores

Lunes 22 de febrero de 1999 +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.eacti@os +.:.3.9.(.).=.Acetona /alas magnAticas /arni> de uDas $aCas Uo?len $6mara B7meda Gradillas met6licas 1eringa autom6tica

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

!9

1eringa ?ara insulina con aguCa del No. :+ Marcador Micro?i?etas -in>as -ortagradillas -untas .u8os de ensaye

Antgeno de B. bigemina y B. bovis A>ul de E@ans $onCugado con 2luorescena Glicerina Soluci4n amortiguadora de 2os2atos ?M =.:. Sueros controles ?ositi@o y negati@o.

$ondiciones am8ientales. Esta ?rue8a de8e reali>arse en condiciones medioam8ientales con tem?eratura de ::K$ a :)K$ sin Bumedad. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra: Se?arar el suero del co6gulo mediante centri2ugaci4n, colocarla en @iales, identi2icar y tra8aCar la muestra. Si no se ?rocesa la muestra inmediatamente, Asta de8er6 congelarse a -='K$. Acondicionarla a tem?eratura am8iente ?ara su ?rocesamiento. -rocedimiento. +.- Diluciones: -re?arar diluciones +:(' de los sueros ?ro8lemas en soluci4n 8u22er de 2os2atos G-/S ?M =.:H y al mismo tiem?o los controles T y -. :.- -re?araci4n de las laminillas:

"&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

%as laminillas con antgeno se sacan del ultracongelador G-='K$H y se colocan con la en@oltura de aluminio en una estu2a de incu8aci4n, sin Bumedad, a 3=K$, durante 3' minutos a?roximadamente, de manera que queden secas. Se elimina la cu8ierta de aluminio y la en@oltura de ?a?el. %as laminillas con antgeno se 2iCan en acetona a8soluta durante +' minutos en una caCa de tinci4n. Marcar con cuadros o crculos so8re la cara de la laminilla que contiene el antgeno, con un l6?i> de ?intura de aceite o con esmalte de uDas Gcon Ceringa y aguCaH. Utili>ando un cuadro ?or diluci4n, se colocan +' microlitros de cada una de las diluciones ?re?aradas con los sueros control ?ositi@o, negati@o y ?ro8lema. %as laminillas se colocan dentro de una c6mara B7meda y se incu8an a 3=K$, durante 3' minutos. $on ayuda de una ?i>eta, los sueros son eliminados mediante un la@ado cuidadoso con -/S; las laminillas se colocan en una caCa de tinci4n con -/S y se contin7a el la@ado durante ( minutos, enCuag6ndolos con agua destilada en otra de tinci4n. %as laminillas se secan a la estu2a de incu8aci4n. Se colocan +' microlitros de la diluci4n 4?tima del conCugado, que contiene a>ul de E@ans +:+' en cada uno de los cuadros y se re?iten los incisos =, < y ,. $olocar una gota de glicerina diluida +:+' en -/S ?M =.: en cada crculo. %as laminillas se examinan con un microsco?io de lu> ultra@ioleta con o8Ceti@o ,) &, y con 2iltro excitador y 2iltro 8arrera a?ro?iados ?ara la 2luorescencia con #sotiocianato de 2luorescena G"#.$H. "4rmulas c6lculo ?ara resultados. En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados. esultado ?ositi@o: ?resencia de ?ar6sitos 2luorescentes es?ec2icamente con una coloraci4n @erdeamarillenta. esultado negati@o: ning7n ?ar6sito 2luorescente. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad. ,(J si se sigue literalmente el mAtodo descrito, con reacti@os y 8iol4gicos semeCantes. /i8liogra2a 1oBnston, %.A.: -earson, .D. And %eatcB, G. E@aluation o2 an indirect 2luorescent anti8ody test 2or detecting Babesia argentina in2ection in cattle. Australian 5eterinary 1ournal. 9,G<H: 3=3-3==. +,=3. $alloE, %.%.; McGregor, V., -arFer, .1. and DalgliesB, .1. #nmunity o2 cattle to Babesia bigemina 2olloEing its elimination 2rom tBe Bost, EitB o8ser@ation on anti8ody le@els detected 8y tBe indirect 2luorescent anti8ody test. Aust. 5et. 1., (': +:-+(,+,=9. Uuttler, U.%., D5M, Adams, %.G. and .odoro@ic .A. $om?arisons o2 tBe com?lement-2ixation and indirect 2luorescent anti8ody reaction in tBe detection o2 8o@ine 8a8esiasis. American 1ournal o2 5eterinary esearcB: +(3-+(), +,==. 11. 2r#celo"i" bovina y caprina .tulo Detecci4n de anticuer?os contra 8rucelosis ?or la ?rue8a de tarCeta o rosa de 8engala.

Lunes 22 de febrero de 1999 !8Ceti@o

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"1

Detecci4n de anticuer?os contra ce?as lisas de /rucella (Brucella abortus+ Brucella melitensis y Brucella suisH en sueros de animales sos?ecBosos. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a ?odr6 ser reali>ada 7nicamente como ?rue8a tami> en 8o@inos, ca?rinos y ?orcinos. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los Animales. Generalidades Es un ?rocedimiento cualitati@o, r6?ido, de aglutinaci4n macrosc4?ica que se e2ect7a en una sola diluci4n y que detecta ?rinci?almente anticuer?os #gG+ y en menor grado #gM. Sir@e como ?rue8a tami> ?or su alta sensi8ilidad y ?ermite reducir el n7mero de ?rue8as diagn4sticas necesarias ?ara controlar yIo erradicar la 8rucelosis en un re8aDo o Bato. Se 2undamenta en que las #gG+ es?ec2icas contra /rucella toda@a act7an a un ?M de 3.<, lo que determina la es?eci2icidad de la ?rue8a. Equi?o e instrumentos +.:.Aglutinosco?io con 2ondo negro mate e iluminaci4n indirecta interna. $ron4metro.

3.Micro?i?eta de @olumen constante o @aria8le que mida 3' microlitros, con sus res?ecti@as ?untillas. 9.Materiales +.:.3.9.Gotero cali8rado a un @olumen de gota de '.'3 ml G3' microlitrosH. -alillos de madera. -i?etas de /ang o ?i?etas de '.: ml Gen caso de no contar con micro?i?etaH. -laca de acrlico 8lanco de las mismas dimensiones del aglutinosco?io. e2rigerador domAstico.

(.-laca de @idrio o acrlico trans?arente, ?re2erentemente del tamaDo del aglutinosco?io, con cuadrcula de 3 x 3 cm. ).eacti@os /iol4gicos. +.- Antgeno o2icial el cual de8er6 reunir las siguientes caractersticas: aH Ela8orado con la ce?a +++,-3 de Brucella abortus . 8H .eDido con rosa de 8engala amortiguado con 6cido l6ctico. cH ?M de 3.)( GTI- '.'(H. dH $oncentraci4n celular del <J ?ara 8o@inos y cerdos, y del 3J ?ara ca?rinos y o@inos. -untas ?ara micro?i?eta.

"2

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

El antgeno ?uede deteriorarse cuando se retira del re2rigerador o si se mantiene a tem?eratura am8iente ?or tiem?o ?rolongado; si la ?rue8a se reali>a e@entualmente en ?ocas muestras se recomienda Bacer ?equeDas alcuotas del antgeno ?ara no sacar todo el 2rasco del re2rigerador. Nunca de8e congelarse. :.- Suero testigo ?ositi@o. 3.- Suero testigo negati@o. 9.- Muestras de suero de animales sos?ecBosos. %os sueros de8er6n ser 2rescos o Ba8er sido mantenidos en re2rigeraci4n a 9K$, no de8en ?resentar Bem4lisis ni estar contaminados. $ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de ::-:( K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %os sueros de animales sos?ecBosos de8er6n ser de ?re2erencia reciAn o8tenidos, conser@ados en re2rigeraci4n y no de8er6n ?resentar Bem4lisis ni contaminaci4n. Asimismo el antgeno y los sueros testigos de8en mantenerse en re2rigeraci4n a 9K$, ?ara reali>ar la ?rue8a de8en estar a tem?eratura am8iente, ?or lo que de8en sacarse del re2rigerador entre 3' y )' minutos incluyendo los sueros sos?ecBosos antes de reali>ar la ?rue8a. %a sensi8ilidad de la ?rue8a se @e a2ectada ?or la tem?eratura a la que se reali>a; si el antgeno y los sueros se usan inmediatamente des?uAs de sacarlos del re2rigerador, la ?rue8a ?ierde sensi8ilidad. -rocedimiento +.- $olocar una gota de 3' microlitros de cada muestra de suero en un cuadro sucesi@o de la ?laca, siguiendo un orden de i>quierda a derecBa y de arri8a a8aCo. No se recomienda tra8aCar m6s de +' muestras a la @e> ?orque la gota de suero se desBidrata, so8re todo en climas c6lidos. :.- Agitar el antgeno y con el gotero cali8rado colocar una gota de 3' ul a un lado de cada gota de suero; esto es recomenda8le ?ara e@itar que em?iece la reacci4n antgeno-anticuer?o antes de reali>ar la me>cla. 3.- #nmediatamente des?uAs de que se agreg4 la 7ltima gota de antgeno, me>clar el suero y el antgeno ?or rotaci4n con un ?alillo ?or suero, a 2in de o8tener una me>cla BomogAnea. 9.- Me>clar durante 9 minutos ?or rotaci4n manual sua@e de la ?laca, e@itando que las muestras de los cuadros adyacentes se ?ongan en contacto entre s. (.- -roceder a reali>ar la lectura so8re el aglutinosco?io. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados %a lectura de8e reali>arse, inmediatamente des?uAs de e2ectuar la me>cla ?or rotaci4n Ginciso 9H %a ?rue8a se considera negati@a cuando no se o8ser@a aglutinaci4n. Se considera ?ositi@a, cuando existe cualquier grado de aglutinaci4n, la cual se o8ser@a con 2ormaci4n de grumos color rosa. En esta ?rue8a no existen los sos?ecBosos. Si la ?rue8a es ?ositi@a, de8e reali>arse una ?rue8a com?lementaria, como la de ri@anol o de 2iCaci4n de com?lemento. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J, si se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"

Alton, G.G., 1ones, %.M., Angus, .D. and 5erger, 1.M.: .ecBniques 2or tBe 8rucellosis la8oratory. Edited 8y lY#nstitute National de la ecBercBe Agro?ecuaire #N A, -ars, "rance, +,<<. $asas !lascoaga, .: Diagn4stico serol4gico de la 8rucelosis. /oletn .Acnico, $entro -anamericano de *oonosis, !-S, !MS, +,=(. Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los animales. $orner, %.A.: /o@ine 8rucellosis. Serology. Australian Standard Diagnostic .ecBniques 2or Animal Diseases, Su8comittee on Animal MealtB %a8oratory Standards, Australia, +,<,. .tulo Detecci4n de anticuer?os contra /rucelosis, ?or la ?rue8a de ?reci?itaci4n con ri@anol. !8Ceti@o Detecar anticuer?os es?ec2icos contra ce?as lisas de /rucella G Brucella abortus+ Brucella melitensis y Brucella suisH en sueros de animales sos?ecBosos, ?or la acci4n qumica del ri@anol so8re las #gM y otras macroglo8ulinas del suero. $am?o de a?licaci4n -ara e2ectos de cam?aDa, se recomienda su reali>aci4n en sueros de 8o@inos, que resultaron ?ositi@os a la ?rue8a de tarCeta. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los Animales. Generalidades Es una ?rue8a serol4gica com?lementaria cuantitati@a, altamente es?ec2ica, ya que se 8asa en la ?reci?itaci4n selecti@a de las #gM en el suero ?or el reacti@o de ri@anol. Este ?reci?itado se retira ?or centri2ugaci4n y con el so8renadante se reali>a una aglutinaci4n en ?laca. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.Materiales +.:.3.9.(.Gotero cali8rado a un @olumen de gota de '.'3 ml G3' microlitrosH Gradilla -alillos de madera -i?etas de + ml con graduaci4n de +I+' en +I+'' -i?etas de /ang o ?i?etas de '.: ml. de +I+' en +I+'' Aglutinosco?io con 2ondo negro mate e iluminaci4n indirecta interna $entr2uga clnica, como mnimos de :,''' r?m $ron4metro Micro?i?eta de @olumen @aria8le entre ( a <' microlitros. e2rigerador domAstico ?re@iamente

).-lacas de @idrio o acrlico trans?arente, ?re2erentemente del tamaDo del aglutinosco?io, con cuadrcula de 3 x 3 cm

"!

(Primera Seccin) =.<.-untas ?ara micro?i?etas

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

.u8os de @idrio de +: ?or =( mm o +3 x +'' mm.

eacti@os /iol4gicos Antgeno o2icial el cual de8er6 reunir las siguientes caractersticas: aH Ela8orado con la ce?a +++,-3 de Brucella abortus . 8H .eDido con una me>cla de @erde 8rillante y cristal @ioleta. cH ?M de (.< a ).:. dH $oncentraci4n celular de 9J. eacti@os y soluciones Soluci4n de ri@anol al +J, ?eso so8re @olumen G-I5H El reacti@o de ri@anol Glactato de :-etoxi-),,-diamino acridinaH es un deri@ado del naranCa de acridina GcoloranteH, que una @e> ?re?arado, de8e guardarse en un reci?iente estAril y conser@arse en re2rigeraci4n a 9K$ ?rotegido contra la lu>, ya sea en 2rasco color 6m8ar o cu8ierto con ?a?el aluminio. $ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de ::-:(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %os sueros sos?ecBosos al igual que el antgeno de8en sacarse del re2rigerador cuando menos 3' a )' minutos antes de reali>ar la ?rue8a, con el ?ro?4sito de que am8os estAn a la misma tem?eratura del la8oratorio al momento de reali>ar la ?rue8a. -rocedimiento +.- $on las ?i?etas de?ositar '.9 ml de soluci4n de ri@anol en un tu8o ?or cada muestra. :.- Utili>ando una ?i?eta o ?unta ?or cada suero ?ro8lema, agregar a cada tu8o '.9 ml de suero. 3.- Me>clar de inmediato ?or agitaci4n del tu8o, e@itando que el contenido entre en contacto con la ?iel. 9.- DeCar re?osar los tu8os a tem?eratura am8iente ?or es?acio de :' a 3' minutos. (.- $entri2ugar a?roximadamente a :''' r?m ?or ( minutos ?ara o8tener un ?aquete a ?artir del ?reci?itado. ).- $on la micro?i?eta o con una ?i?eta de '.: ml, medir del so8renadante '.'<, '.'9, '.':, '.'+ y '.''( ml Gequi@alentes a <', 9', :', +' y ( Sl, res?ecti@amenteH, colocar cada una de dicBas cantidades en un cuadro de la ?laca de @idrio, ?rocurando lle@ar un orden de i>quierda a derecBa y de arri8a a a8aCo, deCando un cuadro sin utili>ar entre las cinco gotas de una muestra y de las de otra. =.- $on el gotero o micro?i?eta, agregar '.'3 ml G3' SlH del antgeno a cada una las gotas so8re la ?laca. <.- Me>clar con ?alillos, extendiendo cada muestra : cm de di6metro a?roximadamente. ,.- Me>clar ?or rotaci4n inclinando la ?laca sua@emente Bacia un lado y a otro 9 @eces. DeCar re?osar ) minutos. +'.- Mo@er la ?laca nue@amente ?or rotaci4n sua@e 9 @eces y deCar re?osar otros ) minutos.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

""

++.- Al tArmino del tiem?o, agitar la ?laca ?or rotaci4n 9 @eces m6s y ?roceder a reali>ar la lectura so8re el aglutinosco?io. %as diluciones corres?onden con los ttulos como sigue: 5olumen de la gota '.'<' '.'9' '.':' '.'+' '.''( Diluci4n +::( +:(' +:+'' +::'' +:9''

"4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados %a ?rue8a se considera ?ositi@a cuando Bay aglutinaci4n de cualquier grado. %a ?rue8a se considera negati@a cuando no existe aglutinaci4n. En animales no @acunados se considera ?ositi@a una aglutinaci4n igual o mayor a +::( y en animales @acunados se considera ?ositi@a una aglutinaci4n igual o mayor a +:(' #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Alton, G.G., 1ones, %.M., Angus, .D. and 5erger, 1.M.: .ecBniques 2or tBe 8rucellosis la8oratory. Edited 8y lY#nstitute National de la ecBercBe Agro?ecuaire #N A, -ars, "rance, +,<<. $asas !lascoaga, .: Diagn4stico serol4gico de la /rucelosis. /oletn .Acnico, $entro -anamericano de *oonosis, !-S, !MS, +,=(. Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los animales. .tulo Detecci4n de anticuer?os contra la /rucelosis ?or la ?rue8a de 2iCaci4n de com?lemento. !8Ceti@o Determinar ttulos de anticuer?os 2iCadores del com?lemento contra ce?as lisas de Brucella s??. ?resentes en el suero. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a sir@e como ?rue8a con2irmatoria en sueros de 8o@inos, ca?rinos, o@inos u otras es?ecies que determine la Secretara. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los Animales. Generalidades

"#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

%a ?rue8a de 2iCaci4n de com?lemento Ba sido am?liamente utili>ada ?ara el diagn4stico con2irmatorio de la /rucelosis en las di2erentes es?ecies animales, de8ido a su gran sensi8ilidad y es?eci2icidad. Es ca?a> de detectar el isoti?o #gG+; ?or esta ra>4n resulta m6s ?recisa com?arati@amente con otras tAcnicas serol4gicas y el diagn4stico 8acteriol4gico. Se considera determinante en el diagn4stico con2irmatorio de los sueros ?ositi@os a la ?rue8a de tarCeta con antgeno teDido con rosa de 8engala. Es una ?rue8a serol4gica r6?ida y muy sensi8le. Se 8asa en la acti@aci4n del com?lemento ?or la @a cl6sica, en donde es necesaria la ?resencia de una uni4n antgeno anticuer?o ?ara iniciar la reacci4n G2ase in@isi8leH. $uando existen anticuer?os contra 8rucela, se da la reacci4n antgeno anticuer?o y el com?lemento se une a esta reacci4n GAg-Ac-$YH, siendo inca?a> de unirse al sistema Bemoltico, que es un segundo sistema antgeno anticuer?o G2ase @isi8leH, o8ser@6ndose una sedimentaci4n de los gl48ulos roCos con anticuer?os o Bemolisina. En ausencia de anticuer?os contra 8rucela en el ?rimer sistema durante la 2ase in@isi8le, el com?lemento queda li8re, uniAndose al segundo sistema antgeno anticuer?o o sistema Bemoltico, o8ser@6ndose una Bem4lisis. Equi?o e instrumentos +.:.3./aDo Mara con escala de +(Z$ a =(Z$. $entr2uga clnica. $ongelador de ' a -:'K$ ?ara conser@ar el com?lemento lio2ili>ado.

Si se utili>a el com?lemento sin lio2ili>ar, la tem?eratura de8e ser de -3( a -='K$. 9.(.).Es?ectro2ot4metro con rango mnimo de 39' a )'' nm de longitud de onda. Micro?i?eta multicanal con @olumen aCusta8le de +' a +'' microlitros.

$ron4metros.

Materiales +.:.3.9.(.).=.<.Gradillas Matraces a2orados Matraces Erlenmeyer Micro?lacas con ,) ?o>os de 2ondo en U -i?etas serol4gicas de @olumen @aria8le -i>etas de ?l6stico -untas ?ara micro?i?etas .u8os de ensayo

eacti@os. .odos los reacti@os de8en ser grado analtico +.:.3.9.(.).Acido ctrico Acido clorBdrico Agua destilada $itrato de sodio $loruro de calcio $loruro de magnesio

Lunes 22 de febrero de 1999 =.<.,.Soluciones aH Soluci4n concentrada de calcio y magnesio $loruro de magnesio BexaBidratado :'.33 g $loruro de calcio diBidratado 9.9+ g $loruro de sodio Dietil8ar8iturato de sodio Glucosa anBidra

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"$

Disol@er con agua destilada en matra> a2orado de +'' ml. Me>clar y distri8uir en @iales y conser@ar en re2rigeraci4n. 8H Soluci4n salina amortiguada con @eronal s4dico y 6cido clorBdrico concentrada (x $loruro de sodio Dietil8ar8iturato de sodio Acido clorBdrico + N Sol. concentrada de $a y Mg Agua destilada c.8.?. <3.'' g +'.+, g 39.(< ml ( ml :,''' ml

%le@ar +,('' ml de agua destilada a un matra> a2orado de :,''' ml. Agregar <3 g de Na$l y disol@er; agregar +'.+, g de (,(-dietil8ar8iturato de sodio y disol@er. Agregar 39.(< ml de M$l + N y me>clar ?or agitaci4n. Agregar ( ml de soluci4n concentrada de calcio y magnesio. A2orar con agua destilada. Diluir + ml de la soluci4n salina con 9 ml de agua destilada y aCustar el ?M a =.3-=.9. $onser@ar la soluci4n (x en re2rigeraci4n y ?ara usarla diluir un @olumen de la soluci4n con 9 @ol7menes de agua destilada y determinar el ?M G=.3-=.9H. cH Soluci4n de Alse@er Ganticoagulante y ?reser@ati@o ?ara la sangreH Glucosa anBidra $loruro de sodio $itrato de sodio Acido ctrico Agua destilada +.<)) g '.9+< g '.<'' g '.'(( g +'' ml

Disol@er en matra> a2orado de +'' ml y a2orar con agua destilada. Esterili>ar ?or 2iltraci4n con mem8rana de '.9( um o en autocla@e a +' l8s durante +' minutos. Distri8uir en tu8os. /iol4gicos +H Antgeno autori>ado a 8ase de Brucella abortus ce?a +++,-3 sin teDir, con ?M de ).< a =.' y concentraci4n celular de 9.(J. :H Sus?ensi4n de gl48ulos roCos de carnero al 3J -ara su estandari>aci4n, o8tener los eritrocitos de o@inos sanos y en 8uen estado nutricional, ?or @eno?unci4n yugular con aguCas cali8re :+G, :'G o +<G. Al extraer la sangre, @aciarla e@itando la Bem4lisis en un @olumen igual de soluci4n de Alse@er. %a@ar los eritrocitos antes de utili>arlos ?or medio

"%

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

de tres centri2ugaciones de +,''' g ?or +' minutos, descartando el so8renadante y usando diluente entre cada la@ado. Utili>ar el ?aquete 2inal ?ara ?re?arar una sus?ensi4n de eritrocitos al 3J. -ara determinar el @olumen del ?aquete celular agregar 3:.3 ml de diluente ?or cada ml del ?aquete de eritrocitos, o8teniAndose una sus?ensi4n de a?roximadamente 3J de concentraci4n. $orro8orar tomando + ml de esta sus?ensi4n y agreg6ndole +( ml de agua destilada. Agitar ?ara lograr una Bem4lisis com?leta y leer el so8renadante en el es?ectro2ot4metro a (9' nm de8iAndose o8tener una densidad 4?tica de '.(. 3H Ela8oraci4n, conser@aci4n y titulaci4n de la Bemolisina Ela8oraci4n.- %a Bemolisina ?uede ela8orarse en el la8oratorio, 8aCo di2erentes esquemas de inmuni>aci4n u o8tenerse en 2orma comercial. $onser@aci4n.- Si la Bemolisina es ela8orada en el la8oratorio donde se @a a lle@ar a ca8o la ?rue8a, una @e> o8tenida, nunca de8e congelarse sola. Se enlistan tres 2ormas de conser@aci4n de la Bemolisina. aH $ongelada. Una @e> o8tenido el suero de8e me>clarse con glicerina @olumen so8re @olumen G@I@H y mantenerse en congelaci4n. %a glicerina ayuda a mantener el ttulo, 2uncionando como conser@ador. 8H %io2ili>ada. De8e mantenerse en re2rigeraci4n entre 9 y )Z$; una @e> resus?endida, se me>cla con glicerina G@I@H y se mantiene en congelaci4n G-:'Z$H. cH e2rigerada con 2enol +::', con la me>cla que se ?ro?one a continuaci4n:

,9 ml de soluci4n amortiguada : ml de Bemolisina conser@ada en glicerina 9 ml de 2enol +::' Gdiluido con la soluci4n amortiguadaH $uando la Bemolisina no se encuentre en glicerina, se diluir6 + ml en ,( ml de soluci4n amortiguada. De8e agitarse diariamente durante +' das antes de utili>arla. .itulaci4n aH -re?arar una sus?ensi4n de eritrocitos de carnero al 3J. 8H -re?arar una diluci4n madre +:+'' de Bemolisina y mantenerla en re2rigeraci4n. cH eali>ar una diluci4n do8le seriada con un @olumen 2inal de + ml en ) tu8os, comen>ando con una diluci4n +:('' de la siguiente manera: tu8o + +:('' +.) ml soluci4n amortiguada '.9 ml de Bemolisina +:+'' tu8o : +:+,''' +.' ml soluci4n amortiguada +.' ml de Bemolisina +:('' tu8o 3 +::,''' +.' ml soluci4n amortiguada +.'. ml de Bemolisina +:''' tu8o 9 +:9,''' +.' ml soluci4n amortiguada +.' ml de Bemolisina +::''' tu8o ( +:<,''' +.' ml soluci4n amortiguada +.' ml de Bemolisina +:9''' tu8o ) +:+),''' +.' ml soluci4n amortiguada +.' ml de Bemolisina +:<'''

dH DesecBar +.' ml del tu8o n7mero ) ?ara tener +.' ml del @olumen 2inal en todos los tu8os. eH Agitar sua@emente la sus?ensi4n de eritrocitos ?re@imente ela8orada, ?ara que estA BomogAnea y aDadir +.' ml de Asta a cada uno de los tu8os que contienen las diluciones de Bemolisina. DeCar la me>cla

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

"9

a tem?eratura am8iente durante +( minutos, ?ara que ?ueda ?roducirse la sensi8ili>aci4n de los eritrocitos, con agitaci4n lenta ?eri4dicamente. 2H -re?arar una diluci4n de com?lemento +:3'' en +' ml. gH -re?arar dos series de tu8os y marcarlas con las diluciones de Bemolisina G+:('', +:+''', +::''', etc.H. BH Agregar a todos los tu8os +.' ml de diluente 2ro y '.( ml de com?lemento diluido +:3''. iH De los tu8os que contienen la Bemolisina en distintas diluciones Gcon los eritrocitos, @er incisos dH y eH; trans2erir '.( ml de cada diluci4n al tu8o corres?ondiente que contiene com?lemento y diluente, @er incisos gH y BH. CH #ncu8ar las series de tu8os durante 3' minutos a 3=Z$ en /aDo Mara. Agitar sua@emente a los +( minutos. FH etirar los tu8os del /aDo Mara.

lH $alcular el ?orcentaCe de Bem4lisis al ('J. Se ?ueden utili>ar dos mAtodos, uno con ayuda de un es?ectro2ot4metro y otro con un ?atr4n de Bem4lisis. $on el es?ectro2ot4metro: ADadir a todos los tu8os : ml de diluente 2ro y centri2ugar a +''' G ?or ( minutos. Se de8e utili>ar una longitud de onda de (9' nm y medir la a8sor8ancia de la muestra. A?licar la siguiente 24rmula: $6lculo del J de Bem4lisis J de Bem4lisis O Donde: D!+ es la densidad 4?tica o8tenida en cada uno de los tu8os de la titulaci4n Ga8sor8anciaH D!: es la densidad 4?tica o8tenida en la estandari>aci4n de eritrocitos al 3J Ga8sor8anciaH ECem?lo: Estandari>aci4n de eritrocitos, lectura de tu8o D!: de '.('' .itulaci4n de Bemolisina, lectura del tu8o GxH D!+ de '.9'' $6lculo del ?orcentaCe de Bem4lisis: J de Bem4lisis '.9' & +'' O <'J de Bem4lisis '.('' Nota: de8e calcularse el ?orcentaCe de Bem4lisis que corres?onda a cada uno de los ) tu8os de la titulaci4n de Bemolisina. $on un ?atr4n de Bem4lisis: $entri2ugar a +''' G ?or ( minutos Gno se de8e aDadir diluente 2roH. -ara simular di@ersos grados de Bem4lisis me>clar: GAH una sus?ensi4n de eritrocitos de carnero con G/H una soluci4n de eritrocitos lisados D!+ & +'' D!:

#&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

-re?arar la sus?ensi4n de eritrocitos GAH agregando + ml de una sus?ensi4n de eritrocitos al 3J a = ml de diluente a la concentraci4n de uso. -ara ?re?arar la soluci4n de eritrocitos G/H: como la soluci4n amortiguadora de tra8aCo se encuentra a ra>4n de ( G(xH, me>clar + ml de la sus?ensi4n de eritrocitos al 3J con (.) ml de agua destilada, se agita Basta que la Bem4lisis sea com?leta y agregar entonces +.9 ml de diluente ?ara resta8lecer la tonicidad. -re?arar a continuaci4n los ?atrones ?ara los di2erentes grados de Bem4lisis, entre 'J y +''J, me>clando la sus?ensi4n GAH con la soluci4n G/H en las ?ro?orciones que se indican a continuaci4n: 'J Sus?ensi4n +.' A en ml Sus?ensi4n ' / en ml +'J '., '.+ :'J '.< '.: 3'J '.= '.3 9'J '.) '.9 ('J '.( '.( )'J '.9 '.) ='J '.3 '.= <'J '.: '.< ,'J '.+ '., +''J ' +

Una @e> ?re?aradas las muestras se de8en centri2ugar los tu8os, a +,''' G ?or ( minutos. -ara calcular el ?orcentaCe de Bem4lisis en los tu8os de la titulaci4n se de8en com?arar Astos con el tu8o ?atr4n. mH SeDalar los ?orcentaCes de Bem4lisis o8tenidos en cada tu8o utili>ando ?a?el semilogartmico. En el eCe de las a8scisas G&H marcar la diluci4n corres?ondiente, y en el de las ordenadas GNH el ?orcentaCe de Bem4lisis. Unir los ?untos entre s mediante una lnea continua ?ara o8tener una gr62ica. nH /uscar el ?unto de las ordenadas que corres?onda al ('J de Bem4lisis, y ?royectarlo al cruce con la a8scisa. El ?unto que marque en el eCe de las a8scisas GxH corres?onder6 a la diluci4n en que se encontrara una unidad ('J de Bem4lisis G+ UM$('JH. oH -ara tra8aCar con 9 unidades ('J de Bem4lisis de8e concentrarse 9 @eces la diluci4n o8tenida. -or eCem?lo: si una unidad Bemoltica ('J se encuentra en la diluci4n +:(''', se di@ide (''' entre 9 O +:(', quedando la diluci4n de tra8aCo como +:+:('. 9H $om?lemento -re?araci4n y conser@aci4n del com?lemento Sangrar ?or lo menos 9 co8ayos, se?arar lo antes ?osi8le el suero del co6gulo, centri2ugarlo y me>clarlo ?ara ?re?arar el com?lemento. El com?lemento ?uede ser lio2ili>ado o desBidratado y de8e almacenarse en congelaci4n al menos a -:'Z$. .itulaci4n del com?lemento aH Sensi8ili>ar eritrocitos me>clando @ol7menes iguales de Bemolisina ?re@iamente titulados con 9UM('J y eritrocitos al 3J. DeCar la me>cla en re?oso durante +( minutos a tem?eratura am8iente y me>clar ?eri4dicamente. 8H -re?arar diluci4n madre +:+' de com?lemento, deCar en re?oso de +( a :' minutos en re2rigeraci4n G9<Z$H y ?re?arar la diluci4n de titulaci4n del com?lemento +:3''. cH %a ?rue8a se reali>a al do8le del @olumen normal ?ara reducir al mnimo los errores de utili>aci4n de ?i?etas y conseguir un @olumen total su2icientemente grande ?ara ?ermitir la lectura en el es?ectro2ot4metro. Dis?oner ) tu8os en una gradilla y agregar los reacti@os en las cantidades y el orden indicados en el siguiente cuadro. .u8os + : 3 9 ( ) $om?lemento +:3'''.3'.9'.('.)'.='.< Diluente +.:+.+.+.''.,'.<'.= Eritrocitos sensi8ili>ados '.('.('.('.('.('.( dH Me>clar el contenido de cada tu8o agit6ndolo sua@emente e incu8ar en /aDo Mara a 3=Z$ durante 3' minutos, agit6ndolos cada +( minutos. Des?uAs de sacar los tu8os del 8aDo agregar : ml de diluente 2ro a cada tu8o y centri2ugar ( minutos a +''' G ?ara sedimentar las cAlulas intactas. Determinar sus

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

#1

densidades 4?ticas GD.!.H en el es?ectro2ot4metro o ?or com?araci4n con ?atrones de Bem4lisis Gen este 7ltimo caso no agregar el diluente 2roH. eH $alcular los @alores de la ex?resi4n yIG+''-yH ?ara cada cantidad de com?lemento, a ?artir del ?orcentaCe de Bem4lisis Gconsiderar solamente los tu8os que ?resenten una Bem4lisis del +' al ,'JH; el c6lculo se Bace como en los eCem?los del cuadro. $A%$U%! DE %A E&- ES#!N NIG+''-NH 5!%UMEN DE $!M-%EMEN.! DENS#DAD !-.#$A -! $EN.A1E DE MEM!%#S#S GNH NIG+''-NH '.3'.'9++''.++'.9'.++::<'.3)'.('.:'<(:+.'<'.)'.:<<=::.(='.='.3:<<:9.(3'.<'.33=<9(.39 -ara reducir la cantidad de c6lculos necesaria, con@iene reali>ar un cuadro en el que se indique: AH El ?orcentaCe de Bem4lisis /H %a ex?resi4n yIG+'' - yH ?ara cada lectura 2otomAtrica com?rendida entre el +'J y el ,'J de Bem4lisis. 2H En un ?a?el logartmico con a8scisas y ordenadas logartmicas marcar los siguientes @alores: En las ordenadas se marca el @olumen de com?lemento y en las a8scisas al J de Bem4lisis Gex?resado como yIyG+'' - yH. Unir los ?untos entre s ?ara o8tener una recta. El ?unto donde la recta cru>a la lnea del @alor en las a8scisas corres?onde al @olumen de com?lemento que ?roduce el ('J de Bem4lisis + unidad Bemoltica ('J GUM$('JH. gH En el eCem?lo + UM$('J corres?onde a '.9< ml de com?lemento ?re@iamente diluido +I3''. la ?rue8a se reali>a con ( UM$('J; si se multi?lica este @olumen ?or cinco G'.9< x (H, resulta el @olumen de com?lemento que contiene (UM$('J. A continuaci4n se de8e calcular la diluci4n necesaria del com?lemento ?ara reali>ar la ?rue8a, utili>ando la siguiente 24rmula: D.$ 5.$ = & 5. . & O D.$. 5.$. x 5. ..

Donde: D.$.O 2actor de diluci4n del com?lemento con el que se 5.$.O @olumen de com?lemento en el que se tienen las 5...O @olumen de com?lemento que se utili>4 ?ara las & O diluci4n requerida. Sustituyendo los @alores del eCem?lo: 3'' :.9 = x '.( +:( O & '.( & = G+:(HG'.(H O ):.( Bi>o la titulaci4n G3''H (UM$('J G:.9H titulaci4n G'.(H

%a diluci4n necesaria es +:):.(, ?ara cualquier @olumen requerido. %a diluci4n de tra8aCo se ?uede reali>ar a ?artir del com?lemento diluido +:+', o del com?lemento sin diluir. Si se @a a ?re?arar a ?artir de la diluci4n +:+', la diluci4n de tra8aCo ser6 +:).:. Se calcula el @olumen necesario ?ara la ?rue8a y se Bace la diluci4n. ECem?lo: Si se necesitan +( ml de com?lemento:

#2

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL $om?lemento G$Y H O +( ml ): 5olumen

Lunes 22 de febrero de 1999

"actor de diluci4n

$O

= '.:9 ml

Se necesitan '.:9 ml de com?lemento y +9.=) ml de diluente o 8ien: +( ).: O :.9 ml de com?lemento y +:.) ml de dilunte

$ondiciones am8ientales De la8oratorio a tem?eratura 4?tima entre +<-:(Z$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %os sueros de8er6n conser@arse en re2rigeraci4n o congelaci4n. No se de8er6n ?rocesar sueros Bemoli>ados yIo contaminados. Diluir cada suero +:( en tu8os de ensayo e inacti@ar a )'Z$ ?or 3' minutos. -rocedimiento .Acnica en micro?laca -re@iamente Ba8er ?re?arado los gl48ulos roCos de carnero sensi8ili>ados al 3J. Diluir el com?lemento a la diluci4n de tra8aCo de acuerdo a la titulaci4n. Diluir el antgeno +::'' y reali>ar la diluci4n de los sueros ?ro8lema. Utili>ar los sueros diluidos ?re@iamente. #ncluir un suero ?ositi@o y uno negati@o en cada serie de tra8aCo. Em?lear una columna de < ?o>os ?or cada suero en la micro?laca. $olocar en los ?o>os A, / y M :( l del suero diluido e inacti@ado. En los ?o>os / a M agregar :( l de diluente. $on una ?i?eta multicanal de +: canales e2ectuar la diluci4n de los sueros, me>clando cinco @eces el contenido de los ?o>os /, @aciar totalmente y medir :( l que se extraen y se trans2ieren a la Bilera $, me>clar cinco @eces, tomar :( l y trans2erir a la Bilera D. e?etir Basta la 2ila G, me>clar y desecBar :( l 2inalmente. $am8iar las ?untas de las micro?i?etas ?ara diluir los sueros de cada ?laca. %as diluciones 2inales quedan como sigue: +:(, +:+', +::', +:9', +:<', +:+)', +:3:'. Agregar a todos los ?o>os :( l del antgeno. %os ?o>os de la Bilera M no lle@an antgeno, sir@en como testigos del suero. Agregar a todos los ?o>os :( l de com?lemento. -re?arar en este momento una serie de ( ?o>os controles de la reacci4n, como sigue: $!N. !% DE: Antgeno GAH $om?lemento G$YH $om?lemento G$YYH $om?lemento G$YYYH Memolisina GMH EA$.#5!S G:( l de cIuH Diluente, antgeno, com?lemento : de diluente, com?lemento G$YH : de diluente, com?lemento G$YYH : de diluente, com?lemento G$YYYH 3 de diluente

$Y O dosis de com?lemento em?leada en la ?rue8a

Lunes 22 de febrero de 1999 $YY O dosis de com?lemento diluida +:: $YYY O dosis de com?lemento diluida +:9

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

#ncu8ar los ?o>os de la reacci4n a 3=Z$ durante 3' minutos. Al tArmino de la incu8aci4n, agregar :( l de gl48ulos roCos sensi8ili>ados. #ncu8ar nue@amente a 3=Z$ durante 3' minutos agitando a los +' y a los :' minutos. DeCar re?osar en re2rigeraci4n durante : Boras. eali>ar la lectura con ayuda de un es?eCo lector. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an #nter?retaci4n de resultados %os resultados se inter?retar6n como sigue: 'J de Bem4lisis :(J de Bem4lisis ('J de Bem4lisis =(J de Bem4lisis +''J de Bem4lisis -ositi@a TTTT -ositi@a TTT -ositi@a TT -ositi@a T Negati@a

Se consideran ttulos ?ositi@os a la diluci4n corres?ondiente desde 'J de Bem4lisis Basta =(J de Bem4lisis. -ara 8o@inos los ttulos se consideran ?ositi@os desde +:+' y ?ara o@inos y ca?rinos desde +:(. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Esta ?rue8a tiene un ndice de re?roduci8ilidad mayor al ,(J si se sigue el mAtodo descrito. /i8liogra2a o re2erencias Alton, G.G.; 1ones, %.M. Angus, .D. and 5erger, 1.M. .ecBniques 2or tBe 8rucellosis la8oratory. #nstitut Nationale de la ecBercBe Agronomique, -aris, +,<<. Garca $arrillo, $.: -rue8a de 2iCaci4n de com?lemento ?ara el diagn4stico de la 8rucelosis. $entro -anamericano de *oonosis. Nota .Acnica No. :9, !rgani>aci4n -anamericana de la Salud-!rgani>aci4n Mundial de la Salud, /uenos Aires, Argentina, +,<+. .tulo -rue8a de anillo en lecBe o anillo de /ang !8Ceti@o Detecci4n de anticuer?os contra 8rucelas lisas G B. abortus , B. melitensis y B. suisH en lecBe de @acas in2ectadas. Esto se detecta cuando se desarrolla el com?leCo antgeno anticuer?o y se adBiere al gl48ulo de grasa de la lecBe 2ormando un anillo coloreado en la su?er2icie. $am?o de a?licaci4n Esta es una ?rue8a de @igilancia e?idemiol4gica en lecBe de @acas. No es 7til en lecBe de ca8ras ni 8orregas ?orque no se 2orma un anillo teDido en la su?er2icie, sino que la coloraci4n es desigual. %a ?odr6n reali>ar ?ersonal de la8oratorios a?ro8ados o 8ien MAdicos 5eterinarios A?ro8ados en .u8erculosis y /rucelosis que Bayan ?asado ?re@iamente un examen de a?titud esta8lecido ?or la $omisi4n Nacional ?ara la Erradicaci4n de la .u8erculosis /o@ina y /rucelosis.

#!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Es una ?rue8a de diagn4stico ?rimario que detecta la ?resencia de lecBe ?ositi@a de una @aca in2ectada cuando se Ba diluido con lecBe de animales no in2ectados, ?or lo que sir@e ?ara detectar Batos ?otencialmente in2ectados. Se requieren muestras de lecBe cruda 2luida y 2resca. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la /rucelosis en los Animales. Generalidades Es un ?rocedimiento ?r6ctico, r6?ido y econ4mico ?ara detectar Batos lecBeros in2ectados y ?ara la @igilancia de los que est6n exentos de la en2ermedad. Se de8e e2ectuar 3 a 9 @eces al aDo com8inando muestras de lecBe de colectores grandes y luego reali>ando ?rue8as indi@iduales. Se Ba utili>ado como ?rue8a de @igilancia e?idemiol4gica en ?ases o regiones donde se Ba esta8lecido un control de la 8rucelosis 8o@ina. Es una ?rue8a muy sensi8le que ?ermite reducir el n7mero de ?rue8as diagn4sticas necesarias ?ara controlar yIo erradicar la /rucelosis en un re8aDo o Bato. El desarrollo de una reacci4n ?ositi@a de?ende de lo siguiente: aH Una aglutinina del gl48ulo de grasa que se encuentra ?resente en la lecBe normalmente 2orma agregados con los gl48ulos de grasa que su8en a la su?er2icie. Esta es la ca?a de crema normal de la lecBe de @aca. 8H %as cAlulas de /rucella teDidas que se agregan como antgeno se aglutinan si existen anticuer?os contra /rucella ?resentes en la lecBe. Estas cAlulas teDidas en 2orma de agregados se adBieren a la su?er2icie de los gl48ulos de grasa y su8en a la su?er2icie Cunto con ellos ?ara 2ormar una ca?a de crema de color a>ul. Equi?o e instrumentos +.:.3.Materiales +.:.3.9.-ara el usuario: +.eacti@os +.- Antgeno o2icial el cual de8er6 reunir las siguientes caractersticas: aH Ela8orado con la ce?a +++,-3 de Brucella abortus , inacti@ada con 2enol al '.(J -I5 8H .eDido con Bematoxilina. cH ?M de 9.' a 9.3 dH $oncentraci4n celular del 9J Material 8iol4gico /ata Gotero cali8rado a un @olumen de gota de '.'3 ml G3' lH. .u8os de @idrio de +3 x +'' mm. -i?etas de @idrio de + ml. Gradilla. /aDo Mara o estu2a 8acteriol4gica a 3=Z$ $ron4metro e2rigerador domAstico

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

#"

Muestras de lecBe de Batos lecBeros sos?ecBosos de estar in2ectados con Brucella s??. o8tenidas de tanques me>cladores o en2riadores. $ondiciones am8ientales %a ?rue8a de8e reali>arse a tem?eratura am8iente entre ::-:(Z$ -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra De8en tenerse las siguientes ?recauciones cuando se ?rue8e una muestra de lecBe: aH Un muestreo incorrecto ?uede conducir a un contenido insu2iciente o excesi@o de crema, lo que inter2erir6 con la lectura de la ?rue8a. 8H %a agitaci4n excesi@a de la lecBe desnaturali>a a la Laglutinina del gl48ulo de grasaL, y a2ecta la ca?a de crema de la su?er2icie. cH $uando la lecBe se calienta a 9(Z$ o m6s se reduce el contenido de anticuer?os contra /rucella. dH %a lecBe ?uede almacenarse Basta =: Boras a tem?eratura de re2rigeraci4n G:-(Z$H sin una ?Ardida de reacti@idad im?ortante. -eriodos m6s largos yIo tem?eraturas de almacenamiento m6s altas ?ueden ocasionar ?Ardida de anticuer?os. %as lecBes congeladas ?ueden dar resultados 2alsos. eH No es 7til en lecBe Bomogenei>ada ni ?asteuri>ada eacciones 2alsas ?ositi@as.- Estas ?ueden ocurrir cuando la ?rue8a se reali>a en: aH %ecBe recientemente ordeDada Gde8e re2rigerarse al menos ?or +: Boras antes de reali>ar la ?rue8a, y Basta =: Boras inclusi@eH 8H %ecBe de @acas con mastitis cH %ecBe que contenga calostro o sangre dH %ecBe de @acas en ?eriodo de secado eH %ecBe de @acas en lactaci4n, no in2ectadas, que Bayan sido @acunadas dentro de los 3 meses anteriores al muestreo, con @acuna ce?a +, El antgeno y la lecBe sos?ecBosa de8en mantenerse en re2rigeraci4n a 9Z$. -ara reali>ar la ?rue8a de8en estar a tem?eratura am8iente, ?or lo que de8en sacarse del re2rigerador entre 3' y )' minutos antes de reali>ar la ?rue8a. %a sensi8ilidad de la ?rue8a se @e a2ectada ?or la tem?eratura a la que se reali>a; si el antgeno y la lecBe se usan inmediatamente des?uAs de sacarlos del re2rigerador, la ?rue8a ?ierde sensi8ilidad. Antgeno El antgeno ?uede deteriorarse cuando se retira del re2rigerador o si se mantiene a tem?eratura am8iente ?or tiem?o ?rolongado; si la ?rue8a se reali>a e@entualmente en ?ocas muestras se recomienda Bacer ?equeDas alcuotas del antgeno ?ara no sacar todo el 2rasco del re2rigerador. Nunca de8e congelarse el antgeno ?orque se rom?e la sus?ensi4n celular. -rocedimiento +.- %a muestra de lecBe y el antgeno de8en estar a tem?eratura am8iente al momento de reali>ar la ?rue8a. :.- Me>clar la lecBe del tu8o o 2rasco de muestra ?ara dis?ersar la crema. 3.- .rans2erir + ml de la lecBe sos?ecBosa a un tu8o de +3 x +'' mm. 9.- Agregar una gota de '.'3 ml G3' microlitrosH del antgeno al tu8o, ta?e el tu8o y agite sua@emente in@irtiendo el tu8o @arias @eces.

##

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

(.- DeCar re?osar el tu8o + minuto ?ara @eri2icar si el antgeno qued4 adecuadamente me>clado con la lecBe. ).- #ncu8ar a 3=Z$ ?or una Bora ya sea en /aDo Mara o en estu2a 8acteriol4gica. =.- %a lectura se reali>a ?or o8ser@aci4n directa del color ya sea del anillo de crema o del tu8o de lecBe. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados No existen 24rmulas ?ara la o8tenci4n de resultados en esta ?rue8a. Sin em8argo, ?ara que la sensi8ilidad de la ?rue8a sea la misma entre Batos de di2erente tamaDo, se recomienda aCustarse al siguiente cuadro ?ara la reali>aci4n de la ?rue8a. Se de8e considerar que en los Batos de m6s de ,'' @acas, se de8en Bacer ?rue8as en gru?os de ,'' @acas m6ximo: N7mero de @acas en el Bato a ?ro8ar %actando + a 9 Macer un L?oolL o me>cla y ?ro8ar + ml del mismo. -ro8ar la lecBe de cada @aca cuando la diluci4n +:+' del ?ool resulte ?ositi@a. (-:'' -ro8ar + ml :'+-('' Usar : ml ?ara la ?rue8a ('+-,'' Usar 3 ml ?ara la ?rue8a ,'+ o m6s .omar una muestra de modo que no se tome lecBe de m6s de ,'' @acas ?or muestra a ?ro8ar. [ Siem?re se agrega una gota de 3' microlitros ?or ?rue8a. #nter?retaci4n de resultados AN#%%! DE $ EMA A>ul "rancamente coloreado Medianamente coloreado Mismo color /lanco coloreado $!%UMNA DE %E$ME /lanca %igeramente coloreado %igeramente coloreado Mismo color "rancamente ESU%.AD! TTTT TTT TT T G-H

$ualquier lectura ?ositi@a, se de8e considerar como sos?ecBosa a /rucelosis. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Esta ?rue8a tiene un ndice de re?roduci8ilidad mayor al ,(J si se sigue el mAtodo descrito. /i8liogra2a Alton, G.G., 1ones, %.M., Angus, .D. and 5erger, 1.M.: .ecBniques 2or tBe 8rucellosis la8oratory. Edited 8y lY#nstitute National de la ecBercBe Agronomique, #N A, -ars, "rance, +,<<. $asas !lascoaga, .: Diagn4stico serol4gico de la 8rucelosis. /oletn .Acnico, $entro -anamericano de *oonosis, !-S, !MS, +,=(. Norma !2icial Mexicana N!M-'9+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la 8rucelosis en los animales. $orner, %.A. /o@ine 8rucellosis. Serology. Australian Standard Diagnostic .ecBniques 2or Animal Diseases, Su8comitee on Animal MealtB %a8oratory Standards, Australia, +,<,. 1 . Rabia .tulo -rue8a de #nmuno2luorescencia directa ?ara diagn4stico de a8ia. !8Ceti@o

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

#$

Detectar la ?resencia de @irus r68ico ?or medio de la ?rue8a de inmuno2luorescencia directa G#"-DH. $am?o de a?licaci4n. Esta ?rue8a se reali>a ?ara con2irmar o descartar la ?resencia del @irus de la ra8ia, en muestras de animales con diagn4stico clnico yIo sos?ecBosos de la en2ermedad. Documentos conexos a consultarse. +.- Manual de tAcnicas de diagn4stico @irol4gico, ".A.!. :.- N!M-'++-SSA:-+,,3. Norma !2icial Mexicana ?ara la -re@enci4n y $ontrol de la Generalidades Determinar la ?resencia del @irus de la ra8ia a tra@As de la #"-D ?ara diagn4stico de ra8ia se 8asa en la utili>aci4n de anticuer?os es?ec2icos contra el @irus r68ico, teDidos con un colorante 2luorescente GconCugadoH, el que al unirse con el antgeno res?ecti@o ?uede ser o8ser@ado con un microsco?io ?ara 2luorescencia. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.).Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.eacti@os A8atelenguas de madera exentos de cera. /arni> ?ara uDas o ?luma marcadora. $aCa ?ara ?ortao8Cetos con ?er2oraciones en la ta?a Gc6mara B7medaH. $Barolas ?ara enCuague. $u8reo8Cetos de :9 x (' mm. 1arras de $o?lin o reci?ientes ?ara tinci4n. 1eringas de + ml y de tu8erculina. %6?i> de gra2ito. -a?el 2iltro. -in>as. -ortao8Cetos. .iCeras. .u8os de ensayo. Autocla@e. $ongelador con tem?eratura de al menos -:'K$. Estu2a 8acteriol4gica. Microsco?io de 2luorescencia. Ultracongelador yIo termo ?ara nitr4geno lquido. e2rigerador con congelador integrado. a8ia.

#%

(Primera Seccin) +.:.3.9.Acetona. Agua destilada estAril. Glicerina.

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH, ?M =.).

/iol4gicos +.:.3.$onCugado antirr68ico. -ortao8Cetos con im?resiones de teCido ner@ioso ?ositi@o y negati@o al @irus r68ico. Sus?ensi4n de cere8ro de rat4n normal al :'J GS$NH.

9.Sus?ensi4n de cere8ro de rat4n in2ectado con @irus est6ndar de con2rontaci4n al :'J G$5SH o nucleo?rotena de cAlulas in2ectadas con ra8ia al :'J. -re?araci4n de la soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH. aH Soluciones concentradas: Soluci4n #:

'.+ M Na:M-!9 G+9.: g de Na:M-!9 anBidro en + litro de agua destilada o :).< g de Na:M-!9 =M:! en + litro de agua destiladaH. Soluci4n ##:

'.+ M Na:M-!9 G+3.< g de Na:M-!9 M:! en + litro de agua destiladaH. Soluci4n ###:

<.(J Na$l <( g Na$l en un litro de agua destilada. $onser@ar estas soluciones entre 9 y <K$. 8H Soluci4n de tra8aCo ,+.( ml. soluci4n # <.( ml. soluci4n ## +''.' ml. soluci4n ### <''.' ml. agua destilada -re?araci4n del Medio de montaCe (' ml de Soluci4n 8u2erada de tra8aCo (' ml de glicerol $ondiciones am8ientales .em?eratura 4?tima de +< a ::K$ en un lugar exclusi@o ?ara el diagn4stico de ra8ia. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %as muestras de8en ser 2rescas, re2rigeradas, congeladas o estar conser@adas en una soluci4n de glicerina al ('J en agua. Estas 7ltimas de8er6n la@arse con -/S 3 @eces con inter@alos de +' minutos.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

#9

%as muestras congeladas de8en descongelarse ?re@iamente a la ela8oraci4n de las im?rontas. A8sorci4n del conCugado. Diluir el conCugado a la concentraci4n 4?tima ?ara el microsco?io que @aya a utili>ar. Adicionar $5S y S$N al conCugado durante 3' minutos, ?ara ?ermitir la a8sorci4n. -re?arar alcuotas ?ara su ?osterior utili>aci4n, conser@adas en congelaci4n. -rocedimiento aH -re?araci4n de im?resiones o im?rontas del teCido a ?artir de las siguientes regiones del encA2alo: caninos y 2elinos: cere8elo, 8ul8o raqudeo y asta de Am4n. rumiantes: trgono ol2atorio, cere8elo y 8ul8o raqudeo. quir4?teros: corte trans@ersal del cere8ro com?leto.

En el extremo de un a8atelenguas se coloca un tro>o ?equeDo del teCido ner@ioso y se ?resiona ligeramente contra Aste un ?ortao8Cetos que se Ba di@idido en tres regiones y del cual s4lo se utili>ar6n las dos ?rimeras ?ara la ela8oraci4n de las im?rontas. %as im?resiones de8en ser muy delgadas, ?ues de lo contrario incrementa la 2luorescencia ines?ec2ica. 8H "iCaci4n y tinci4n de las im?rontas. +.- Sumergir los ?ortao8Cetos en una Carra de $o?lin con acetona ?or un ?eriodo mnimo de + Bora GBasta :9 BorasH, ?ues esto ?ermite que la muestra se adBiera 2uertemente al ?ortao8Cetos, elimina grasas e incrementa la ?ermea8ilidad celular, lo que 2acilita que el conCugado ?enetre a las cAlulas y reaccione con el @irus. Se recomienda que la acetona estA conser@ada a menos :'K$. :.- Al tArmino de la 2iCaci4n se de8e rodear las im?rontas con 8arni> u otro marcador. Esto e@itar6 que el conCugado se extienda y se seque o se utilice mayor cantidad de Aste G:(-(' SlH. No omitir utili>ar testigos tanto ?ositi@o como negati@o en cada ?rue8a. 3.- Descongelar dos alcuotas de conCugado Guna a8sor8ida con $5S y otra con S$NH y cu8rir las im?resiones con Astos. 9.- $olocar los ?ortao8Cetos en la c6mara B7meda e incu8ar a 3=K$ ?or 3' minutos. (.- .ranscurrido el tiem?o, la@ar los ?ortao8Cetos con -/S dos @eces, deC6ndolas sumergidas la segunda ocasi4n ?or +' minutos, al tArmino de los cuales se re?ite el enCuague ?ero con agua destilada. ).- -ermitir que se sequen las im?rontas, adicionar la glicerina 2os2atada, colocar so8re ella un cu8reo8Cetos y o8ser@ar al microsco?io de 2luorescencia. cH !8ser@e ?rimero el ?ortao8Cetos con el testigo ?ositi@o ?ara identi2icar las caractersticas de la 2luorescencia es?ec2ica, des?uAs o8ser@e su control negati@o ?ara reconocer la ?resencia de 2luorescencia ines?ec2ica y ?or 7ltimo sus muestras ?ro8lema. #nter?retaci4n de resultados. %a intensidad de la 2luorescencia @ara de negati@o a 9T, siendo directamente ?ro?orcional a la cantidad de antgeno es?ec2ico ?resente. %as muestras que resulten negati@as en esta ?rue8a de8er6n examinarse nue@amente ?or medio de la inoculaci4n en ratones lactantes o de :+ das de edad o en culti@os celulares de neuro8lastoma Gesta 7ltima ?rue8a es m6s r6?ida ya que en 9' Boras se o8tiene el resultadoH. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito.

$&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

/i8liogra2a +.- U.S. De?artment o2 MealtB and Muman Ser@ices. +,<+ %a8oratory MetBods 2or Detecting $enter 2or Disease $ontrol. :.- Vorld MealtB !rgani>ation +,)). VM! Ex?ert $ommittee on re?ort. .tulo -rue8a 8iol4gica en ratones ?ara la detecci4n del @irus de ra8ia. !8Ceti@o Esta ?rue8a se utili>a ?ara determinar la ?resencia o ausencia del @irus r68ico. $am?o de a?licaci4n %a ?rue8a se reali>a con muestras de teCidos ?ro@enientes de animales con neuro?atas sugesti@as de ra8ia. Documentos conexos a consultarse. +.- Manual de tAcnicas de diagn4stico @irol4gico, ".A.!. :.- N!M-'++-SSA:-+,,3. Norma !2icial Mexicana ?ara la ?re@enci4n y control de la ra8ia. Generalidades Determinar la ?resencia del @irus de la ra8ia a tra@As de la signologa que ?resentan los ratones lactantes o de :+ das inoculados con una sus?ensi4n de teCido ner@ioso o de gl6ndulas sali@ales de animales sos?ecBosos a ra8ia. A ?artir de muestras ?re@iamente anali>adas ?or la tAcnica de inmuno2luorescencia directa. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.Materiales +.:.3.9.(.).=.<.eacti@os AguCas Bi?odArmicas cali8re := ?or media ?ulgada. Algod4n. Alimento ?ara ratones. 1eringas de '.:( ml, '.( ml y + ml. Mortero de ?orcelana con ?istilo o mortero de .em8roeF. -in>as. .iCeras. .u8os de ensayo. $entr2uga clnica o re2rigerada. 1aulas ?ara ratones. e2rigerador con congelador integrado. Ultracongelador yIo termo ?ara nitr4geno lquido. a8ies. .ecB. a8ies.

e?. Ser. No. 3:+ 2i2tB

Lunes 22 de febrero de 1999 +.:.3./iol4gicos +.:.3.Eter.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

$1

Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH ?M =.). Soluci4n de anti8i4ticos ?enicilina G+'' ''' U.#.ImlH T estre?tomicina G+'' ''' U.#.ImlH.

Suero 2etal 8o@ino li8re de anticuer?os contra ra8ia o al87mina 8o@ina 2racci4n 5. Animales de ?rue8a. atones lactantes o de :+ das.

$ondiciones am8ientales .em?eratura 4?tima de +< a ::K$ en un lugar exclusi@o ?ara el aloCamiento de los animales de ?rue8a. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. %as muestras de8en ser 2rescas, re2rigeradas, congeladas o estar conser@adas en una soluci4n de glicerina al ('J en agua. Estas 7ltimas de8er6n la@arse con -/S 3 @eces con inter@alos de +' minutos. %as muestras congeladas de8en descongelarse ?re@iamente. -rocedimiento +.- Se o8tiene una muestra de + a 9 g del teCido a ser ?ro8ado y se macera en un mortero estAril utili>ando una cantidad su2iciente de -/S adicionado con '.=(J de suero 2etal 8o@ino o al87mina 8o@ina al '.9J y anti8i4ticos ?ara una concentraci4n 2inal de +'' a +''' U.#. de ?enicilina y de +'' a +''' U.#. de estre?tomicina ?or ml Gde?endiendo del grado de contaminaci4n de las muestras ?rocesadasH ?ara o8tener una sus?ensi4n de teCido al +'J que ser@ir6 de in4culo ?ara los ratones. :.- %a sus?ensi4n al +'J se centri2uga a +('' r?m durante ( minutos, ?re2erentemente en una centr2uga re2rigerada a 9K$. 3.- Des?uAs de anestesiar a los ratones con Ater y transcurridos al menos 3' minutos des?uAs de Ba8er agregado anti8i4ticos al in4culo, se inoculan '.'3 ml del mismo ?or @a intracere8ral. "4rmulas de c6lculo. En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados +.- El ?eriodo de o8ser@aci4n de los animales inoculados de8e ser al menos de :< das y la muerte de ratones en las ?rimeras =: Boras de8en considerarse ines?ec2icas. :.- Se considera un diagn4stico ?ositi@o cuando los ratones ?resentan los signos ner@iosos caractersticos de la ra8ia Gtremores, incoordinaci4n, ataxia, ?ar6lisis ?rogresi@a, ?ostraci4n y muerteH. A ?artir del quinto da se ?uede sacri2icar ?aulatinamente los animales y reali>ar la ?rue8a de inmuno2luorescencia directa, ?ara a8re@iar el tiem?o de duraci4n de la ?rue8a en @irtud de que se ?uede o8ser@ar 2luorescencia es?ec2ica en animales a?arentemente sanos. 3.- El diagn4stico se considera negati@o si los ratones so8re@i@en el ?eriodo de o8ser@aci4n de la ?rue8a. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad. Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a

$2

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999 a8ies.

+.- U.S. De?artment o2 MealtB and Muman Ser@ices. +,<+ %a8oratory MetBods 2or Detecting $enter 2or Disease $ontrol. :.- Vorld MealtB !rgani>ation +,)). VM! Ex?ert $ommittee on re?ort. .tulo -rue8a 8iol4gica en cAlulas de neuro8lastoma ?ara la detecci4n del @irus de ra8ia. !8Ceti@o Esta ?rue8a se utili>a ?ara determinar la ?resencia o ausencia del @irus r68ico. $am?o de a?licaci4n a8ies. .ecB.

e?. Ser. No. 3:+ 2i2tB

%a ?rue8a se reali>a en muestras de teCidos ?ro@enientes de animales con neuro?atas sugesti@as de ra8ia. Documentos conexos a consultarse. +.- Manual de tAcnicas de diagn4stico @irol4gico, ".A.!. :.- N!M-'++-SSA:-+,,3. Norma !2icial Mexicana ?ara la ?re@enci4n y control de la ra8ia. Generalidades Determinar la ?resencia del @irus de la ra8ia a tra@As de culti@os de neuro8lastoma in2ectados con una sus?ensi4n de teCido ner@ioso o de gl6ndulas sali@ales de animales sos?ecBosos a ra8ia, ?re@iamente anali>ados ?or medio de la tAcnica de inmuno2luorescencia directa Equi?o e instrumentos +.:.3.9.Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.eacti@os $u8reo8Cetos. 1arras de $o?lin. Mortero de ?orcelana con ?istilo o mortero de .em8roeF. -in>as. -i?etas de + ml. -ortao8Cetos delimitados con te2l4n. .iCeras. .u8os de ensayo. /otellas de culti@o celular de ( ml. $entr2uga clnica o re2rigerada. Estu2a 8acteriol4gica. e2rigerador con congelador integrado. Ultracongelador yIo termo ?ara nitr4geno lquido.

Lunes 22 de febrero de 1999 +.:.3.9.(./iol4gicos +.:.Acetona a -:'K$. Agua destilada estAril.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

Medio mnimo esencial ?ara culti@o de teCidos. Soluci4n de anti8i4ticos ?enicilina G+'' ''' U.#.ImlH T estre?tomicina G+'' ''' U.#.ImlH. Soluci4n salina amortiguada con 2os2atos G-/SH ?M =.).

$ulti@os de cAlulas de neuro8lastoma con con2luencia del <'J. Suero 2etal 8o@ino li8re de anticuer?os contra ra8ia o al87mina 8o@ina 2racci4n 5.

$ondiciones am8ientales .em?eratura 4?tima de +< a ::K$ en un lugar exclusi@o ?ara el diagn4stico de ra8ia. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. %as muestras de8en ser 2rescas, re2rigeradas o congeladas o estar conser@adas en una soluci4n de glicerina al ('J con agua. Estas 7ltimas de8er6n la@arse con -/S 3 @eces con inter@alos de +' minutos. -rocedimiento +.- Se o8tiene una muestra de + a 9 g del teCido a ser ?ro8ado y se macera en un mortero estAril utili>ando una cantidad su2iciente de -/S adicionado con '.=(J de suero 2etal 8o@ino o al87mina 8o@ina al '.9J y anti8i4ticos ?ara una concentraci4n 2inal de +'' a +''' U.#. de ?enicilina y de +'' a +''' U.#. de estre?tomicina ?or ml Gde?endiendo del grado de contaminaci4n de las muestras ?rocesadasH ?ara o8tener una sus?ensi4n de teCido al +'J que ser@ir6 de in4culo ?ara las cAlulas. :.- %a sus?ensi4n al +'J se centri2uga a +('' r?m durante ( minutos, ?re2erentemente en una centr2uga re2rigerada a 9K$. 3.- $on '.( ml de este material se inoculan monoestrato celulares de neuro8lastoma con una con2luencia del <'J y se incu8an durante ,' minutos a 3= grados centgrados. 9.- Al tArmino de este tiem?o se adiciona medio mnimo de culti@o con :J de suero 2etal 8o@ino, ?ara incu8ar a 3=K$ ?or 9' Boras. (.- Al 2inali>ar este ?eriodo se ?ractica un ras?ado del monoestrato, se coloca en un tu8o ?ara centr2uga y se resus?enden las cAlulas o8tenidas en -/S ?ara centri2ugar a +('' r?m y ?osteriormente se desecBa el so8renadante. Este ?roceso se re?ite una @e> m6s. ).- Ma8iendo desecBado el so8renadante ?or segunda ocasi4n, se resus?enden las cAlulas en un @olumen de '.( ml de -/S coloc6ndolas en un ?ortao8Cetos y delimitando el 6rea con te2l4n ?ara ?ermitir su secado. Se 2iCa con acetona a -:'K$ durante +( minutos, deCar secar y se reali>a la ?rue8a de inmuno2luorescencia directa. "4rmulas de c6lculo. En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados Un diagn4stico ?ositi@o se o8tiene al o8ser@ar la 2luorescencia es?ec2ica en las cAlulas de neuro8lastoma inoculadas. El diagn4stico se considera negati@o si no se o8ser@a la 2luorescencia. /i8liogra2a

$!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999 a8ies.

+.- U.S. De?artment o2 MealtB and Muman Ser@ices. +,<+ %a8oratory MetBods 2or Detecting $enter 2or Disease $ontrol. :.- Vorld MealtB !rgani>ation +,)). VM! Ex?ert $ommittee on re?ort. 3.- Manual de tAcnicas de diagn4stico @irol4gico, ".A.!. 1!. <#berc#lo"i" bovina .tulo. Diagn4stico Bisto?atol4gico de la tu8erculosis 8o@ina. !8Ceti@o a8ies. .ecB.

e?. Ser. No. 3:+ 2i2tB

Diagn4stico Bistol4gico di2erencial de la .u8erculosis 8o@ina en lesiones granulomatosas ?resentes en n4dulos lin26ticos y otros 4rganos en los 8o@inos. $am?o de a?licaci4n #denti2icaci4n de las lesiones Bistol4gicas com?ati8les con tu8erculosis, organismos alcoBol-6cido resistentes, auramina o ?ositi@os reactores durante el estudio ?ostmortem. Documentos conexos a consultarse. Norma !2icial Mexicana N!M-'3+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la .u8erculosis /o@ina GMycobacterium bovisH. Generalidades eali>ar el estudio Bistol4gico de las lesiones com?ati8les con tu8erculosis y las ?rue8as con2irmatorias mediante coloraciones de Bematoxilina-eosina contratada, *ieBl Neelsen yIo nue@a 2ucsina. eacti@os +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.Materiales Acido acAtico glacial concentrado. Agua destilada. AlcoBol etlico ='J, <'J, ,(J y +''J &ilol. Auramina-!. A>ul de metileno 84rax /4rax. $ar8onato de litio. $loruro 2Arrico. "enol. "ormalina amortiguada al +'J ?M =.:. NaranCa de acridina. Nue@a 2ucsina. -ara2ina ?unto 2usi4n ()K$.

Lunes 22 de febrero de 1999 /iol4gicos:

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

$"

Muestras de animales asegurados en la lnea de ins?ecci4n de carnes sos?ecBosos yIo reactores a la ?rue8a de la tu8erculina. N4dulos lin26ticos: traqueo8ronquiales, mediastnicos, medial retro2arngeo, mandi8ulares, ?arotdeos, Be?6ticos y mesentAricos en algunos casos ?ulm4n, Bgado, 8a>o y riD4n con ?resencia de lesiones sugesti@as. $ondiciones am8ientales El corte de teCidos ?ara el ?rocesamiento se reali>ar6, en la cam?ana de Bumos, ?rotegiAndose las manos con guantes de l6tex y oCos con los gogles, accionando la cam?ana de extracci4n durante la ?re?araci4n de los teCidos reci8idos ?ara ?rocesamiento. Durante el ?rocesamiento de teCidos se ?re2erira mantener el equi?o de las cam?anas de extracci4n de @a?ores o alternati@amente en un 6rea am?lia y @entilada. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %as condiciones de rece?ci4n de las muestras ser6 recomendado el en@o de los teCidos en un tamaDo no mayor de : cm en una soluci4n de 2ormalina amortiguada al +'J ?M =.:, en una relaci4n de teCido2ormalina +:+' con la identi2icaci4n clara de las muestras con sus datos generales; 4rganoGsH, nom8re del ?ro?ietario, u8icaci4n de la ex?lotaci4n de origen, d4nde se o8tu@o la muestra, la descri?ci4n del animal Ges?ecie, ra>a, sexo, edad, etc.H, identi2icaci4n ?recisa del animal Garete, marcas u otrosH, as como el nom8re, registro y domicilio del mAdico @eterinario o2icial o a?ro8ado que remita la muestra. -ara el estudio Bistol4gico de rutina se contar6 con laminillas control ?ositi@o de teCidos con 8acterias alcoBol-6cido resistentes. -ara las ?rue8as de *ieBl Neelsen y auramina o rodamina. %as muestras ser6n ordenadas ?ara su registro en los 2ormatos de ?rocesamiento de teCidos, ?osteriormente se extraen teCidos de los 2rascos y se colocan so8re toallas desecBa8les ?ara a8sor8er la soluci4n de 2ormalina en la cual est6n em8e8idas. $ada teCido se examinar6 y cortar6 se?aradamente con un grosor de :-( mm seleccion6ndose 6reas de teCido normal y anormal, reincor?or6ndose nue@amente a los 2rascos originales de en@o de teCidos. -osteriomente se colocan Astos en las c6?sulas de ?rocesamiento de teCidos identi2icadas ?re@iamente, cuando Astas Bu8ieran estado calci2icados se colocar6n des?uAs de la 2ormalina en las soluciones descalci2icadoras antes del ?rocesamiento de los teCidos[. -rocedimiento #nclusi4n en ?ara2ina. +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:."ormalina amortiguada 3' min. AlcoBol etlico ='J )' min. AlcoBol etlico <'J )' min. AlcoBol etlico ,(J )' min. AlcoBol etlico ,(J )' min. AlcoBol etlico +''J )' min. AlcoBol etlico +''J )' min. AlcoBol etlico +''J )' min. &ilol )' min. &ilol )' min. &ilol )' min. -ara2ina )' min. a )'K$.

$#

(Primera Seccin) +3.+9.+(.-ara2ina )' min. a )'K$. -ara2ina )' min. a )'K$.

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

#nclusi4n de teCidos en ?ara2ina ?unto de 2usi4n ()K$ lquida.

+).$orte de los teCidos a ?artir de los 8loques de ?ara2ina en microtomo con un grosor de 9 a ) micras. +=.Montar el corte so8re la laminilla con el adBesi@o, des?ara2inar en ?laca caliente u Borno de microondas. +<.Se tiDen las laminillas con los ?rocedimientos indicados y se montan con resina sintAtica ?ara su o8ser@aci4n. .inciones .inci4n de Bematoxilina-eosina contrastada. %os teCidos ?rocesados ser6n teDidos rutinariamente ?ara la identi2icaci4n de lesiones com?ati8les con tu8erculosis 8o@ina y di2erenciar con otras entidades ?atol4gicas 8aCo el siguiente ?rocedimiento: +. :. 3. 9. (. ). =. <. ,. +'. ++. +:. +3. +9. +(. +). +=. +<. +,. &ilol +' min. AlcoBol etlico +''J ( min. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol etlico <'J ( min. AlcoBol etlico ='J ( min. AlcoBol etlico ('J ( min. %a@ar con agua corriente. Mematoxilina ( min. GBematoxilina de MarrisH. %a@ar con agua corriente. $lari2icar con alcoBol 6cido. %a@ar con agua corriente. 5irar con agua amoniacal o car8onato de litio. Eosina + a : min. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol a8soluto ( min. AlcoBol-xileno ('J ( min. &ileno +' min. &ileno +( min.

.inci4n de nue@a 2ucsina

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

$$

De manera alternati@a a la tinci4n de *ieBl Neelsen, este ?rocedimiento ?uede 2a@orecer la identi2icaci4n de 8acilos alcoBol-6cido resistentes. +.:.3.9.(.).&ilol ( min. &ilol ( min. AlcoBol etlico +''J +-: min. AlcoBol etlico +''J : min. y secar al aire. %a@ar con agua destilada. .eDir con nue@a 2ucsina +' min.

=.$olocar la laminilla indi@idualmente en una soluci4n saturada de cloruro de litio durante 3' seg. <.,.+'.++.+:.+3.+9.Di2erenciar en alcoBol acAtico cuando la laminilla sea decolorada. %a@ar con agua tam?onada corriente. $ontrateDir con a>ul de metileno 84rax. AlcoBol etlico ,(J : min. AlcoBol etlico +''J : min. $lari2icar en : cam8ios de xilol :-3 min. Montar con resina sintAtica cada uno.

.inci4n de Auramina oIy naranCa de acridina ?ara 8acilos alcoBol-6cido resistentes. Se em?lear6 como ?rue8a con2irmatoria en los casos sos?ecBosos de tu8erculosis 8o@ina. +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.+9.&ilol ( min. &ilol ( min. AlcoBol etlico +''J AlcoBol etlico +''J Agua destilada Auramina +' min. + min. +-: min. : min. : min.

Agua ta?onada corriente $loruro 2Arrico +'J +' min.

Agua tam?onada corriente NaranCa de acridina :.( min.

+ min.

Agua tam?onada corriente AlcoBol etlico ='J AlcoBol etlico ,(J AlcoBol etlico +''J + min. + min. + min.

+ min.

$%

(Primera Seccin) +(.+).+=.-

DIARIO OFICIAL &ilol ( min. &ilol ( min.

Lunes 22 de febrero de 1999

$u8rir la laminilla con resina.

.inci4n de *ieBl Neelsen. Se em?lea como ?rocedimiento de rutina ?ara el diagn4stico con2irmatorio de 8acilos alcoBol-6cido resistentes en muestras teDidas con Bematoxilina y lesiones com?ati8les con tu8erculosis 8o@ina. +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.+3.+9.+(.+).+=.+<.+,.:'.&ileno +( min. &ileno +( min. AlcoBol etlico +''J ( min. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol etlico <'J ( min. AlcoBol etlico ='J ( min. AlcoBol etlico ('J ( min. %a@ar con agua corriente. $ar8ol 2ucsina 3' min. %a@ar con agua corriente. Decolorar con alcoBol 6cido. %a@ar con agua corriente. $ontrastar con a>ul de metileno + min. %a@ar con agua corriente. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol etlico ,)J ( min. AlcoBol etlico +''J ( min. AlcoBol xileno G('I('H ( min. &ileno +' min. &ileno +( min.

#nter?retaci4n de resultados. +.- Mematoxilina-eosina. N7cleos a>ules y cito?lasma rosa, identi2icando el granuloma caracterstico en tu8erculosis 8o@ina. :.- *ieBl Neelsen. /acilos alcoBol-6cido resistentes color rosa-roCi>os, 2ondo a>ul tenue, eritrocitos color roCo. 3.- Nue@a 2ucsina.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

$9

/acilos alcoBol-6cido resistentes color roCo, 2ondo color a>ul ca2A. 9.- Auramina-!. "luorescencia ?ositi@a 8acilos alcoBol-6cido resistentes. En la tAcnica de Mematoxilina-eosina contrastada ?ueden @ariar ligeramente los tiem?os en am8os colorantes. El tratamiento con su8stancias descalci2icantes ?uede a2ectar la tinci4n de 8acilos alcoBol-6cido resistentes en la tinci4n de nue@a 2ucsina, los tiem?os requeridos en las eta?as de la tinci4n de Auramina! y rodamina de8er6n ser exactos ?or lo que se Bace necesario em?lear controles ?ositi@os. /i8liogra2a Mo.e ". ., MuBm, %. . and Gigstad, $.D.: A staining metBod using acridine orange and auramine-! 2or 2ungi and myco8acteria in 8o@ine tissue. Stain tecnology. (': (, G+,=(H. Mc #lroy, G.S., Neill, D.S. and Mc $racFen, M. . 5eterinary ecord. ++<: =+<-=:+ G+,<)H.

$orner, %.A., Mel@ille, %.U., Mc $u88in, Small, U.1., Mc $ormicF, /.S., Vood, .-., and otBel, S.#.: E22iciency o2 ins?ection ?rocedures 2or tBe detection o2 tu8erculosis lesions in cattle. Australian 5eterinary 1ournal. )=: 3<,-3,: G+,,3H. .u8erculosis training 2or regulatory @eterinarians. Animal and -lant MealtB #ns?ection Ser@ice. USDA, N5S% AMES #A G+,,3H. .tulo Aislamiento de Mycobacterium bovis !8Ceti@o Determinar 8acteriol4gicamente la ?resencia de Mycobacterium bovis en muestras de origen animal. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a se reali>ar6 en muestras de teCidos u 4rganos de animales con lesiones sos?ecBosas de ser tu8erculosas o en n4dulos lin26ticos de animales ?ositi@os a las ?rue8as de tu8erculina. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-'3+-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la .u8erculosis /o@ina GMycobacterium bovisH. Generalidades El estudio 8acteriol4gico de la tu8erculosis sir@e ?ara corro8orar el diagn4stico reali>ado en el cam?o ?or medio de las ?rue8as tu8erculnicas y ?ara detectar animales con lesiones sos?ecBosas de tu8erculosis en los rastros o mataderos dentro de un ?rograma de @igilancia e?i>ootiol4gica. Equi?o e instrumentos +.:.Autocla@e /istur y BoCas de 8istur

3.$am?ana de seguridad 8iol4gica ti?o ## o ### con extracci4n de aire con @elocidad ?romedio de =( ?ies ?or minuto y 2iltraci4n ti?o ME-A 9.(.).$entr2uga de seguridad 8iol4gica con cu8etas con ta?4n de rosca $ongelador Estu2a 8acteriol4gica a 3=Z$

%&

(Primera Seccin) =.<.,.+'.++.Microsco?io de cam?o claro -in>as de rat4n

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

-i?eteador manual o autom6tico e2rigerador .iCeras

%a cam?ana de seguridad 8iol4gica, la centr2uga y la incu8adora de8en estar en una sola 6rea aislada delimitada del resto del la8oratorio y que tenga seDalamientos de riesgo 8iol4gico. Materiales +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.++.+:.Arena estAril $Barolas met6licas con y sin ta?a "rascos color 6m8ar con gotero Matraces a2orados Matraces Erlenmeyer Morteros de ?orcelana con mano -erlas de @idrio -i>etas -ro8etas .u8os de ensaye de +3 x +'' .u8os de @idrio con ta?4n 5asos de ?reci?itado

Equi?o de seguridad +.:.3.Guantes de Bule %entes de ?rotecci4n Mascarillas ?rotectoras con 2iltros ME-A

Medidas de 8ioseguridad %as in2ecciones ?or el 8acilo de la tu8erculosis 8o@ina son un riesgo com?ro8ado ?ara el ?ersonal de la8oratorio es?ecialmente ?ara los indi@iduos ex?uestos a los aerosoles in2ecciosos. Existen requisitos mnimos de 8ioseguridad ?ara el ?ersonal que tra8aCa con mico8acterias tu8erculosas o 8o@inas. -ersonal - El ?ersonal de la8oratorio de8e ser tu8erculino G--DH ?ositi@o. De resultar negati@o de8e @acunarse con /$G y ser admitido en el 6rea Basta que se @eri2ique su ?ositi@idad. - De8e reali>arse un control radiogr62ico de t4rax del ?ersonal cada aDo y conser@ar las ?lacas ?ara estudios com?arati@os ?osteriores. Area de tra8aCo

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%1

- De8e Ba8er un 6rea delimitada y aislada de las otras secciones del la8oratorio donde se encuentre el equi?o, se tra8aCen las muestras y se realicen culti@os y resiem8ras. - %a entrada al 6rea de8e ser restringida al momento de tra8aCar con muestras en la cam?ana, centri2ugar, re@isar o reali>ar culti@os. - El equi?o de seguridad y ?re@enci4n de accidentes de8e estar dis?oni8le, ser su2iciente ?ara el ?ersonal del 6rea y estar en un lugar @isi8le Cunto con las instrucciones ?ara su uso. - Siem?re de8e contarse con ?ro?i?etas o 8om8as ?ara ?i?etear, e@itando ?i?etear con la 8oca. %im?ie>a y desin2ecci4n - .odas las >onas de tra8aCo de8en descontaminarse al menos una @e> al da y siem?re des?uAs de tra8aCar. DesecBo de material contaminado - Antes de desecBarlo, todo el material 8iol4gico contaminado de8e ser esterili>ado en autocla@e. - %a cristalera y material utili>ados en el ?rocesamiento de muestras ?resumi8lemente contaminados o material 8iol4gico como culti@os de8en ser esterili>ados antes de ser la@ados. eacti@os +.:.3.9.(.).=.<.,.+'.Material 8iol4gico Material sos?ecBoso con lesiones granulomatosas: n4dulos lin26ticos o teCidos di@ersos, o n4dulos lin26ticos o teCidos de animales reactores a la ?rue8a de tu8erculina en soluci4n saturada de 8orato de sodio en una relaci4n de teCido-@olumen +:+ o +::. $uando no se cuente con medios dis?oni8les ?ara siem8ra inmediata, los 4rganos de8er6n ser retirados de la soluci4n de 8orato y ser conser@ados en congelaci4n a -:'Z$. $ondiciones am8ientales El ?rocesamiento de las muestras se de8e reali>ar 8aCo condiciones estrictas de seguridad 8iol4gica, en el interior de ca8inas de seguridad micro8iol4gica. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Seleccionar ?re@iamente la muestra: retirar toda la grasa y teCido conecti@o de la muestra a ?rocesar. Si la lesi4n es muy grande o tiene mucBo exudado, elegir una ?arte externa de la lesi4n Gc6?sulaH y ?arte del Acido clorBdrico AlcoBol etlico de ,)Z A>ul de metileno "enol en cristales "ucsina 86sica Midr4xido de sodio Mi?oclorito de sodio Medio de %oEenstein 1ensen Medio de Stone8rinF oCo de 2enol

%2

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

interior de la lesi4n. $uando la muestra es muy ?equeDa, incluir toda. En caso de no Ba8er lesiones @isi8les, seleccionar una ?orci4n de teCido re?resentati@o de la muestra. -rocedimiento Descontaminaci4n. %a descontaminaci4n de la muestra ?uede Bacerse ?or el mAtodo de -etro22 o ?or su @ariante 6cido-6lcali. MAtodo de -etro22.- $olocar la muestra en un mortero con arena y agua destilada, todo estAril y macerar. .ras@asar a un tu8o con soluci4n estAril de Bidr4xido de sodio al 9J en una ?ro?orci4n +::. Agitar @igorosamente e incu8ar a 3=Z$ ?or :' minutos, agitando cada ( minutos. $entri2ugar ?or :' minutos a 3,''' r?m y desecBar el so8renadante. Agregar al sedimento + a : gotas de soluci4n de roCo de 2enol y unas gotas de una soluci4n de 6cido clorBdrico al +'J Basta que @ire el indicador del roCo @iol6ceo al amarillo anaranCado. Agregar : ml de agua destilada estAril y sem8rar o 8ien agregar 3 ml de agua destilada estAril, agitar y centri2ugar a 3,''' r?m ?or +( minutos. DesecBar el so8renadante y sem8rar el sedimento. 5ariante 6cido-6lcali del mAtodo de -etro22.- Macerar en un mortero de ?orcelana agregando un ?oco de arena y agua destilada estAriles. .ras@asar a dos tu8os de ensaye estAriles con ta?4n y guardar uno identi2icado en congelaci4n. ADadir al segundo tu8o ( ?artes de 6cido clorBdrico al +'J y aDadir : a 3 gotas de roCo de 2enol al +J Basta que @ire a un color naranCa. Agitar y deCar en re?oso :' minutos. ADadir gota a gota una soluci4n de Bidr4xido de sodio : N agitando el tu8o Basta que @ire a un color @iol6ceo Gmorado a lilaH. $entri2ugar a 3,''' r?m ?or :' minutos y desecBar el so8renadante. Sem8rar el sedimento. Siem8ra Sem8rar el sedimento descontaminado con Biso?o, ?i?eta -asteur o asa 8acteriol4gica, so8re la su?er2icie de + tu8o de medio %oEenstein 1ensen y : tu8os de medio de Stone8rinF. #ncu8ar a 3=Z$ los tu8os sem8rados con los ta?ones 2loCos en ?osici4n Bori>ontal el ?rimer da y en ?osici4n @ertical des?uAs del segundo da ?ara que el sedimento seque so8re toda la su?er2icie del medio. e@isar semanalmente durante , semanas. En caso de contaminaci4n de todos los tu8os, Astos se de8en desecBar y se de8e ?rocesar la muestra congelada Gde rA?licaH. Esta se di@ide en dos tu8os. Se guarda uno en congelaci4n y el otro se ?rocesa ?ara descontaminaci4n y se de8e e2ectuar nue@a siem8ra como ya 2ue descrito. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados No existen ?ara este ?rocedimiento. #nter?retaci4n de resultados %as colonias de Mycobacterium bovis se a?recian a sim?le @ista a ?artir de la 3a. semana generalmente, ?ero ?ueden tardar Basta , semanas. $recen meCor en el medio de Stone8rinF Gcrecimiento eug4nico o a8undanteH que en el medio de %oEenstein 1ensen Gcrecimiento disg4nico o ?o8reH. Mor2ologa colonial Medio de %oEenstein 1ensen: colonias muy ?equeDas G<.' a +.( mmH, transl7cidas; con el tiem?o toman una 2orma ?iramidal. Medio de Stone8rinF: colonias generalmente ?equeDas, 8lancas, como ?e>ones, que suelen estar dis?ersas. Mor2ologa celular /acilos largos; en el examen microsc4?ico con tinci4n de *ieBl Neelsen se o8ser@an 8acilos largos 6cido alcoBol resistentes GroCosH de : a ) x '.3 um, que ?ueden o8ser@arse como LcordonesL.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

% e2erencia

.odas las ce?as aisladas sos?ecBosas de ser M. bovis de8en ser remitidas al %a8oratorio de ?ara reali>ar la identi2icaci4n ?or ?rue8as en>im6ticas. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Es del ,)J a?roximadamente. /i8liogra2a

/alandrano, $.S.; An>aldo, ".G.; -eDa ".G.-. y /etancourt M.&.: .u8erculosis. Manual de -rocedimientos de %a8oratorio #ND E-SAGA . A. Esco8ar G. -u8licaci4n No. +< del #nstituto Nacional de Diagn4stico y e2erencia E?idemiol4gicos; Secretara de Salud; Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural; !rgani>aci4n -anamericana de la Salud. MAxico, D."., Cunio de +,,). Da@id, M.; %e@y-"re8ault, 5. et .Borel, M.".: MetBodes de la8oratoire ?our myco8acteriologie clinique, $omission de %a8oratoires de A2Arence et dYEx?ertise de lY#nstitut -asteur; #nstitut -asteur, -ars, +,<,. Uantor, #.N.: /acteriologa de la .u8erculosis Mumana y Animal. $entro -anamericano de *oonosis. !rgani>aci4n -anamericana de la Salud-!rgani>aci4n Mundial de la Salud, Monogra2a $ient2ica y .Acnica No. ##I e@. +, Martne>, Argentina, +,<<. 1&. Enfermedad de A#je"%5y .tulo Sueroneutrali>aci4n ?ara detecci4n de anticuer?os contra el @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy GEAH. !8Ceti@o Esta ?rue8a se utili>a ?ara cuanti2icar los anticuer?os contra el @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy, en muestras de suero sanguneo de ?orcinos que Ban estado en contacto con el @irus. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a se utili>a ?ara con2irmar o descartar la ?resencia de anticuer?os en animales @acunados, sos?ecBosos o con signos clnicos de EA. Documentos conexos a consultarse. Norma !2icial Mexicana N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Generalidades Determinar la ?resencia de anticuer?os es?ec2icos contra el @irus de la EA, ca?aces de neutrali>ar la acci4n in2ectante del @irus de la EA a una concentraci4n de :'' D#$$ ('J. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.Agitador de micro?lacas. /aDo Mara. $entr2uga clnica. Estu2a de $!:.

%!

(Primera Seccin) (.).=.<.,.Microsco?io de lu> in@ertida.

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Multi?i?etas de < a +: canales G('-:'' microlitrosH. Micro?i?etas de ('-+'' microlitros. Ultracongelador o termo con nitr4geno lquido e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos, con congelador integrado.

Materiales +.:.3.9.eacti@os +.:.3./iol4gicos +.- $Alulas -U+( GriD4n de cerdoH, SU% Glnea de riD4n de cerdoH o cualquier otra lnea o culti@o al cual estA ada?tado el @irus. $Alulas en sus?ensi4n, ?ero se ?uede tra8aCar en monoestrato. :.- Suero "etal /o@ino. 3.- Suero de ?orcino, testigo negati@o. 9.- Suero de ?orcino testigo ?ositi@o. (.- 5irus de la En2ermedad de AuCes>Fy con ttulo mnimo de +'( D#$$ ('JIml, el cual se de8e conser@ar en congelaci4n a -='K$ o en nitr4geno lquido. $ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra - $entri2ugar la muestra de suero a +,('' r?m x +' minutos. - .rans2erir el suero a un tu8o de ensayo e identi2icar. - #nacti@ar a ()K$ durante 3' minutos en /aDo Mara. - En caso de que la ?rue8a se lle@e a ca8o el da siguiente de ?re?arada la muestra, esta 7ltima de8e conser@arse en congelaci4n. -rocedimiento En los dos ?rimeros ?o>os de cada columna de una micro?laca, de?ositar (' microlitros del suero ?ro8lema. %as cantidades G(' microlitrosH ?ueden @ariar y se ?ueden utili>ar :( microlitros. Anti8i4tico G?enicilina, estre?tomicina o Fanamicina al +JH. /icar8onato de sodio en soluci4n al =J. %.E. GEarles con lactoal87minaH. Gradillas. Micro?lacas de ,) ?o>os con 2ondo ?lano. -untas ?ara ?i?etas. .u8os de ensayo.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%"

- Agregar a todos los ?o>os de la micro?laca, (' microlitros de medio diluente G%.E.T+J de 8icar8onato de sodioH. - Macer diluciones do8les a ?artir del :o. ?o>o, quedando el ?rimer ?o>o como control de suero, ?ara detectar si Aste ?resenta toxicidad o alguna otra caracterstica, que ?ueda inter2erir con la ?rue8a. - Agregar (' microlitros de @irus de E.A. aCustado a :'' D#$$ ('J Gdosis in2ectantes de culti@o celular ('JH a cada ?o>o, exce?to a los controles de suero. - #ncu8ar durante + Bora a 3= K$. - ADadir +'' microlitros de cAlulas -U+( o equi@alente y deCar en incu8aci4n de 9< a =: Boras, re@isando diariamente los controles. -ara el control de los 8iol4gicos utili>ados, ?re?arar en 2orma ?aralela otra micro?laca con lo siguiente: - 5irus origen L!L o @irus de tra8aCo, a ?artir del cual se Bar6n 3 diluciones logartmicas. %as que ir6n en las Bileras corres?ondientes a: - $ontrol de cAlulas: De?ositar en las Bileras ++ y +: de la micro?laca, +'' microlitros de cAlulas -U+( o equi@alente ?or ?o>o, ?ara detectar ?osi8les alteraciones en las mismas. - $ontrol de @irus: El @irus se aCusta de acuerdo al ttulo a :'' D#$$ ('J, a ?artir de lo cual e2ectuar tres diluciones logartmicas ?ara asegurar que Bay :'' dosis. + y :: 5irus de origen. 3 y 9: +'-+ ( y ): +'-: = y <: +'-3 - $ontrol ?ositi@o: Utili>ar un suero testigo ?ositi@o, con ttulo conocido de anticuer?os contra E.A. $olocar en la Bilera n7mero , de la micro?laca. - $ontrol negati@o: Em?lear un suero testigo negati@o a anticuer?os contra la E.A. y de?ositarlo en la Bilera n7mero +' de la micro?laca. "4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados +.- $ontrol de cAlulas.- !8ser@ar que el monoestrato estA com?leto y que las cAlulas ?resenten una mor2ologa caracterstica. :.- $ontrol ?ositi@o.- !8ser@ar que el monoestrato celular se encuentre com?leto, en @irtud de que el suero testigo ?ositi@o neutrali>4 al @irus y e@it4 el e2ecto cito?6tico. 3.- $ontrol negati@o.- !8ser@ar el e2ecto cito?6tico ?roducido ?or el @irus, al no existir anticuer?os en el suero testigo negati@o. %a lectura se ?uede Bacer m6s e@idente, eliminando el medio diluente y aDadiendo alg7n colorante @ital, como el a>ul de metileno, que tiDe 7nicamente a las cAlulas @i@as. %os resultados de esta ?rue8a se ex?resan en 2orma cuantitati@a, con 8ase al ttulo o cantidad de anticuer?os neutrali>antes que estAn ?resentes en el suero ?ro8lema. -or lo tanto, los ttulos ser6n cuanti2icados, a ?artir del ?rimer ?o>o en el que se o8ser@e claramente e2ecto cito?6tico.

%#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Es decir, si el e2ecto cito?6tico se o8ser@4 en el ?o>o con diluci4n de +:3:, el ttulo ser6 ex?resado como +:+), ya que en la siguiente diluci4n no neutrali>aron el @irus, ?or lo que este 7ltimo ?ro@oc4 muerte celular. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a un ,(J si se sigue literalmente el mAtodo descrito. /i8liogra2a !22ice #nternational des E?i>ooties GD#EH: Manual o2 ecommended Diagnostic .ecBniques and equeriments 2or /iological -roducts 2or %ists a and /. Diseases. 5ol. ## +,,' GAI'+3H. 5eterinary 5irology. SasBi /. MoBanty, SuFanta U. Dutta; Edit. %ea "e8iger. -Biladel?Bia +,<+. 5irologa -r6ctica. $Barles M. $unningBam. Edit. Acri8ia *arago>a +,(,. ??. =+-<'. .tulo Aglutinaci4n l6tex ?ara la detecci4n de anticuer?os contra el @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy GEAH. !8Ceti@o Detectar anticuer?os es?ec2icos contra el @irus de la EA, utili>ando un mAtodo de aglutinaci4n @isi8le a sim?le @ista. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a se utili>a ?ara con2irmar o descartar la ?resencia de anticuer?os en animales @acunados, sos?ecBosos o con signos clnicos de EA. %a ?rue8a est6 estandari>ada de 2orma cualitati@a, usando suero o ?lasma ?orcino. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Generalidades Des?uAs de la in2ecci4n con el @irus de ?seudorra8ia, el BuAs?ed desarrolla una res?uesta inmune contra el @irion, ?rimero a?arecen las #nmunoglo8ulinas G#gH M e inmediatamente des?uAs las #gG. %as #gM declinan r6?idamente, mientras las #gG se mantienen de ?or @ida en el BuAs?ed. %a ?rue8a de aglutinaci4n en l6tex ?ro@ee un mAtodo r6?ido ?ara detectar las #gM o contra el @irus de la EA en suero o en el ?lasma. El reacti@o es una sus?ensi4n de ?artculas de l6tex que Ban sido sensi8ili>adas con antgenos ?re?arados con @irus de EA ?arcialmente ?uri2icado. $uando el l6tex es me>clado ?or rotaci4n so8re una ?laca de cristal con suero que contiene anticuer?os contra el @irus de la EA, el l6tex aglutina. %a ?resencia de anticuer?os es indicati@a de que el animal en cuesti4n, en alg7n ?eriodo de su @ida estu@o en contacto con @irus de cam?o de la EA o 2ue @acunado. Equi?o e instrumentos +.Agitador G54rtexH.

Lunes 22 de febrero de 1999 :.3.Materiales 5ienen incluidos en el Uit. eacti@os 5ienen incluidos en el Uit. $ondiciones am8ientales

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%$

Micro?i?etas de ('-+'' microlitros. e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos, con congelador integrado.

De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %a muestra ?uede utili>arse en su 2orma original o ?uede inacti@arse a ()K$ durante 3' minutos en /aDo Mara. En caso de que la ?rue8a se lle@e a ca8o el da siguiente de ?re?arada la muestra, esta 7ltima de8e conser@arse en congelaci4n. %os sueros Bemoli>ados ?arecen no a2ectar la sensi8ilidad y es?eci2icidad de la ?rue8a. %os sueros contaminados no de8en ?rocesarse. -rocedimiento a.- %os reacti@os de8en estar a tem?eratura am8iente de :+K$ a :(K$. 8.- Marcar e identi2icar cada muestra que se @a a ?ro8ar. c.- Agregar con una ?i?eta Gmicro?i?etaH, +(' microlitros de la soluci4n de diluci4n. d.- Agregar (' microlitros de suero a cada tu8o que contiene 8u22er de diluci4n ?ara que quede una diluci4n +:9 y me>clar @arias @eces. $on la misma ?unta trans2erir (' microlitros de la muestra diluida a la ?laca de @idrio de +.9 cms. e.- Dis?ersar las muestras que @an a ser examinadas con un agitador Gusar uno ?or muestraH. 2.- Me>clar el reacti@o de l6tex en el @4rtex GagitadorH ?or unos cuantos segundos o en 2orma manual in@irtiAndolo @arias @eces. $olocar la 8otella del reacti@o del l6tex en una ?osici4n @ertical y ?er?endicular a la ?laca ?ara que la gota del l6tex sensi8ili>ado caiga li8remente so8re cada ?o>o de la ?laca que contiene el suero diluido. E@itar que la gota sea muy grande. $olocar la ?laca so8re un rotor de cu8ierta B7meda y girar de <' a +:' r?m, 2ormando crculos de a?roximadamente : cm de di6metro o me>clar la muestra girando la ?laca de @idrio en 2orma manual ?or ( minutos; girando en 2orma inclinada lentamente Ga?roximadamente :' a :( @eces ?or minutoH durante ( minutos. #nacti@aci4n ?or calor: Muestra no diluida, en /aDo Mara a ()K$ GT-:H ?or 3'-33 minutos. #nter?retaci4n %a ?laca de8er6 leerse en estado B7medo e inmediatamente examinarla 8aCo lu> incandescente o 8aCo la lu> del sol ?ara o8ser@ar ?artculas agregadas de l6tex que son similares a las o8ser@adas en el suero control ?ositi@o.

%%

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Mo@er sua@emente la ?laca ?ara que se 2acilite la @isuali>aci4n de las reacciones ?ositi@as dA8iles. %a aglutinaci4n en l6tex indica la ?resencia de anticuer?os y de8e re?ortarse como ?ositi@a. %os sueros negati@os no ?roducen aglutinaci4n y el l6tex se mantiene terso. %a ?resencia de anticuer?os es indicati@o de in2ecci4n o de @acunaci4n con el @irus de la EA. .odas las muestras ?ositi@as +:9 se de8en ?ro8ar de acuerdo al siguiente ?rotocolo: %as muestras ?ositi@as de8en ser ?ro8adas con diluci4n +:9', esto se Bace me>clando (' microlitros de la soluci4n original +:9 y 9'' microlitros G'.9( ml.H de la soluci4n de diluci4n G+-, ?artesH. %as muestras de suero que son ?ositi@as a am8as diluciones de8en ser consideradas ?ositi@as. %as muestras que son ?ositi@as +:9 ?ero negati@as a +:9' se de8en inacti@ar y re?etirse. -ro8ar el suero con la diluci4n +:9 como se indica. Si el suero se mantiene ?ositi@o en la diluci4n +:9 es ?ositi@o y se de8e con2irmar con otra ?rue8a. /i8liogra2a 5eterinary 5irology. SasBi /. MoBanty, SuFanta U. Dutta; Edit. %ea "e8iger. -Biladel?Bia +,<+. 5irologa -r6ctica. $Barles M. $unningBam. Edit. Acri8ia *arago>a +,(,. ??. =+-<'. .tulo -rue8a de #nmuno?eroxidasa ?ara detecci4n de anticuer?os sAricos contra el @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy GE.A.H. !8Ceti@o Detectar anticuer?os contra la EA ?or la tAcnica #nmunoen>im6tica-?eroxidasa directa. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a se utili>a como ?rue8a tami> ?ara la detecci4n de animales o ?iaras sero?ositi@as, como a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Generalidades Est6 8asada en los ?rinci?ios de la ?rue8a de E%#SA en monoestrato de lneas celulares sensi8ili>adas con el @irus de EA, las muestras de suero que tengan anticuer?os es?ec2icos contra Aste, e2ectuar6n la uni4n antgeno-anticuer?o GAg-AcH y una ?rotena conCugada con ?eroxidasa G?rotena g conCugadaH, se 2iCa a la ?orci4n 2c de los anticuer?os ?ermitiendo la reacci4n en>im6tica al agregar el sustrato; la ?eroxidasa acti@a al indicador, coloreando es?ec2icamente el cito?lasma de las cAlulas. Equi?o e instrumentos +.Estu2a 8acteriol4gica con rango de tem?eratura de ::K$ a 9'K$.

Lunes 22 de febrero de 1999 :.3.-

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

%9

Micro?i?eta uni o multicanales de + a (' y de (' a :(' microlitros Microsco?io de lu> in@ertida

Materiales +.:.3.9.(.).=."rascos de @idrio de +', (', +'' y ('' ml. Marcadores con tinta indele8le Micro?lacas de ,) ?o>os de 2ondo en LUL o 2ondo ?lano -i?etas de +, (, +' y :' ml. -untas ?ara micro?i?eta eci?iente con ta?a ?ara incu8aci4n de micro?lacas Gc6mara B7medaH .oallas a8sor8entes de ?a?el

eacti@os:[ +.#ndicador G3-amino-,-etil-car8a>olH

:.Micro?lacas con monoestrato de cAlulas -U+( u otra lnea celular con caractersticas similares, sensi8ili>adas con el @irus de la E.A. 3.9.-rotena G conCugada con ?eroxidasa Soluci4n A: 2os2ato de sodio al '.( M Soluci4n /: Acido ctrico al '.+ M (.).=.<.,.Soluci4n de diluci4n M:!: al 3'J. Soluci4n de la@ado Suero testigo negati@o Suero testigo ?ositi@o Sustrato.

$ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Sueros ?ara estudio conser@ados en re2rigeraci4n o congelaci4n, sin inacti@ar. -rocedimiento -re?araci4n de los reacti@os de acuerdo al instructi@o de los equi?os GFitYsH de ?eroxidasa ela8orados ?or la -roductora Nacional de /iol4gicos 5eterinarios. - eali>ar diluciones de los sueros ?ro8lema y de los testigos ?ositi@os y negati@os +:+' G:' microlitros de suero y +<' microlitros de soluci4n de diluci4nH. - Descongelar una micro?laca sensi8ili>ada durante ( min. a medio am8iente y la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado.

9&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

- Secar 8ien las micro?lacas con toallas a8sor8entes y adicionar (' microlitros ?or ?o>o G3 ?o>os; + testigo negati@o y : in2ectadosH de los sueros ?ro8lema ?re@iamente diluidos +:+', as como de los sueros testigo ?ositi@o y negati@o. - #ncu8ar la micro?laca a 3=K$ ?or 3' min. en c6mara B7meda. - etirar de la incu8aci4n las micro?lacas y decantar los sueros, la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado. - Secar las micro?lacas con toalla a8sor8ente y adicionar (' microlitros de ?rotena G conCugada, diluida +:('' en soluci4n de diluci4n. - #ncu8ar a 3=K$ ?or 3' min. en c6mara B7meda. - etirar de la incu8aci4n las micro?lacas, decantar la ?rotena y la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado. - Secar las micro?lacas con ?a?el a8sor8ente y adicionar (' microlitros del indicador diluido en la soluci4n A y / m6s el sustrato, el indicador de8e ser ?re?arado en el momento que se @a a adicionar. - .a?ar las micro?lacas e incu8ar a tem?eratura am8iente ?or :' min. eali>ar las lecturas en el microsco?io de lu> in@ertida.

"4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados Se considera reacci4n ?ositi@a cuando : de los ?o>os que contienen cAlulas in2ectadas, muestran ?or lo menos una colonia de cAlulas teDidas de color ca2A-roCi>o en su cito?lasma y el n7cleo ?ermanece sin tinci4n. Se considera reacci4n sos?ecBosa si uno de los ?o>os in2ectados mani2iesta cAlulas teDidas, de8iendo reali>ar nue@amente la ?rue8a. Se considera reacci4n ines?ec2ica cuando en el ?o>o que contiene cAlulas no in2ectadas se o8ser@an cAlulas teDidas y tendr6 que re?etirse, Baciendo m6s diluciones del suero +::' y +:9' o reali>ar la ?rue8a de E%#SA yIo sueroneutrali>aci4n. Se considera reacci4n negati@a, en el caso de que los : ?o>os que contienen cAlulas in2ectadas no muestren coloraci4n. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a ,(J si se sigue literalmente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. .tulo -rue8a de #nmunoensayo ligado a en>imas GE%#SAH, ?ara detecci4n de anticuer?os contra la En2ermedad de AuCes>Fy EA Gtami> LscreeningLH. !8Ceti@o Detectar anticuer?os contra la En2ermedad de AuCes>Fy ?or la tAcnica de inmunoen>ayo, que es una ?rue8a r6?ida y con2ia8le. $am?o de a?licaci4n

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

91

Esta ?rue8a se utili>a como ?rue8a tami> ?ara la detecci4n de animales o ?iaras sero?ositi@as, como a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Generalidades %a ?rue8a est6 8asada en una reacci4n inmunoen>im6tica que se e2ect7a en ?lacas sensi8ili>adas con antgeno ?uri2icado. Equi?o e instrumentos +.:.3.9.(.Materiales +.:.3.9.(.eacti@os: %a mayora de estos reacti@os @ienen incluidos en el Fit. +.:.3.9.(.).=.<.,.$oncentrado de A/.S $onCugado anti?orcino con gentamicina como conser@antes $ontrol negati@o ?orcino $ontrol ?ositi@o dA8il $ontrol ?ositi@o 2uerte Diluyente ?ara A/.S -lacas a8sor8ida con @irus EA Soluci4n de la@ado +'& Soluci4n ?re?arada de 6cido 2luorBdrico diluido "rascos de (' y +'' ml. "rascos de @idrio de ('' ml. con ta?4n de rosca 5aso de ?reci?itado de ('' ml. eci?ientes contenedores de soluciones -untas de ?l6stico ?ara micro y multi?i?etas %ector E%#SA Micro?i?eta #m?resora Estu2a 8acteriol4gica a 3:K$, con Bumedad e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos, con congelador integrado

92

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

$ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -rocedimiento De8ido a las di2erentes metodologas descritas ?or los di@ersos 2a8ricantes, se de8er6n seguir estrictamente las mismas, as como las recomendaciones anexas en el equi?o. A continuaci4n se descri8e la tAcnica utili>ada ?or #DE&& GMerd cBeFH. 5ertir +'' microlitros del control negati@o no diluido en los ?o>os A+, A: y A3. 5ertir +'' microlitros del control ?ositi@o dA8il no diluido en los ?o>os A9, A(, A). 5ertir +'' microlitros de control ?ositi@o 2uerte no diluido en los ?o>os A= y A<. +. %a muestra ?ro8lema diluida +::' en los ?o>os corres?ondientes. G.odas las muestras se de8en de tra8aCar ?or du?licadoH. :. Se incu8a 3'Y a tem?eratura am8iente. 3. Se @aca el lquido. 9. Se la@a de 3 a ( @eces con 3'' microlitros de soluci4n de la@ado, sacudir 2irmemente so8re un ?a?el a8sor8ente. (. -oner (' microlitros de conCugado a cada ?o>o. ). #ncu8ar 3'Y a tem?eratura am8iente y ?re?arar la soluci4n A/.S en este momento. =. e?etir ?aso n7mero ).

<. -oner +'' microlitros de la soluci4n de su8strato A/.S en cada ?o>o de las ?lacas de la ?rue8a. ,. #ncu8ar :'Y a tem?eratura am8iente. +'. 5ertir (' microlitros de soluci4n detenedora en cada ?o>o de la ?laca de ?rue8a ?ara detener la reacci4n y en los ?o>os de la ?laca en 8lanco que contiene el sustrato. ++. $ali8rar el lector con ?laca no a8sor8ida y leer a 9+' nm. "4rmula ?ara c6lculo de resultados +. $6lculo del -romedio del $ontrol negati@o GN$=H N$ - Ai AG9+'H T A: AG9+'H T A3 AG9+'H 3 :. $6lculo del ?romedio del control ?ositi@o dA8il GV-$*H V-$ x A9 AG9+'H T A( AG9+'H T A)AG9+'H 3 3. $6lculo del ?romedio del control ?ositi@o 2uerte GS-$xH S-$ x O A= AG9+'H T A<G9+'H : 9. $6lculo del cociente sI?

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL s I ? O G AG9+'H muestra - GN$xH G V-$xH - GN$xH

(Segunda Seccin)

#nter?retaci4n de resultados +. Si el cociente sI? es menor que '.9 la muestra se considera negati@a. :. Si el cociente sI? es mayor o igual que '.9 la muestra se clasi2ica como -ositi@a. /i8liogra2a !22ice #nternational des E?i>ooties GD#EH: Manual o2 ecommended Diagnostic .ecBniques and equeriments 2or /iological -roducts 2or %ists a and /. Diseases. 5ol. ## +,,' GAI'+3H. 5eterinary 5irology. SasBi /. MoBanty, SuFanta U. Dutta; Edit. %ea "e8iger. -Biladel?Bia +,<+. 5irologa -r6ctica. $Barles M. $unningBam. Edit. Acri8ia *arago>a +,(,. ??. =+-<'. .tulo -rue8a de #nmunoensayo ligado a en>imas GE%#SAH, ?ara detecci4n de anticuer?os contra la glico?rotena # del @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy GEA g?#H. !8Ceti@o Detectar anticuer?os en muestras de suero de ?orcinos, contra la glico?rotena # del @irus de la En2ermedad de AuCes>Fy, los cuales en caso de ser detectados s4lo son ?roducidos cuando: aH %os cerdos Ban estado en contacto con @irus de cam?o de la EA. 8H %os cerdos 2ueron @acunados con @acunas ela8oradas con @irus com?leto de la EA. $am?o de a?licaci4n Esta ?rue8a se utili>a ?ara la detecci4n de animales o ?iaras sero?ositi@as al @irus de la EA, como a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''=-*!!-+,,9, $am?aDa Nacional contra la En2ermedad de AuCes>Fy. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Generalidades %a ?rue8a est6 8asada en una reacci4n inmunoen>im6tica que se e2ect7a en ?lacas sensi8ili>adas con antgeno ?uri2icado. Durante la ?rimera incu8aci4n, los anticuer?os anti EA ?resentes en el suero, incluyendo aquellos ?roducidos contra g?# reaccionan con el antgeno en el ?l6stico. Des?uAs de un la@ado, se aDade el conCugado de anticuer?os monoclonales anti g?# a la ?laca, donde ?uede unirse a cualquier antgeno g?# durante una segunda incu8aci4n. Si no Bay anticuer?os anti g?# en el suero ?ro8lema, el antgeno g?# no ocu?ado est6 dis?oni8le ?ara los anticuer?os conCugados. -or el contrario, si Bay anticuer?os anti g?# en el suero, los anticuer?os monoclonales conCugados con la en>ima, no ?ueden reaccionar con el antgeno. Des?uAs de este ?eriodo de incu8aci4n el conCugado que no Ba reaccionado se elimina ?or la@ado y se aDade una soluci4n sustrato-crom4geno. En ?resencia de la en>ima, el sustrato se con@ierte en un ?roducto que reacciona con el crom4geno generando un color a>ul.

9!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Equi?o e instrumentos +. :. 3. 9. (. ). =. <. ,. Materiales +. :. 3. 9. (. ). =. eacti@os: %a mayora de estos reacti@os @ienen incluidos en el Uit. $onCugado anti EA g?# +. :. 3. 9. Suero control negati@o al @irus de la EA Soluci4n amortiguadora de 2os2atos G-/SH ?M =.:. Suero control ?ositi@o al @irus de la EA .etra-metil-8en>idine G.M/H y su diluente "rasco de @idrio de (' y +'' ml. "rascos de @idrio de ('' ml. con ta?4n de rosca Micro?lacas de ,) ?o>os con antgeno de EA adBerido a la su?er2icie Micro?lacas ?ara culti@o celular de ,) ?o>os de 2ondo ?lano -untas de ?l6stico ?ara micro?i?eta de 3'' l. de ca?acidad eci?ientes contenedores de soluciones. 5aso de ?reci?itado de ('' ml. Estu2a 8acteriol4gica de 3=K$, con Bumedad #m?resora %ector ?ara ?lacas de E%#SA Micro?i?eta de un solo canal (-+'' l. Micro?i?etas de < a +: canales con ca?acidad de (' a 3'' l. -i?etas serol4gicas de +,( y +' ml. -otenci4metro -ro8etas graduadas, de ('' ml. e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos, con congelador integrado

$ondiciones am8ientales .em?eratura de la8oratorio G+<-:)K$H, e@itar corrientes de aire acondicionado o de cale2acci4n, no tra8aCar 8aCo la lu> directa del sol. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra Diluir las muestras en 8ase : G+::H en diluente ?ara las muestras. -rocedimiento De8ido a las di2erentes metodologas descritas ?or los di@ersos 2a8ricantes, se de8er6n seguir estrictamente las mismas, as como las recomendaciones anexas en el equi?o.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

9"

A continuaci4n se descri8e la tAcnica utili>ada ?or #DE&&: Merd$BeF Anti AD5 g?# . 5ertir +'' l del control negati@o no diluido en los ?o>os A+, A: y A3. 5ertir +'' l del control ?ositi@o no diluido en los ?o>os A9 y A(. 5ertir +'' l de muestra diluida, en los ?o>os a?ro?iados. #ncu8ar )'Y a tem?eratura am8iente +<-:3 K$H %a@ar de 3 a ( @eces con 3'' l de soluci4n de la@ado, sacudir sua@e ?ero 2irmemente so8re un ?a?el a8sor8ente. -oner +'' l de conCugado anti AD5 g?# en cada ?o>o. #ncu8ar :'Y a tem?eratura am8iente y ?re?arar la soluci4n .M/ en este momento. e?etir el ?aso de la@ado. -oner +'' l de la soluci4n de su8strato .M/ en cada ?o>o de las ?lacas de la ?rue8a. #ncu8ar +(Y a tem?eratura am8iente. 5ertir (' l de soluci4n detenedora en cada ?o>o de la ?laca de ?rue8a ?ara detener la reacci4n. $ali8rar el lector de E%#SA con aire y leer a )(' nm. "4rmula ?ara c6lculo de resultados +. $6lculo del -romedio del $ontrol negati@o GN$xH A+ AG)('H T A: AG)('H T A3 AG)('H 3 :. $6lculo del ?romedio del control ?ositi@o G-$xH: A9 AG)('H T A( AG)('H : 3. $6lculo de inBi8ici4n J: N$x - muestra AG)('H & +'' N$x #nter?retaci4n de resultados -resencia de $!%! GA*U%H en el ?o>o

%o anterior se de8e a que los e?ito?es g+ del @irus de la E.A. 2ueron ocu?ados ?or los anticuer?os monoclonales contra la glico?rotena +, los cuales al reaccionar con el crom4geno re@elan el color a>ul. %os e?ito?es g+ se encontra8an li8res de8ido a que los anticuer?os ?resentes en la muestra son contra glico?rotenas di2erentes a la g+. En este caso, el @alor SIN es igual o mayor de '.=. Es decir, las muestras de suero corres?onden a $E D!S 5A$UNAD!S $!N 5A$UNA g+ NEGA.#5A. Ausencia de color en el ?o>o.

9#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Signi2ica que se encuentran anticuer?os contra todo ti?o de e?ito?es del @irus de la E.A., incluyendo a la g+. Es decir el cerdo 2ue @acunado con 5A$UNA DE 5# US $!M-%E.! o tu@o contacto con 5# US DE $AM-!. Gca?aces de reaccionar contra la glico?rotena +H. %o anterior se de8e a que los e?ito?es g+ del @irus de la E.A. N! 2ueron ocu?ados ?or los anticuer?os monoclonales contra la glico?rotena +, los cuales son desecBados en el ?roceso de la@ado y ?or lo tanto N! Bay sustrato ?ara el crom4geno. En este caso el @alor SIN es igual o menor a '.). +. Si el cociente sI? es menor que '.9 la muestra se considera negati@a. :. Si el cociente sI? es mayor o igual que '.9 la muestra se clasi2ica como -ositi@a. /i8liogra2a !22ice #nternational des E?i>ooties GD#EH: Manual o2 ecommended Diagnostic .ecBniques and equeriments 2or /iological -roducts 2or %ists a and /. Diseases. 5ol. ## +,,' GAI'+3H. Gusta2son, D.-. +,<9. -seudorra8ies, -. :',-::3 in %eman, A. D., GlocF, .D., Mengeling, V. %., -enny, . M., et al. Diseases o2 SEine, (tB Edition. .Be #oEa State Uni@ersity -ress, Ames, #oEa, U.S.A. 1'. Fiebre porcina cl*"ica .tulo Aislamiento del 5irus inmuno?eroxidasa. !8Ceti@o Aislar el @irus de casos clnicos de "-$ y e@idenciar el antgeno ?or tAcnicas inmunoen>im6ticas Ginmuno?eroxidasaH. $am?o de a?licaci4n En la con2irmaci4n del diagn4stico de "-$ como a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la "-$. Documentos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Generalidades %a ?rue8a se utili>a ?ara aislar el agente etiol4gico de la "-$, a ?artir de muestras remitidas ?ara su diagn4stico ?or #nmuno2luorescencia: tonsila, 8a>o, ganglio y riD4n, los cuales se maceran, 2iltran e inoculan en monoestratos de lneas celulares de riD4n de cerdo G-U+(H, de testculo de cerdo GS.H ya que Astas son susce?ti8les a la re?licaci4n del @irus de "-$. Equi?os e instrumentos +. :. Autocla@e escala de +.( Fg de ?resi4n a +:+K$. /alan>a con escala de '.''+ g a +' g, mnimo de "ie8re -orcina $l6sica G"-$H en micro?lacas, e@idenciado ?or

Lunes 22 de febrero de 1999 3. 9. (. ). =. <. ,. Materiales +. :. 3. 9. (. ). =. <. ,. +'. ++. +:. eacti@os +. :. 3. 9. (. ). =. <. ,. +'. ++.

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

9$

$entr2uga re2rigerada escala de ' a (''' r?m y de 'K$ a -:(K$. $ongelador con escala de tem?eratura de 'K$ a -3'K$. Estu2a 8acteriol4gica con suministro de $!:, rango de tem?eratura de ::K$ a 9'K$. Microsco?io 4?tico, con o8Ceti@os seco dA8il, seco 2uerte e inmersi4n Microsco?io in@ertido, o8Ceti@os: ?anor6mico, seco dA8il y seco 2uerte e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos con congelador integrado Ultracongelador G e@coH con escala de 'K$ a -='K$.

/otellas ?ara culti@os celulares de ( a +( ml. $aCas de -etri "iltros con mem8rana de .9( y .:: micr4metros de di6metro Marcadores de tinta indele8le Micro?lacas de ?l6stico, con ,) ?o>o, 2ondo ?lano Mortero de ?orcelana con ?istilo y mortero de Sten8rooF Multi?i?etas con < o +: canales -in>as y tiCeras -i?etas de (, +' y :' ml. -ro8etas de +'' ml. -untas ?ara multi?i?eta .u8os de centr2uga

Amino -,-etilcar8a>ol Gcrom4genoH Acetona al 3'J Al87mina sArica 8o@ina al .':J Anti8i4ticos en ?ol@o G?enicilinaIestre?tomicinaH /icar8onato de sodio en soluci4n al =J $onCugado ?ara inmuno?eroxidasa G?rotena GT?eroxidasaH M:!: al 3'J GsustratoH Medio mnimo esencial GMEMH com?leto Soluci4n amortiguadora de 2os2ato SA", ?M =.: Soluci4n de 2os2atos .'+ M T tEeen :' GSA"-%H Soluci4n de 2os2atos .'+ M T Na$l :.+J T .Eeen :' al '.(J GSA"-DH

9%

(Primera Seccin) +:. Soluciones A y /

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

/iol4gicos +. :. 3. 9. %neas celulares de riD4n de cerdo G-U+(H y de testculo de cerdo GS.H Suero de cerdo, Bi?erinmune contra el @irus de la "-$ Suero "etal /o@ino, li8re de @irus y anticuer?os contra el @irus de la Diarrea 5iral 8o@ina 5irus de "-$

$ondiciones am8ientales De la8oratorio, con tem?eratura 4?tima de +<-:)K$ en 6rea estAril. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra %a tonsila, ganglios su8maxilares y 8a>o son los 4rganos de elecci4n. De8en conser@arse en re2rigeraci4n yIo congelaci4n en 2rascos o 8olsas estAriles con cierre BermAtico. -rocedimiento $ortar + a : g. de muestra, ?asar a caCas de -etri y la@ar : @eces con -/S con anti8i4tico al :J. -osteriormente macerar en un mortero, agregando -/S o soluci4n de EA %E estAril, Basta o8tener una ?asta BomogAnea Gdiluci4n +:+'H -asar a un mortero Sten8rooF ?ara una segundo macerado. De?ositar la sus?ensi4n del macerado en tu8os de centr2uga. $entri2ugar a (''' r?m durante +( minutos a tem?eratura de (K$. $osecBar el so8renadante y 2iltrar. #nocular +'' microlitros del 2luido centri2ugado a las micro?lacas, deCando los ?o>os de las columnas ++ y +:, sin in2ectar como controles de cAlulas. #nocular en la lnea M de la micro?laca el @irus control ?ositi@o. El 2luido del macerado de8e inocularse a una 8otella de culti@o, deCando una 8otella como control celular. #ncu8ar las micro?lacas a 3=K$ con (J de $': ?or 9< o =: Boras. El 2luido de las micro?lacas se retira y se la@an con -/S, se secan y se 2iCan con acetona al 3'J con al87mina sArica al .':J durante +' a +( minutos, sec6ndolas ?osteriormente. %a 8otella se incu8a + Bora a 3=K$ y ?osteriormente se retira el in4culo, se la@a con -/S y se adiciona MEM, incu8ando 9< o =: Boras. %as 8otellas inoculadas se congelan a -='K$ y des?uAs, se descongelan r6?idamente. El 2luido se recolecta en tu8os de centr2uga y se centri2uga a 3''' - (''' r?mI+(-:' minutos. $osecBar el so8renadante, ?rosiguiendo con los ?untos ( y ,. "iltrar. #nocular a micro?lacas. #nocular en la lnea M de la micro?laca el @irus control ?ositi@o. #ncu8ar. Una @e> secas las micro?lacas, ?re?arar el suero Bi?erinmune de "-$ en una diluci4n +:+' y de?ositar (' microlitros en cada ?o>o e incu8ar +(-:' minutos a 3=K$. etirar el suero Bi?erinmune y la@ar las micro?lacas con GSA" %H :-3 @eces.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

99

Adicionar el conCugado a una diluci4n +:('', de?ositando (' ml a cada ?o>o de las ?lacas e incu8ar con las mismas condiciones del ?unto anterior. etirar conCugado y la@ar con SA"-% :-3 @eces. Adicionar el sustrato crom4geno, (' mlI?o>o, e incu8ar a medio am8iente +(-:' minutos. etirar sustrato y la@ar las ?lacas con SA"-% : a 3 @eces. Secar y o8ser@ar al microsco?io in@ertido o microsco?io 4?tico. #nter?retaci4n de resultados $uando se o8ser@a tinci4n roCo ladrillo en el cito?lasma y mem8rana de la lnea celular, el resultado se considera ?ositi@o, tal como se o8ser@a en el control ?ositi@o. #ndices de re?roducti8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines !#E, -ars, "rancia +,,:. 1utting /S, National 5eterinary Ser@ices %a8oratories, USDA, A-M#S, Ames, #oEa. .tulo #nmuno2luorescencia directa ?ara diagn4stico de "ie8re -orcina $l6sica G"-$H en cortes ?or congelaci4n. !8Ceti@o %a ?rue8a se utili>a ?ara la detecci4n del @irus de la "ie8re -orcina $l6sica. $am?o de a?licaci4n -ara la con2irmaci4n del diagn4stico clnico de "-$ como a?oyo a la $am?aDa Nacional contra la "-$. Documentos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Generalidades Detectar el antgeno @iral de "-$ ?or medio de un conCugado de inmunoglo8ulinas #gG Gsuero Bi?erinmuneH conCugado con isotiocianato de 2luorescena, que al ?onerse en contacto con el teCido sos?ecBoso: tonsilas, n4dulo lin26tico y 8a>o @a a unirse a la 2racci4n antigAnica del @irus de la "-$ e2ectu6ndose la uni4n Ag-Ac, dicBa reacci4n se o8ser@a ?or medio del microsco?io de 2luorescencia. Equi?o e instrumentos +. :. 3. $ongelador con tem?eratura de ' a -:'K$. $riostato Estu2a 8acteriol4gica con rango de :: a 9'K$.

1&& 9.

(Primera Seccin) Microsco?io de 2luorescencia

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Materiales +. :. 3. 9. (. ). eacti@os: +. :. 3. /iol4gicos +. :. $onCugado de "-$ con ttulo de tra8aCo, mnimo de +:9. $ortes congelados de tonsilas ?ositi@os y negati@os. Acetona Glicerina Soluci4n amortiguada de 2os2atos GSA"H ?M =.: $aCa ?ara ?ortao8Cetos con ?er2oraciones en la ta?a y ?a?el 2iltro Gc6mara B7medaH $u8reo8Cetos 1arra de $o?lin -in>as -ortao8Cetos .iCeras

$ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra .eCido de estudio: tonsilas, 8a>o o ganglio lin26tico. %os teCidos de elecci4n son las tonsilas, n4dulo lin26tico y 8a>o. %as muestras de8en colocarse en en@ases con sello BermAtico y conser@arse en re2rigeraci4n. -rocedimiento - Montar un corte de + cm: a?roximadamente con gelatina y congelar en el criostato a -:'K$. eali>ar cortes de 9 a ( micras de es?esor y colocarlas en ?ortao8Cetos.

- "iCar con acetona en congelaci4n ?or +' min. - Secar y teDir los cortes, con el conCugado Cunto con los testigos ?ositi@os y negati@os. - #ncu8ar a 3=K$ ?or 3' min. en c6mara B7meda. - %a@ar de 9 a ( @eces con -/S. - %a@ar con agua destilada y secar al medio am8iente. - Montar con glicerina 8u2erada. - !8ser@ar en microsco?io de 2luorescencia. #nter?retaci4n de resultados

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1&1

%a 2luorescencia es?ec2ica se o8ser@a exclusi@amente en el cito?lasma de las cAlulas e?iteliales de las cri?tas tonsilares yIo en cAlulas lin2oides de los n4dulos lin2oides. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor al ,(J si se sigue estrictamente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. .tulo -rue8a de #nmuno?eroxidasa ?ara detecci4n de anticuer?os contra el @irus de la "ie8re -orcina $l6sica G"-$H. !8Ceti@o %a ?rue8a se utili>a ?ara la detecci4n de anticuer?os sAricos contra el @irus de la "ie8re -orcina $l6sica ?or la tAcnica inmunoen>im6tica-?eroxidasa. $am?o de a?licaci4n Diagn4stico yIo monitoreo de ?iaras, como ?arte de la $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Documentos conexos a consultarse. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Generalidades Detectar anticuer?os contra el @irus de la "-$ 8asado en los ?rinci?ios de la ?rue8a de E%#SA, en monoestratos de lneas celulares sensi8ili>adas con el @irus de "-$. %os anticuer?os es?ec2icos contra Aste, que estAn ?resentes en el suero sanguneo, e2ectuar6n la uni4n antgeno-anticuer?o GAg-AcH. Un segundo anticuer?o conCugado con ?eroxidasa G?rotena G conCugadaH, se 2iCa a la ?orci4n 2iCadora del com?lemento de los anticuer?os ?ermitiendo la reacci4n en>im6tica al agregar el Sustrato. %a ?eroxidasa acti@a al indicador ?or lo que el cito?lasma de las cAlulas, de8e mostrar una coloraci4n es?ec2ica, en caso de Ba8er anticuer?os contra el @irus de la "-$ en el suero ?ro8lema. Equi?o e instrumentos +. :. 3. Materiales +. :. Marcadores de tinta indele8le Micro?lacas de ?l6stico, con ,) ?o>os, 2ondo ?lano Estu2a 8acteriol4gica con rango de tem?eratura de ::K$ a 9'K$. Micro?i?eta uni o multicanales de + a (' y de (' a :(' microlitros Microsco?io de lu> in@ertida

1&2 3. 9. (. Materiales +. :. 3. 9. (. ). =. eacti@os:[ +.

(Primera Seccin) -i?etas de (, +' y :' ml. -ro8etas de +'' ml. -untas ?ara multi?i?eta

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

"rascos de @idrio de +', (', +'' y ('' ml. Marcadores con tinta indele8le Micro?lacas de ,) ?o>os de 2ondo en LUL -i?etas de +, (, +' y :' ml. -untas ?ara micro?i?eta eci?iente con ta?a ?ara incu8aci4n de micro?lacas Gc6mara B7medaH .oallas a8sor8entes de ?a?el.

#ndicador.

:. Micro?lacas con monoestrato de cAlulas -U+( u otra lnea celular con caractersticas similares, sensi8ili>adas con el @irus de la "-$. 3. 9. (. ). =. <. ,. -rotena G conCugada. Soluci4n A y /. Soluci4n de diluci4n. Soluci4n de la@ado. Suero testigo negati@o. Suero testigo ?ositi@o. Sustrato.

$ondiciones am8ientales De la8oratorio con tem?eratura 4?tima de +< a :(K$. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra. Sueros ?ara estudio conser@ados en re2rigeraci4n o congelaci4n, sin inacti@ar. -rocedimiento -re?araci4n de los reacti@os de acuerdo al instructi@o de los Fits de inmuno?eroxidasa comerciali>ados ?or la - !NA/#5E. - eali>ar diluciones de los sueros ?ro8lema y de los testigos ?ositi@os y negati@os +:+' G:' microlitros de suero y +<' microlitros de soluci4n de diluci4nH. - Descongelar una micro?laca sensi8ili>ada durante ( min. a medio am8iente y la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1&

- Secar 8ien las micro?lacas con toallas a8sor8entes y adicionar (' microlitros ?or ?o>o G3 ?o>os; + testigo negati@o y : in2ectadosH de los sueros ?ro8lema ?re@iamente diluidos +:+', as como de los sueros testigo ?ositi@o y negati@o. - #ncu8ar la micro?laca a 3=K$ ?or 9( min. en c6mara B7meda. - etirar de la incu8aci4n las micro?lacas y decantar los sueros, la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado. - Secar las micro?lacas con toalla a8sor8ente y adicionar (' microlitros de ?rotena G conCugada, diluida +:('' en soluci4n de diluci4n. - #ncu8ar a 3=K$ ?or 3' min. en c6mara B7meda. - etirar de la incu8aci4n las micro?lacas, decantar la ?rotena y la@ar en tres tiem?os con soluci4n de la@ado. - Secar las micro?lacas con ?a?el a8sor8ente y adicionar (' microlitros del indicador diluido en la soluci4n A y / m6s el sustrato, el indicador de8e ser ?re?arado en el momento que se @a a adicionar. - .a?ar las micro?lacas e incu8ar a tem?eratura am8iente ?or :' min. eali>ar las lecturas en el microsco?io de lu> in@ertida.

"4rmulas de c6lculo ?ara resultados En esta tAcnica no se utili>an. #nter?retaci4n de resultados Se considera reacci4n ?ositi@a cuando : de los ?o>os que contienen cAlulas in2ectadas, muestran ?or lo menos una colonia de cAlulas teDidas de color ca2A-roCi>o en su cito?lasma y el n7cleo ?ermanece sin tinci4n. Se considera reacci4n sos?ecBosa, si uno de los ?o>os in2ectados mani2iesta cAlulas teDidas, de8iendo reali>ar nue@amente la ?rue8a. Se considera reacci4n ines?ec2ica cuando en el ?o>o que contiene cAlulas no in2ectadas se o8ser@an cAlulas teDidas y tendr6 que re?etirse, Baciendo m6s diluciones del suero +::' y +:9' o reali>ar la ?rue8a de E%#SA yIo sueroneutrali>aci4n. Se considera reacci4n negati@a, en el caso de que los : ?o>os que contienen cAlulas in2ectadas no muestren coloraci4n. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor a ,(J si se sigue literalmente el mAtodo descrito. /i8liogra2a Manual o2 Standards 2or Diagnostic .ests and 5accines, !#E. -ars, "rancia +,,:. .tulo #nmunoensayo ligado a en>imas, E%#SA, ?ara la detecci4n de Anticuer?os contra el @irus de "ie8re -orcina $l6sica G"-$H. !8Ceti@o Determinar la ?resencia de anticuer?os contra el @irus de "-$, mediante una ?rue8a r6?ida y con2ia8le. $am?o de a?licaci4n

1&!

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Se utili>a ?ara e2ectuar las ?rue8as que esta8lece la Norma !2icial Mexicana de la $am?aDa contra la "ie8re -orcina $l6sica. Diagn4stico Serol4gico de ".-.$. Diagn4stico Di2erencial de #n2ecciones ?or -esti@irus. Documentos conexos a consultarse. Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Generalidades Se utili>an : anticuer?os monoclonales, cada uno de los cuales reconoce un e?ito?e es?ec2ico di2erente de la ?rotena LE+L, de la en@oltura del @irus. %a ?laca ?osee un anticuer?o monoclonal es?ec2ico ligado a su su?er2icie. Una @e> la@ada la ?laca de tra8aCo, se adiciona un segundo anticuer?o monoclonal y adem6s se agrega la me>cla de @irus-suero ?ro8lema que 2ue incu8ado ?re@iamente en una ?laca de culti@o celular, con ?oca ca?acidad de 2iCar ?artculas. Des?uAs de una segunda incu8aci4n se retira el in4culo, se la@a la ?laca y se adiciona un crom4geno-sustrato. %a reacci4n se inter?reta de la siguiente manera: si am8os anticuer?os monoclonales se unen al antgeno, la en>ima ?eroxidasa induce una reacci4n cromogAnica, indicando que el suero ?ro8lema es negati@o a anticuer?os contra el @irus de ".-.$. Si uno o am8os e?ito?es son 8loqueados ?or anticuer?os del suero ?ro8lema, el conCugado es la@ado y los ?o>os ?ermanecen claros, indicando que el suero ?ro8lema contiene anticuer?os contra el @irus de ".-.$., en resumen: reacci4n con colorONEGA.#5!, sin colorO-!S#.#5!. [ $om?lex-.ra??ing-/locFing: E%#SA 2or detection o2 M'G $Bolera Anti8odies $ED#.ES., %elystad Molland. 1uly +,,9. Equi?o e instrumentos +. :. 3. 9. (. ). =. <. Materiales +. :. "rasco de @idrio de (' y +'' ml. "rascos de @idrio de ('' ml. con ta?4n de rosca Estu2a 8acteriol4gica de 3=K$, con Bumedad #m?resora %ector ?ara ?lacas de E%#SA Micro?i?eta de un solo canal (-+'' l. Micro?i?etas de < a +: canales con ca?acidad de (' a 3'' l. -i?etas serol4gicas de +,( y +' ml. -otenci4metro e2rigerador con ca?acidad mnima de , ?ies c78icos, con congelador integrado.

3. Micro?lacas de ,) ?o>os con un anticuer?o monoclonal ligado a la su?er2icie ?reser@adas con glicerol

Lunes 22 de febrero de 1999 9. (. ). =. eacti@os

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1&"

Micro?lacas ?ara culti@o celular de ,) ?o>os de 2ondo ?lano -untas de ?l6stico ?ara micro?i?eta de 3'' l. de ca?acidad eci?ientes contenedores de soluciones 5aso de ?reci?itado de ('' ml.

%a mayora de estos reacti@os @ienen incluidos en el Uit. +. sueros de re2erencia G+: suero ?ositi@o 2uerte. :: suero ?ositi@o dA8il. 3: suero negati@o de re2erencia ?ara indicar la sensi8ilidad de la ?rue8a. 9: suero negati@oH. :. Acetato de sodio !.+M 3. Acido acAtico 9. Acido sul27rico !.(M (. Antgeno de "-$, ?rotena E-+ del @irus de "-$. ). $onCugado de ?eroxidasa-anticuer?o monoclonal. =. Dimetil sul24xido GD!M!S!H. <. -er4xido de Bidr4geno al 3'J ,. Soluci4n amortiguadora de 2os2atos G-/SH ?M =.:. +'. Suero control negati@o ++. Suero equino +:. .etra-metil-8en>idine G.M./H +3. .Eeen <'. $ondiciones am8ientales .em?eratura de la8oratorio G+<-:)K$H, e@itar corrientes de aire acondicionado o de cale2acci4n, no tra8aCar 8aCo la lu> directa del sol. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra !8tener la muestra de suero lo m6s clara ?osi8le, es decir li8re de Bem4lisis, no de8en estar contaminados, la muestra se diluye +::.( con la soluci4n de diluci4n de muestras. -rocedimiento: En una ?laca de culti@o celular, de ,) ?o>os u otra que tenga una 8aCa ca?acidad de ligar ?artculas a su su?er2icie que se utili>a como ?laca 2alsa. $olocar en la columna + el suero negati@o G=( l.H. En la columna :, se ?one =( l. de suero de re2erencia + en los ?o>os A: y /:, en el ?o>o $: y D:, el suero de re2erencia :, el suero 3 de re2erencia en los ?o>os E: y ": y el suero 9 en los ?o>os G: y M:. De la columna 3 en adelante, se ?onen 9( l. de soluci4n de diluci4n[ y 3' l. del suero ?ro8lema G+::.(H <' sueros ?or ?laca.

1&#

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Adicionar =( l. de soluci4n de diluci4n a la columna +. Adicionar =( l. del @irus M$5-El diluido como indica el 2a8ricante G+:3'H en las columnas :-+:. #ncu8ar a 3=K$, durante 3' minutos en c6mara B7meda, ?re@iamente selladas. Una @e> transcurrido el tiem?o G3' minutosH, la@ar la ?laca de tra8aCo ( @eces con la soluci4n de la@ado[[ ?ara remo@er el glicerol. De?ositar (' l. de conCugado G?ara una ?laca ( ml. de soluci4n de diluci4nT+)) l. de conCugadoH, en todos los ?o>os de la ?laca. .rans2erir (' l. de la me>cla antgeno-suero de la ?laca 2alsa a la ?laca de tra8aCo, tal como est6n en la ?laca donde se lle@4 a ca8o la incu8aci4n Ag-suero, utili>ando ?untas di2erentes ?ara cada suero. Sellar e incu8ar a 3=K$, durante + Bora en c6mara B7meda. Una @e> concluida la segunda incu8aci4n, se retira el in4culo. %a@ar +' @eces con -/STtEeen <' y se adicionan +'' l. del crom4geno-sustrato G+'' l. .M/T+' l. de acetato de sodio ?M )T+'' l. de una soluci4n de M:!:, ?re?arada con <( l. de M:!: al 3'J en ( ml. de agua destiladaH. Agitar a inter@alos de : minutos durante +' o :' minutos. Detener la reacci4n mediante la adici4n de +'' l. de 6cido sul27rico '.(.M. en todos los ?o>os. %eer inmediatamente la ?laca en un lector de E%#SA a una Densidad !?tica de 9(' nm. [-ara una ?laca :' ml. -/ST '.'(J .Eeen <'T:J suero equino. [[Soluci4n de la@ado: )'' ml. -/ST3'' l de .Eeen <', ?ara una ?laca. "4rmula de c6lculo ?ara resultados: %os ?orcentaCes de inBi8ici4n de los sueros de re2erencia de la columna : y la de los sueros ?ro8lema se calculan de acuerdo a la siguiente 24rmula: J inB O +'' D! suero ?ro8lema D! m6xima x +''

#nter?retaci4n de resultados: @ '-3'J de #nBi8ici4n O Negati@os a anticuer?os contra la ".-.$. @ 3+-('J de #nBi8ici4n O sos?ecBosos. e?etir la ?rue8a.

@ (+-+''J de #nBi8ici4n O -ositi@o a anticuer?os contra el @irus de la ".-.$. #ndices de re?roduci8ilidad y re?eti8ilidad Mayor de ,(J, si se sigue literalmente el mAtodo descrito. /i8liogra2a o re2erencias G. Vens@oort, M. /loemraad and $. .er?stra: 5eterinary Micro8iology +=: +:,-+9', +,<<. E%#SA: .i?s .Acnicos: "locF $BeF: Memorias del $urso de actuali>aci4n en tAcnicas de inmunoensayo GE%#SAH, a?licadas al diagn4stico de en2ermedades de los animales. $entro de An6lisis e #n@estigaciones -ecuarias de %a %aguna :=-:,, "e8rero +,,),G4me> -alacio, Dgo. .itulo

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1&$

Microseroneutrali>aci4n ligada a ?eroxidasa GMS%-H, ?ara la detecci4n de anticuer?os sAricos contra el @irus de la "ie8re -orcina $l6sica G"-$H. !8Ceti@o Determinar cuantitati@amente los anticuer?os ?resentes en el suero sanguneo de cerdos que Ban estado en contacto con el @irus de la "-$. $am?o de a?licaci4n Se utili>a ?ara e2ectuar las ?rue8as que esta8lece la Norma !2icial Mexicana de la $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Esta ?rue8a se e2ect7a ?ara esta8lecer el ttulo de anticuer?os contra el @irus de la "-$ que est6n ?resentes en muestras de suero sanguneo. Documentos conexos a consultarse Norma !2icial Mexicana N!M-''3-*!!-+,,9, $riterios ?ara la o?eraci4n de la8oratorios de ?rue8as a?ro8ados en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-':,-*!!-+,,(, $aractersticas y es?eci2icaciones ?ara las instalaciones y equi?o de la8oratorios de ?rue8as yIo an6lisis en materia >oosanitaria. Norma !2icial Mexicana N!M-'3=-*!!-+,,(, $am?aDa Nacional contra la "ie8re -orcina $l6sica. Generalidades Esta ?rue8a se lle@a a ca8o en micro?lacas en las cuales se me>clan diluciones ?rogresi@as de suero sanguneo y de @irus de la "-$, ?osteriormente se adicionan cAlulas de lnea S. en sus?ensi4n y se incu8an durante 9< Boras a 3=K$, en una atm4s2era de (J de $!:. -ara Bacer e@idente la reacci4n antgeno-anticuer?o, des?uAs de incu8ar, se a?lica la tAcnica de inmuno?eroxidasa utili>ando un suero Bi?erinmune diluido, se adiciona conCugado a 8ase de ?rotena G T ?eroxidasa y 2inalmente se agrega un crom4geno-sustrato. El ttulo de anticuer?os ?resentes en el suero se determina al o8ser@ar el o los ?o>os en los cuales Bay o no coloraci4n roCi>a. Equi?o e instrumentos +. :. 3. 9. (. ). =. Materiales +. :. 3. /otellas de culti@o celular de +(, 3' y +'' ml. /otellas de @idrio de (', +'' y ('' ml. Gradilla ?ara tu8os de +3 x +'' mm. Agitador G5ortexH /aDo Mara con regulador de tem?eratura $entr2uga Estu2a 8acteriol4gica con suministro de $!: y Bumedad relati@a al ='J Micro?i?etas de un canal y de < y +: canales de ('-:'' ml. Microsco?io de lu> in@ertida e2rigerador con congelador integrado de , ?ies c78icos

1&% 9. (. /iol4gicos: +.

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

Micro?lacas de 2ondo ?lano de ,) ?o>os ?ara culti@o celular .u8os de @idrio de +3 x +'' mm.

$Alulas de lnea de testculo de cerdo S.

:. Suero 2etal 8o@ino li8re de anticuer?os contra los @irus de la "-$ y contra la diarrea @iral 8o@ina 3. 9. eacti@os +. Acetona G:'' ml de acetona T <'' ml de SA" '.'+ ?M, =.: T '.: y al87mina sArica de 8o@inoH. :. 3. 9. (. ). =. <. /icar8onato de sodio al =J $onCugado de ?rotena E T ?eroxidasa $rom4geno 3 amino , etil car8a>ol %-glutamina Medio Mnimo esencial GMEMH de Eagle Soluci4n A y / Soluci4n de anti8i4tico ?enicilina-estre?tomicina Suero Bi?erinmune es?ec2ico contra "-$ 5irus de la 2ie8re ?orcina cl6sica ada?tado a la8oratorio. ECem?lo ce?a E.

,. Soluci4n de diluci4n ?ara el conCugado y suero Bi?erinmune G+ litro de soluci4n amortiguadora de 2os2atos GSA"H, ?M =.:, '.'+ M T :+ y Na$l T '.( ml de .Eeen :'. +'. ++. +:. +3. +9. Soluci4n de la@ado: SA", ?M =.:, '.'+ M, + litro T ( ml de .Eeen :'. Soluci4n de tri?sina-@erseno. Sustrato de ?er4xido de Bidr4geno al 3'J .-/ .Eeen :'.

$ondiciones am8ientales .em?eratura de la8oratorio G+<-:)K$H, e@itar corrientes de aire acondicionado o de cale2acci4n, no tra8aCar 8aCo la lu> directa del sol. -re?araci4n y acondicionamiento de la muestra !8tener la muestra de suero lo m6s clara ?osi8le, es decir li8re de Bem4lisis, no de8en estar contaminados y se inacti@an a ()K$ ?or 3' minutos. -rocedimiento $olocar en una micro?laca de 2ondo ?lano, estAril de ,) ?o>os, (' microlitros GmltH de medio de diluci4n GMEM T (J S"/ T :J de Na M$!3H en todos los ?o>os. Agregar en la columna A, (' mlt de suero ?ro8lema.

Lunes 22 de febrero de 1999

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

1&9

Agregar (' mlt de suero ?ro8lema en el ?rimer ?o>o de la columna :. Me>clar 8ien y trans2erir (' mlt al ?o>o de la siguiente columna, me>clar y trans2erir (' mlt al ?o>o de la columna 9 y as sucesi@amente, Basta llegar a la 7ltima columna de la micro?laca, o8teniendo as diluciones de suero de +:: Basta +::'9<. Adicionar (' mlt de una sus?ensi4n de @irus E, conteniendo :'' D#$. ('I'.( mlt diluido con MEM. Me>clar en un agitador de ?lacas durante :' segundos. #ncu8ar a 3=K$ durante )' minutos con (J de $!: y ='J de Bumedad relati@a GM H Adicionar (' mlt de una sus?ensi4n de cAlulas de lnea S. a una concentraci4n de +::. -ara ?re?arar la sus?ensi4n de cAlulas, decantar el medio de crecimiento o extraerlo con una 8om8a de @aco, de una 8otella de +(, 3' o +'' ml, de?endiendo de la cantidad de cAlulas que se @ayan a necesitar. %a@ar el monoestrato con SA" ?M =.: a 3=K$, : @eces. Adicionar de ( a +' mlt de la soluci4n de tri?sina-@erseno a 3=K$, Bumedecer 8ien la su?er2icie del monoestrato y retirar r6?idamente. ADadir nue@amente + o : ml de la misma soluci4n y deCar a 3=K$ durante (-+' minutos, o8ser@ando el des?rendimiento de la ca?a de cAlulas se ?uede acelerar esto mediante agitaci4n @igorosa o ?or gol?es en la 8otella con la ?alma de la mano. Una @e> que ya se Bayan des?rendido las cAlulas en su totalidad, se adiciona medio de crecimiento G(J S"/T:J N-M$!3TMEM, con -/ :J %-glutamina y :J de anti8i4ticoH, su2iciente como ?ara tener una concentraci4n 2inal de +::. #ncu8ar a 3=K$, con (J $!: y ='J de Bumedad relati@a, ?or un tiem?o de 9< Boras. Descartar el medio de crecimiento. %a@ar 3 @eces con soluci4n de la@ado. Secar ?er2ectamente con una toalla a8sor8ente. "iCar las cAlulas con acetona adicionando +'' mlt en todos los ?o>os y deCar a tem?eratura am8iente +' minutos. etirar la acetona y secar 8ien a medio am8iente a 3=K$ 9( minutos. %a@ar con soluci4n de la@ado 3 @eces. Secar con una toalla a8sor8ente. Adicionar (' mlt de suero Bi?erinmune diluido en la soluci4n de diluci4n, de?endiendo del ttulo, de tal 2orma que tengamos un ttulo 2inal de +:3'', en todos los ?o>os. #ncu8ar 3' minutos a 3=K$. etirar el in4culo. %a@ar 3 @eces con la soluci4n de la@ado. Agregar (' mlt de ?rotena GT ?eroxidasa ?or ?o>o e incu8ar 3' minutos a 3=K$. Adicionar (' mlt de soluci4n de crom4geno-sustrato. #ncu8ar a medio am8iente durante +(-3' minutos. Macer la lectura @isualmente.

11&

(Primera Seccin)

DIARIO OFICIAL

Lunes 22 de febrero de 1999

En casos dudosos se ?uede leer en el microsco?io de lu> in@ertida o en el microsco?io 4?tico de 8aCo ?oder. $ontroles: aH $ontrol de suero Bi?erinmune, diluyendo desde +' a la +, Basta +' a la ( Gde?endiendo del ttulo originalH, inoculando 9 ?o>os ?or diluci4n o suero Bi?erinmune (' mlt T (' mlt de cAlulas. 8H $ontrol de @irus diluciones +' a la ', a +' a la 3, in2ectando 9 ?o>os ?or diluci4n. (' mlt @irus (' mlt cAlulas (' mlt de MEM. cH $ontrol de suero ?ositi@o conocido. Se de8e diluir igual que el suero ?ro8lema. (' mlt suero GTH T (' mlt @irus T (' mlt de cAlulas. dH $ontrol de suero negati@o conocido diluido. Se de8e diluir igual que el suero ?ro8lema, (' mlt suero G-H T (' mlt de @irus T (' mlt de cAlulas. eH $ontrol de cAlulas. +'' mlt de medio de crecimiento (' mlt de cAlulas. 2H $ontrol de suero, ?ara cBecar toxicidad de las cAlulas de8ido a Aste. (' mlt suero ?ro8lema T (' mlt de MEM T (' mlt de cAlulas. $!N. !% DE SUE ! - !/%EMA $ontrol ?ositi@o $ontrol negati@o $ontrol de suero Bi?erinmune #nter?retaci4n de resultados: Un suero ?ositi@o se considera como tal Basta la diluci4n donde no Bay cAlulas teDidas, ya que Basta aqu se neutrali>4 el @irus. %a coloraci4n se de8e a que el Ag que se neutrali>4 reacciona con el suero Bi?erinmune y se une al conCugado y se Bace e@idente con el crom4geno. Un suero negati@o es considerado cuando los ?o>os de todas las diluciones son teDidos de roCo marr4n. El suero Bi?erinmune de8e neutrali>ar Basta la diluci4n donde se o8tenga el ttulo original. El @irus control de8e teDir los ?o>os de las columnas +' Basta la diluci4n, donde tengamos las :'' D#$. ('I'.'( ml que es el ('J de los ?o>os de la diluci4n. $ontrol de cAlulas $ontrol de @irus

Lunes 22 de febrero de 1999 #ndice de re?eti8ilidad: +''J se sigue el mismo ?rocedimiento. /i8liogra2a

DIARIO OFICIAL

(Segunda Seccin)

111

+. !22ice #nternational des E?i>ooties GD#EH: Manual o2 ecommended Diagnostic .ecBniques and equeriments 2or /iological -roducts 2or %ists a and /. Diseases. 5ol. ## +,,' GAI'+3H. :. 1ensen, M.M. Detection o2 Anti8odies Against Mog $Bolera @irus and /o@ine 5iral DiarrBea 5irus in -orcine Serum. Acta 5et. Scand. ::: <(-,<. G+,<+H. 3. .er?stra, $., /loemraad, M. and GielFens, A%.1. .Be Neutrali>ing -eroxidase - %inFed Assay 2or Detection o2 Anti8ody Against SEine "e@er 5irus. 5eterinary Micro8iology ,: ++3-+:' G+,<9H. 9. Adams, .%.-. $ell $ulture 2or /iocBemists in: %a8oratory .ecBniques in /iocBemistry and Molecular /iology 5ol. <, Edited 8y: /urdon, .M. and Uni??en8erg, -.M. @an :a. Ed. Else@ier Science -u8lisBers /.5. G/iomedical di@isionH +,,'. (. 1utting, /.S.: #nmuno?eroxidase Screening .est 2or Mog $Bolera Anti8odies National 5eterinary Ser@ices %a8oratories, USDA, A-M#S, AMES, #!VA. ). Eernisse, U.A. and EricFson, G.A. Microtitration Serology MetBods 2or /o@ine 5irology. 1(. Sancione" El incum?limiento a las dis?osiciones contenidas en la ?resente Norma, ser6 sancionado con2orme con lo dis?uesto en la %ey "ederal de Sanidad Animal y la %ey "ederal so8re Metrologa y Normali>aci4n. 1). Concordancia con norma" internacionale" Esta Norma !2icial Mexicana no es equi@alente a alguna norma internacional. 1+. Di"po"icione" tran"itoria" %a ?resente Norma entrar6 en @igor a los 3' das ?osteriores a su ?u8licaci4n en el Diario Oficial de la Federacin. Su2ragio E2ecti@o. No eelecci4n.

MAxico, D."., a 3+ de diciem8re de +,,<.- El Director General 1urdico de la Secretara de Agricultura, Ganadera y Desarrollo ural, Hor/e ;oreno Collado .- 78rica.

Вам также может понравиться