Modelos para Bioensayos

II Congreso Nacional de Ingeniera Sanitaria y Ambiental
Ciudad de Guatemala, 8 - 12 de octubre de 2001

La Ingeniera Sanitaria y Ambiental en el Cumplimiento de los Acuerdos de Paz
Microbioensayos ecotoxicolgicos para monitoreo ambiental y otras aplicaciones
Lic. Pablo Mayorga Sagastume Servicios y Productos Ambientales (SEPRA) 20 avenida A 3-35 B zona 15 VH1 01015 Guatemala, Guatemala sepra@intelnet.net.gt www.sepra-gt.com tel/fax++(502) 3656896
Contenido
LA CRISIS GLOBAL DEL AGUA.................................................................................................................................................1 MICROBIOENSAYOS ECOTOXICOLGICOS.......................................................................................................................2 LOS TOXKITS..................................................................................................................................................................................4 PROTISTAS: EL CILIADO TETRAHYMENA THERMOPHILA.........................................................................................5 ALGAS VERDES UNICELULARES DE AGUA DULCE: SELENASTRUM CAPRICORNUTUM (= RAPHIDOCELIS SUBCAPITATA)...............................................................................................................................................................................6 ROTFEROS ......................................................................................................................................................................................7 CRUSTCEOS..................................................................................................................................................................................9 SISTEMA DE CLASIFICACIN DE LA CONTAMINACIN...............................................................................................15 S ISTEMA DE CLASIFICACIN PARA AGUAS NATURALES ..................................................................................................... 16 S ISTEMA DE CLASIFICACIN PARA DESECHOS VERTIDOS EN AMBIENTES ACUTICOS ............................................. 18 SISTEMA DE CLASIFICACIN DEL POTENCIAL EUTROFICANTE...............................................................................21 S ISTEMA DE CLASIFICACIN PARA AGUAS NATURALES ..................................................................................................... 22 INDICE DE EUTROFICACIN PARA DESECHOS VER TIDOS EN AMBIENTES ACUTICOS................................................ 22 LITERATURA CITADA.................................................................................................................................................................24
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II Congreso Nacional de Ingeniera Sanitaria y Ambiental Ciudad de Guatemala, 8 - 12 de octubre de 2001 Microbioensayos ecotoxicolgicos para monitoreo ambiental y otras aplicaciones Pablo Mayorga - Servicios y Productos Ambientales
La crisis global del agua

La crisis global del agua ha sido anticipada por hidrlogos durante varias dcadas. No fue, sin embargo, hasta despus de las conferencias de Dubln en 1992 y de las Naciones Unidas en 1997, y de acciones subsecuentes, que la crisis del agua adquiri una prioridad a nivel poltico (Ongley, 2001). La escasez de agua afectar a 3 billones de personas para el ao 2025, pero la situacin empeorar debido a que la contaminacin seguir aumentando si no se toman medidas adecuadas al respecto. La eutroficacin y contaminacin de aguas superficiales, subterrneas y costeras se sumarn a la escasez de agua, reducindose las posibilidades de usar el agua contaminada para otros usos beneficiosos. Esta crisis tiene ya efectos en la produccin de alimentos, en el desarrollo social y en la salud publica especialmente en algunos pases del Sudeste de Asia y Europa de Este (y en menor grado en Amrica Latina). Por esto es prioritario remediar y proteger los cuerpos y fuentes de agua, con programas adecuadamente diseados (Ongley, 2001). Un problema que enfrentan la mayora de los pases menos desarrollados, respecto de la calidad del agua, es la incapacidad de evaluar significativamente el estatus de la calidad del agua para propsitos de su manejo como recurso. Los programas de monitoreo de agua se llevan a cabo utilizando tcnicas y parmetros fsicoqumicos no adecuados. En muchos pases esto se debe a la ineficiencia de los programas de monitoreo y su poca relevancia para el manejo de la calidad del agua. Por lo tanto, la modernizacin de los programas de calidad del agua deben incluir aspectos polticss, de legislacin, institucionales y tcnicos (Ongley, 2001). Entre los aspectos tcnicos se puede mencionar la necesidad de adquirir informacin sobre la presencia, niveles y significancia potencial de patgenos y contaminantes. Las determinaciones del estatus de patgenos en agua potable falla en muchos pases debido a la incapacidad de laboratorios nacionales (centralizados) de comunicar los resultados rpidamente a las comunidades. En el caso de otros tipos de contaminacin (p.ej., qumica), la mayora de los pases menos desarrollados no tienen la capacidad tecnolgica para medirlos con exactitud (Ongley, 2001). Existen tcnicas modernas de bioensayos que permiten obtener informacin de calidad de manera eficiente. Existen incluso kits [de anlisis bacteriolgico] para uso en el campo1, as como otras metodologas bien conocidas, cuyos resultados finales son fciles de aplicar e interpretar. Queda en manos de agencias gubernamentales pero, especialmente, en las de agencias internacionales y donantes, que tcnicas de
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En SEPRA utilizamos ColiBag y ColiPlate para detectar la presencia/ausencia y cuantificar coliformes totales y/o Escherichia coli. Estas pruebas rpidas no requieren asepsia ni mayor entrenamiento, y se basan en las tecnologas del X-Gal y MUG, respectivamente. Ver detalles sobre estas pruebas en nuestro sitio web http://www.sepra-gt.com o escrbanos a info@sepra-gt.com.
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bioensayos sean incorporados en sus programas de calidad de agua (Ongley, 2001). Debe asegurarse tambin que estos programas sean sostenibles. A continuacin se presenta informacin general sobre bioensayos ecotoxicolgicos, as como la tecnologa utilizada y propuesta por SEPRA.
Microbioensayos ecotoxicolgicos
La determinacin de los peligros resultantes de la contaminacin accidental o deliberada de ambientes terrestres y acuticos est, en la mayora de pases, an limitada a la deteccin y cuantificacin de los presuntos contaminantes por anlisis qumicos (Persoone et al., 2000). Desafortunadamente, esta metodologa se ve limitada por los siguientes factores: los costos y dificultades tcnicas de analizar cada sustancia qumica individual que pueda estar presente en la muestra, y la dificultad de calcular o valorar los peligros y riesgos de la contaminacin ambiental a partir de un conjunto de datos qumicos (Persoone et al., 2000).
Durante las ltimas dcadas la comunidad cientfica y reguladora se ha dado cuenta gradualmente que se deben considerar metodologas biolgicas para una valoracin de la significancia ecolgica de los peligros toxicolgicos de los contaminantes. Las evaluaciones de efectos obtenidas con tcnicas biolgicas integran el impacto de todos los contaminantes a los que la biota est expuesta (Persoone et al., 2000). Bioensayos con especies experimentales selectas, representantes de comunidades biolgicas de los ambientes considerados se utilizan en la actualidad (ms o menos rutinariamente [en algunos pases industrializados]) para determinar efectos txicos y genotxicos. Considerando la especificidad de la toxicidad respecto de las especies y de los qumicos, la necesidad de un enfoque con una batera de ensayos con especies de distintos niveles trficos, generalmente se acepta e implementa en la actualidad (Persoone et al., 2000). Entre los organismos que se utilizan o se han utilizado para efectuar bioensayos (tradicionales) se pueden mencionar, varias especies de: bacterias; algas azulverdosas; levaduras; hongos; protistas flagelados y ciliados; algas microscpicas; plantas vasculares; celenterados; nemtodos; rotferos; lombrices de tierra; moluscos; crustceos; insectos; erizos de mar; peces; ranas y; mamferos (ratones, ratas, cobayos, conejos y otros) (Kaiser y Palabrica, 1991).
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Debe quedar claro que un balance entre anlisis qumicos, biolgicos, toxicolgicos y microbiolgicos es siempre la mejor estrategia para generar la base de informacin ms amplia sobre peligros ambientales (Persoone et al., 2000). La necesidad de pruebas biolgicas se ha topado con el problema de costos asociados con las pruebas ecotoxicolgicas, especialmente las utilizadas para control rutinario y monitoreo. Un problema mayor (si no el mayor problema) que limita la aplicacin de bioensayos a un nmero restringido de laboratorios especializados, es la necesidad intrnseca y los altos costos de cultivo y mantenimiento continuo de stocks de organismos vivos para los ensayos (Persoone et al., 2000). Intensa investigacin se ha llevado a cabo en las ltimas dos dcadas en varios laboratorios para desarrollar microbioensayos alternativos para permitir llevar a cabo pruebas rutinarias de bajo costo, y con equipo y materiales bsicos de laboratorio (Persoone et al., 2000). Entre las principales caractersticas con las que debe contar un microbioensayo, se pueden mencionar: debe ser poco caro o rentable; generalmente no requiere de trabajo intensivo; potencialmente debe poder procesarse un alto nmero de muestras; los cultivos de organismos deben ser fciles de mantener o no requerir mantenimiento del todo; debe utilizar un modesto espacio de laboratorio e incubacin; bajo costo de consumibles (p.ej., recipientes para los bioensayos); requiere de poco volumen de muestra (Blaise, 1991).
La reciente publicacin de Persoone et al. (2000) evidencia la gran variedad de bioensayos en pequea escala desarrollados y la diversidad de aplicaciones que tienen. Algunos ejemplos del tipo de materiales o muestras que se puede analizar con los bioensayos de toxicidad son los siguientes: aguas naturales (subterrneas, superficiales, intersticiales), efluentes industriales (con o sin tratamiento), lixiviados (p.ej., de vertederos de desechos), lluvia, nieve suelos, sedimentos, lodos, compost, deposiciones atmosfricas sustancias qumicas sintticas o naturales (puras o mezclas), productos de consumo (domstico o industrial), materias primas, biocidas, reactivos de laboratorio, pinturas preservantes para buques, medicamentos, extractos vegetales, alimentos, biotoxinas (algas, hongos, bacterias)
Entre las determinaciones que se pueden efectuar con los bioensayos se pueden mencionar las siguientes: ___________________________________________________________________
evaluacin de reduccin de toxicidad (p.ej., en plantas de tratamiento) dosis/concentracin letal/efectiva/inhibitoria media (p.ej., DL50, CE50, CI50; en toxicidad aguda y crnica) dosis/concentracin mnima inhibitoria concentracin sin efecto observado riesgo ecotoxicolgico de aguas naturales, efluentes y otras matrices (ver detalles sobre el Sistema de Clasificacin de la Contaminacin ms adelante) potencial de eutroficacin de aguas naturales o de efluentes lquidos (ver detalles sobre el Sistema de Clasificacin de la Eutroficacin ms adelante)
Para procesar los resultados de los efectos observados y obtener los datos numricos de las determinaciones de toxicidad aguda mencionadas anteriormente, existen paquetes de clculos estadsticos para computadora (p.ej., Dunnett, Spearman-Karber, Probit y otros) y mtodos manuales de interpolacin grfica.
Los Toxkits
Los Toxkits son los microbioensayos utilizados por SEPRA. Estos son kits que contienen todos los materiales necesarios para efectuar una prueba de toxicidad, incluyendo: stocks concentrados (sales prepesadas disueltas) de los medios estndar; recipientes para incubacin/lectura de resultados; y los organismos de prueba. Con estos se pueden efectuar bioensayos simples, rpidos, sensibles y reproducibles, a un costo muy por debajo del costo de bioensayos tradicionales. Los Toxkits disponibles (F=agua dulce, M=marino/estuarino, y lo que se mide) son: protozoos: Protoxkit F (inhibicin, densidad pitca = DO, espectrofotmetro) algas verdes unicelulares: Algaltoxkit F (inhibicin, DO) rotferos: Rotoxkit F acute o chronic (mortalidad o reproduccin, estereomicroscopio), Rotoxkit M (mortalidad) crustceos anacostracos: Thamnotoxkit F, Artoxkit M (mortalidad) crustceos cladceros: Daphtoxkit F magna, Daphtoxit F pulex, Ceriodaphtoxkit F (inmovilizacin, con una mesa de luz y una lupa) crustceos ostrcodos: Ostracodtoxkit F (toxicidad crnica de contacto de sedimentos; mortalidad y elongacin corporal, estereomicroscopio)
Debe mencionarse que todos los Toxkits han sido desarrollados por los grupos de investigacin dirigidos por el Prof. Dr. Guido Persoone (en el Laboratorio de Investigacin Biolgica en Contaminacin Acutica, Universidad Estatal de Ghent, Blgica), excepto: Protoxkit F, desarrollado por el grupo de investigacin del Dr. W. Pauli, del Instituto de Bioqumica y Biologa Molecular (Universidad Libre de Berln,
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Alemania) y adaptado al concepto de Toxkit por el grupo del Prof. Dr. G. Persoone, y Rotoxkit F, Rotoxkit F chronic y Rotoxkit M, desarrollados en colaboracin del grupo del Prof. Dr. G. Persoone y el Prof. Dr. T.W. Snell, de la Universidad de Tampa, Florida, Estados Unidos.
Para los clculos de toxicidad aguda con los Toxkits se pueden utilizar hojas de interpolacin grfica (efecto porcentual en el eje x vrs log concentracin en el eje y, segn el mtodo USEPA/600/485/013, 1985) incluidas en los kits, o un mtodo computarizado en DOS (USEPA. 1985. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to fresh water and marine organisms. 3rd ed. Toxdat. Multimethod program: binomial, moving average and Probit method.), que hace lo mismo que el mtodo de interpolacin grfica, obteniendo resultados de DL50 casi idnticos. Una desventaja del mtodo de interpolacin grfica frente al mtodo computarizado es que el primero no indica niveles de confianza de los resultados obtenidos. Para las pruebas con protozoos, algas, el ostrcodo y las otras pruebas de toxicidad crnica, existen hojas de clculo diseadas especialmente por el fabricante de los Toxkits. El diskette con estos programas es distribuido junto con los kits. Cada lote de organismos de los Toxkits tiene una LC50 especfica (poco variable en el tiempo) con dicromato de potasio y un rango de lmites de confianza. Como control de calidad, cada laboratorio utilizando Toxkits debe efectuar peridicamente determinaciones de LC50 con K 2Cr2O7 para saber si est siguiendo las metodologas adecuadamente y, por lo tanto, si sus resultados son confiables o no. Los Toxkits son utilizados en ms de 40 pases alrededor del mundo, incluyendo Mxico, Argentina, Chile, Colombia y Guatemala en Amrica Latina. A continuacin se presentan algunos detalles sobre la biologa y ecologa de los organismos, aspectos metodolgicos de los Toxkits y las especies utilizadas.
Protistas: el ciliado Tetrahymena thermophila

Los protistas son, en su inmensa mayora, microscpicos y se encuentran siempre en lugares donde haya humedad. Sin embargo, son primariamente acuticos y viven en agua dulce o salada, desde charcos hasta en los ocanos. Algunos viven en suelo hmedo, en la capa de agua que rodea cada partcula del suelo. Algunos protozoarios forman, como consecuencia de cambios graduales en su ambiente, esporas o quistes inactivos que pueden resistir la desecacin (Villee, 1988; Barnes, 1984). El filo Ciliophora es el ms grande y homogneo de los principales grupos de protozoarios Se han descrito unas 8000 especies y todava hay grupos que no estn bien estudiados. Difcilmente hay un lugar en la tierra donde no se encuentren protozoos ciliados. Los ___________________________________________________________________
ciliados se encuentran ampliamente distribuidos en aguas dulces o marinas y la mayora son solitarios y de vida libre (Barnes, 1984). Como un grupo constitutivo de la cadena alimenticia, juegan un rol importante en los ecosistemas como purificadores y recicladores de la materia en los ambientes acuticos naturales y en las plantas de tratamiento de aguas residuales. Su alimentacin a base de bacterias resulta en una mayor transparencia (i.e ., contenido de cargas orgnicas menores en los efluentes del tratamiento) (Pauli y Berger, 2000). El gnero Tetrahymena es y ha sido un microorganismo modelo para estudios de biologa celular de eucariotas. ...[un] ciliado de inters biolgico general es el gnero Tetrahymena que puede cultivarse en un medio qumicamente definido. Como las vas metablicas en todos los organismos tienen varias similitudes bsicas, el estudio de Tetrahymena ... est aclarando problemas similares en otros organismos, incluso el hombre (Villee, 1988). Cabe mencionar que el nico parsito ciliado del ser humano es Balantidium coli (Pelczar et al., 1982). Actualmente se est desarrollando un lineamiento metodolgico prioritario por la OCDE. Como resultado de extensos y diversos estudios (ahora muy aceptados y estandarizados internacionalmente) con el gnero Tetrahymena ha conllevado a que sea recomendado por la Agencia Ambiental Federal Alemana como uno de los organismos para anlisis de riesgo ambiental (Pauli y Berger, 2000).
Algas verdes unicelulares de agua dulce: Selenastrum capricornutum (= Raphidocelis subcapitata )

Hay unas 7000 especies de algas verdes (uni- o multicelulares) distribuidas en medios muy variados, desde agua salada, agua dulce, suelo hmedo, y sobre rocas, cortezas de rboles, plantas y animales (Villee, 1988; Pelczar et al., 1982). Lo conspicuo y la importancia de las plantas flotantes microscpicas (fitoplancton) en los sistemas acuticos (que puede ser desde un acuario hasta los ocanos, es que son ms importantes productores de alimento [para los consumidores primarios] que las plantas macroscpicas (Villee, 1988). Las algas son de importancia econmica debido a: su rol en la fertilidad del suelo (fijacin de nitrgeno); sntesis de vitaminas; su uso como alimento o aditivo de alimentos para humanos y animales; y por su rol en algunas enfermedades. Respecto de sto ltimo, se sabe que hay algunas especies de algas patgenas al hombre (p.ej., Prototheca sp.) y otras (p.ej., Cepheleuros sp.) que parasitan ciertas plantas superiores de importancia econmica. Algunas algas microscpica secretan productos metablicos potencialmente medicinales (p.ej., similares a antibiticos) y, en contraste, hay otras que producen toxinas letales para peces y otros animales. Estas toxinas pueden ser secreciones extracelulares, ___________________________________________________________________
pero tambin pueden encontrarse intracelularmente y ser liberadas por la ruptura de las paredes de clulas muertas en descomposicin. Los dinoflagelados marinos Gymnodinium y Gonyaulax producen una neurotoxina de alto peso molecular que puede causar la muerte de animales acuticos. El alga Prymnesium parvum ha causado muerte masiva de peces en aguas saladas. Las toxinas producidas por las algas verdeazules de los gneros Microcystis y Anabaena pueden matar aves y mamferos que beban aguas donde se encuentren dichos organismos (Pelczar et al., 1982). Selenastrum capricornutum no es un alga txica, por lo que ha sido utilizada como un control negativo (= no txico) en ensayos para la deteccin de toxinas de cianobacterias (algas verdeazules), mediante microbioensayos ecotoxicolgicos, en Hungra (Trkn, 2000). Entre las metodologas estndar para ensayos ecotoxicolgicos con algas utilizando, entre otras, la especie que aqu nos ocupa, se pueden mencionar: APHA (1998), ASTM, mtodo E 1218-90 (1990, citado en un panfleto sin fecha sobre Algaltoxkit F), ISO mtodo ISO/DIS 10253.2 (1987, citado en un panfleto sin fecha sobre Algaltoxkit F) y OCDE, mtodo 201 (1984). Este mtodo es el utilizado en el Algaltoxkit F (1996).
Rotferos
Los rotferos es un grupo conformado por animales acuticos comunes y abundantes. Se han descrito unas 1800 especies y se encuentran en aguas marinas, estuarinas, dulces, suelos, sedimentos y musgos. La mayor parte residen en agua dulce y forman parte del zooplancton (Barnes, 1984; Snell y Janssen, 1998). En la actualidad se conocen unas 3000 especies, muchas de las cuales tienen una amplia distribucin geogrfica (Snell y Janssen, 1998). Un objetivo importante de la ecotoxicologa acutica es determinar los efectos de compuestos txicos en organismos que juegan un papel central en las comunidades acuticas. En ambientes de agua dulce y marino-costeros, los rotferos tienen un impacto de grande en varios procesos ecolgicos importantes. Como se alimentan, mediante filtracin, de plancton y bacterias, los rotfereos ejercen una presin de forrajeo substancial excediendo a veces la ejercida por los crustceos que conforman el zooplancton de mayor tamao (Gilbert y Bogdan, 1984; Bogdan y Gilbert, 1987, citados en Rotoxkit F, 1992). Muchas especies de rotferos planctnicos influyen la composicin de especies de algas por forrajeo selectivo. Tambin pueden influir en la coexistencia de competidores y en la ___________________________________________________________________
calidad general del agua (Diner et al., 1986, citados en Rotoxkit F, 1992; Snell y Janssen, 1998). La contribucin de los rotferos a la produccin secundaria en muchas comunidades acuticas es substancial (Edmondson, 1974; Bogdan y Gilbert, 1982; Hernroth, 1983; Heinbockel et al., 1988, citados en Rotoxkit F, 1992). En aguas dulces, estos organismos constituyen a menudo, la mayor fraccin de la biomasa de zooplancton en ciertas pocas del ao (Makarewicz y Likens, 1979; Pace y Orcutt, 1981, citados en Rotoxkit F, 1992). Como las poblaciones de rotferos pueden alcanzar densidades de > 10/ml, los rotferos conforman cantidades substanciales de biomasa disponibles para niveles trficos superiores (Snell y Janssen, 1998). Los rotferos y otro zooplancton son una fuente significativa de alimento para muchos peces larvarios, peces adultos planctvoros (OBrien, 1979; Evans, 1986, citados en Rotoxkit F, 1992) y varios depredadores invertebrados (Williamson, 1983; Stemberger, 1985; Egloff, 1988, citados en Rotoxkit F, 1992). Entre los depredadores de los rotferos se incluyen otros rotferos, coppodos y larvas de insectos y peces. Por ello los rotferos son utilizados ampliamente en acuicultura, como alimento de estados larvarios de varios peces (Snell y Janssen, 1998). La elevada tasa metablica de los rotferos contribuyen a su rol en el ciclo de los nutrientes, el cual puede ser ms importante que el rol de los crustceos en ciertas comunidades (EsjmontKarabin, 1983, 1984, citados en Rotoxkit F, 1992). Adems de la importancia de su rol ecolgico en comunidades acuticas, los rotferos son organismos atractivos para estudios ecotoxicolgicos por la extensa base de datos existente sobre su biologa bsica. Por ejemplo, existen publicaciones (todas citadas en Rotoxkit F, 1992) sobre: tcnicas de cultivo de muchas especies de rotferos (Pourriot, 1977; Stemberger, 1981), el ciclo de vida de estos organismos (el cual est ya bien definido) (Birky y Gilbert, 1971; King y Snell, 1977), y los factores que lo regulan (que se comprenden razonablemente bien) (Gilbert, 1980, 1983; Snell, 1986; Snell y Boyer, 1988), estudios detallados sobre varios aspectos sobre su comportamiento (Gilbert, 1963; Snell y Hawkinson, 1983; Clement et al., 1983; Snell et al., 1987), caracterizacin de la biogeografa de muchas especies de rotferos (Pejler, 1977; Dumont, 1983) y descripciones de la sistemtica del grupo (Ruttner-Kolisko, 1974; Koste, 1978).
Los rotferos del gnero Brachionus son particularmente tiles para toxicologa ambiental por su rpida reproduccin, corto tiempo de generacin, sensibilidad y disponibilidad comercial de huevos durmientes (quistes) (Halbach, et al., 1983, citado en Rotoxkit F, 1992). Este gnero tienen una distribucin cosmopolita que abarca los 6 continentes (Dumont, 1983, citado en Rotoxkit F, 1992) y son miembros importantes de muchas comunidades acuticas impactadas por contaminacin. El uso de B. plicatilis en ensayos ___________________________________________________________________
de toxicidad agudos de corto plazo para ambientes marinos y estuarinos y B. rubens en agua dulce ha sido descrito por Snell y Persoone (1988a y b, citados en Rotoxkit F, 1992). La especie planctnica Brachionus calyciflorus se encuentra en hbitats lnticos en todos los continentes y es un componente ecolgicamente significativo de muchos cuerpos de aguas naturales. Por lo tanto, los resultados de ensayos ecotoxicolgicos pueden ser comparados con mucha relevancia ecolgica. Los rotferos se utilizan desde la dcada de 1970 en experimentos toxicolgicos y en los ltimos 5 aos de forma rutinaria para los mismos propsitos (Snell y Janssen, 1998). El rotfero de agua dulce Brachionus calyciflorus
El mtodo utilizado se adhiere al mtodo estndar ASTM E1440-91 (toxicidad aguda) (Rotoxkit F, 1992). La prueba de toxicidad crnica de 48 h (Rotoxkit F chronic, 1999) se propone en APHA (1998) y sigue los lineamientos franceses de AFNOR. El material biolgico del Rotoxkit F est siendo considerado para aprobacin en la norma ISO/CD 20666 (com. pres., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). El rotfero estuarino/marino Brachionus plicatilis
El mtodo usado se adhiere al mtodo estndar ASTM E-1440-91 (Rotoxkit M, 1994).
Crustceos
Los crustceos de la Clase Branchiopoda son pequeos y mayormente habitan agua dulce. Se denominan branquipodos pues tiene apndices corporales que son pies de branquias. Estos actan, adems de rgano de intercambio gaseoso, como filtros de alimento y sirven para su locomocin. Esta Clase est compuesta por varios grupos u ordenes: Anostraca, Notostraca y Diplostraca (compuesto por los subrdenes Conchostraca y Cladocera). La mayor parte de los branquipodos tienen unos pocos milmetros de longitud y algunos son tan pequeos que no pasan de los 0.25 mm. Los ms grandes son los anostrceos, que pueden alcanzar hasta 10 cm. Casi todos los branquipodos son plidos o transparentes, pero a veces se observa color rosado o rojo por la presencia de hemoglobina cuando hay poco oxgeno disuelto en su hbitat. Algunos cladceros y concostrceos son pardos o negros (Barnes, 1984). Los branquipodos viven casi slo en agua dulce, excepto algunos cladceros que son marinos. Sin embargo, slo los cladceros habitan arroyos, lagos y lagunas. Los otros grupos estn restringidos a charcas temporales, manantiales y pequeas lagunas. La nica excepcin es el camarn de agua salobre Artemia, un anostraco que se encuentra en lagos de aguas saladas en todo el mundo. Los branquipodos, excepto los cladceros, se caracterizan porque con frecuencia no se encuentran en algunas lagunas pero s estn presentes en otras cercanas. Tambin pueden desaparecer sin explicacin de una laguna ___________________________________________________________________
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y aparecer varios aos ms tarde. Muchas especies son efmeras y slo aparecen brevemente durante la existencia limitada de charcos formados por deshielos o lluvias. La restriccin de los branquipodos ms grandes a los cuerpos pequeos de agua dulce puede deberse a la ausencia de peces en estos hbitats (Barnes, 1984). Con pocas excepciones, los branquipodos son filtradores, utilizando finas cerdas localizadas en los bordes de sus apndices del tronco. El material filtrado es dirigido por diversas maniobras al surco alimenticio, llegando finalmente a la boca. Los branquipodos planctnicos se alimentan de plancton y las formas bentnicas de detritus. Algunas especies de Daphnia se alimentan de bacterias (Barnes, 1984). La partenognesis es frecuente en los branquipodos y en algunas especies los machos son raros o inexistentes. En los cladceros, los huevos partenogenticos eclosionan en el interior de las hembras por varias generaciones, hasta que ciertos factores (cambios de temperatura o menos disponibilidad alimenticia por aumentos de poblacin) inducen la aparicin de machos, dndose lugar a la fecundacin de huevos. Las paredes de la cmara de incubacin [de los huevos] se transforman en una cmara protectora en forma de silla de montar (efipio). Los efipios flotan, se hunden hasta el fondo o se adhieren a objetos y son capaces de tolerar la desecacin, el congelamiento e incluso el paso a travs del tracto digestivo de peces o aves y mamferos piscvoros. Por medio de estos huevos latentes protegidos, los cladceros pueden dispersarse por accin del viento, por diversos animales o sobrevivir durante las sequas estivales (Barnes, 1984). La produccin de huevos latentes puede verse estimulada por factores externos como la densidad de poblacin, temperatura y fotoperodos. La latencia (o diapausia) puede ocurrir despus de un periodo inicial de desarrollo [del embrin], por lo que los huevos pueden estar listos para eclosionar rpidamente cuando se presenten condiciones favorables. Factores que interrumpen la latencia son: oxgeno, salinidad, temperatura e iluminacin (Barnes, 1984). Algunos huevos pueden permanecer viables por varios cientos de aos en la naturaleza (Fryer, 1997). Algunos branquipodos presentan uno (p.ej., con pico poblacional en primavera y disminucin en verano), dos (con picos en primavera y otoo) o ningn ciclo de poblacin, dependiendo de la especie y de las condiciones, pero no es predecible. Algunas especies de Daphnia presentan estos tres comportamientos poblacionales (Barnes, 1984). El anostraco de agua dulce Thamnocephalus platyurus
Los anostracos (o anacostracos) de agua dulce, a menudo llamados camarones hadas (fairy shrimp), son uno de los muchos grupos de crustceos. Estos microcamarones son habitantes tpicos de ambientes acuticos temporales, donde hay pocos depredadores, que se secan totalmente de forma peridica o presentan cambios drsticos en el nivel de agua (Thanmotoxkit F, 1995). ___________________________________________________________________
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Los camarones hada tienen una distribucin geogrfica muy amplia, desde el rtico o regiones altas, hasta estanques creados por la lluvia en reas subtropicales. Sin embargo, estos ocurren principalmente en reas localizadas y, a menudo, remotas (Thanmotoxkit F, 1995). Como en los camarones de mar (brine shrimp) del gnero Artemia, que son los parientes marinos de los camarones hada, la supervivencia durante perodos adversos se asegura por la produccin de huevos resistentes, llamados quistes. Cuando el hbitat se torna favorable nuevamente, los quistes eclosionan, dando lugar a la salida de nauplios que rpidamente crecen hasta llegar al estado de adulto, asegurando as la siguiente generacin activa (Thanmotoxkit F, 1995). En contraste con Artemia, que es una fuente importante de alimento vivo para estados larvarios de crustceos y peces en acuacultura comercial, y que son utilizados extensamente en investigacin biolgica fundamental, los camarones hada han sido considerados, hasta recientemente, curiosidades cientficas (Thanmotoxkit F, 1995). Sin embargo, durante los ltimos aos, como resultado del creciente inters de los camarones de mar para aplicaciones ecotoxicolgicas (Persoone y Wells, 1987, citado en Thanmotoxkit F. 1995), se iniciaron investigaciones en el Laboratorio para Investigacin Biolgica en Contaminacin Acutica en la Universidad de Ghent, Blgica, para determinar el potencial del camarn hada como una especie candidata para ensayos de toxicidad de agua dulce (Brendonck y Persoone, 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Estas investigaciones condujeron al desarrollo de un bioensayo sencillo y rentable de toxicidad aguda con nauplios del camarn hada Streptocephalus proboscideus (Centeno et al., 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Organismos vivos pueden ser eclosionados, segn la necesidad de hacer pruebas, a partir de quistes de dicha especie, que son producidos bajo condiciones controladas (Brandonck et al., 1990, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Anlogamente con otros ensayos de toxicidad basados en quistes desarrollados por el mismo laboratorio: 1) con nauplios de Artemia (Van Steertegem y Persoone, 1992, citado en Thanmotoxkit F, 1995), y 2) con rotferos (Snell y Persoone, 1989a,b, citado en Thanmotoxkit F, 1995), el bioensayo con una especie de camarn hada se miniaturiz en un Toxkit, llamado Streptoxkit F (Thanmotoxkit F, 1995). Recientemente se descubri que las larvas del camarn hada Thamnocephalus platyurus son, en general, ms sensibles a sustancias qumicas y residuos que las de S. proboscideus. Adems, el xito de eclosin [viable] de la primera especie result ser ms predecible y consistente que la segunda especie (Centeno et al., 1993, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Como resultado, el Streptoxkit F fue sustituido por el Thamnotoxkit ___________________________________________________________________
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F, para tamizaje rutinario de la toxicidad aguda de sustancia qumicas y residuos en agua dulce (Thanmotoxkit F, 1995). El Thamnotoxkit F es un bioensayo estandarizado y muy rentable. De hecho, al igual que otros Toxkits basados en quistes, este bioensayo supera uno de los principales cuellos de botella en pruebas de toxicidad: la necesidad de cultivo y mantenimiento continuo de stock vivo de organismos para los ensayos (Persoone, 1991, citado en Thanmotoxkit F, 1995). Este organismo ha resultado ser especialmente susceptible a las biotoxinas de algas azul verdosas. Detalles sobre esta aplicacin se encuentran en el trabajo de Trkn (2000). El anostraco estuarino/marino Artemia salina (= A. franciscana)
El camarn de agua salobre (o de mar), Artemia, se encuentra en lagos de aguas saladas en todo el mundo (Barnes, 1984). El camarn de mar (brine shrimp) Artemia produce, bajo ciertas condiciones ambientales, huevos durmientes (quistes) que pueden almacenarse en condiciones secas por largo tiempo, sin perder su viabilidad. Al sumergirse en agua de mar, larvas (instar I) de nado libre eclosionan de los quistes en aproximadamente 24 horas. La disponibilidad permanente de quistes de este organismo, que se usa extensamente en acuacultura para la produccin de alimento vivo para larvas de crustceos y peces [incluso en ventas de acuarios y peces], es hasta la fecha una gran ventaja para el uso rutinario de esta especie en toxicologa acutica. El uso de quistes como material biolgico inicial resuelve uno de los principales problemas biolgicos, tecnolgicos y financieros de la ecotoxicologa rutinaria. Esto es, que evita la necesidad de cultivar y mantener continuamente stock vivo de estos organismos, en estado saludable y en nmeros suficientes. Adems, el hecho que todos los investigadores puedan obtener y usar quistes estndar (de referencia) puede contribuir significativamente a la estandarizacin de los mtodos de bioensayos y la repetibilidad de los resultados (Artoxkit M, 1990). Como se indica en el documento Artemia en toxicologa acutica (Persoone y Wells, 1987, citado en Artoxkit M, 1990), las ventajas de estos camarones como organismos de prueba, gradualmente condujeron al aumento en la utilizacin de esta especie en investigaciones fundamentales y aplicadas de ecotoxicologa. Actualmente, Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de objetivos tales como: investigacin de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias qumicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias qumicas, deteccin de toxinas naturales en comestibles y farmacuticos, estudios de modelos de accin txica de sustancias, y estudios de la transferencia trfica de contaminantes (Artoxkit M, 1990; Sols, 1995). A rtemia ha probado ser un organismo verstil y valioso en pruebas de toxicidad ___________________________________________________________________
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con un slo organismo, particularmente si es estudiado con otras especies endmicas (Artoxkit M, 1990). Algunos investigadores se han opuesto (y quizs an se oponen) al uso de Artemia en ecotoxicologa argumentando que, como la especie no se encuentra en el mar ni en estuarios, no es una especie verdaderamente marina y no puede ser un representante de la biota marina. Este argumento es poco fundamentado, pues la nica razn que estos camarones se encuentran principalmente en biotopos de alta salinidad es porque son ecolgicamente no competitivos con otro zooplancton marino (Artoxkit M, 1990). La capacidad de esta especie de vivir en condiciones ultrasalinas le ha permitido tener gran xito en el establecimiento de poblaciones muy grandes en todo el mundo, ya que la salinidad es una barrera muy efectiva contra depredadores y otros competidores (Sam, 1993; Artoxkit M, 1990). Como Artemia se puede cultivar en rangos de salinidad de 5 a 150 ppt, es una de las especies ms euriplsticas [referente al rango de toxicidad que tolera] y que se puede adaptar fcilmente a un amplio rango de condiciones ambientales (Artoxkit M, 1990). El potencial de Artemia para investigacin y aplicaciones en toxicologa acutica se ha explorado dese 1975 en el Laboratorio de Investigacin Biolgica en Toxicologa Acutica de la Universidad Estatal de Ghent, Blgica (Sorgeloos et al., 1978, citado en Artoxkit M, 1990). En 1981 se desarroll el primer ensayo estandarizado de ecotoxicologa marina: el ensayo ARC, que es un ensayo de 24 [ahora de 48] horas para determinar la concentracin letal media (CL50) en nauplios de nstares II y III. La confiabilidad y precisin de este ensayo fue investigada durante un extenso ejercicio de calibracin involucrando a 80 laboratorios americanos y europeos, dando resultados muy satisfactorios (Persoone y Vanhaecke, 1981, citado en Artoxkit M, 1990). La experiencia obtenida desde entonces con el predecesor del presente Artoxkit ha abierto el camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje ms sencillos, ms reproducible y rentable en toxicologa acutica (Artoxkit M, 1990). Un ejemplo de una aplicacin de esta especie en farmacologa es la prueba de letalidad para el pretamizaje de extractos de especies vegetales medicinales (Sam, 1993), p.ej., contra Trypanosoma cruzi (Zani et al., 1995). Se ha publicado mucha literatura al respecto correlacionando la actividad anti-Artemia contra otros patgenos humanos, pero no se incluye aqu. Los cladceros de agua dulce Daphnia magna, D. pulex y Ceriodaphnia dubia
Los cladceros representan el segundo suborden de los diplostracos branquipodos. Se conocen comnmente como pulgas de agua, y su representante ms conocido es el gnero Daphnia. Adems de algunas caracterstica comunes a los branquipodos, a continuacin se mencionan algunas caractersticas especficas. Algunas especies de Daphnia pueden alimentarse de bacterias debido a la eficiencia de sus cerdas filtrantes. ___________________________________________________________________
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Usualmente son organismos transparentes en agua bien aireada pero pueden tornarse rosados en aguas estancadas, debido a la presencia de hemoglobina. Esta puede transferirse a los ovarios y huevos o el hierro resultante de la degradacin de la hemoglobina puede ser excretado por glndulas especiales. Los brotes o ciclos poblacionales anuales de Daphnia no son previsibles y pueden ser monocclicos, dicclicos o acclicos, segn el lago o laguna (Barnes, 1984). Como los rotferos y coppodos, los cladceros son miembros ecolgicamente importantes de las comunidades acuticas. Daphnia magna y Ceriodaphnia dubia son los crustceos de agua dulce ms utilizados para determinar los efectos de sustancias xenobiticas en los consumidores primarios de ecosistemas dulceacucolas (Ceriodaphtoxkit F, sin fecha). Los Toxkits utilizando Daphnia spp. siguen los lineamientos del mtodo estndar OCDE 202 (que puede adaptarse a lineamientos de ISO, DIN, US-EPA y ASTM) (Daphtoxkit F magna, 1996; Daphtoxkit F pulex, 1996). Ceriodaphnia dubia es el organismo empleado en la prueba de toxicidad aguda de 24 h en el Ceriodaphtoxkit F. Este bioensayo se apega al mtodo estndar de la USEPA (com. pers., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). El Toxkit del bioensayo de toxicidad crnica con C. dubia est en sus etapas finales de desarrollo. Adems, el uso de efipios de este organismo como fuente de material biolgico, tambin est considerado en la propuesta de norma ISO/CD 20665, para el bioensayo estndar de toxicidad crnica (com. pres., MICROBIOTESTS, Inc., 2001). El ostrcodo de agua dulce Heterocypris incongruens
Los ostrcodos son crustceos pequeos (menos de 1 mm hasta 3 cm) ampliamente distribuidos en el mar y todo tipo de aguas dulces. Su cuerpo est cubierto por un caparazn bivalvo que se mantiene cerrado por msculos (Barnes, 1984). La mayor parte de los ostrcodos viven cerca de los fondos de los cuerpos de agua, donde nadan intermitentemente o aran la capa superior de los sedimentos. Algunas especies viven asociadas a algas u otros animales (como comensales) y hay 2 especies terrestres. Su alimentacin es diversa: herbvoros, carnvoros, carroeros o filtradores, y las algas son un alimento comn (Barnes, 1984). La partenognesis es comn en los Cyprinidae de agua dulce y hay especies en las que no existen machos. Los huevos son liberados al agua o depositados en alguna superficie (Barnes, 1984).
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El ostrcodo Heterocypris incongruens es utilizado en el Ostracodtoxkit F (2000). Este es el primer Toxkit de contacto directo para evaluar la toxicidad de sedimentos o suelos [y otras matrices slidas o pastosas]. Es una prueba crnica de 6 das que determina la toxicidad total de los contaminantes disueltos (en el agua intersticial) y no disueltos (asociados a la materia slida). La toxicidad es reflejada en la elongacin corporal de los neonatos y la mortalidad (en comparacin con un control estndar no txico). La susceptibilidad de este ensayo es comparable con la prueba de 10 das con el crustceo amfpodo Hyallela azteca y es mucho ms susceptible que el ensayo con larvas del dptero Chironomus riparius (Ostracodtoxkit F, 2000). Heterocypris incongruens es omnvoro (puede sobrevivir de algas, pequeos crustceos y detritus orgnico), tiene una distribucin mundial y puede encontrarse en hbitats bnticos de agua dulce en todos los continentes (Ostracodtoxkit F, 2000; Fryer, 1997). Ms detalles sobre su biologa y ecologa pueden encontrarse en Fryer (1997). A continuacin se presentan los aspectos ms importantes de los Sistemas de Clasificacin de la Contaminacin y Eutroficacin, mencionados anteriormente en este documento. Fueron traducidos y editados del documento original (FITA4 Programme, 2000).
Sistema de clasificacin de la contaminacin

Se proponen dos diferentes sistemas de evaluacin/clasificacin: uno para la determinacin bruta del grado de contaminacin txica de sistemas acuticos naturales, y - otro para la cuantificacin de la toxicidad de desechos antes de ser vertidos a ambientes acuticos Ambos sistemas se basan en la aplicacin de una batera de microbioensayos de corto tiempo de exposicin (1-3 das). La batera est compuesta de especies experimentales pertenecientes a diferentes grupos filogenticos, incluyendo [al menos] las siguientes categoras de biota: Microalgas (Algaltoxkit F) (72h) Protistas (Protoxkit F) (24h) Rotferos (Rotoxkit F acute) (24h) Crustceos (Daphtoxkit F magna (48 h) o Thamnotoxkit F (24 h))
Si es posible, esta batera debera ampliarse con un microbioensayo utilizando bacterias. NOTA: Debido al corto tiempo de exposicin, las clasificaciones de riesgo/toxicidad expresan nicamente efectos agudos. ___________________________________________________________________
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Sistema de clasificacin para aguas naturales Principio del sistema de clasificacin Este sistema se basa en la determinacin, en un paso, del riesgo de toxicidad aguda de aguas naturales con muestras no diluidas, utilizando una batera de microbioensayos. Sistema de evaluacin El sistema de clasificacin se basa en dos valores: 1. la jerarquizacin en 5 clases de riesgos de toxicidad aguda, y 2. en un punteo ponderado para cada clase de riesgo. Clases de riesgos agudos Despus de la determinacin del efecto porcentual (EP) obtenido con cada uno de los microbioensayos aplicados a muestras no diluidas, el agua analizada se coloca en uno de los 5 rangos de clases, basados en la ms alta toxicidad encontrada en al menos uno de los ensayos efectuados. Estas clases son: Clase I: no hay riesgo agudo = ninguno de los ensayos mostr efectos txicos (i.e., un efecto significativamente mayor que los controles) Clase II: riesgo agudo leve = un EP estadsticamente significativo se obtuvo en al menos un ensayo, pero el nivel de efecto es menor al 50% NOTA:. Para determinar si el EP observado en la muestra de agua es significativamente diferente del EP en el control, se deben analizar los datos con un programa estadstico. Alternativamente, se puede utilizar el nivel de efecto del 20% como el EP ms bajo con un efecto txico significativo. Clase III: riesgo agudo = el EP50 es alcanzado o excedido en por lo menos un ensayo, pero el nivel de efecto est por debajo del 100% Clase IV: riesgo agudo alto = el EP100 es alcanzado en por lo menos un ensayo Clase V: riesgo agudo muy alto = el EP100 es alcanzado en todos los ensayos
Punteos ponderados ___________________________________________________________________

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Un punteo ponderado se calcula para cada clase de riesgo para indicar la importancia cuantitativa (ponderacin) de la toxicidad en esa clase. El punteo ponderado se expresa en %, en el rango de 25% (si slo un ensayo en la batera alcanz el nivel de toxicidad de esa clase) a 93 % (si todos los ensayos excepto uno alcanzaron el nivel de toxicidad para esa clase). NOTA: La base lgica para este punteo adicional es que mientras ms alto el punteo ponderado, esto expresa un mayo riesgo de toxicidad del agua en la clase en cuestin. Clculo de los punteos ponderados 1. Asignacin del punteo de un ensayo para los resultados de efecto de cada microbioensayo de la batera. Efecto txico no significativo Efecto txico significativo pero < EP50 > EP50, pero <EP100 EP100 = punteo 0 = punteo 1 = punteo 2 = punteo 3
2. Clculo de los punteos ponderados de clase punteos de todos los ensayos n donde n = nmero de ensayos efectuados. Punteo ponderado de clase = 3. Clculo del punteo ponderado de clase en % Punteo ponderado de clase en % = Punteo de clase Punteo ponderado de clase mximo x 100
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Ejemplo prctico Ensayo Bacterias Microalgas Protistas Rotferos Crustceos Clasificacin: La muestra de agua del ejemplo pertenece a la clase IV (riesgo agudo alto), pues el nivel de efecto de 100% se obtuvo en al menos un ensayo (crustceos). Punteo ponderado de clase: 0 + 1 + 2 + 2 + 3 = 8 = 1.6 5 5 Punteo ponderado de clase en %: 1.6 x 100 = 53% 3 COROLARIOS: 1. En caso que se utilicen 2 microbioensayos con crustceos, slo se deber tomar en cuenta para los clculos el ensayo con el ms alto valor de efecto. 2. Cuando se de un estmulo de crecimiento en vez de inhibicin de crecimiento de algas, los puntos se deben asignar al potencial de eutroficacin del agua analizada, por tanto a un riesgo indirecto. Sistema de clasificacin para desechos vertidos en ambientes acuticos Principio del sistema de clasificacin Determinacin y cuantificacin en dos pasos, de la toxicidad aguda de los desechos lquidos o lixiviados con una batera de microbioensayos. En el primer paso, se determina la toxicidad de muestras no diluidas. En el segundo paso, se efectan pruebas de toxicidad en una serie de diluciones de las muestras, con los microbioensayos que presentaron ms de 50% de efecto con la muestra no diluida. % efecto < 20 35 72 60 100 Punteo del ensayo 0 1 2 2 3
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Sistema de evaluacin El sistema propuesto se basa en dos valores: una jerarquizacin de toxicidad aguda en 5 clases, y un punteo ponderado para cada clase de toxicidad. Clases de toxicidad aguda Los resultados de efectos obtenidos con cada microbioensayo se transforman en Unidades Txicas (UT) con la frmula: UT = [1/CL50] x 100 (o [1/CE50] x 100) Las muestras se clasifican en una de las siguientes categoras, en base al nmero ms alto de UT encontrado en uno de lo ensayos de la batera. Clase I: no hay toxicidad aguda = ninguno de los ensayos present efectos txicos (i.e., un valor de efecto significativamente ms alto que en los controles) Clase II: toxicidad aguda leve = el efecto porcentual observado en por lo menos un ensayo de toxicidad es significativamente ms alto que en el control, pero est por debajo del 50% (< 1 UT). NOTA: Para determinar si el efecto porcentual observado en la muestra de desecho es significativamente diferente al control, se deberan analizar los datos con un programa estadstico. Alternativamente, se puede utilizar el un nivel de efecto del 20% como el EP ms bajo que se considera que tiene un efecto txico significativo. Clase III: toxicidad aguda = la CL50 o CE50 es alcanzado o excedido en por lo menos un ensayo, pero en la dilucin 10x de la muestra, el efecto es menor que 50% ( = 1-10 UT) Clase IV: toxicidad aguda alta = la CL50 o CE50 es alcanzado en la dilucin 10x en por lo menos un ensayo, pero no en la dilucin 100x ( = 10-100 UT) Clase V: toxicidad aguda muy alta = la CL50 o CE50 es alcanzada en la dilucin 100x en por lo menos un ensayo ( = >100 UT)
Punteos ponderados Un punteo ponderado se calcula para cada ensayo de toxicidad para indicar la importancia cuantitativa (ponderacin) de la toxicidad en esa clase. Este punteo ponderado se expresa en % y su rango va desde 25% (si slo un ensayo en la batera alcanz el nivel de toxicidad de esa clase) a 93% (si todos los ensayos, excepto uno, alcanzaron el nivel de toxicidad de esa clase). ___________________________________________________________________
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NOTA: El principio lgico para este segundo tipo de punteo es que, mientras ms alto el punteo ponderado de clase, expresa un ms alto el riesgo de toxicidad la muestra de desecho en la clase en cuestin. Clculo de los punteos ponderados de clase 1. Asignacin de un punteo de ensayo o de resultados del efecto de cada microbioensayo de la batera. Efecto txico no significativo Efecto txico significativo, pero < L(E)C50 ( = < 1 UT) 1 - 10 UT 10 100 UT > 100 UT = punteo 0 = punteo 1 = punteo 2 = punteo 3 = punteo 4
2. Clculo de los punteos ponderados de clase punteo de todos los ensayos n donde n = nmero de ensayos efectuados. Punteo ponderado de clase = 3. Clculo del punteo ponderado de clase en % Punteo ponderado de clase (en %) = Punteo ponderado de clase x 100 Punteo mximo de clase
Ejemplo prctico Ensayo Bacterias Microalgas Protistas Rotferos Crustceos Clasificacin La muestra de agua de inters se clasifica en la clase IV (toxicidad aguda alta) porque el nmero de UT en la prueba ms sensible se sita entre 10 y 100. Punteo ponderado de clase: 3 + 2 + 1 + 3 + 3 = 12 = 2.4 ___________________________________________________________________
UT 12 2 <1 55 27
Punteo del ensayo 3 2 1 3 3
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5 Punteo ponderado de clase (en %): 2.4 x 100 = 80% 3
Sistema de clasificacin del potencial eutroficante

Antecedentes y base lgica La determinacin del efecto txico de muestras contaminadas en productores primarios (plantas) suele llevarse a cabo con un bioensayo con microalgas midindose la inhibicin de crecimiento despus de 72 h. Regularmente se determina, sin embargo, que en vez de inhibicin de crecimiento uno detecta estmulo de crecimiento de las algas. Este estmulo de crecimiento se debe a factores que provocan el crecimiento adicional de las algas en el medio de cultivo de las algas. Como las microalgas en el control se multiplican por un factor de al menos 16 veces durante el tiempo de exposicin, el medio de cultivo de las algas no limita su crecimiento, por lo que la muestra analizada debe contener compuestos adicionales que favorecen el crecimiento de las algas. Estimulacin del crecimiento ms all del crecimiento normal en los controles indica entonces un potencial de eutroficacin de la muestra analizada, que es una forma indirecta de contaminacin (por los aspectos bsicos de la eutroficacin de aguas naturales por explosiones poblacionales de algas y sus consecuencias). Como una extensin de esos sistemas de clasificacin de toxicidad, se propone un sistema adicional de clasificacin, para la deteccin y cuantificacin del potencial de eutroficacin de aguas naturales por un lado, y el de desechos descargados hacia el ambiente acutico por el otro. Observacin importante: Los sistemas de clasificacin de la eutroficacin propuestos no necesitan anlisis adicionales al microbioensayo Algaltoxkit que se efecta junto con otros ensayos con Toxkits en el marco (por laboratorios especficos) del programa FITA4. Los sistemas de clasificacin de la eutroficacin se basan, de hecho, en un anlisis y manejo de datos diferentes al de datos del Algaltoxkit F de muestras mostrando estimulacin de crecimiento de algas en vez de inhibicin de crecimiento de las mismas. [NOTA: Sin embargo, como el sistema de clasificacin de la eutroficacin no puede diferenciar si hay un efecto txico de inhibicin leve an cuando haya un efecto de crecimiento, se ha acordado aplicar este sistema cuando no se detecte toxicidad aguda ___________________________________________________________________
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en ninguno de los otros ensayos utilizados en la batera de ensayos del sistema de clasificacin de la contaminacin.] Sistema de clasificacin para aguas naturales Principio del sistema de clasificacin Este sistema se basa en la determinacin del porcentaje de estimulo de crecimiento de algas (ECA)con el microbioensayo Algaltoxkit en muestras de agua no diluidas, en comparacin al crecimiento obtenido en el control. El porcentaje de estimulacin del crecimiento se calcula fcilmente de la siguiente manera: % ECA = Ns Nc Nc x 100
donde Ns = nmero de algas en la muestra y Nc = nmero de algas en el control [despus de 72 h de incubacin]. Jerarquizacin de la muestra en clases de eutroficacin Las aguas naturales analizadas pueden clasificarse en una de las 4 categoras siguientes de potencial de eutroficacin en base a su % ECA: Clase I: sin potencial de eutroficacin = no hay crecimiento (significativo) adicional en la muestra en comparacin al control (el lmite del nivel de significancia puede establecerse en 20% ECA) Clase II: potencial de eutroficacin leve = se alcanza un % ECA estadsticamente significativo, pero el % est por abajo del 50% Clase III: potencial de eutroficacin substancial = se alcanza o excede el 50% ECA pero el % extra de crecimiento de algas es menor que 100% Clase IV: potencial de eutroficacin alto = el % ECA alcanza o excede el 100%. Indice de eutroficacin para desechos vertidos en ambientes acuticos Principio
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Este se basa en una determinacin y cuantificacin en dos pasos del potencial de eutroficacin de desechos lquidos o lixiviados con el microbioensayo Algaltoxkit. En el primer paso se determina el estmulo de crecimiento de algas (ECA) en muestras no diluidas (como en el sistema de clasificacin de la eutroficacin para aguas naturales). En el segundo paso, se efectan pruebas con el Algaltoxkit en una serie de diluciones con las muestras para las que se detect ms del 50% ECA en la muestra no diluida.
Sistema de evaluacin Unidades de Eutroficacin El % ECA obtenido se transforma en Unidades de Eutroficacin (UE) con la frmula: UE = (1 / 50% del nivel ECA*) x 100 * El 50% del nivel ECA es la dilucin en la cual ocurre un 50% de estmulo de crecimiento de algas. Indice de Eutroficacin El siguiente Indice para el potencial de eutroficacin de muestras de desechos puede ser considerado: Indice 1 : sin potencial de eutroficacin = el % ECA no es significativo (e.g., menos de 20% de crecimiento adicional en el desecho no diluido) Indice 2 : potencial de eutroficacin leve = el % ECA es mayor al 20% pero menor que 50% en el desecho no diluido (< 1 UE) Indice 3 : potencial de eutroficacin sustancial = el % ECA es > 50% en la muestra no diluida, pero no alcanza el 50% en la muestra diluida 10 veces (1 10 UE) Indice 4 : potencial de eutroficacin muy alto = 50% ECA se alcanza en la muestra diluida 10 veces, pero no en la muestra diluida 100 veces (10 100 UE) Indice 5 : potencial de eutroficacin extremo = 50% ECA se alcanza o excede en la muestra diluida 100 veces (> 100 UE)
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Literatura Citada
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II Congreso Nacional de Ingeniera Sanitaria y Ambiental

Ciudad de Guatemala, 8 - 12 de octubre de 2001

Microbioensayos ecotoxicolgicos para monitoreo ambiental y otras aplicaciones

La crisis global del agua

Protistas: el ciliado Tetrahymena thermophila

Algas verdes unicelulares de agua dulce: Selenastrum capricornutum (= Raphidocelis subcapitata )

El mtodo usado se adhiere al mtodo estndar ASTM E-1440-91 (Rotoxkit M, 1994).

Sistema de clasificacin de la contaminacin

Punteos ponderados ___________________________________________________________________

Punteo del ensayo 3 2 1 3 3

5 Punteo ponderado de clase (en %): 2.4 x 100 = 80% 3

Sistema de clasificacin del potencial eutroficante

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