CARAUJICEMARANMIKROBA: ANGKALEMPENGTOTAL(ALT)DANANGKAKAPANGKHAMIR(AKK) A.TUJUAN 1 . M e n g h i t u n g j u m l a h m i k r o b a a e r o b m e s o f i l y a n g t e r d a p a t d a l a m produk makanan. 2.

Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh mengandungmikroba melebihi batas yang ditetapkan karena berbahaya (toksik) bagi kesehatan. B.DASAR TEORI Pertumbuhan kuman merupakan peningkatan umlah sel kuman yang terjadi akibat peningkatan biomassa kuman yang teratur, pertumbuhan k u m a n m e m e r l u k a n l i n g k u n g a n n u t r i s i y a n g c o c o k s e h i n g g a d a p a t mendukung proses perkembangbiakan kuman. Konsentrasi sel kuman dapat diukur dengan perhitungan jumlah sel hidup dengan cara pengenceranyang diikuti dengan penentuan unit pembentukan koloni pada permukaan media agar (Arthur, 1993). Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi. Kapang adalah fungi yang mempunyai filament (miselium). Sedangkan khamir a d a l a h j u g a t e r m a s u k f u n g i , t a p i y a n g d i b e d a k a n d a r i k a p a n g k a r e n a bentuknya yang terutama uniseluler. Reproduksi vegetative khamir dengan pertunasan dan dapat tumbuh lebih cepat daripada kapang. Khamir lebih e f e k t i f m e m e c a h k o m p o n e n k i m i a d i b a n d i n g k a n g k a p a n g k a r e n a mempunyai perbandingan luas permukaan dengan volume yang lebih besar. Khamir tidak dapat melakukan proses fotosintesis. Sel khamir mempunyai ukuran sel yang bervariasi yaitu dengan panjang 1-5 mikrometer dan lebar 1-10 mikrometer. Bentuk sel khamir yaitu bulat, oval, silinder, bulat panjang dengan salah satu ujung runcing, segitiga melengkung berbentuk botol, bentuk apikulat dan lemon dan sebagainya (Srikandi, 1992). U j i a n g k a l e m p e n g t o t a l b e r t u j u a n u n t u k m e n u n j u k k a n j u m l a h mikroorganisme dalam suatu sediaan dengan metode hitungan cawan. Jikasel masih dapat ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat langsung dilihatdengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Cara perhitungan koloni yaitu dengan memilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlahnya berkisar a n t a r a 2 5 k o l o n i 2 5 0 k o l o n i . B i l a t i a p c a w a n m e m i l i k i t i n g k a t pengenceran yang berbeda, tetapi memiliki jumlah koloni seperti kisaran dia t a s , m a k a p i l i h c a w a n k o l o n i d e n g a n k o l o n i y a n g b a n y a k . K e m u d i a gunakan tally counter untuk menghitung jumlah koloni. Beri tanda padakoloni yang telah dihitung untuk menghindari perhitungan ulang. Bila ada koloni yang menyebar dihitung sebagai satu koloni. Akan tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada cawan adalah koloni yang menyebar, maka cawan tidak perlu dihitung. Perhitungannya (jumlah koloni per mlsampel) adalah dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceranyang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran. Secara sistematis dapat dirumuskan sebagai berikut : Faktor pengenceran = (pengenceran) x (jumlah yang ditumbuhkan) Jumlah koloni = (jumlah koloni) x (1/faktor pengenceran) (Anonim,2001). Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang ditentukan.Jenis populasi mikrobia lama tanah, air, bahan makanan, dll. Berbeda-bedatergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara perhitungan jumlah mikrobia, yaitu perhitungan secara langsung ( direct method) d a n s e c a r a tidak langsung (indirect method) (Jutono, 1980).

1.Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Langsung Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan antara lain : a.Menggunakan counting chamber Perhitungan ini dapat memakan haemacytometer, Petroff- Hausser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahanatau biakan mikrobia pada alat terebut, ditutup dengan gelas penutupkemudia diamat idengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dari alattersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia tiap cc (Jutono, 1980). b.Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik Pada cara ini mulamula dibuat preparat mikroskopik padag e l a s b e n d a : s u s p e n s i b a h a n a t a u b i a k a n m i k r o b i a y a n g t e l a h diketahui volumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luastertentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel m i k r o b i a t i a p b i d a n g p e m a n d a n g a n m i k r o s k o p . L u a s b i d a n g pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan dapat diperoleh jumlah mikrobia tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yangh a m p i r s a m a y a n g b i a s a n y a d i p a k a i u n t u k m e n g h i t u n g j u m l a h bakteri ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1 ccd a r a m a n u s i a ; s e t e l a h t e r c a m p u r h o m o g e n d i b u a t p r e p a r a t mikr oskopik. Dari perbandingan jumlah ratarata sel bakteri dan jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah ba kteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normalrata-rata mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc (Jutono, 1980). c. Menggunakan filter membran (milliporefilter) Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba kemudian disaring dengan filter membran yang tela h disterilkan. Dengan menghitung jumlah sel ratar a t a t i a p k e s a t u a n l u a s p a d a f i l t e r m e m b r a n d a p a t d i h i t u n g jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kalau perhitungansecara biasa sukar, perlu dilakukan pengecatan pada filter membran,kemudia filter membran dijenuhi dengan minyak imersi supayadapat menjadi trasparan (Jutono, 1980). 2.Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Tidak Langsung a. Menggunakan sentrifuge Caranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge denganmemakai sentrifuge yang biasa dipakai untuk menentukan jumlah butirbutir darah. Supaya hasilnya dapat dipertanggungjawabkan,maka kecepatan dan waktu

sentrifugasi harus diperhatikan. Setelahdiketahui volume mikrobia keseluruhan makan dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagivolume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap selmikrobia (Jutono, 1980). b.Berdasarkan kekeruhanDasar penentuan cara ini ialah jika seberkas sinar dilewatkan pada suatu suspensi mikrobia makan makin pekat (keruh) suspensit e r s e b u t m a k i n b e s a r i n t e n s i t a s s i n a r y a n g d i a b s o r p s i s e h i n g g a intensitas sinar yang diteruskan makin kecil. Untuk keperluan inid i p a k a i a l a t - a l a t s e p e r t i photoelectric turbidimeter :electrophotometer; spectrophotometer; nephelometer dan alat lainyang sejenis. Alat tersebut memakai sinar monokromatik dengan panjang gelo mbang tertentu. Dengan membaca persentase sinar yangdiabsorpsi atau sinar yang diteruskan dan dibandingkan dengansuspensi standar mikrobia sama yang telah diketahui jumlahnya tiapc c . A l a t y a n g p a l i n g s e d e r h a n a u n t u k p e n e n t u a n t e r s e b u t i a l a h kompar ator blok, tapi penggunaan alat ini kesalahannya sangat besar sebab cara pengamatannya hanya memakai mata biasa (Jutono,1980).

c. Menggunakan penghitung elektronik ( electronic counter )Alat ini dapat menentukan beribu -ribu sel tiap detik secaratepat. Prinsip kerjanya ialah adanya gangguan-gangguan pada alirani o n i o n ( l i s t r i k ) y a n g b e r g e r a k d i a n t a r a k e d u a e l e k t r o d e . Peny umbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yangterdapat di antara ke dua elektrode itu menyebabkan terputusnyaa l i r a n l i s t r i k . J u m l a h p e m u t u s a n a l i r a n t i a p s a t u a n w a k t u dihubungkan dengan kecepatan alir an cairan yang mengandungmikrobia merupakan ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut(Jutono, 1980). d.Berdasarkan analisa kimiaCara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia.Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianyasecara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan umummnya ialah kandungan protein : asam-asam nukleat (DNA dan RNA) ataufosfor dari asam-asam nukleat, dan sebagainya (Jutono, 1980). e.Berdasarkan berat keringCara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat keringsuatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-sel yangdapat dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia (Jutono, 1980). f.Menggunakan cara pengenceranC a r a p e n g e n c e r a n i n i d i p a k a i u n t u k m e n e n t u k a n j u m l a h mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah mengencerkansejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikrobasecara bertingkat. Seletah diinokulasikan ke dalam medium dandiinkubasik

an dilihat adanya pertumbuhan mikrobia. Misalnya suatuseri pengenceran dengan kelipatan 10 pada pengenceran 1 : 1000 ada pertumbuhan tetapi pada pengenceran 1 : 10000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoretis jumlah mikrobia pada suspensi bahan atau biakan mikrobia antara 1000 dan 10000 tiap cc (Jutono,1980). g. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)Cara di atas kurang tepat mengingat tidak semua mikrobiadapat tumbuh dalam suatu medium pada keadaan tertentu. Untuk mengatasinya makan tiap pengenceran dibuat beberapa ulangan,hasilnya secara matematik dapat untuk menentukan kemungkinana besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspensi bahan tersebut.Cara ini dikenal sebagai Most Probable Number (jumlah mikrobiayang paling mungkin). Untuk penentuan jumlah mikrobia yang p aling mungkin digunakan daftar Most Probable Number misalnyadaftar HOSKINS atau daftar MC.CRADY (Jutono, 1980). h. Berdasarkan jumlah koloni ( plate count )Cara ini yang paling umum dipakai untuk perhitungan jumlahmikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahandengan keliapatan 10; dari masing-masing pengenceran diambil 1 ccdan dibuat taburan dalam petridish ( pour plate ) dengan medium agar yang macam dan caranya tergantung pada jenis mikrobia. Setelahdiinkubasikan, dihitung jumlah koloni tiap petridish dari masingm a s i n g p e n g e n c e r a n . D a r i j u m l a h k o l o n i d e n g a n k e b a l i k a n pengen cerannya, misalnya untuk pengenceran 1 : 10000 terdapat 45koloni bakteri maka tiap cc atau gram bahan mengandung 450000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam petridish dapat digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi denganelectronic register . Pada perhitungan dengan cara ini ada beberapasyarat yang harus dipenuhi, antara lain : Jumlah koloni tiap petridishantara 30300 koloni, jikam e m a n g t i d a k a d a y a n g m e m e n u h i s y a r a t d i p i l i h y a n g jumlahnya mendekati 300. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader. P e r b a n d i n g a n j u m l a h b a k t e r i d a r i h a s i l p e n g e n c e r a n y a n g berturutturut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama ata

u lebih kecil dari duahasilnya maka di rata-rata; tapi jika lebih besar dari dua yangdipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya di rata-rata (Jutono, 1980). C . P R O S E D U R K E R J A 1.UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) Alat dan Bahana a.Media Plate Count Agar (PCA) b.Buffered Pepton Water (BPW) c . S a m p e l u j i m a k a n a n ( j a j a n p a s a r d a n m a k a n a n d a l a m kemasa n pabrik) d.Pipet volume e.Colony Counter (alat hitung koloni) f . C a w a n m o r t i r s t e r i l g.Gelas arloji steril h.Sendok steril Cara Kerja a.Persiapan dan Homogenisasi Makanan Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan denganalkohol 70% Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar tercipta suasana aseptis Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk makananujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku, dikalengkan),dapat dilihat di lampiran pada buku panduan b. Pembuatan media PCA sesuai dengan yang tertera pada kemasan c.Pengujian sampel Sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yangtidak dalam kemasan yang bisa dihancurkan denganmenggunakan mortir steril. Timbang @ 5 grammenggunakan gelas arloji steril secara aseptis Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanandibersihkan, dicuci/dilap dengan alkohol 70 %, bagiantutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dankemudian dibuka secara aseptis d.Homogenisasi dan Pengenceran Sampel Dengan cara aseptik timbang 5 gram atau 10 gram masing-masing sampel makanan yang telah dihaluskan denganmortir, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW, kocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan pengenceran 10-1. (Berat sampel/bahan bisa disesuaikandengan kebutuhan). Siapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 mlBPW. Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I,kocok sampai homogen. Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, kocok sampai homogeny Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan masukkan ke dalamtabung III, kocok sampai homogen. Dengan demikian pengenceran yang diperoleh adalah 10 -2, 10 -3, 10 -4.

e . U j i A L T Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut, pipet1 ml dan tuangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah dicairkan(suhu 45-55 oC). Tuangkan ke dalam cawan petri steril, goyang sampaihomogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa hinggasuspensi tersebar merata (metode pour plate). Percobaandibuat duplo. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat ujikontrol. Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatankontrol kontaminasi media. Caranya : ke dalam satu cawan petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW kedalam media PCA, biarkan memadat. Biarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. Amati hasil dan hitung jumlah koloni kuman yang tumbuh.dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni. Jumlah koloni rata-ratadari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka LempengTotal (ALT) dalam tiap gram contoh bahan (jumlah bakteri per ml sampel : CFU/ml sampel). Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir dalam lampiran 2. Bandingkan hasil angka ALT yang diperoleh denganliteratur tentang persyaratan ALT pada makanan yangditetapkan berdasarkan SNI. 2.UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK) Alat dan Bahan a.Media Malt Extract Agar (MEA) b.Buffered Pepton Water (BPW) c . S a m p e l u j i m a k a n a n ( j a j a n p a s a r d a n m a k a n a n d a l a m kemasa n pabrik) d.Kloramfenikol 100 mg/liter media Pembuatan larutan kloramfenikol : 1 gram kloramfenikoldalam 100 ml air suling sterile . P i p e t v o l u m e f. Colony Counter (alat hitung koloni) g.Cawan mortir sterilh. Gelas arloji sterili . Sendok steril Cara Kerja a.Persiapan dan Homogenisasi Makanan Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan denganalkohol 70% Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar tercipta suasana aseptis

Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk makananujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku, dikalengkan),dapat dilihat di lampiran pada buku panduan b. P e m b u a t a n m e d i a M E A ( Malt Extract Agar ) s e s u a i dengan yang tertera pada kemasan c.Homogenisasi dan Pengenceran Sampel Perhitungan Angka Kapang Khamir (AKK) bertujuan untuk menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang terdapatdalam bahan. Pada prinsipnya pengujian ini menggunakanmetode yang sama dengan penentuan Angka Lempeng Total(ALT). Media pertumbuhan yang digunakan adalah MEA ( Malt Extract Agar ) d . U j i A K K Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA ditambahdengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml ditambah 0,5ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram antibiotik dalam100 ml air suling steril). Metode pour plate : ambil 15 ml MEA suhu 45-50 oC dalamtabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol) dantambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceransampel makanan. Tuangkan ke dalam cawan petri steril,goyang sampai homogen dengan cara memutar petrisedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate ). Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi padasuhu 20-25oC dan diinkubasi 24-48 jam. Saat pengamatan, catat jumlah koloni jamur yang tumbuh.Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri. Kolonikapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir berwarna putih dan licin (berbau asam). Lempeng agar yang diamatiadalah lempeng di mana terdapat 10-150 kolonikapang/khamir. Jumlah total koloni dari kedua cawandihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasildinyatakan sebagai Angka Kapang Khamir (AKK) dalamtiap gram atau ml contoh bahan Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir dalam lampiran 2. Bandingkan hasil angka AKK yang diperoleh denganliteratur tentang persyaratan AKK pada makanan yangditetapkan berdasarkan SNI.