Investigacin de manchas secas de sangre

Mara Luisa Oneto-Mara montalto

Sangre
Agua 90% Fraccin Lquida (Plasma)
Plasma 55% Elem cel 45%

Slidos 10%

Composicin

Protenas Lpidos Glcidos Sales minerales Enzimas

Glbulos Rojos
Glbulos Blancos Plaquetas
2

Fraccin Slida (Elementos Celulares)

Glbulos rojos (Hemates o Eritrocitos)

Anucleados, bicncavos, circulares 7 7,5 m dimetro 2 3 m espesor Alrededor de 5.000.000/ mm3

Elementos Celulares

Glbulos blancos (Leucocitos)

Nucleados. 4.500 10.000/ mm3 6 14 m dimetro Neutrfilos-BasfilosEosinfilos-Linfocitos y Monocitos

Plaquetas

150.000-250.000/ mm3
3

Cadena

Hemoglobina

Estructura
Globina
Fraccin proteica constituida por 4 cadenas polipeptdicas.

Fe

Cadena

Hemo

PM 64.500 96% Globina 4% Hemo

Hemo

-Ncleo porfirnico formado por 4 pirroles unidos por puentes de meteno (=C) -1 tomo de hierro ligado a los cuatro nitrgenos en el centro del anillo.

Molcula de Hemoglobina

cuatro cadenas polipeptdica + 4 Grupos Hemo

4

Investigacin de manchas de sangre

1 -Bsquedas de las posibles manchas de sangre 2 -Traslado de las mismas al laboratorio 3 -Anlisis de las manchas

1. Observacin de las muestras 2. Ensayos preliminares 3. Ensayos confirmatorios 4. Investigacin de especie 5.Tipificacin de la mancha de sangre humana 6. ADN
5

2. Ensayos preliminares
Peroxidasa (HEMO)

Donor reducido + H2O2 <=> Donor oxidado + 2 H2O Incoloro Color o luminiscencia
Van Deen (1861): Resina de guayaco en etanol
Adler (1904): Bencidina en cido actico glacial Medinger: Leucobase del verde de malaquita en cido actico y agua Kastle Meyer: Fenolftalena reducida en medio alcalino Luminol: 3-aminoftalhidrazida en medio alcalino

2. Ensayos preliminares

Falsos positivos Sustancias no sanguneas pueden catalizar la reaccin.

Oxidantes qumicos Peroxidasas vegetales

2. Ensayos preliminares

Falsos negativos

La mancha puede ser tan vieja o diluida que no produce reaccin. Sin embargo el anlisis de ADN puede ser todava posible.

Reaccin de Kastle Meyer

C20H14O4 + H2O2 C20H12O42- + 2H2O

HEMO

Al

realizarse en medio bsico, no es producida por peroxidasas vegetales

Reaccin con luminol

/HEMO

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3. Ensayos confirmatorios

Mtodos microscpicos Mtodos microcristalogrficos Teichmann (cristales de hemina). Takayama (cristales de piridina-hemocromgeno)

Mtodo cromatogrfico Mtodo microespectroscpico

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4.Investigacin de especie

Observacin de los elementos figurados

Mtodo de las precipitinas Reaccin en un tubo o capilar Difusin en agar (Ouchterlony)
Sangre humana Sangre humana Antisuero humano

Antisuero humano

Sangre no humana

Por electroforesis
Ctodo Anodo

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5.Tipificacin de la mancha de sangre humana

Antgenos en la superficie Ag y Ac de la sangre ABO, Rh, MN Otros sistemas: Kell, Lewis, Kidd, P
Ag A Ag B Ag Rh

Sistema ABO
Grupo A
Ag o aglutingenos en GR Ac o aglutininas en suero A anti B

Grupo B
B anti A

Grupo AB
A y B ----

Grupo O
---anti A y anti B y

Aglutininas y Aglutingenos

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Estructura de los antgenos A y B

Oligosacrido precursor
NAG Gal

Ag A
NAG Gal Fuc NAG Gal Fuc NAGA

Sustancia H

NAG

Gal
Fuc

Gal

Ag B

NAG: N-acetilglucosamina Gal: D-galactosa Fuc: L-fucosa NAGA: N-acetilgalactosamina

14

15

Investigacin de aglutininas en manchas secas de sangre

1 2 Muestra 1:

Escamitas de la mancha

Escamitas de la mancha

Escamitas de la mancha

GR A

GR B

GR O

Se observa aglutinacin con GR A y GR B Aglutinacin con los GRB

Aglutinacin con los GRA

Unin GR A-anti A

Unin GR B-anti B

Muestra contiene anti A

Muestra contiene anti B

Muestra pertenece grupo O

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Muestra 2:

Aglutinacin con los GRA

: Se observa aglutinacin con GR A y no con GR B

Unin GR A-anti A

Muestra contiene anti A

Ag B Muestra puede pertenecer al

grupo B
Aglutinacin con los GRA Aglutinacin con los GRB

Unin GR A-anti A

Unin GR A-anti B

Muestra contiene anti A

Muestra contiene anti B

Muestra puede pertenecer

grupo O

Conclusin: Grupo B o O con anti B deteriorados

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Investigacin de aglutingenos en manchas secas de sangre

Tcnicas indirectas

Absorcin-inhibicin
Absorcin-elucin

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Tcnica de absorcin-inhibicin
Muestra Muestra
1/2 1/4

1/8

1/16

1/32

Policubetas de Kline

Blanco

Blanco

1 Muestra y blanco 2 Anti A y anti B ttulo 32 3 Trizar 4 En cmara hmeda 1h Retitular el As (anti a y anti B) despus de estar en contacto con la muestra 5 Solucin fisiolgica en las concavidades restantes 6 Diluir As 7 Policubeta A agregar GR A (1,5 %) y a la policubeta B GR B (1,5%) (NO donde estn trozos de tela) 8 En cmara hmeda 30 min, observar cada 10 min
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Absorcin- elucin
Anti A Anti B Lectina anti H
Controles

Anti A

Anti B

Lectina anti H

M1

Sangre O Sangre A1 Sangre B Sangre A1B

B1

M2

B2

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Absorcin- elucin

1. Poner antisueros A y B y la lectina (absorcin)

2. Lavar

3. Calentar (elucin)

4. Agregado de GR

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Tcnica de absorcin-elucin vs absorcin-inhibicin Secretores y no secretores 80 % Secreciones

Tcnicas de absorcin-inhibicin absorcin-elucin

20 %

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Factores que pueden afectar los resultados Antigedad de la muestra Condiciones ambientales: luz, calor y humedad Naturaleza del sustrato

Contaminacin bacteriana
Manipular las muestras sin guantes

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Algunos conceptos de gentica

Gen Locus Alelo Dominante Recesivo Codominante Hombre diploide

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Sistema ABO 3 genes allicos: A, B y O

A A B O AA BA OA B AB BB OB O AO BO OO

Genotipos: AA, AB, AO, BB, BO, OO. Son 6 Fenotipos: A , AB, A
(grupos)

,B , B , O

. Son 4

Sistema MN (por absorcin-elucin) 2 Ag: Ag M y Ag N 2 genes allicos: M y N

Genotipos: MM, NN, MN. Son 3

Fenotipos: M , N,
(grupos)

MN. Son 3
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Sistema Rh MN

(por absorcin-elucin)

5 Ag detectables: C, c, D, E y e Rh+ RhC D E c d e

est presente Ag D no est presente Ag D

Fisher y Race: 3 locus y 6 alelos (3 pares) un locus y sus 2 alelos

c/u de los genes controla la presencia de su Ag, excepto el d Wiener: 1 slo locus y 8 alelos r, r, r, ry, R0, R1, R2, Rz
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Grupo sanguneo Rh

Genotipo FisherRace Wiener C c D E e %

Orden de frecuencia

CDe/cDE
CDe/cde CDe/CDe Cde/cde cDE/cde cDE/cDE cDe/cDe cdE/cde cde/cde

R1R2
R1r R1R1 rr R2r R2R2 R0 rr rr

+
+ + + -

+
+ + + + + + +

+
+ + + + + -

+
+ + + -

+
+ + + + + + +

13,34
34,89 18,50 0,76 11,75 2,33 2,06 0,92 15,10

4
1 2 9 5 6 7 8 3 27

Protenas polimrficas -

Isoenzimas

Fosfoglucomutasa (FGM)
Esterasa D (EsD) Adenilato quinasa (AQ)

Fosfatasa cida de eritrocito (FAE)

Fosfoglucomutasa (FGM)
Tejidos y fluidos biolgicos: sangre semen y secreciones vaginales 3 locus: 1; 2 y 3 Locus 1 Tiene 2 alelos: FGM1 y FGM2
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Frecuencia de los grupos sanguneos en la poblacin

Grupo ABO (ciudad autnoma de Bs. As.) O 47,2 % A 39,6 % B 9,6 % AB 3,6 % Fosfoglucomutasa (ciudad autnoma de Bs. As.) FGM1 57,0 % FGM2-1 35,7 % FGM2 7,3 %

Factor Rh Rh + 85 % Rh15 %

Esterasa de D (ciudad autnoma de Bs. As.) EsD1 76,4 % EsD2-1 22,3 % EsD2 1,3 %

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Utilidad de la tipificacin

Grupo AB

3,6 %

RhFGM2 EsD2-1 f= 0,036 x 0,15 x 0,073 x 0,223 = 9x10 -5

15

7,3 % 22,3 %

Conclusin: 9 de cada 100000 individuos pueden presentar esta combinacin

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Cada nuevo individuo es nico en su informacin gentica, de aqu el trmino de individualidad biolgica. En cualquier parte del organismo siempre se encuentra el mismo material gentico, propio de cada individuo y diferente de cualquier otro, excepto en el caso de gemelos monocigotos.
Zannoni Primarrosa 1999
31

6. Anlisis de ADN

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4 pirroles con sust laterales Protoporfirina + Fe(II) Protoporfirina + Fe(III)

PROTOPORFIRINA HEMO HEMATINA

Protoporfirina + Fe(III) + Cl
Protoporfirina + Fe(II) + otra sust.

HEMINA
HEMOCROMOGENO

Protoporfirina + Fe(II) + globina (imidazol de una histidina) HEMOGLOBINA Protoporfirina + Fe(II) + globina + O2 Protoporfirina + Fe(II) + globina + CO2 Protoporfirina + Fe(III) + globina METAHEMOGLOBINA
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