Estructura primaria de las protenas La secuencia de aminocidos en una protena se conoce como estructura primaria.

La determinacin del orden de aminocidos en una cadena polipeptdica requiere la utilizacin de diversas tcnicas experimentales. Primero, se analiza la composicin en aminocidos, es decir, el tipo y la cantidad de aminocidos presentes en la protena y se tabula. Luego, se determina la identidad de los aminocidos en los extremos de la protena. Finalmente, el polipptido original se corta especficamente en fragmentos ms pequeos, cuyas secuencias pueden ser determinadas. Estos fragmentos pueden, luego, ser ordenados para reconstruir la secuencia del polipptido original. Veamos estas tcnicas: A. Composicin aminocidica de los polipptidos: 1. Hidrlisis cida: El primer paso para determinar la estructura primaria de una protena es identificar y cuantificar sus constituyentes. La protena o polipptido a ser analizados se hidrolizan, primero, por tratamiento con cido fuerte a 110 durante 24 horas. Este tratamiento rompe las uniones peptdicas y libera los aminocidos individuales. Adems, la glutamina y asparragina (o asparagina) se hidrolizan a glutamato y aspartato, respectivamente, mientras que el triptofano se destruye casi por completo. 2. Cromatografa: Los aminocidos individuales, obtenidos por hidrlisis cida de la protena, se separan por cromatografa de intercambio inico. En este mtodo, se siembra una mezcla de aminocidos sobre una columna que contiene un intercambiador inico insoluble. En las condiciones acdicas empleadas, todos los aminocidos poseen una carga positiva y quedan unidos a la columna de intercambio que posee una carga negativa. Cada aminocido es liberado, secuencialmente, de la columna cromatogrfica mediante elucin con soluciones de fuerza inica y pH crecientes. A medida que el pH aumenta, los aminocidos pierden protones, primero de los carboxilos y, luego, de las cadenas laterales y grupos amino. Al ir perdiendo los protones, los aminocidos se vuelven ms negativos y se liberan de la resina. Cada aminocido eluir de la columna a un pH y fuerza inica especficos. 3. Anlisis cuantitativo: Los aminocidos separados, encontrados en el eluido de la columna, se analizan cuantitativamente por calentamiento con ninhidrina, un reactivo que forma un compuesto de color azul con la mayora de los aminocidos, amonaco y aminas (pero forma un derivado amarillo con el nitrgeno imino de la prolina). La cantidad de cada aminocido se determina espectrofotomtricamente, determinando la cantidad de luz absorbida por el derivado de ninhidrina. Se registra en forma continua la absorbancia de cada derivado de aminocido en un registrador. Cada pico en el registrador corresponde a un aminocido individual; el rea debajo de cada pico es proporcional a la cantidad de ese aminocido en particular, presente en el polipptido original. La composicin en aminocidos se informa como residuos de cada uno por molcula proteica. El anlisis, as descripto, se realiza, generalmente, mediante un analizador automtico. B. Determinacin del aminocido N-terminal.

1. Mtodo de Sanger: Estn disponibles diversos mtodos para identificar al aminocido localizado en el extremo amino terminal de la cadena polipeptdica. En el mtodo de Sanger, el fluorodinitrobenceno reacciona con los grupos a-amino de los aminocidos N-terminales, para formar un dinitrofenil-derivado (DNP) del aminocido. La unin entre el grupo DNP y el aminocido no se rompe por hidrlisis cida suave. De este modo, el aminocido que se ha transformado en el derivado DNP, puede ser aislado luego de la hidrlisis del polipptido. El derivado DNP del aminocido, que corresponde al extremo amino terminal, puede ser identificado por cromatografa de intercambio inico. 2. Reactivo de Edman: Tambin puede utilizarse el fenilisotiocianato, conocido como reactivo de Edman, para marcar el aminocido N-terminal. El derivado de feniltiohidantona (PTH) formado, puede ser clivado en forma especfica del polipptido, sin perturbar al resto de los enlaces peptdicos entre los restantes residuos aminoacdicos. El reactivo de Edman posee una ventaja frente al reactivo de Sanger: puede ser aplicado sucesivamente sobre el polipptido acortado en el paso anterior. Usando tcnicas automatizadas, la repeticin de este mtodo puede utilizarse para determinar la secuencia de ms de 100 aminocidos, comenzando desde el extremo N-terminal. C. Determinacin del aminocido C-terminal. 1. Hidrazina: Todos los grupos carbonilo, unidos en enlace peptdico, reaccionan con hidrazina para formar hidrazonas. Sin embargo, el aminocido C-terminal no reacciona con la hidrazina y, por lo tanto, es liberado sin modificacin y puede ser separado de los residuos modificados e identificado. 2. Carboxipeptidasa: Esta exopeptidasa cliva, secuencialmente, los enlaces peptdicos comenzando desde el extremo C-terminal. El aminocido C-terminal ser, por lo tanto, el primer aminocido liberado por la carboxipeptidasa. Fuente: http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/proteinas.htm

1. El reactivo de Edman. El reactivo de Edman o fenilisotiocianato, se utiliza en condiciones ligeramente bsicas, para marcar especficamente el grupo amino terminal de una protena. El derivado feniltioidantoina (comnmente conocido como PTH), hace inestable el segmento N-terminal de manera que puede ser selectivamente hidrolizado. Sin romper los dems enlaces peptdicos. El reactivo de Edman puede ser aplicado repetidamente al pptido resultante del tratamiento anterior. Este proceso ha sido automatizado y se lleva a cabo por un secuenciador que puede determinar la secuencia de alrededor de 100 aminocidos en una protena desde su N-terminal 2. Ruptura del polipptido en fragmentos pequeos. Muchas protenas poseen una secuencia primaria mayor a 100 aminocidos, por tanto, estas molculas no pueden ser secuenciadas directamente desde el N-terminal hasta el C-terminal por el secuenciador. Por lo tanto deben ser cortadas en sitios especficos y as los fragmentos resultantes

pueden ser secuenciados independientemente. Al utilizar por separado, mas de un agente para romper a la molcula, ya sea una enzima o un agente qumico, el anlisis de los fragmentos que se sobrepongan proveer de la secuencia completa del polipptido original. 3. Ruptura enzimtica de la protena Por ejemplo la tripsina que es una enzima digestiva que se produce por el pncreas e in vtro es utilizada comnmente para romper especficamente a los polipptidos de gran tamao, en fragmentos susceptibles de ser secuenciados. La tripsina rompe a los enlaces peptdicos que se encuentran en el lado carboxilo de una lisina o arginina. Los fragmentos resultantes se denominan pptidos tripsinizados: 4.Ruptura qumica de la protena El tratamiento de una protena con bromuro de ciangeno se utiliza tambin comnmente para romper de manera especfica a las protenas. El bromuro de ciangeno rompe la cadena en el lado carbonilo de un residuo de metionina. Este agente como la tripsina es muy especfico y usualmente lleva a la produccin de un nmero limitado de fragmentos. 5.Pptidos superponibles Los pptidos producidos por la ruptura de una protena con una enzima digestiva o con un reactivo qumico, generalmente pueden ser secuenciados por la degradacin de Edman, an as, al conocer la secuencia de estos fragmentos, no puede ser conocida la secuencia que estos fragmentos ocupan en la protena original. Para conocer su posicin, deben preparares pptidos superponibles que se obtienen al romper a la protena con diferentes agentes para obtener diferentes segmentos. Estos pptidos superponibles actan como puentes para ordenar los fragmentos, debido a que un fragmento obtenido por el corte con un reactivo o enzima, se superpone con otro fragmento obtenido con otro reactivo o enzima, por ejemplo en los ejemplos anteriores se obtienen los siguientes fragmentos.

Fuente_ http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/secuenciacion%20proteina.html