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PRCTICA NMERO 3

CARTERSTICAS TINTORIALES DE LOS HONGOS

PRCTICA NMERO3

CARTERSTICASTINTORIALESDELOS HONGOS

UNIDAD2Micologa|
PRCTICA NMERO 3 UNIDAD 2 - MICOLOGA|

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CARTERSTICAS TINTORIALES DE LOS HONGOS

la aplicacin de diversas tcnicas de tincin y montaje. INTRODUCCIN Las tcnicas de tincin de hongos son: 1. TCNICAS DE TINCIN SIMPLE: Las cuales se caracterizan por el empleo de un slo colorante como pueden ser; azul de metileno, lugol, safranina, etc. Tincin con azul de metileno: Se utiliza para exmenes en fresco o coloraciones compuestas. Los hongos adquieren un color azul semejante al azul de algodn, aunque el hongo se observa ms intenso que el fondo del campo como se puede ver en la siguiente figura.

Una de las caractersticas bsicas para la clasificacin de las estructuras de los hongos, es la pigmentacin ya sea que las hifas sean hialinas o dematiceos, o bien las hifas sean tabicadas o no. Que los hongos sean miceliales o levaduriformes como se aprecia enm la siguiente figura

Microsporum canis, morfologa microscpica. Hifas hialinas, septadas y ramificadas. Fragmoconidios (macroconidios con divisiones transversales) en forma de huso. Cuando el hongo es micelial, una forma de clasificarlos es mediante la observacin de las hifas y esporas. Por lo que el cometido de la presente prctica es poder identificar, diferenciar, clasificar y montar, los hongos aislados en la prctica nmero dos, la forma de realizarlo es mediante Aspergillus versicolor, esporas exgenas (Conidia). Tincin de azul algodn lactofenol.

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Tincin con safranina: Los elementos fngicos se tien de color rojo intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro o rosa plido. til para el estudio de cultivos y productos biolgicos lquidos.

Nocardia sp, tincin de Ziehl Neelsen. 3. TCNICAS DE TINCIONES ESPECIALES: Absidia corymbifera, tincin con safranina. 2. TCNICAS DE TINCIN DIFERENCIALES: Son tcnicas que utilizan dos o ms colorantes y/o principios activos como pueden ser; tincin de Ziehl-Neelsen, la tcnica de Schiff, etc. Como se observa en la siguiente figura. Con los hongos demateceos es ms recomendable el uso de KOH del 10% al 30%, como mordente.

Pitiriasis versicolor, tincin con tinta Parker.

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OBJETIVOS: 1. Adquirir la capacidad de diferenciar hongos de diferentes fuentes, mediante diferentes tcnicas tintoriales. 2. Conocer y realizar las principales tcnicas de tincin de hongos. 3. Identificar y clasificar los hongos aislados en la prctica dos.

MATERIAL POR EQUIPO: Un microscopio. Portaobjetos Cubreobjetos. Asa y porta-asa. REACTIVOS: KOH al 10%, 50 mL Lugol, 50 mL Azul de algodn de lactofenol, 50 mL Azul de metileno, 50 mL Safranina, 50 mL Alcohol-acetona para la tcnica de Gram, 50 mL Cristal violeta, 50 mL Muestras de hongos aislados en la prctica anterior.

Alcohol metlico, 100mL Xilol, 100 mL Eritrocina 50 mL Etanol al 70%, 100 mL. Etanol al 96%, 100 mL Blsamo de Canad, 100 mL Esmalte para uas incoloro o merkoglass. Fuccina fenicada, 100 mL Alcohol-cido, 100 mL Nigrosina, 50 mL Colorante de Wright, 250 mL Solucin amortiguadora para Wrihgt, 250 mL Colorante de Giemsa, 250 mL Solucin amortiguadora para Giemsa, 250 mL

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MTODO 1. Tome un espcimen de los aislados anteriormente, que presente abundante crecimiento. 2. Aplique la tcnica para teir el hongo. 3. Observe a 10X y 40X y esquematice lo visto al microscopio. 4. Aplique otra(s) tcnica(s) y el KOH al 10% (pregunte al asesor para ms informacin). 5. Observe a 10X y 40X y esquematice lo visto al microscopio. I) Tcnicas para preparaciones con azul algodn-lactofenol a partir de colonias de hongos:

Aspergillus terreus, con tcnicas para preparaciones con azul algodnlactofenol. II) Tcnica de tincin con eritrocina:

1. Ponga un portaobjetos limpio sobre una superficie transparente e iluminada, si esto no es posible, ponga el portaobjetos sobre una hoja blanca. 2. Ponga una gota pequea de azul de algodn lactofenol en el centro del portaobjetos. 3. Tome un fragmento de la colonia mediante el asa recta o con aguja de diseccin. 4. Monte la preparacin depositando suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos. 5. Estas preparaciones se sellan con spray merckoglas o esmalte incoloro de uas, en el anexo de la prctica existe un ejemplo.

1. Fije con alcohol metlico por diez minutos. 2. Cubra con eritrocina por 15 minutos. 3. Lave ligeramente con agua de la llave. 4. Haga pasar rpidamente alcohol al 70% y deje secar. 5. Pase por alcohol absoluto durante 5 minutos y deje secar. 6. Ponga en xilol por 15 minutos y deje secar. 7. Monte en blsamo de Canad, en el anexo de la prctica existe un ejemplo.

Aspergillus candidus, en tincin de eritrosina.

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III)

Tincin con azul algodn actico:

1. Fije con alcohol metlico, cubriendo el portaobjetos y deje evaporar. 2. Cubra la preparacin con azul de algodn actico por 20 minutos, caliente hasta emisin de vapores. 3. Lave rpidamente con agua. 4. Pase por alcohol al 96% y seque. 5. Aplique xilol hasta que transparente la preparacin. 6. Monte en blsamo de Canad o resina sinttica, en el anexo de la prctica existe un ejemplo.

4. Coloque una gota de nigrosina en el extremo del portaobjetos y extienda como si fuera un frotis sanguneo en capa fina, deje secar y observe a 10X y 40X. V) Tcnica de Zielh-Neelsen para Actinomyces: 1. La preparacin se llena con fucsina fenicada a emisin de vapores por 3 minutos. 2. Decolore con alcohol-cido y lave con agua. 3. Cubra la preparacin con azul de metileno durante un minuto y deje escurrir. 4. Deje secar y observe en 10X y 40X. VI) Tincin de Gram: Siga la tcnica usada Microbiologa General I.

en

Aspergillus flavus, en tincin con azul algodn actico. IV) Tincin de Zielh-Neelsen modificado: Candida albicans en tincin de Gram. 1. La preparacin se llena con fucsina fenicada a emisin de vapores por 5 minutos. 2. Decolore con alcohol-cido y lave con agua. 3. Cubra la preparacin con azul de metileno durante 2 minutos y deje escurrir.
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VII) Tincin de Wright: 1. No es necesario fijar el frotis. 2. Coloque el portaobjetos completamente horizontal sobre una superficie adecuada que deje libre la mayora de sus bordes y cbralo con el colorante. 3. Despus de tres minutos agregue solucin buffer (buffer de fosfatos o agua destilada) en la misma cantidad que la de colorante, mezcle la solucin (colorante-buffer), aplicando una corriente de aire sobre la mezcla mediante una pipeta. 4. Despus de cinco minutos enjuague con agua de la llave. 5. Deje secar y lea al microscopio en seco dbil, seco fuerte y a inmersin. DIAGRAMA DE FLUJO

Aplicar tincin a los especmenes aislados anteriormente.

Observar al microscopio a 10X y 40X y esquematice. I) Tcnicas para preparaciones con azul algodn-lactofenol a partir de colonias de hongos: Agregar una gota de azul de algodn lactofenol en un portaobjetos limpio.

Acremonium strictum, en tincin de Wright. Colocar un fragmento de colonia en el portaobjetos con Azul de algodn lactofenol.
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Colocar cubreobjetos en muestra y sellar.

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II)

Tcnica de tincin con eritrocina: Fijar asada a portaobjetos por 10 minutos con alcohol metlico.

III)

Tincin con azul algodn actico:

Fijar muestra con alcohol metlico y dejar evaporar.

Cubrir con eritrosina, lavar inmediatamente y pasar por alcohol rpidamente.

Cubrir con azul de algodn y calentar a emisin de vapores.

Pasar por alcohol absoluto, adicional xilol y dejar secar. Montar en blsamo de Canad.

Pasar por alcohol y secar, aplicar xilol y montar en blsamo de Canad.

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CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento y en qu casos se utiliza la tcnica de Gram, Ziehl-Neelsen y la tcnica de Schiff? 2. Qu tcnica de tincin se usa en hongos demateceos? 3. Qu tcnicas de tincin son ms utilizadas en el rea de Bioqumica Clnica para el diagnstico de hongos, patgenos tanto miceliales como levaduriformes? 4. Qu tcnicas de tincin son ms utilizadas en el rea Farmacutica para la determinacin de hongos de importancia industrial o de contaminacin en plantas farmacuticas?

4. Rippon J. Tratado de micologa mdica. Mxico: Editorial Interamericana; 1990.

REFERENCIAS 1. Gamazo C, Lpez-Goi I, Daz R. Manual prctico de microbiologa. 3 ed., Barcelona (Espaa): Editorial Masson; 2005. 2. Herrera T, Ulloa M. El reino de los hongos. Mxico: Editorial Fondo de Cultura Econmica y UNAM; 1990. 3. Koneman R. Micologa: prcticas de laboratorio. Argentina: editorial Panamericana; 1993.

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