MINISTRIO DA AGRICULTURA,

PECURIA E ABASTECIMENTO
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ISSN 0101-5516
Abril, 2002
Embriognese Somtica e Regenerao de
Plantas em Aaizeiro
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Repblica Federativa do Brasil
Fernando Henrique Cardoso
Presidente
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Marcus Vincius Pratini de Moraes
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa
Conselho de Administrao
Mrcio Fortes de Almeida
Presidente
Alberto Duque Portugal
Vice-Presidente
Dietrich Gerhard Quast
J os Honrio Accarini
Srgio Fausto
Urbano Campos Ribeiral
Membros
Diretoria-Executiva da Embrapa
Alberto Duque Portugal
Diretor-Presidente
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Dante Daniel Giacomelli Scolari
J os Roberto Rodrigues Peres
Diretores-Executivos
Embrapa Acre
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Chefe-Geral
Milcades Heitor de Abreu Pardo
Chefe-Adjunto de Administrao
J oo Batista Martiniano Pereira
Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Evandro Orfan Figueiredo
Chefe-Adjunto de Comunicao, Negcios e Apoio
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 34
Ana da Silva Ledo
Osmar Alves Lameira
Ilmarina Campos de Menezes
Embriognese Somtica e Regenerao de
Plantas em Aaizeiro
Rio Branco, AC
2002
ISSN 0101-5516
Abril, 2002
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Centro de Pesquisa Agroflorestal do Acre
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:
Embrapa Acre
Rodovia BR-364, km 14, sentido Rio Branco/Porto Velho
Caixa Postal, 321
Rio Branco, AC, CEP 69908-970
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sac@cpafac.embrapa.br
Comit de Publicaes da Unidade
Presidente: Murilo Fazolin
Secretria-Executiva: Suely Moreira de Melo
Membros: Ana da Silva Ledo, Celso Lus Bergo, Claudenor Pinho de S, Clesa
Brasil da Cunha Cartaxo*, Edson Patto Pacheco, Elias Melo de Miranda, Evaldo
Muoz Braz, Flvio Arajo Pimentel*, Hlia Alves de Mendona, Joo Alencar de
Sousa, Jos Tadeu de Souza Marinho, Judson Ferreira Valentim, Lcia Helena
de Oliveira Wadt, Lus Cludio de Oliveira, Marclio Jos Thomazini
*Revisores deste trabalho
Superviso editorial: Claudia Carvalho Sena / Suely Moreira de Melo
Reviso de texto: Claudia Carvalho Sena / Suely Moreira de Melo
Normalizao bibliogrfica: Luiza de Marillac Pompeu Braga Gonalves
Tratamento de ilustraes: Fernando Farias Sev
Editorao eletrnica: Fernando Farias Sev
1 edio
1 impresso (2002): 300 exemplares
Todos os direitos reservados.
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos
autorais (Lei n 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP).
Embrapa Acre.
Embrapa 2002
Ledo, Ana da Silva.
Embriognese somtica e regenerao de plantas em aaizeiro. / Ana
da Silva Ledo, Osmar Alves Lameira e Ilmarina Campos de Menezes. Rio
Branco : Embrapa Acre, 2002.
22 p. : il. ; 22 cm. (Embrapa Acre. Boletim de Pesquisa ; 34).
1. Embriognese. 2. Regenerao artificial. 3. Aa . 4. Euterpe
oleracea. I. Lameira, Osmar Alves. II. Menezes, Ilmarina Campos de. III. Ttulo.
IV. Srie.
CDD 634.9745
Sumrio
Resumo ........................................................................... 5
Abstract ........................................................................... 7
Introduo ....................................................................... 9
Material e Mtodos......................................................... 10
Material Vegetal ............................................................. 10
Induo de Culturas Embriogenticas ......................... 12
Manuteno e Multiplicao de Culturas
Embriogenticas ........................................................... 12
Desenvolvimento, Maturao e Converso
de Embries Somticos ................................................ 13
Condies de Cultura................................................... 13
Resultados e Discusso................................................ 13
Concluses ................................................................... 20
Referncias Bibliogrficas ............................................ 21
Embriognese Somtica e
Regenerao de Plantas em
Aaizeiro
Resumo
O objetivo do presente trabalho foi estudar as diferentes respostas
morfogenticas de embries zigticos de aaizeiro (Euterpe
oleracea Mart.) submetidos a vrias condies de cultura in vitro.
Os experimentos foram conduzidos em laboratrio com material
vegetal coletado de plantas de aa da Embrapa Amaznia Oriental,
Belm, PA, Brasil. Verificou-se a expresso de um modelo de
embriognese somtica direto, repetitivo e assincronizado em
embries zigticos maduros cultivados em meio primrio MS
suplementado com 339,36 ?M de 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) e
transferidos para meio secundrio MS na presena de 0,537 ?M

de
cido 1-naftalenoactico (ANA) e 12,30 ?M

de 2-isopenteniladenina
(2iP). A converso de embries somticos em plntulas foi
alcanada aos 210 dias da inoculao com a transferncia das
culturas para um terceiro meio com a concentrao de sais e
sacarose reduzida metade e na ausncia de reguladores de
crescimento.
Termos para indexao: Euterpe oleracea Mart., micropropagao,
cultura de tecidos, embries somticos.
____________
1
Eng. agrn., D.Sc., Embrapa Acre, Caixa Postal 321, 69908-970, Rio Branco, AC,
analedo@cpafac.embrapa.br
2
Eng. agrn., D.Sc., Embrapa Amaznia Oriental, Caixa Postal 48, 66017-970, Belm, PA,
osmar@cpatu.embrapa.br
3
Eng. agrn., M.Sc., Embrapa Amaznia Oriental, ilmarina@cpatu.embrapa.br
Ana da Silva Ledo
1
Osmar Alves Lameira
2
Ilmarina Campos de Menezes
3
Abstract
The aim of this work was to study the morphogenetic responses of
zygotic embryos aai palm (Euterpe oleracea Mart.) submitted to
several conditions of in vitro culture. Several research experiments
were conducted, in laboratory, using vegetable material collected
from aai palm plants at Embrapa Amaznia Oriental, Belm, PA,
Brazil. It was possible to verify the expression of a direct, repetitive
and non-synchronized model of somatic embryogenesis in mature
zygotic embryos cultivated in primary MS medium supplemented
with 2,4-D (339.36 ?M) and transferred to a secondary MS medium
in the presence of NAA (0.537 ?M) and 2iP (12.30 ?M). The
conversion of somatic embryos in seedlings was reached with the
transfer of the cultures to a third medium with sucrose and mineral
salt concentrations reduced to half, without growth regulators starting
at 210-day-old.
Index terms: Euterpe oleracea Mart., micropropagation, tissue
culture, somatic embryos.
Somatic Embryogenesis and
Plant Regeneration of Aai
Palm
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Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
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Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Introduo
Dentre as diversas espcies nativas da Amaznia, destaca-se o
aaizeiro (Euterpe oleracea Mart.), tendo em vista suas diferentes
possibilidades de uso e seu grande potencial para comercializao
de produtos e subprodutos, frutos e palmito, no mercado nacional e
internacional. Entretanto, o uso de tcnicas inadequadas de
propagao e a ausncia de material gentico melhorado tm
contribudo negativamente para a explorao racional e econmica
desta espcie (Alves et al., 1998; Oliveira, 1999).
Inmeras justificativas tm sido reportadas ao uso de tcnicas de
cultura in vitro em palmeiras como uma prtica auxiliar para estudos
morfogenticos e para acelerar programas de melhoramento
gentico. No caso de palmeiras, os programas de melhoramento
so demorados e complexos devido ao longo ciclo, hbito de
crescimento e ausncia de mtodos convencionais de propagao
vegetativa. Neste contexto, a cultura de tecidos, quando integrada a
um programa de melhoramento, torna-se um instrumento valioso na
obteno de plantas livres de vrus, na propagao vegetativa in vitro
para clonagem rpida de gentipos superiores, na preservao e
intercmbio de germoplasma e no melhoramento gentico (Ferreira
et al., 1998).
No existem informaes sobre a propagao in vitro de aaizeiro;
os estudos tm sido direcionados para Cocos nucifera, Phoenix
dactilyfera e Elaeis guineensis, que apresentam grande impacto
econmico nos mercados internacionais. Em geral, dois processos
bsicos tm sido utilizados para a cultura de tecidos de palmeiras:
a) embriognese somtica e organognese direta ou indireta; b)
reverso de meristemas de inflorescncias jovens para o estgio
vegetativo (Tisserat, 1987).
O objetivo do presente trabalho foi estudar as respostas
morfogenticas de embries zigticos de E. oleracea Mart.
submetidos a vrias condies de cultura in vitro.
10
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Material e Mtodos
As atividades foram conduzidas no Laboratrio de Recursos
Genticos e Biotecnologia da Embrapa Amaznia Oriental, Belm,
PA, conforme fluxograma apresentado na Fig. 1.
Material Vegetal
Foram utilizados embries zigticos maduros excisados de frutos,
com peso mdio de 2,17 g, obtidos da coleo de germoplama da
Embrapa Amaznia Oriental. Os frutos foram lavados em gua
corrente e imersos em gua morna (40C), para despolpamento. As
sementes foram submetidas ao processo de desinfestao em
cmara de fluxo laminar, com a imerso em etanol a 70%, por dois
minutos, seguida da imerso em soluo de hipoclorito de sdio a
2%, por 20 minutos sob agitao, e lavadas quatro vezes em gua
esterilizada.
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Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Fig. 1. Fluxograma da metodologia adotada para regenerao de
plntulas, por embriognese somtica, a partir de embries
zigticos maduros de Euterpe oleracea Mart.
12
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Induo de Culturas Embriogenticas
Os embries zigticos, excisados das sementes, foram inoculados
em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 0,6%
de gar, 0,25% de carvo ativado, 3% de sacarose, 500 mg.L
-1
de
casena hidrolisada e com diferentes concentraes de 2,4-D
(113,12; 226,24; 339,36; 454,48; 565,61; 678,73 ?M). O meio de
cultura teve o pH ajustado para 5,8 e, em seguida, foi submetido
esterilizao em autoclave a 120?C durante 15 minutos.
O delineamento estatstico utilizado foi o inteiramente casualizado,
com seis tratamentos e quatro repeties, sendo cada unidade
experimental constituda de quatro frascos, contendo trs explantes
cada. Aos 80 dias da inoculao, avaliaram-se o nmero de
explantes com respostas morfogenticas e as porcentagens de
explantes com calo, estruturas pr-embriogenticas e embries
somticos globulares.
As variveis foram submetidas anlise de varincia pelo teste F e
as mdias comparadas pelo agrupamento de Scott & Knott (Scott &
Knott, 1974) em nvel de 1% e 5% de probabilidade.
Manuteno e Multiplicao de Culturas Embriogenticas
As culturas embriogenticas, iniciadas a partir de embries zigticos
maduros no meio primrio ou indutor, foram transferidas, aos 85
dias de cultura, para meio secundrio com o objetivo de induzir a
multiplicao de clulas pr-embriogenticas e de embries
somticos em estgios globulares iniciais.
As culturas pr-embriogenticas foram inoculadas em frascos de
vidro, com capacidade de 200 mL, contendo 40 mL de meio de
cultura bsico MS com 0,6% de gar, 2% de sacarose na presena
de 0,537 ?M de ANA e de 12,30 ?M de 2iP.
Aos 60 dias da transferncia, avaliaram-se a freqncia
embriogentica obtida pela porcentagem de culturas
embriogenticas em relao ao total de explantes do meio primrio
13
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
(A), o nmero de embries somticos por explante (B) e a eficincia
embriogentica (A x B)/100 (Lazzeri et al., citados por Guerra, 1989).
As avaliaes qualitativas consistiram da caracterizao dos
estgios embriogenticos e do comportamento das culturas.
Desenvolvimento, Maturao e Converso de Embries
Somticos
Com o objetivo de estimular a progresso das fases iniciais para
fases tardias e obter embries somticos maduros, convertendo-os
posteriormente em plntulas, as culturas embriogenticas foram
transferidas para meio tercirio aos 150 dias de cultura.
As culturas foram inoculadas em frascos de vidro com capacidade
de 200 mL, contendo 40 mL de meio de cultura MS, com 0,6% de
gar e 1% de sacarose, na ausncia de reguladores de
crescimento.
Aos 60 dias da transferncia, avaliaram-se a freqncia
embriogentica obtida pela porcentagem de culturas
embriogenticas em relao ao total de explantes do meio
secundrio, o nmero de embries somticos na fase bipolar e o
nmero de plntulas regeneradas por cultura. As avaliaes
qualitativas consistiram da caracterizao dos estgios
embriogenticos e do comportamento das culturas.
Condies de Cultura
No perodo inicial de sete dias, as culturas foram mantidas em sala
de crescimento, na ausncia de luz para prevenir a oxidao, com
temperatura de 26C 2C, umidade relativa do ar em torno de 70%.
Depois desse perodo, foram mantidas em fotoperodo de 16 horas
de luz branca fria (52 mol.m
-2
.s
-1
de irradincia)/8 horas de escuro.
Resultados e Discusso
Foram observadas diferentes respostas morfogenticas de
embries zigticos maduros de aaizeiro cultivados in vitro em
funo da concentrao de 2,4-D aos 80 dias de cultura (Tabela 1).
14
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Tabela 1. Respostas morfogenticas de embries zigticos maduros de
Euterpe oleracea Mart., cultivados em meio MS suplementado com
diferentes concentraes de 2,4-D, aos 80 dias de cultura.
1
Sobre o total de 45 explantes.
2
Porcentagem sobre o total de explantes com resposta morfogentica.
Embries zigticos maduros cultivados em meio MS com 113,12 e
226,24 ?M de 2,4-D apresentaram o desenvolvimento do n e da
lmina cotiledonar e, aos 14 dias de cultura, a emisso da radcula e
do coleptilo cotiledonar, dando origem a plntulas normais e
vigorosas.
A supresso do processo de converso de embries zigticos em
plntulas e o aparecimento de estruturas granulares sobre a regio
do pecolo cotiledonar, aos 40 dias de cultura, caracterizaram a
primeira manifestao morfogentica em embries zigticos
cultivados em meio de cultura suplementado com 339,36; 454,48 e
565,61 ?M de 2,4-D (Fig. 2A). No se verificou a iniciao
embriogentica em embries zigticos cultivados em meio com
678,73 ?M de 2,4-D.
Aos 60 dias de cultura, sobre as estruturas granulares, agregados
de embries somticos globulares tpicos de colorao amarelada
(Fig. 2B) foram visualizados, sendo facilmente destacados do tecido
matriz.
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Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
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Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Detectaram-se diferenas significativas entre as concentraes de
2,4-D para a porcentagem de embries zigticos maduros com
estruturas granulares e embries somticos (P ? 0,01). As maiores
freqncias de embries somticos globulares foram verificadas em
explantes cultivados em meio com 454,48 e 339,36 ?M de 2,4-D
(Fig. 3). Apesar da concentrao de 565,61 ?M de 2,4-D ter induzido
uma alta freqncia de estruturas granulares embriogenticas, a
porcentagem de explantes com embries somticos globulares foi
baixa.
Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente entre si, em
nvel de 1% pelo agrupamento de Scott & Knott. EGR-CV = 8,01%;
EGL-CV = 36,60%.
Fig. 3. Porcentagem de embries zigticos maduros de Euterpe oleracea
Mart. com estruturas granulares (EGR) e embries somticos globulares
(EGL) sob diferentes concentraes de 2,4-D aos 80 dias de cultura.
O comportamento morfogentico observado nas culturas de
embries zigticos maduros de Euterpe oleracea Mart. pode ser
caracterizado por dois aspectos: a iniciao embriogentica ocorreu
diretamente a partir da formao de tecido embriogentico de
aspecto granular na regio do n cotiledonar e em nenhum caso
verificou-se a iniciao a partir dos tecidos da lmina cotiledonar
(haustrio).
17
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Aos 35 dias aps a transferncia de clulas pr-embriogenticas e
de embries somticos em estgios globulares iniciais para o meio
de manuteno e multiplicao, observou-se o incio da progresso
dos embries para o estgio de desenvolvimento bipolar nos
explantes pr-cultivados em meio com 339,36 ?M de 2,4-D.
Apesar dos tratamentos primrios com 454,48 e 565,61 ?M de 2,4-D
terem induzido a iniciao de estruturas pr-embriogenticas na
fase inicial, verificaram-se alta intensidade de oxidao dos
explantes, menor nmero de embries somticos por explante e
paralisao do desenvolvimento dos embries somticos no estgio
globular, sem a progresso para os estgios subseqentes, aos 150
dias de cultura (Tabela 2). Provavelmente as altas concentraes de
2,4-D inibiram a progresso das culturas, alm de contribuir para a
oxidao, sugerindo que para essas concentraes o tempo de
permanncia no meio primrio deva ser reduzido.
Tabela 2. Mdias da freqncia embriogentica (FRE), do nmero de
embries somticos (NES) por cultura e da eficincia embriogentica (EFE)
de embries zigticos maduros de Euterpe oleracea Mart. cultivados em
meio secundrio MS na presena de 0,537 ?M de ANA e 12,30 ?M de 2iP,
aos 150 dias de cultura.
1
Mdia de culturas embriogenticas em relao ao total de explantes do meio
primrio.
2
Conforme Lazzeri et al., citados por Guerra (1989).
18
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Outro aspecto a ser levantado que o desenvolvimento
embriogentico no foi sincronizado, ou seja, as culturas
apresentaram embries somticos em diferentes estgios de
desenvolvimento (Fig. 2C). Em algumas culturas, verificou-se a
formao de embries somticos a partir dos primeiros embries
somticos diferenciados, configurando um modelo embriogentico
secundrio ou repetitivo de alta freqncia e longa durao. Este
mesmo padro tambm foi observado por Guerra & Handro (1991 e
1998) em culturas de embries zigticos de Euterpe edulis Mart.
Os resultados obtidos concordam com Tisserat (1984a, 1984b) o
qual reporta que o meio MS suplementado com 2,4-D, ANA e 2iP
promove as melhores condies para se obter um protocolo de
regenerao de plantas, por meio da embriognese, em palmeiras a
partir de diferentes explantes. De acordo com Blake (1983), em um
sistema de multiplicao in vitro de palmeiras, as auxinas so
requeridas para a iniciao de calos e as citocininas para a induo
de embriognese somtica.
Guerra & Handro (1998) tambm alcanaram a expresso de um
modelo de embriognese somtica, a partir de embries zigticos
imaturos e maduros de Euterpe edulis Mart., com a transferncia dos
explantes de meio enriquecido com altas concentraes de 2,4-D
(50-100 mg.L
-1
) para meio suplementado com ANA e 2iP.
Aos 30 dias aps a transferncia das culturas para meio MS, na
ausncia de reguladores de crescimento, detectaram-se o incio da
maturao dos embries somticos e, aos 60 dias, a converso em
plntulas normais. As culturas iniciadas em meio primrio
suplementado com 339,36 ?M de 2,4-D apresentaram alta
freqncia embriogentica, bem como a progresso de embries
para a fase bipolar e a regenerao de plntulas (Tabela 3). Nas
culturas inoculadas em meio primrio com 454,48 ?M de 2,4-D,
observaram-se uma paralisao no desenvolvimento dos embries
na fase globular e intensa oxidao. Provavelmente as altas
concentraes de 2,4-D, apesar de terem induzido uma
competncia embriogentica nos explantes no meio primrio,
19
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
podem ter alterado o desenvolvimento da rota morfogentica,
promovendo a paralisao do desenvolvimento dos embries no
meio secundrio.
O processo de embriognese secundria direta foi mantido nesta
fase de cultura na ausncia de reguladores de crescimento,
concordando com Guerra & Handro (1991) em culturas de embries
zigticos de Euterpe edulis Mart. Observou-se a formao direta de
embries somticos a partir de embries diferenciados (Fig. 2C) e
sobre plntulas recm-regeneradas (Fig. 2D).
Tabela 3. Mdias da freqncia embriogentica (FRE), do nmero de
embries somticos na fase bipolar (NEB) e do nmero de plntulas
regeneradas (NPR) por cultura, a partir de embries zigticos maduros de
Euterpe oleracea Mart. cultivados em meio MS, na ausncia de
reguladores de crescimento, aos 210 dias de cultura.
1
Mdia de culturas embriogenticas em relao ao total de explantes do meio
secundrio.
A converso dos embries somticos iniciou, aproximadamente,
aos 200 dias de cultura. Guerra & Handro (1998) tambm
observaram um processo de embriognese mais lento em embries
zigticos maduros de Euterpe edulis Mart. quando comparados com
embries imaturos que alcanaram a produo de plntulas aos 180
dias. Aos 240 dias de cultura, as plntulas apresentavam-se com
desenvolvimento normal da parte area e do sistema radicular
(Fig. 2E), sendo observada a formao de mltiplas plntulas, em
decorrncia da embriognese direta secundria (Fig. 2F).
20
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Este modelo apresenta a possibilidade de obter um padro contnuo
de produo de embries somticos com riscos mnimos de
alteraes genticas, conforme preconizado por Guerra (1989).
Apresenta grande potencial de aplicabilidade em estudo de eventos
bioqumicos e fisiolgicos relacionados com a determinao, no
resgate de embries interespecficos, obteno de linhagens e
conservao in vitro de Euterpe oleracea Mart.
Concluses
? A expresso de um modelo de embriognese somtica direta,
repetitiva e no sincronizada e com alta eficincia e freqncia
embriogentica alcanada em embries zigticos maduros
cultivados em meio primrio MS suplementado com 2,4-D e
transferidos para meio secundrio MS na presena de ANA e
2iP.
? A maturao de embries somticos e a converso em
plntulas normais so obtidas em meio MS, na ausncia de
reguladores de crescimento.
? A ativao de um modelo de embriognese somtica em
Euterpe oleracea Mart. dependente do tipo e estdio fisiolgico
do explante e da concentrao do regulador de crescimento no
meio primrio.
21
Embriognese Somtica e Regenerao de Plantas em Aaizeiro
Referncias Bibliogrficas
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PECURIA E ABASTECIMENTO
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ISSN 0101-5516
Abril, 2002
Embriognese Somtica e Regenerao de
Plantas em Aaizeiro
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