TINCIONES

ANGELICA MARIA CARDENAS IVONNE JULIANA MARTNEZ BERMDEZ MARIA ALEJANDRA MARTNEZ SANABRIA

JOHN EMERSON LEGUIZAMON GUERRERO INSTRUCTOR

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA CENTRO DE GESTION INDUSTRIAL TECNOLOGA EN QUMICA INDUSTRIAL BOGOT D.C. FEBRERO 23 DE 2011

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCION .......................................................................................................... 3 OBJETIVOS .................................................................................................................. 4 MARCO TEORICO ....................................................................................................... 5 1. CLASES DE TINCIONES ......................................................................................... 5 Tinciones vitales y no vitales. ....................................................................................... 5 Tinciones tradicionales y especiales. .......................................................................... 5 2. TINCION DE GRAM .................................................................................................. 7 Tcnica Tincin de Gram .............................................................................................. 9 3. MICROORGANISMOS GRAM POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS. .............. 10

REACTIVOS ............................................................................................................... 12 RESULTADOS ........................................................................................................... 13 ANALISIS DE RESULTADOS ................................................................................... 14 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 16 BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 17

INTRODUCCION

La tincin es una tcnica que utiliza colorantes para aumentar el contraste entre los microorganismos y el medio que los rodea. Se utiliza para diferenciar los tipos de clulas, los constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, ncleo, mitocondria, etc.

Generalmente se realiza la fijacin del microorganismo antes de su coloracin para evitar cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que realmente son, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

OBJETIVOS

Aprender las tcnicas de preparacin y de coloracin ms empleadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos.

Hacer la tincin de Gram a diferentes cultivos obtenidos de diferentes fuentes.

Diferenciar los microorganismos Gram positivos y Gram negativos, analizar su morfologa.

MARCO TEORICO

1. CLASES DE TINCIONES Tinciones vitales y no vitales. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. Tinciones tradicionales y especiales. Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clsicas). Estos colorantes se renen en 4 grupos: Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las

estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucledos. Uno de ellos es el azul de metileno. Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreada. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosina de azul de metileno.

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante. Uno de ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.

Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizan

sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de colorantes bsicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidativa (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean en el diagnstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de MayGrnwald). Tambin hay tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias especficas. Son de dos clases: Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos)

que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro. Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, ms o

menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias,

localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.

2. TINCION DE GRAM El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas)a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo, y acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una

solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de Gram positivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de

gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede

variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. Tcnica Tincin de Gram Fijar un frotis:Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. Tincin: Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. Enjuague: Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro

delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo. La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% Mordiente: Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias. Decoloracin:Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado: Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste: Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague:Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

3. MICROORGANISMOS GRAM POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS. Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

10

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

11

REACTIVOS Aceite de Inmersin Tiene aproximadamente el mismo ndice de retraccin que el vidrio. Mediante el aceite de inmersin se elimina casi completamente la desviacin de los rayos de luz y se aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos de los microscopios. Lugol El lugol o solucin de Lugol es una disolucin de yodo molecular I2 y yoduro potsico KI en agua destilada. Fucsina El fucsina este un colorante rojo tirado a violeta.Este producto se produce en la coloracin de Gram, y tambin en medios de cultivo bacterianos. Cristal violeta Es un colorante bsico bacteriosttico potente, especialmente contra microorganismos gran positivos, las bacterias gran negativas son alteradas en poco grado.

12

RESULTADOS

Caractersticas del cultivo 1. Hongo tubera: Es circular de color verde, tiene cierto relieve de color de blanco hasta un verde muy oscuro. 2. Carnet: Es una mancha de forma irregular, esta es algo gruesa y se ve hmeda de un color amarillo claro. 3. Zapato primer cultivo: Este cultivo est conformada por colonias en forma de crculos que a su vez forman lneas. 4. Zapato segundo cultivo: Se form una lnea y sobre esta se observan pequeas colonias circulares de color blanco. 5. Moneda primer cultivo: Este cultivo formo solo una lnea delgada de color amarillo crema. 6. Moneda segundo cultivo: Es una lnea gruesa con un color entre blanco grisceo y amarillo crema. Se realiz la tincin de Gram y se observo por el microscopio a cinco de los cultivos, a los hongos no se les realizo el proceso. 1. Zapato primer cultivo: Bacilos, Gram 2. Zapato segundo cultivo: Cocos Gram + 3. cultivo obtenida del carnet: Cocos Gram + 4. Moneda primer cultivo: Cocos Gram + 5. Moneda segundo cultivo: bacilos Gram -

13

ANALISIS DE RESULTADOS

Hongo: Las esporas de los hongos ambientales microscpicos se dispersan y transmiten por el aire. Es el azar el que distribuye estas esporas, que al germinar dan lugar a las colonias de hongos: agrupaciones de varios millones de individuos que forman estructuras de unos pocos centmetros visibles a simple vista. En el laboratorio se obtuvo una colonia que germino sobre la superficie del agar, estos

hongos tomo un aspecto circular y una estructura parecida al moho. Esta colonia de hongos se obtuvo a partir de una muestra microscpica de una tubera ya que estos microorganismos se encuentran y crecen de manera favorable en medio hmedo. Cocos Gram positivos: dentro de este grupo bacteriano se encuentran los siguientes tres gneros: los Stafilococcus,

Streptococcus y Enterococcus. En el laboratorio se obtuvo tres colonias de cocos Gram positivos a partir de muestras microscpicas de un carnet , zapato y una moneda. En los cultivo de la moneda y carnet se muestra una lnea amarilla y estas bacterias pueden estn distribuidas de una manera muy irregular, segn su morfologa se puede suponer que pertenece al grupo de los Stafilococcus. En el cultivo del zapato se pueden clasificar en el gnero Streptococcus ya que forman pequeas colonias circulares muy tpicas, pequeas a modo de gotas de roci, con bordes gruesos y que se agrupan en forma de cadenas parecidas a la que se observo en el microscopio. Bacilo Gram negativo: En la muestra que se obtuvo del primer cultivo del zapato dio como resultado una tincin rosada fuerte a bacterias en forma de bacilos. Pero estas bacterias Gram negativas se pueden

14

encuentran en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas y en los animales desde los insectos al hombre. Estas bacterias se caracterizan por formar colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos, parecidos a la colonia encontrada en el zapato. Que se obtuvo en la muestra del zapato.

15

CONCLUSIONES

En los diferentes cultivos hechos en el laboratorio se observo coloracin y apariencia, algunos presentaron coloracin amarilla clara, otros blanca y verde oscura. La apariencia de cada cultivo fue diferente unos cultivos presentaron una formar esfrica y otros una forma muy irregular

Se hizo la tincin de Gram a diferentes muestras de cultivo(carnet, zapato, moneda y tubera), se diferencio y clasific las bacterias Gram negativas y Gram positivas segn su coloracin.

Se observaron en el microscopio los cultivos con la tincin de Gram. En algunos cultivos sacados de muestras de zapato, carnet y moneda se obtuvo un color morado esto nos quiere decir que son bacterias Gram positivos.

Al observar en el microscopio el primer cultivo del zapato y el segundo cultivo de la moneda se obtuvo un color rosado fuerte esto nos quiere decir que son bacterias Gram negativas.

16

BIBLIOGRAFIA 1. El rincn del vago, Tinciones hematolgicas [en lnea], < http://html.rincondelvago.com/tinciones-hematologicas.html>[citado 2006]. 2. WIKIPEDIA, Tincin de Gram [en lnea],

<http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram>[citado 2005]. 3. El rincn del vago, bacterias clasificacin de cocoa [en lnea], <http://html.rincondelvago.com/bacterias_5.html>[citado 2005].

17