HENRY SALAZAR

Junio 19, 2007

Práctica 1-2 Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – Diagnóstico

de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2
Práctica 1-2: EXTRACCIÓN DE ADN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) - Diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2

OBJETIVOS
1. Aprender la técnica de extracción de ADN humano a partir de sangre periférica.
2. Usar el ADN extraído en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
3. Conocer las aplicaciones de la PCR

ADN

El ADNes una macromolécula compleja, compuesta por dos cadenas o hélices que se entrelazan
entre sí formando una doble hélice. Cada cadena está formada por millones de eslabones, llamados
nucleótidos o bases nitrogenadas (son cuatro: A-T, G-C).
Ambas hélices están unidas entre sí, a nivel de los eslabones complementarios de cada hélice,
por parejas. La secuencia de los pares de bases es lo que determina el código genético.
Según el orden que sigan esos pares de bases, se codifica una función u otra, o simplemente no
se codifica nada. El ADN de la célula se organiza en cromosomas. Cada cromosoma es una
molécula largísima de ADN. El ser humano tiene su DNA organizado en 23 pares de cromosomas
distintos, es decir, 46 cromosomas. La mínima secuencia de ADN que es capaz de codificar una
función o una estructura completa se denomina GEN. Sin embargo existen largas secuencias del
ADN, que aunque molecularmente se compongan de lo mismo que un GEN (son una secuencia de
nucleótidos), no codifican absolutamente, y por lo tanto no se les llama genes. Algunos han
llamado a esas secuencias ‘vacías’, ADN basura. Hoy día se piensa que la función de ese ADN es
estructural, es decir, contribuye a dar estabilidad a la molécula de ADN. Cada cromosoma contiene
miles de genes. Hoy día se estima que el ser humano tiene más de 30.000 genes en sus
cromosomas.
INTRODUCCIÓN

La PCR es una reacción bioquímica in vitro catalizada por una enzima, en la cual
pequeñas cantidades de un segmento específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN
de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de ADN lineal de doble
cadena. Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una ADN polimerasa (la más
comúnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas más extensamente
caracterizada y aplicada en biología molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada
inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del ADN recombinante,
la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución. Actualmente, la tecnología
de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el
clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biología molecular. Los primeros
experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por el Dr. Mullís y el Dr. Fred A.
Faloona, un matemático quien desarrolló el primer dispositivo automático regulador de la
temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullís y Faloona, 1987).
La amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales consta de
tres estadios de temperatura distintos: (1)

1) Desnaturalización del templado o "plantilla" de ADN (ADN que servirá de modelo para su
amplificación) a una temperatura de 94 a 96ºC.

2) Unión o annealing de los primers (conocidos también como cebadores). Los primers
son olígonucleótidos, formados por moléculas de cadena simple de ADN que son
complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada de ADN que actúa como
templado o plantilla. Su función es servir al templado de ADN como punto de partida para la
polimerización. Este paso requiere una temperatura que varía entre los 42 a 60°C; y
3) Extensión del primer por ADN polimerasa: Los primers son extendidos en una cadena
templado de ADN de cadena simple (previamente desnaturalizado) gracias a la enzima
ADN polimerasa en presencia de desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) bajo condiciones
adecuadas de reacción, esto da corno resultado la síntesis de nuevas cadenas de ADN
complementario a las cadenas templado. Para este paso se requieren temperaturas entre los 60 a
72° C. Luego de la extensión se obtienen moléculas de ADN de doble cadena, sin embargo, la
síntesis de nuevas cadenas de ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar el ADN
por calor (desnaturalización), seguidamente promoviendo el annealing o unión de los primers
mediante el enfriamiento de la mezcla para finalmente conducir a la extensión de los primers
gracias a la ADN polimerasa a la temperatura adecuada para cada reacción. Cada repetición de
esta síntesis de nuevas cadenas constituye un ciclo de amplificación.
La reacción de amplificación contiene dos prirners dispuestos de tal manera que puedan
hibridizar con las cadenas opuestas de la secuencia "blanco" o secuencia a amplificarse. Debido a
que el producto extendido incluye la secuencia complementaria a la del otro primer, el producto de
cada reacción sirve como templado en el nuevo ciclo de PCR verificándose así una reacción
bioquímica en cadena.
 El impacto de esta tecnología (PCR) ha sido particularmente importante en algunos campos
relacionados al análisis del genoma humano, especialmente en el mapeo genético y físico de los
cromosomas y análisis de la expresión génica.

MATERIALES

EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE PERIFÉRICA

- Dos muestras de 1 cc de sangre periférica heparinizada
- Agua bidestilada
- Recipiente con cloro
- Tampón de lisis de leucocitos:
Tris (2M)
NaCI (5M)
EDTA (0.25M)
Agua químicamente pura

- HCI
- SDS 10%
- Proteinasa K
- NaCI (6M)
- Etanol absoluto
- Isopropanol
- Etanol al 70%
- Tris-EDTA (TE) 1:0.1 pH 8
- Vortex
- Baño maría a 37° C.
- Pipeta Pasteur
- Centrífuga multitubos
- Tubos cónicos
- Guantes estériles
- Vaso de precipitación.
 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
- Termociclador
- Tubos eppendorf de 0,5 mi
- Gradilla para tubos eppendorf
- Parafilm
- Micropipetas de 200 y 10 microlitros
- Puntas para micropipetas (estériles)
- Tubos eppendorf de 1,5 mi
- Hielo picado
- Master Mix:
- Agua químicamente pura
- dNTPs
- Taq polimerasa
- Buffer o lampón de reacción 10X
- Primers
- MgCI2
- ADN a ser amplificado

PRUEBA DE EXTRACCIÓN EN GEL DE AGAROSA

- Cámara de electroforesis
- Azarosa
- TAE1X:
- Bromuro de etidio
- 100pb
- Azul de Bromofenol
- Micropipetas
- Puntas para micropipeta
-
Gel de Agarosa
cámara Pequeña

% Agarosa TAE (50x) H20 destilada Producto

1% 0.2gr 400ul 20ml ADN-ADNc
2% 0.4gr 400ul 20ml PCR

cámara grande
% Agarosa TAE (50x) H20 destilada Producto
1% 0.75gr 1.5 ml 75ml ADN-
2%
Bromuro de1.25gr
Etidio 1.5 ml 75ml PCR
STOCK = 10 mg/ml
Diluido = 0.5 ug/ml (50 en 1000 ml de H2O destilada)
 EXTRACCIÓN DE ADN EN SANGRE PERIFÉRICA
1. Tomar de 5 mi de sangre periférica con EDTA (tubo tapa lila)
2. Ingresar los datos al cuaderno de registro y dar un código a la muestra.
3. De muestra coger 1ml, y colocar en un tubo estéril eppendorff de 2ml,
previamente etiquetado.
4. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM.
5. Retirar, con una micro pipeta de 1000 ul estéril el plasma; sin agitar el tapón celular
(cuidado con los
glóbulos blancos).
6. Llenar el tubo con buffer de lisis de eritrocitos y agitar suavemente hasta que se
resuspenda el botón celular.
7. Colocar la muestra a 4°C por 3 minutos.
8. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM
9. Descartar el sobrenadante con micro pipeta estéril, evitando tomar los glóbulos
blancos.
10. Resuspender el tapón de células blancas en :
a) 500 ul de buffer de lisis de leucocitos
b) 10 ul de Proteinasa K (PK) 10 mg/ml
c) 50 ul de DUODECIL sulfato de sodio (SDS) al 10%
11. Incubar la muestra en baño de maría húmedo a 37°C por toda la noche (o a 56 °C
por 2 horas)
Al día siguiente

12.Colocar 200 ul de Cloruro de Sodio (ClNa), 5 M a la muestra

13.Agitar suavemente la muestra por 15 minutos
14.Centrifugar la muestra por 10 minutos a 12000 RPM

El ADN se encuentra a partir de este paso en el sobrenadante

15. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a un nuevo tubo estéril

previamente etiquetado (no llevar
nada del precipitado)
16. Añadir fenol cloroformo 500 ul, dar vortex y centrifugar a 15
minutos a 12000 RPM.
17. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado
y agregar un volumen =
de cloroformo, dar vortex por 10 segundos y centrifugar por 2minutos a 12000
RPM (para limpiar el ADN).
18. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado y
añadir 300 ul de
isopropanol (helado)
19.Invertir la muestra suavemente hasta que la medusa del ADN se
observe.
20.Centrifugar la muestra por 2 minutos a 10000 RPM.
21. Retirar el sobrenadante tener cuidado de no llevarse la medusa y añadir
500ul de etanol al 70%
22. Centrifugar el tubo de Eppendorff por 2 minutos a 10000 RPM y
descartar el sobrenadante, teniendo
cuidado de no perder la medusa de ADN
23. Dejar evaporar el etanol a temperatura ambiente o baño de maría seco a
37°C y suspender la medusa
de ADN en agua bidestilada.
24.Dejar la muestra en baño de maría seco a 37°C por 1 hora.
25. Cuantificar la muestra en el espectrofotómetro y dejarla en una
concentración final de 100 ng/ul.
 26.Congelar la muestra a -20°C.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA PCR

1. Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estéril para preparar la
rnaster rnix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseñada para el
objeto.

* Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la
mezcla y deberán ser mantenidos sobre hielo picado antes y después de ser usados. Al
descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente.

* Para la adición de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y

estériles y la preparación de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes.

* Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la
piel, etc.

* La cantidad de rnaster rnix a preparar debe ser calculada según el número de

tubos de reacción.

MASTER MIX (Volumen final por tubo de reacción = 25 microlitros)

Componentes del PCR

M-MIX Ci Vi Cf Vf No. R
H2O bd - 16.6 ul - 25 ul 3
Buffer 10x 2.5 ul 1x 25 ul 3
MgCl 50mm 1.5 ul 1.5mm 25 ul 3
DNTPs 25mm 0.2 ul 0.2mm 25 ul 3
Primers 10x 1 ul c/u 0.8x 25 ul 3
Taq 5u 0.15 ul 0.075u 25 ul 3
Polimerasa
ADN - 2.5 ul c/u - 25 ul 3
2. Colocar 22.5 microlitros de master mix en cada tubo de reacción (tubos eppendorf
0,2 ml). Añadir a cada uno 1 microlitro del ADN extraído.
3. Llevar los tubos al área de PCR
4. Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reacción en
caso de no usarlos inmediatamente.
 ELECTROFORESIS

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga
eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a
incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius ,
impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de
materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este
termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas ,
se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de
bajo peso molecular.
Fundamento.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un
campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee
carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente
se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas esta
gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el
solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro
lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano
debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía
cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura
mayor difusión. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren
de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un
cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya
anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos
reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas
resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El
gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas
de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero
el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,
pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un
gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que
retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de
alrededor 20.000 nucleótidos.
GEL DE AGAROSA
1. Pesar 0,4 gr de agarosa.
2. Calentar la solución hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se
riegue la misma.
3. Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55° C y agregar. Preparar el
molde del gel y verter la solución en el mismo moviendo las burbujas hacia la
orilla.
4. Colocar la peinilla en el gel y dejar que éste se solidifique, entonces retirar la peinilla
con cuidado.
5. En un pedazo de parafilm limpio colocar 4 microlitros de tinta azul por cada tubo de
reacción y mezclar con 10 microlitros de ADN amplificado en el termociclador.
6. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TAE 1X. Colocar la
mezcla obtenida en el paso 5,en cada uno de los pocillos del gel preparado
anteriormente.
7. Procederá la electroforesis a voltaje constante (90 voltios).
8. Colocar el gel en la solución Bromuro de Etidio por 5 minutos.
9. Lavar el Gel en abundante agua y observarlo en la cámara de UV.

Nest- PCR para el diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus, y

Herpes 1-2 utilizando cebadores específicos que amplifican un fragmento conocido

1ra amplificación.
Procedimiento:
1. Reacción de PCR
1 reacción de PCR
Volumen de reacción 25 uL

Componentes del PCR

M- MIX Ci Vi Cf Vf No. R
H2O bd 16.6 ul 25 ul 48.3 ul
Buffer 10x 2.5 ul 1x 25 ul 7.5 ul
MgCl 50mm 1.5 ul 1.5mm 25 ul 4.5 ul
DNTPs 25mm 0.2 ul 0.2mm 25 ul 0.6 ul
Primers ( f ) 10x 1 ul 0.8x 25 ul 3 ul
Primers ( r ) 10x 1 ul 0.8x 25 ul 3 ul
Taq 5u 0.15 ul 0.075u 25 ul 0.45ul
Polimeraza
ADN 2.5 ul 25 ul 2.5c/u

5 tubos
 CN MI M2 RH H2O

ADN uL

Notas: Descongelar los reactivos y mantenerlos a 4°C durante la preparación de la

mezcla.

El MgCI2 descongelarlo y homogeneizarlo bien mediante "vortex" antes de añadirlo en

la mezcla.

2. Condiciones de amplificación

Desnaturalización inicial 94ºC 5min

35 ciclos de: 94ºC 1min

Desnaturalización
Annealing 55ºC 1min 3. Electroforesis en gel de
Extensión 72ºC 1min agarosa al 2 %.
Extensión final 72ºC 10min • Preparación de la muestra:
4ºC. A 10 ul de producto de PCR se le
añaden 2 ul de Bromofenol azul 6x ( 0.25 % Bromofenol azul, 40 % (w/v) Sucrosa en
agua (4°C)
• Corrida: La corrida se realizara en una cámara de electroforesis submarina ,
utilizando para ello el tampón de corrida TAE 1x. a 100V
• Visualización del ADN: Se visualiza el ADN, mediante luz ultravioleta
utilizando un transiluminador.

2da amplificación

Procedimiento:
 1. Reacción de PCR

1 reacción de PCR

Volumen de reacción 25 ul

Componentes del PCR

M- MIX Ci Vi Cf Vf No. R
H2O bd 16.6 ul 25 ul 112.7 ul
Buffer 10x 2.5 ul 1x 25 ul 17.5 ul
MgCl 50mm 1.5 ul 1.5mm 25 ul 10.5 ul
DNTPs 25mm 0.2 ul 0.2mm 25 ul 1.4 ul
Primers ( f ) 10x 1 ul 0.8x 25 ul 7 ul
Primers ( r ) 10x 1 ul 0.8x 25 ul 7 ul
Taq 5u 0.15 ul 0.075u 25 ul 1.4ul
Polimeraza
ADN 2.5 ul 25 ul 17.5c/u

Mezcla
6 tubos

CN nest CN MI M2 RH+ H2O

ADN- PCR 1

- 1ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul
2. Condiciones de amplificación
Desnaturalización inicial 93ºC 5min

20 ciclos de: Desnaturalización 93ºC 1min

Annealing 55ºC 1min
Extensión 72ºC 1min

Extensión final 72ºC 10min

4ºC.

RESULTADOS:

C+ C- 066
1500pb
…
500pb
400pb
300pb C+ C- m1 m2 m3 m4 m5
1500pb
200pb
…
100pb
500pb
78pb
400pb
0pb
300pb
200pb
100pb
78pb
0pb
HSV + HSV - m1 m2 m3 m4 m5
1500pb
…
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
78pb
0pb
Las muestras 1 y 4 tienen la presencia del citomegalovirus mientras que las muestras
1,3 y 5 del herpes. Las muestras no fueron contaminadas ya que el grupo control tanto
C- Y HSV- no fueron marcadas en la escala de pb.

Investigación:
1. ¿Qué es el PCR anidado o nested PCR? Es una técnica que
comporta dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)
sucesivas, con dos pares de cebadores distintos, de tal modo que los
cebadores utilizados en la segunda PCR (internal o nested PCR)
flanqueen una región genómica amplificada en la primera reacción
en cadena (external PCR), como ilustra la figura. El método de la
PCR interna se utiliza sobre todo cuando se tienen pequeñas
cantidades del ADN de interés o cuando se quieren evitar las
amplificaciones inespecíficas que a veces se observan con la PCR
clásica, dado que en cada etapa se realiza un número menor de ciclos
(las PCR de muchos ciclos conllevan a menudo errores de lectura y
de síntesis, debido, entre otras cosas, a la falta de fidelidad de la
polimerasa Taq). Además, si el producto de la primera PCR es el
resultado de una amplificación inespecífica, el segundo par de
cebadores internos no reconocerá la secuencia complementaria, y
por consiguiente no habrá amplificación.
2. ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los
primers? Explique
La temperatura de annealing debe ser de aproximadamente 5°C menor que la
temperatura de fusión pero en algunos otros experimentos debe ser de hasta menos de
15 °C que la temperatura de fusión. Si la temperatura de annealing es demasiado baja
o demasiado alta, los primers pueden hibridar parcialmente sin incluir el extremo 3', y
estos híbridos no serán extendidos. Sin embargo, si la hibridación parcial incluye el
extremo 3', sí habrá elongación.
Evitar en lo posible la utilización de primers que tengan en su secuencia más de 3 ó 4
Gs ó Cs
seguidas. Los primers deberán tener, al menos, 18 bases para asegurarnos de que
hibriden con el ADN aecuenciar. Si es posible es interesante anclar los primers con
GCs en 3´.Utilizar primers con una Tm por encima de 500C . Para primers con un
contenido en GCs
menor del 50%, puede ser necesario extender el oligo más de 18pb para conseguir
una Tm por
encima de 500C. La utilización de primers más largos de 18 pb, minimiza la
posibilidad de hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto. Evitar la
utilización de primers con secuencias que formen estructuras
secundarias,especialmente en el extremo 3´, o que puedan hibridar formando dímeros
intercatenarios. No emplear primers con mismatches, ni primers que hibriden en más
de un sitio en la secuencia.
3. Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR?
Es necesario usar material que sea de plástico descartable y estéril que este
certificado para el uso en cultivos (punteras y microtubos). Usar micropipetas
exclusivamente para la manipulación de ciertos tipos de muestra.
Todo material que no sea descartable debe ser esterilizado.
El uso siempre de material nuevo es indispensable para evitar el contagio y
contaminación entre las muestras, y evitar el contagio hacia la persona que esta
trabajando (ej. Si se esta trabajando con algún tipo de virus muy fuerte como el
VIH).También para no contaminar la muestra que contiene DNA se debe cambiar las
puntas de las micro pipetas al utilizar cada sustancia para evitar problemas de
contaminación por formación de aerosoles.
4. Herpes 1-2
5. Citomeglovirus
6. Toxoplasma gondii
7. Contaminación por aerosoles
BIBLIOGRAFÍA
León J., García J.M. 1992. Manual de Genética Molecular. SÍNTESIS Ed. Madrid.
Newton, C.R; Graham, A. 1994. PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford,
United Kingdom.
Strachan, J., Read, A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers
Limited, UK.
Thompson, N.W; Mclnnes, R.R; Willard, H.F. 1996. Genetics in
Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A.
Verma, R; Babu, A. 1995. Human Chromosomes. Principies and Techniques. McGraw.
Philadelphia.