Caracterizacin de Klebsiella pneumoniae productora de la -lactamasa SHV-5, en una unidad de cuidados intensivos

Characterization of SHV-5 -lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in an intensive care unit

Vernica Andrade, M en CI !rupo de "esistencia #acterianaII $es%s Silva, &r en C'I

I

Instituto Nacional de Salud Pblica, Centro de Investigacin sobre Enfermedades Infecciosas. Cuernavaca, Morelos, Mxico II ru!o de "esistencia #acteriana$ %u& Elena Es!inosa de los Monteros, 'r en C, (ernica )imne&, #iol. *os!ital Infantil de Mxico +ederico me&. Mxico, '+, Mxico. Carlos Cervantes, 'r en C. Instituto de Investigaciones ,u-mico.#iolgicas, /niversidad Mic0oacana, Morelia, Mic0oac1n, Mxico

"(S)M(* +#$(,IV+- Caracteri&ar molecularmente los aislamientos de Klebsiella pneumoniae obtenidos de !acientes !edi1tricos 2 del !ersonal de salud en la unidad de cuidados intensivos de un 0os!ital de tercer nivel de atencin en la Ciudad de Mxico, 'istrito +ederal. MA,("IA. / M0,+&+S- Se anali&aron 34 aislamientos de Klebsiella pneumoniae colectadas de un brote durante el mes de 5unio de 3667, oc0o de !acientes 2 siete de !ersonal del *os!ital Infantil de Mxico. %os aislamientos fueron caracteri&ados !or electroforesis en gel de cam!os !ulsados 8E CP9, am!lificacin a&arosa del !olimorfismo de :'N !or reaccin en cadena de la !olimerasa 8::P'.PC"9, 2 seroti!ificacin, isoelectroenfo;ue de .lactamasas 2 secuenciacin nucleot-dica de !roductos de la reaccin en cadena de la !olimerasa. "(S).,A&+S- El seroti!o !redominante fue el 73 2 correlacion con los !erfiles de ::P'.PC" 2 E CP en 33 de los 34 aislamientos. Se identific una clona !redominante !roductora de S*(.4 con una alta letalidad. C+*C.)SI+*(S- %as tcnicas de biolog-a molecular fueron 0erramientas mu2 tiles en la caracteri&acin de la clona de K. pneumoniae identificada en !acientes 2 el !ersonal 0os!italario, ;ue sugirieron una !osible transmisin cru&ada. Estos resultados ilustran ;ue se debe a!o2ar el fortalecimiento de los !rogramas de control !ara evitar la diseminacin de infecciones nosocomiales en esa unidad en estudio. El texto com!leto en ingls de este art-culo est1 dis!onible en$ <7=eng

1ala2ras clave- Klebsiella pneumoniae> tcnica de ti!ificacin bacteriana> electroforesis en gel de cam!o !ulsado> reaccin en cadena de la !olimerasa> tcnica del :'N !olimorfo am!lificado aleatorio> Mxico

A#S,"AC, +#$(C,IV(- ?o !erform t0e molecular c0aracteri&ation of Klebsiella pneumoniae isolates from !ediatric !atients and 0ealt0 care @orAers at t0e intensive care unit of a tertiar2 care 0os!ital in Mexico Cit2. MA,("IA. A*& M(,H+&S- +ifteen Klebsiella pneumoniae isolates collected during an outbreaA in )une 3667 @ere anal2&ed> eig0t @ere from !atients and seven from 0ealt0 care @orAers of MexicoBs C0ildrenBs *os!ital. C0aracteri&ation of isolates @as carried out b2 !ulsed field gel electro!0oresis 8P+ E9, random am!lified !ol2mor!0ic 'N: !ol2merase c0ain reaction 8":P'.PC"9 and serot2!ing, .%actamase isoelectric focusing 8IE+9, and nucleotide se;uencing of PC" !roducts. "(S).,S- Serot2!e 73 @as !redominant and correlated @it0 genomic finger!rints of ":P' and P+ E in 33 of 34 isolates. Cne S*(.4.!roducer !redominant clone @it0 a 0ig0 case.fatalit2 rate @as identified. C+*C.)SI+*S- Molecular biolog2 tec0ni;ues are useful tools to c0aracteri&e t0e K. pneumoniae clone isolated from !atients and 0ealt0 care @orAers, suggesting !otential cross.transmission. ?0ese data call for strengt0ening control !rograms to !revent dissemination of nosocomial infections in t0e studied 0os!ital. ?0e Englis0 version of t0is !a!er is available at$ 0tt!$==@@@.ins!.mx=salud=<7=eng 3e45ord- Klebsiella pneumoniae> bacterial t2!ing tec0ni;ues> electro!0oresis, gel !ulsed.field> !ol2merase c0ain reaction> random am!lified !ol2mor!0ic 'N: tec0ni;ue> Mexico

Klebsiella pneumoniae es un !atgeno o!ortunista coloni&ador de !iel 2 mucosas de !acientes 0os!itali&ados ;ue !ueden !resentar infecciones invasoras como bacteriemias o se!ticemias.3 /sualmente las manos contaminadas del !ersonal son el ve0-culo res!onsable de brotes e!idmicos.D %as .lactamasas de es!ectro extendido 8#%EE9 son en&imas derivadas de las familias ?EM 2 S*(, codificadas en !l1smidos, ;ue 0an substituido de 3 a E amino1cidos cercanos al sitio activo confiriendo resistencia a a&treonam, cefotaxima 2 cefta&idima.E En Mxico existen algunos re!ortes ;ue muestran a K. pneumoniae como uno de los !rinci!ales organismos causantes de infecciones intra0os!italarias, ;ue causan niveles significativos de morbilidad 2 mortalidad.<.7 En este traba5o se describen las caracter-sticas moleculares de K. pneumoniae !roductora de #%EE ti!o S*(.4, entre !acientes de la unidad de cuidados intensivos neonatal 2 el !ersonal de un 0os!ital !edi1trico de la Ciudad de Mxico.

Material 4 m6todos

Cepas bacterianas. Se anali&aron 34 aislamientos de K. pneumoniae colectados de un brote durante el mes de 5unio de 3667 en la /nidad de Cuidados Intensivos Neonatal 8/CIN9, !rocedentes del *os!ital Infantil de Mxico. %as caracter-sticas de los aislamientos se muestran en el cuadro I. %as ce!as fueron designadas con un nmero arbitrario, seguido de la letra N 8neonato9 o P 8!ersonal9. %os aislamientos fueron identificados con el sistema automati&ado MicroScan 8':'E, combo DF9. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana y confirmacin en la produccin de lactamasas de espectro extendido (BLEE). %a concentracin m-nima in0ibitoria 8CMI9 se determin !or el mtodo de dilucin en !laca, 2 la !rueba confirmatoria !ara la !roduccin de #%EE se reali& de acuerdo con las gu-as ;ue describe el National Committee for Clinical %aborator2 Standards 8/S:, NCC%S9.G Aislamiento de pl smidos y transferencia de la resistencia. %a extraccin de !l1smidos se efectu !or el mtodo de Hieser.I %a transferencia de la resistencia a cefotaxima 2 am!icilina se 0i&o segn el mtodo de Miller ),6 usando como ce!a rece!tora a Esc!eric!ia coli )4E.D 8+., pro, met, "if r9, seleccionando en forma inde!endiente en agar %uria su!lementado con rifam!icina 83FF Jg=ml9 en combinacin con cefotaxima 83 Jg=ml9 o con am!icilina 83FF Jg=ml9. "erotipificacin. %os aislamientos fueron ensa2ados !or aglutinacin en micro!laca con GD antisueros es!ec-ficos obtenidos en el %aboratorio de #acteriolog-a Intestinal del *os!ital Infantil de Mxico. %a !urificacin de los antisueros se desarroll !or el mtodo de Ed@ards 2 +ife.3F Amplificacin a#arosa del polimorfismo de A$% por la reaccin en cadena de la polimerasa (PC&' por sus si(las en in(l)s) (AAP$-PC&). El :'N total de los 34 aislamientos fue am!lificado con el oligonucletido "EPD.'t, segn lo descrito !or Eisen ' 2 colaboradores.33 *soelectroenfo+ue (*E,) y bioensayo. El !atrn de bandas de las .lactamasas fue obtenido de acuerdo a lo descrito !or Matt0e@ 2 colaboradores.3D %a identificacin de las #%EE se determin mediante el bioensa2o, segn Silva 2 :guilar.3E Electroforesis en (el por campos pulsados (E-CP). Se em!le el mtodo descrito !or Haufmann 2 colaboradores,3< digerido el :'N con la en&ima .baI 8 ibco, #"%, ait0ersburg, Md.9> los fragmentos obtenidos se se!araron en un sistema C*E+. '"III 8#io."ad, *ercules, California, Estados /nidos de amrica KE/:L9. El !atrn de bandas fue clasificado de acuerdo con los criterios de ?enover 2 colaboradores.34 Amplificacin por la PC& de bla"/0' y secuenciacin nucleot1dica. Para am!lificar el gene blaS*( se utili&aron los oligonucletidos SE4 2 S#E descritos !or Silva 2 colaboradores, DFF3.4 %os !roductos de la PC" fueron secuenciados con el e;ui!o :#I P"ISM EGG.3I, con el Hit ?a; +S $ye terminator Cycle "e+uencin(. %a conversin de la secuencia de nucletidos a amino1cidos se reali& con el !rograma 2ranslate tool 80tt!$==@@@. ex!as2.c0=tools=dna.0tml9. %os alineamientos mlti!les de los nucletidos 2 amino1cidos se efectuaron en el !rograma Clustal 3 del !a;uete C 8-enetics Computer -roup9 usando como secuencia de referencia blaS*(.337 8nmero de acceso a enbanA :+I<II4F9.

"esultados

Cepas bacterianas. %os 34 aislamientos de K. pneumoniae tuvieron un fenoti!o de resistencia a aminoglucsidos 2 cuando menos a una cefalos!orina de tercera generacin. Cc0o aislamientos corres!ondieron a !acientes con infeccin nosocomial 2 siete de co!rocultivos obtenidos del !ersonal !aramdico 8enfermeras 2 mdicos9 ;ue !ermaneci en contacto con los !acientes. %a letalidad en estos !acientes fue de 4FM 8< de I !acientes con aislamiento !ositivo de K. pneumoniae !roductor de #%EE9 8cuadro I9. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. %os aislamientos anali&ados fueron susce!tibles a cefoxitin, ci!rofloxacina e imi!enem 2 resistentes a amiAacina 2, cuando menos, a una cefalos!orina de tercera generacin, exce!to los aislamientos 3ED6N, 3ED7N, 3EEGN 2 3E<FP, 8este ltimo obtenido del !ersonal9. Este fenoti!o suger-a ;ue las ce!as fuesen !roductoras de #%EE. :l determinar la CMI !ara cefotaxima 2 cefta&idima en combinacin con 1cido clavul1nico 8in0ibidor de . lactamasas de clase :9, la CMI disminu2 de I a 3F veces, confirmando la !roduccin de #%EE en los aislamientos anali&ados de acuerdo con lo indicado !or el National Committee for Clinical %aborator2 Standars 8NCC%S934 8cuadro I9. An lisis molecular de los aislamientos por serotipificacin' amplificacin a#arosa del polimorfismo del A$% (AAP$) y electroforesis en (el de campos pulsados (E-CP). Se identificaron cuatro seroti!os, el ma2oritario corres!ondi al seroti!o 73 ;ue inclu2 33 ce!as, de las cuales seis !ertenecieron a !acientes 2 cinco al !ersonal. %os seroti!os 7<, 4< 2 <G inclu2eron un aislamiento cada uno> el aislamiento 3E<FP no fue !osible ti!ificarlo 8cuadro I9. El segundo criterio fue el ::P' ;ue inclu2 cuatro gru!os, el ma2oritario fue el I ;ue com!rendi a cinco aislamientos cl-nicos 2 a seis del !ersonal> el gru!o II inclu2 dos aislamientos cl-nicos 2 los gru!os III 2 I( inclu2eron un aislamiento de !ersonal 2 uno cl-nico, res!ectivamente 8cuadro I9. El tercer criterio em!leado 8E CP9 estuvo conformado !or una clona ma2oritaria : con tres subti!os 8:3 a :E9, ;ue inclu2eron seis aislamientos cl-nicos 2 seis aislamientos del !ersonal, adem1s de tres clonas no relacionadas ;ue corres!ondieron dos a !acientes 83ED7N 2 3EEEN9 2 uno a !ersonal mdico 83E<FC9, 8cuadro I 2 figura 39.

Perfil de pl smidos y transferencia de la resistencia. %os aislamientos !resentaron de 3 a E !l1smidos con !esos moleculares de N4<, 7F 2 33F Ab, aun;ue en ningn caso fue !osible transferir, !or con5ugacin bacteriana, la resistencia a cefotaxima o am!icilina. *E, de -lactamasas y deteccin de acti4idad de cefotaximasa. Cnce de los ;uince aislamientos ex!resaron .lactamasas con !unto isoeclctrico 8!I9 de 4.<, G.7 2 I.D 8seis aislamientos cl-nicos 2 cinco de !ersonal9> esta ltima en&ima tuvo la actividad de cefotaximasa 8cuadro I9. %os aislamientos susce!tibles a .lact1micos corres!ondieron a una ce!a de origen cl-nico 83ED6N9 2 dos al !ersonal 83EEGP 2 3E<FP9, las cuales ex!resaron .lactamasas con !I de 4.< 2 G.7. El aislamiento 3ED7N no fue !roductor de .lactamasas. Caracteri#acin molecular de las -lactamasas5 amplificacin y secuencia nucleot1dica. 'os aislamientos, 3EEEN 2 3EE4P, fueron seleccionados al a&ar como re!resentantes de las dos !oblaciones de aislamientos cl-nicos 2 del !ersonal. %os resultados de biolog-a molecular indicaron ;ue la .lactamasa con !I de 4.< corres!ondi a la familia ?EM, la de !I de G.7 a S*(.3, 2 la de !I de I.D a la variante S*(.4 8#%EE9.

&iscusin

El desarrollo de las tcnicas de ti!ificacin clonal 0a !ermitido detectar el origen 2 la ruta de e!idemias 0os!italarias, as- como definir estrategias de control 2 eliminacin de la infeccin.3G %os tres criterios ;ue se em!learon !ara determinar la relacin clonal entre los aislamientos mostraron una correlacin mu2 estrec0a> de esta forma se !udo identificar a una clona con tres subti!os como la res!onsable de la infeccin causada en los !acientes 2 la coloni&acin en el !ersonal mdico indicando una !osible diseminacin en forma cru&ada, como 2a se 0a descrito en es!ecies de "tap!ylococcus 2 enterobacterias como E. coli' "erratia marcsecens 2 K. pneumoniae como los !rinci!ales agentes etiolgicos de la infeccin.3I,36 %a ma2or-a de los aislamientos ex!resaron dos ti!os de en&imas, la .lactamasa ?EM.3 2 dos del ti!o S*(. Por otra !arte, estos datos correlacionan con el !atrn electrofortico de las .lactamasas, donde la segunda en&ima 8!I de I.D9 tiene solamente la actividad de cefotaximasa en el bioensa2o. En relacin con la susce!tibilidad con los diferentes antibiticos .lact1micos, los valores de CMI !ara cefotaxima 2 cefe!ime !resentaron cierta variabilidad ;ue !uede ex!licarse mediante la !osible ad;uisicin de otros mecanismos de resistencia a antibiticos .lact1micos, tales como la alteracin en la !ermeabilidad mediado !or O!orinasO o la ad;uisicin de bombas de ex!ulsin. DF :un;ue la ma2or-a de los aislamientos estudiados contienen al menos un !l1smido de 33F, 7F o N4< Ab, sin embargo, no se logr la transferencia !or con5ugacin bacteriana. Se 0a descrito a K. pneumoniae como uno de los !rinci!ales agentes causantes de bacteriemias nosocomiales.3,<,4 En este estudio se describen siete casos de bacteriemias secundarias 2 aun;ue no se tienen datos sobre los sitios de infeccin !rimaria involucrados en la generacin de las bacteriemias, se sugiere ;ue las infecciones endovasculares !odr-an asociarse con los casos estudiados, debido a una !osible contaminacin de soluciones !arenterales 2 descuido de las medidas as!ticas em!leadas en la insercin 2 mantenimiento de catteres vasculares. Estas ser-an las !rinci!ales causas de la v-a de entrada de este agente bacteriano 2 !osiblemente los res!onsables de una diseminacin vertical clonal.D3, DD %os resultados de este estudio, aun cuando no son recientes, !onen de manifiesto ;ue en la sala de la /CIN de esta institucin debe !racticarse !ermanentemente una serie de medidas tales como$ establecer el nmero de !acientes cr-ticos atendidos !or el !ersonal de enfermer-a, crear !rogramas continuos de tcnicas de lavado de manos, establecer !rotocolos ;ue !ermitan detectar la concentracin bactericida de los antis!ticos em!leados en los !rocedimientos relacionados con !acientes 2 !romover el uso racional de antibiticos !ara evitar el surgimiento 2 diseminacin de bacterias multirresistentes.

Agradecimientos
Se agradece a la #iloga P #ecerra 2 a la ?cnica ? "o5as su excelente asistencia tcnica.

"eferencias

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Solicitud de so2retiros 'r. )ess Silva 'e!artamento de "esistencia #acteriana Instituto Nacional de Salud Pblica, Centro de Investigacin sobre Enfermedades Infecciosas :venida /niversidad 744, colonia Santa Mar-a :0uacatitl1n 7D4FI Cuernavaca, Morelos, Mxico Correo electrnico 5silvaYcorreo.ins!.mx +ec0a de recibido$ D de diciembre de DFFE +ec0a de a!robado$ 3 de se!tiembre de DFF<

Este trabajo recibi apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (1892N-P, !9 8-" y #1$12-%&'