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1. Histria do Instituto de Biocincias e do departamento de Botnica.

O Instituto de Biocincias (IB) foi criado em 1969 com a Reforma Universitria. Da sua constituio faziam parte os Departamentos de Biologia, Botnica, Fisiologia e Zoologia, estabelecidos em 1934 na antiga Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras, e nela fundados quando da criao da Universidade de So Paulo. O Instituto de Biocincias recebeu, em 1970, no apenas os membros dos referidos departamentos, mas tambm professores de disciplinas afins de outras faculdades, especialmente os botnicos da antiga Faculdade e Bioqumica e os geneticistas da Faculdade de Medicina. Alm dos quatro departamentos iniciais, foi criado em 1976, pelo Conselho Universitrio, o Departamento de Ecologia Geral, reunindo os docentes do IB mais voltados aos estudos ecolgicos. O atual Curso de Cincias Biolgicas, oferecido pelo IB, teve sua origem no curso de Histria Natural da Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras. Alm de suas atividades didticas, o Instituto tem uma longa tradio de pesquisa, iniciada nos departamentos j em 1934 por seus fundadores, Contou, no passado, com valiosa cobertura financeira de entidades estrangeiras e continua recebendo importantes auxlios,

principalmente de entidades nacionais. O departamento de botnica foi fundado em 1934 pelo prof. Felix Kurt Rawitscher, renomado botnico alemo. O prof. Felix ao ser enviado por Theodoro Ramos a organizar o Departamento de botnica da Faculdade de Filosofia, Ciencias e Letras, da Universidade de So Paulo, de recente criao, no hesitou em aceitar. Aqui chegou em 30 de junho de 1934, em companhia dos professores Breslau e Rheinboldt. Nesta ocasio a Faculdade de Filosofia, Ciencias e Letras estava instalada, a ttulo provisrio na Faculdade de Medicina, onde Rawitscher iniciou a organizao do Departamento de botnica. Como primeiros auxiliares encontrou D. Maria Ignes da Rocha e Silva e o Sr. Alssio Pdula. Pde logo contratar os servios de jardineiro do Sr. Georg Seyfried, horticultor diplomado na Alemanha, que organizou rapidamente um pequeno mas excelente jardim, onde nunca faltaram as plantas necessrias ao ensino e a pesquisa.
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Como primeiro assistente, Rawitscher fez vir da Alemanha o Doutor Karl Arens, do Instituto de Botnica de Colnia. Aguns anos aps Arens acitou o cargo de Professor da Faculdade Nacional de Filosofia, sendo substitudo pelo Sr. Hermann Kleerkoper. Logo, por sua vez Kleerekoper deixou o Departamento de botnica, por um cargo que lhe ofereceu a diviso de Caa e Pesca, indo depois trabalhar na MacMaster University, no Canad. O professor Rawitscher se ocupou desde logo com a formao de discpulos brasileiros, os quais eventualmente deveriam suced-lo. Como no Brasil faltavam livros bsicos de boa qualidade , o prof. Rawitscher comeou logo a preparar o pequeno livro Introduo ao Estudo de Botnica, que teve sua primeira edio publicada em 1948, prestando a poca excelentes servios, no s aos seus alunos, mas tambm ao professores secundrios. Desse livro o prof. Rawitscher eliminou todas as questes meramente descritivas, que sobrecarregam desnecessariamente os programas das escolas. Ciente que um bom ensino universitrio s pode ser ministrado por professores que se dediquem pesquisa, o Prof. Rawitscher procurou, desde sua chegada ao Brasil, organizar laboratrios com os requisitos mnimos, e j em 1937 o Departamento de Botnica publicava o seu Boletim n 1, o segundo impresso pela Faculdade de Filosofia. Contendo trs trabalhos: um do Prof. Rawitscher intitulado Experincias sobre a simetria de folhas, dois do Prof. Arens o primeiro sobre a Fotossntese de plantas aquticas e o segundo sobre o Mecanismos de Infeco de determinado fungo. Ao iniciar suas excurses para tomar contato com diversos tipos de vegetao do pas, o Prof. Rawitscher logo se apercebeu do grande manancial de problemas que aguardavam soluo no campo da fitoecologia. Comeou a reunir no Departamento a bibliografia necessria, muito dispersa e de difcil encontro. A fim de facilitar aos que desejassem se iniciar na investigao de assuntos da nossa ecologia, redigiu os Problemas de Fitoecologia com consideraes especiais sobre o Brasil Meridional, em duas partes, publicadas respectivamente, em 1942 e 1944 nos Boletins de Botnica nmeros 3 e 4: a primeira dedicada aos fatores Temperatura e gua; a segunda ao estudo da luz, oxignio, gs carbnico, ventos e solos.

De seus estudos concluiu que freqentemente a gua o fator limitante da vegetao. E em 1942 salientou a importncia para o pas, das pesquisas sobre a economia dgua de nossa vegetao, em um estudo publicado nos anais da Academia Brasileira de Cincias. Deve-se, pois a Rawitscher o mrito de ter introduzido no Brasil esta linha de pesquisa que se tem revelado to frtil em resultados de valor no apenas acadmico, mas indispensveis ao planejamento da agricultura e da silvicultura em bases cientficas. Acompanhando de perto o desenvolvimento de seus discpulos, o Prof. Rawitscher interessou-os de tal forma na pesquisa de problemas ligados ao balano d'gua das plantas, que dois deles, Ferri e Rachid, aps publicarem com ele o primeiro trabalho de fitoecologia realizado no Brasil, com bases em dados experimentais obtidos no campo (Profundidade dos solos e vegetao em campos cerrados do Brasil Meridional, Anais da Academia Brasileira de Cincias, 1943), trabalharam para os seus doutoramentos em 1944 e 1947, respectivamente, em balano d'gua das plantas do cerrado. Mais trs doutoramentos se realizaram no Departamento de Botnica, sob a orientao do Prof. Rawitscher: o de Berta Lange de Morretes, que estudou o ciclo evolutivo do fungo Pilacrella delectans Mller, em 1948; o de Erika Rawitscher, que estudou criticamente, em 1949, a aplicabilidade da potumetria em medidas de transpirao; e o de Aylthon Brando Joly, dedicado ao conhecimento da flora e da fitogeografia da regio do Butantan, em 1950. Nos anos subseqentes Rawitscher, cada vez mais empenhado no estudo de questes ligadas nossa ecologia, publicou numerosos trabalhos, divulgando no exterior os resultados obtidos por ele e por seus discpulos. Com isso conquistou para o Departamento de Botnica uma excelente reputao. Reflete essa verdade no s ter sido Rawitscher escolhido pela UNESCO para presidir o "International Committee for Tropical Ecology", como ainda ter o Departamento, recebido logo aps cientistas do renome de Went e de Stocker, interessados nos problemas aqui investigados, e jovens que buscam aprimorar seus conhecimentos.

2. Informaes gerais

O Departamento de botnica fica no Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo (IBUSP) localizado na Rua do Mato, 277 caixa postal 11461- CEP- 05422-970-Cidade Universitria. A aluna estagiria Liliane da Costa Santos, que mora na Viela dos Navegantes nmero 30, no bairro cantinho do cu SP - CEP: 04849510 - RA: T342HB-3. O estgio teve durao de 05 meses a comear de abril de 2013 terminando em setembro de 2013. Foi realizado no Departamento de Botnica do Instituto de Biocincias, representado por seu chefe, Professora Doutora Helenice Mercier.

3. Recursos administrativos

O laboratrio de fotoqumica conta com 3 funcionrios: um auxiliar de laboratrio, um tcnico de laboratrio e um especialista em bioqumica. Apresenta ainda 4 professores titulares. O Instituto de Biocincias legalmente representado pelo docente Diretor do Instituto. O rgo de deliberaes superiores do IB um colegiado chamado Congregao que rene representantes de docentes das vrias categorias: Professor Doutor, Professor Associado e Professor Titular. Os departamentos de ensino esto subordinados Direo do Instituto de Biocincias, acatando as deliberaes normativas e de organizao da Congregao. No caso do Instituto de Biocincias, so 5 os departamentos: Gentica e Biologia Evolutiva, Fisiologia Geral, Zoologia, Botnica e Ecologia. Nos departamentos o rgo deliberativo o Conselho de cada departamento. O Conselho tambm um colegiado formado por professores que representam as categorias docentes. A Estrutura hierrquica do Departamento tem como gestor o Professor Chefe de Departamento. A ele esto subordinados os demais docentes do departamento, assim como funcionrios tcnicos e administrativos.

Os laboratrios de pesquisa esto subordinados s deliberaes do Conselho do Departamento de Botnica e ao Chefe do Departamento. Os laboratrios so administrados por um docente responsvel pelo laboratrio, e possui outros docentes agregados a ele em virtude das linhas de pesquisa prprias. Nos laboratrios de pesquisa h docentes, alunos, pesquisadores e funcionrios.

Figura 1. Fluxograma das rotinas vivenciadas. Fonte: Elaborado pelo prprio autor.

4. Recursos tcnicos

Material botnico As espcies estudadas esto descritas na tabela 1. Os vouchers foram depositados no Herbrio do Instituto de Pesquisas Jardim Botnico do Rio de Janeiro-RJ. A identificao do material foi confirmada pela Profa. Dra. Elsie F. Guimares.

Para algumas espcies as folhas foram fragmentadas no ato da coleta e armazenadas em tubos plsticos contendo slica com indicador de umidade, sendo assim mantidas at a ocasio da extrao do DNA. Para outras espcies as folhas frescas foram coletadas de espcimes cultivados in vivo no viveiro de mudas do Laboratrio de Qumica de Produtos Naturais (LQPN), Instituto de Qumica USP.

Tabela 1. Espcies de Piper utilizadas para anlises respectivos vouchers, local de coleta e seo. Espcies Voucher Local de coleta P. tuberculatum K-169 IQ-USP P. richardiaefolium K-593 Santa Teresa-ES P. hostmmanianum K-713 Manaus-AM P. hostmmanianum cf K-1598 Manaus-AM P. aduncum K-1691 Mateiros-TO P. fuligineum cf K-1689 Mateiros-TO P. hispidum K-442 IQ-USP P. crassinervium K-091 IQ-USP P. gaudichaudianum K-031 IQ-USP P. amplum cf K-1372 Ubatuba-SP P. marginatum K-223 IQ-USP P. callosum K-161 IQ-USP P. regnellii K-242 IQ-USP Pp. solmsianum K-487 IQ-USP Fonte: Elaborado pelos autores.

moleculares, com os Seo Macrostachys Macrostachys Radula Radula Radula Radula Radula Radula Radula Radula Radula Schilleria Schilleria Schilleria

Extrao de DNA e amplificao O trabalho de extrao de DNA, amplificao e sequenciamento foi realizado no Laboratrio de Fitoqumica e Sistemtica Molecular do Departamento de Botnica do Instituto e Biocincias da Universidade de So Paulo. Para extrao de DNA foi utilizado o kit e o protocolo da NUCLEO SPIN PLANT II da MACHEREY-NAGEL - MN. Para verificar a qualidade do DNA adquirido foi realizado eletroforese em gel de agarose 1% e visualizado em transiluminador de luz UV. A amplificao da regio ITS, foi realizado com base nos procedimentos de Berry et al. (2005). Os iniciadores utilizados foram ITS4 (TCC TCC GCT

TAT TGA TAT GC) e ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG) (White et al., 1990). A amplificao foi realizada com uma reao de PCR com volume total de 50L utilizando um termociclador. Os componentes da reao foram: 10 L de tampo de amplificao Go Taq; 2 L de dNTPs 2 mM; 0,5 L do iniciador reverso (10 M); 0,5 L do iniciador direto (10 M); 0,25 L da enzima Taq DNA polimerase; 2 L de PVP 1 %; 32,75 L de gua milliQ e 2 L de DNA molde diludo de acordo com a concentrao inicial obtida. A programao utilizada para amplificao foi: 94C por 2 minutos + 40 ciclos de (94C por 1 minuto, 50C por 2 minutos aumentando 5 segundos por ciclo, 72C por 1 minuto e 45 segundos) + 4C . Purificao e sequenciamento O produto, quando verificado xito da amplificao com a tcnica de eletroforese, foi purificado com a utilizao do kit de purificao de PCR GFX Amersham Bioscience. Na reao de sequenciamento, foram utilizados dois iniciadores (primers), os mesmos da regio correspondente ao ITS, na concentrao de 10M cada. Para cada amostra de DNA purificado, foi identificado 2 tubos para PCR um para cada iniciador. Em cada um dos tubos foi acrescentado: 4,75 L de gua milliQ; 0,25 L do iniciador; 3L do produto purificado (DNA) e 2 L de BigDye Terminator. O volume final de reao de amplificao foi de 10 L. O programa empregado para a amplificao em termociclador foi: 40 ciclos de 96C, 10 segundos; 51C, 20 segundos; 60C, 4 min; 4C . Aps a reao de amplificao para sequenciamento, foi adicionado aos tubos de PCR 90L de isopropanol 70% e depois o contedo foi transferido para um tubo eppendorf de 1,5mL, incubado por 20 minutos, no escuro, em temperatura ambiente e centrifugar a 13000 rpm por 25 minutos. O sobrenadante foi descartado com o auxlio da pipeta e adicionado 200L de etanol 70% (sem perturbar o pellet), com posterior centrifugao a 13000 rpm por 5 minutos. As sequncias foram complementadas e alinhadas em computador PC, atravs do programa BioEdit. Foi organizado uma matriz a partir das

sequencias alinhadas sendo analisada atravs do critrio da mxima parcimnia usando-se o programa MEGA 5. Foi construda uma rvore de consenso a partir das rvores mais parcimoniosas. O consenso estrito foi utilizado por apresentar os grupos

monofilticos que coincidem em todas as rvores mais parcimoniosas

Resultados e discusso Como intuito de fazer sequenciamento, foi realizado primeiramente a extrao do DNA das amostras coletadas. A Figura 1 apresenta um exemplo de anlise por eletroforese dos resultados da extrao utilizando o kit e o protocolo da NUCLEO SPIN PLANT II da MACHEREY-NAGEL MN. Foi observado que a extrao se mostrou efetiva, pois as bandas esto ntegras, com pouco ou nenhum rastro indicando menor degradao. As amostras utilizadas para as amplificaes foram diludas em gua Miliq de acordo com a qualidade do seu DNA. Na eletroforese da amplificao, foi possvel observar que as bandas amplificadas foram detectadas em alturas diferentes. Isso ocorre devido ao nmero de pares de bases da regio analisada, significa que quanto mais perto do poo maior o nmero de pares de bases (Figura 2).

Figura 1. Anlise por eletroforese do DNA extrado das amostras de Piper. Fonte: Elaborado pelos autores.

Figura 2. Anlise por gel de agarose 1% das amostras amplificadas. Fonte: Elaborado pelos autores.

Os resultados da anlise das sequncias de ITS foram bastante satisfatrios para inferncia filogentica, visto que essa regio tem sido amplamente utilizada na anlise filogentica para o nvel de espcie e dados indicam uma resoluo robusta dentro Piper (Figura 3). Jaramillo et, al.1 afirmaram que as reconstrues filogenticas com base de sequncias do cloroplasto, como Matk e Trnk, apresentaram uma baixa resoluo em Piper, no entanto a regio ITS tem variao suficiente para designar as espcies a que clado pertencem. Este resultado sugere que novos marcadores nucleares devem ser desenvolvidos para aumentar a compreenso das relaes dentro Piper. O gene ITS apresenta o maior nmero de caracteres constantes e informativos de anlise. Pode-se novamente confirmar o monofiletismo do gnero, sendo possvel observar clados bem sustentado sem politomia. Um grande clado (Radula) reuniu um grupo com duas espcies de mata atlntica (P. aduncum e P. fuligineum cf) sendo do estado de Tocantins e outro grupo com duas espcies da Amaznia (P. hostmmanianum cf , P. hostmmanianum). Trs espcies (P. callosum, P. regnellii e P. solmsianum) de mata atlntica constitui o clado Schilleria. Outras duas espcies (P. tuberculatum e P. richardiaefolium) formou o clado Macrostacys que muito rica em espcies da regio da Neotropica2. Foi observado que a formao dos clados entre as espcies analisadas de Piper corresponde a distribuio geogrfica das mesmas no Brasil.

Figura 3. rvore mais parcimoniosa baseada em ITS de sequncias de Piper.

Saururus

cernuus foi usada como grupo externo. Barras verticais indicam sees do gnero Piper e chaves relacionam a distribuio geogrfica das espcies . Fonte: Elaborado pelos autores com auxlio do software MEGA 5.

Esses dados corroboram dados da literatura que relatam sobre estudos filogenticos de Piper, com base em dados morfolgicos. Jaramillo et, al.1 realizaram uma anlise cladstica de Piper baseado na morfologia floral. Os autores comprovaram a monofilese do gnero, o que foi observado tambm neste trabalho, baseado em dados moleculares. Outro aspecto referente associao dos dados moleculares com caracteres qumicos, com intuito de tentar inferir sobre as relaes filogenticas entre as espcies de Piper. Yoshida3 verificou que os perfis qumicos podem ser utilizados para analisar a relao natural entre as espcies de Piper. A reconstruo dos caracteres qumicos combinada com anlise molecular evidenciou a

proximidade filogentica de espcies que produzem e acumulam uma classe especifica de metablitos, indicando que est uma ferramenta importante a ser considerada nos critrios de classificao das espcies. No entanto, a classificao no deve ser baseada somente nos caracteres qumicos, embora possam ser considerados caracteres robustos para a classificao de Piper, eles devem ser usados em conjunto com outros caracteres como moleculares, morfolgicos e biogeogrficos. A Figura 4 apresenta a reconstruo dos caracteres qumicos em Piper sobre a rvore filogentica mais parcimoniosa baseado na regio ITS. Essa anlise fornece evidncias robustas para dar suporte aos clados gerados a partir da anlise das sequncias de DNA, caracterizando pela produo de lignanas/fenilpropanides, cidos benzoicos e cromenos3. Yoshida3 sugere que as amidas, liganas e fenilpropanide formam temas estruturais muito comuns em espcies de Piper, que teria surgido no inicio do processo de especiao do gnero Piper. Assim, espcies que no produzem amidas ou lignanas/fenilpropanides, mas que derivam de ancestrais

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produtores, provavelmente ainda tenham genes que codificam a biossntese destes compostos, mas podem estar latentes ou inativos. As espcies que acumulam preferencialmente lignanas/fenilpropides foram agrupados nos clados Macrostachys e Shilleria. Foi observado que a distribuio de lignanas/fenilpropanides est correlacionada com a segregao taxonmica3. O clado Schileria possui vrios caracteres plesiomrficos, o que dificulta sua caracterizao. Inclui aproximadamente 200 espcies encontradas na Amrica Central e na Mata Atlntica brasileira, onde encontra uma maior diversidade de espcies. So arbustos de mdio porte, a maioria apresenta grande ramificaes1. Alguns indivduos deste clado produzem determinada classe de metablito, como a espcie P. solmsianum que tem como principal componente nos extratos os lignides, mas em particular lignana

tetraidrofuranica (-)-grandisina que perfaz 70% da massa seca das folhas. A espcie P. regnelli destaca-se pelo acumulo de fenilpropanides e de ligananas benzofurnicas, como o (+)-conocarpano e eupomatenides3.

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Figura 4. rvore mais parcimoniosa baseada em ITS de sequncias de Piper. Barras verticais indicam sees do gnero Piper. Em quadrados, destaca-se as classes de metablitos secundrios produzidos pelas espcies. Fonte: Elaborado pelos autores com base no trabalho de Yoshida
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As plantas do clado Macrostachys so arbustos de tamanho mdio ou pequena rvores. uma linhagem muito rica em espcies da regio Neotropical com cerca de 200-500 espcies, muitas delas ocorrendo na Mata Atlntica do Brasil, com poucos representantes na Amaznia, na regio da Amrica central e Norte dos Andes2. As espcies deste clado acumulam preferencialmente lignanas do tipo dibenzilbutirolactnicas e furofurnica 3. A produo de cromenos e cidos benzoicos se concentrou no clado Radula. Estas classes de metablitos so caracteres evolutivos derivados e seriam sinapomorfias qumicas. No entanto, a ocorrncia de espcies em outros clados pode ser um trao autopomrfico, onde uma espcie pode ter evoludo independente3. O clado Radula tem aproximadamente 450 espcies, sendo amplamente distribuda na regio Neotropical. Muitas espcies desse clado ocorrer em locais abertos e, portanto, so comuns ao longo das estradas e bordas da floresta, mas algumas ocorrem no sub-bosque1. Deve ser ressaltado que o presente trabalho apresenta apenas resultados parciais, uma vez que esse trabalho est inserido num projeto de contexto maior onde so abordados todas as seces do gnero Piper, com diversos marcadores moleculares e os dados obtidos sero confrontados com filogenias morfolgicas e qumicas.

5. Garantia de qualidade As normas do laboratrio de fitoqumica inclui a utilizao de EPIs (Equipamento de Proteo Individual), sendo itens obrigatrios como: Avental - o uso do avental de manga longa obrigatrio para as atividades no laboratrio. O tecido ideal para fotoqumica 100% algodo, sendo 70% polister, o mnimo recomendado. culos e segurana a preveno dos olhos um dos pontos importantes na preveno de acidentes com partculas solidas projetada e/ou em suspenso. Luvas a escolha da luva correta depender do experimento a ser efetuado e dos produtos qumicos utilizados.

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Mscara para p recomenda-se seu uso ao manusear slica, utilizada para placas e colunas, e no moinho de facas. Sapato fechado recomenda-se couro e anti derrapante.

No laboratrio devemos ficar atentos s diversas recomendaes, como manter os cabelos sempre presos, ter sempre as mos um caderno de laboratrio, onde poderemos organizar nossos dados e anotar informaes relacionadas aos funcionamentos dos equipamentos, usar lpis para etiquetar frascos para evitar que as informaes sejam perdidas, manter sempre as bancadas organizadas e limpas, nunca tentar identificar um produto qumico pelo odor e sabor, verificar as voltagens dos equipamentos antes de liga-los na tomada, entre outros cuidados que devemos ter.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Jaramillo MA, Callejas R, Davidson C, Smith JF, Stevens AC, Tepe EJ. A Phylogeny of the Tropical Genus Piper Using ITS and the Chloroplast Intron psbJpetA. Syst. Bot. 2008; 33(4): 647660. 2. Jaramillo MA, Manos PS. Phylogeny and patterns of floral diversity in the genus Piper ( Piperaceae). Am. J. Bot. 2001; 88(4): 706716. 3. Yoshida NC. Anlise filogentica e estudo do metabolismo fenilpropanodico em espcies de Piper. [Tese de Doutorado]. So Paulo: Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo: 2013. 4. Lopes NP. Metablitos secundrios de Virola surinamensis (Rol.) Warb. (Myristcadeae). [Tese de Doutorado] So Paulo: Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo: 2009. 5- Motta LB. Aspectos qumicos e moleculares ligados filogenia de Camarea (Malpighiaceae). [Tese de Doutorado]. So Paulo: Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo; 2007.

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