Manejo en Fragmentacion Elevada del ADN.

Dr. Natalio Cruz

www.andromedi.com ncruz@gmx.es
COORDINADOR NACIONAL ANDROLOGIA

Hablar de Manejo de la Fragmentacion, es hablar del: Papel del Urologo o Andrologo en Reproduccion Conceptos: La era de la ICSI y la Fragmentacion del DNA. El cambio de objetivo del Andrlogo:

Andrologo del espermatozoide

Nuevo Paradigma
Mejora del Varn
Disfunciones sexuales y eyaculatorias Alteraciones anatmicas: pene, meato, etc.

Mejora del Semen:

Concentracin: Azoospermia, Oligo., Poli., ... Calidad: Asteno., Necro., Terato, ... Plasma seminal: Volumen, pH,

...

Mejora del Gameto:

Cromosmicas Moleculares Genticas Fragmentacin del DNA

efecto iceberg :
Si bien el 27% de los espermatozoides tienen fragmentado en mayor o menos grado su DNA (DAO PRIMARIO),

El 73% restante tienen un tipo de dao (DAO SECUNDARIO) ("dao oculto") y que es incompatible con el desarrollo de un embarazo a trmino

CMO MANEJAR EL AUMENTO DE FRAGMENTACION?

(Papel del Urlogo o Andrlogo en Reproduccin)

- Conocer el problema - Diagnosticar y tratar la causa - Tratar el sntoma

Conocer el Problema:

Que es Fragmentacin del DNA?

En los espermatozoides el ADN ni se transcribe, ni se traduce a ARN, por lo que a diferencia de otras clulas no puede realizar una respuesta completa de apoptosis que lleve a la muerte celular en caso de que la clula resulte daada. - Realizan una forma restringida de apoptosis, que conduce la fragmentacin del ADN. (Sakkas et al., 2004).

Que es Fragmentacin del DNA?

- En una clula somtica la estimulacin de la va apopttica intrnseca conduce a la aparicin repentina de endonucleasas que son liberadas de la mitocondria (como endonucleasa G) o activadas en el citosol (desoxirribonucleasa caspasa-activado) y luego se mueven en el ncleo para romper el ADN dentro del nucleosoma. -En los espermatozoides la separacin fsica de las mitocondrias y el espacio citoplasmtico origina que mecanismos de la clula somtica no pueden ser operativos. - En ellos las especies reactivas del oxgeno (ROS) (Koppers et al., 2008), activan la ruta apopttica intrnseca, caracterizada por la formacin de ROS mitocondrial, que produce un dao oxidativo en las bases del DNA, y esto lleva a roturas en las cadena del DNA (Aitken y De Iuliis, 2009).

Que es Fragmentacin del DNA?

-Son capaces de producir la activacin de las caspasas y de exteriorizar la fosfatidilserina (Weng et al., 2002). -Al expresar marcadores de apoptosis en su superficie, estos espermatozoides daados pueden ser identificados y fagocitados en su paso por el tracto genital femenino; de modo que sern eliminados y sin que se asocie con una respuesta inflamatoria en toda regla (Kurosaka et al., 2003)

Background:

El Dao del DNA spz puede tener tres potenciales mecanismos:

1. Una Condensacin defectuosa de la cromatina durante la espermatogenesis
2. La Apoptosis durante la espermatogenesis o en el tracto genital 3. El Estrs Oxidativo por ROS producidas: - Internamente - Externamente

Cmo se produce Fragmentacin del DNA?

Causas
Testiculares
meiosis de la profase I Espermiognesis

Post-testiculares
estrs oxidativo en epiddimo activacion de caspasas espermticas

Background:

Potenciales mecanismos ntimos:

1. Alteraciones durante el proceso de la espermiognesis: Nucleasas endgenas que cortan y ligan el ADN durante su protaminacin. Induccin incontrolada de apoptosis 2. Durante la migracin de espermatozoides maduros e inmaduros desde los tbulos seminferos al epiddimo: Inmaduros con exceso de citoplasma Aumento de endonucleasas aberrantes 3. Activacin de caspasas y endonucleasas en espermatozoides diferenciados por factores fsico-qumicos: infecciones, inflamacin, varicocele, etc.

Resumen:
Se han detectado altos niveles de ROS en el semen de un 25% de los hombres infrtiles Los niveles de ROS han sido asociados con el dao de ADN de esperma, aunque no se sabe el umbral por encima del cual hay dao del ADN. Los ROS en semen se generan por espermatozoides (especialmente, defectuosos o inmaduros) y leucocitos. La liberacin controlada de bajos niveles de ROS es normal, y necesaria para la funcin de los espermatozoides normales Pero los niveles altos de ROS pueden causar disfuncin espermtica La susceptibilidad de los espermatozoides humanos a estrs oxidativo se debe principalmente a la abundancia de cidos grasos insaturados en la membrana plasmtica del espermatozoide.

Resumen:
Estos cidos grasos insaturados proporcionan fluidez que es necesaria para: los eventos de fusin de membrana (por ejemplo, reaccin del acrosoma e interaccin espermatozoide-vulo) y La movilidad de los espermatozoides Sin embargo, la naturaleza insaturada de estos cidos los predispone al ataque de los radicales libres y peroxidacin lipdica de la membrana plasmtica del espermatozoide. Una vez que este proceso se ha iniciado, se produce: Acumulacin de perxidos de lpidos en la superficie de los espermatozoides y derivar en un dao oxidativo al ADN Se ha demostrado que las fuentes de ROS pueden ser exgenas o endgenas Ambas han sido capaces de inducir dao de ADN de esperma in vitro, confirmando que las ROS puede desempear un papel en la etiologa de dao de ADN de esperma en hombres infrtiles

RESUMEN. 2/4: ROS. Base del problema

ANTIOXIDANTES !!!

Resumen:
El lquido seminal es una importante fuente de antioxidantes (reductores de ROS) y es clave en la proteccin del dao oxidativo de los espermatozoides Esto es particularmente importante porque: Los espermatozoides tienen poco citoplasma (las enzimas antioxidantes son generalmente intracelulares), Prcticamente no hay capacidad para la sntesis de protenas y Hay poca capacidad antioxidante Son enzimas endgenas reductoras de ROS La superxido dismutasa (SOD), catalasa y glutatin peroxidasa (GPX). Estas enzimas antioxidantes se encuentran en el tracto reproductivo masculino y en el semen Adems, varios antioxidantes no enzimticos (vitaminas C y E, hipotaurina, taurina, L-carnitina, licopeno) tambin se encuentran en el semen y representan gran parte de la actividad antioxidante total seminal

CAUSAS de Fragmentacin del DNA

Edad Aumento de la temperatura en los testculos. Varicocele Fiebre, Temperatura ambiente Profesiones o Hbitos Problemas inherentes a la espermatogenesis/espermiogenesis. Ausencia de protaminas Elevacin de ROS Hipogonadismos Aumento de las clulas inflamatorias: Infecciones o inflamaciones genitales y prostticas Agentes txicos directos Quimio-, Radioterapia, Qumicos, Tabaco, etc. Congelacin de semen.

Varicocele:
ADULTOS NORMOZOOSPERMICOS:

ADULTOS ESTERILES: Hay disminucin de recuento y movilidad Hay afectacin de la morfologa?: Hay un aumento de gotas citoplsmicas (morfologa asociada a estrs oxidativo), que estn relacionadas con daos en el DNA. ADOLESCENTES: con varicocele pese a no haber diferencias en los parmetros seminales si se ve un incremento en el DFI (COMET)
Fertil Steril. 2006 Mar;85(3):625-8. Sperm nuclear DNA fragmentation in adolescents with varicocele. Bertolla RP, Cedenho AP, Hassun Filho PA, Lima SB, Ortiz V, Srougi M.

SE DEBEN OPERAR?: En pacientes operados se observa mejora.

J Androl. 2006 Jan-Feb;27(1):106-11. Infertile men with varicocele show a high relative proportion of sperm cells with intense nuclear damage level, evidenced by the sperm chromatin dispersion test. Enciso M, Muriel L, Fernndez JL, Goyanes V, Segrelles E, Marcos M, Montejo JM, Ardoy M, Pacheco A, Goslvez J.

Aumentos de Temperatura:
Fiebre: puede alterar el ratio histona : protamina. Y se asocia a anormalidades estructurales. Esto puede ser debido a defectos en la espermatognesis (periodo en el cual ocurre la deposicin de las protaminas) Temperatura ambiente Hbitos asociados a altas temperaturas escrotales (saunas, mantas calientes, etc), Determinadas profesiones (cocinero, panadero, agricultor, pintor, soldador, etc) aumentan el dao.

Inflamacin, Infecciones:

Inflamacin del tracto genital: inflamacin del epiddimo, testculo o prstata provoca leucocitospermia, incremento de especies reactivas y por tanto fragmentacin del DNA.

Infecciones: Las muestras con leucocitos

El dao puede ser causado por la apoptosis ( muerte celular controlada).

La apoptosis destruye aproximadamente el 75% de los spz. La apoptosis selectiva evita la formacin de spz anormales. Sakkas et al. sugieren que spz con DNA daado han escapado de esa apoptosis controlada, ya sea por edad de los pacientes, gonadotoxinas o terapias (cncer, etc.).

TOXICOS QUE CAUSAN FRAGMENTACION DEL DNA:

Edad:

CAUSAS DE FRAGMENTACION DEL DNA:

Conocidas Desconocidas
1. 2. 3. 4. 5. Txicas Inflamatorias Infecciosas Fsicas Varicocele

Tratables Curables? Intratables

CMO MANEJAR EL AUMENTO DE FRAGMENTACION?

(Papel del Urlogo o Andrlogo en Reproduccin)

- Conocer el problema - Diagnosticar y tratar la causa - Tratar el sntoma

Management of DNA FRAGMENTATION

Lifestyle. Counseling and Education

Empirical
treatments

Risk Factors

Causes

ATR Pitfalls to avoid

Management of DNA FRAGMENTATION

2.- Lifestyle Modification

Stop smoking Limit or avoid alcohol Follow healthy diet Exercise regularly

Management of Male Infertility

Lifestyle. Counseling and Education

Empirical
treatments

Risk Factors

Causes

ATR Pitfalls to avoid

TRATAMIENTO: RECOMENDACIONES ESHRE

(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs)

DICLOFENACO

Estado pro-inflamatorio

ANTIOXIDANTES

J Assist Reprod Genet. 2009 Aug;26(8):427-32. doi: 10.1007/s10815-009-9343-5. Epub 2009 Sep 19.

Antioxidants and sperm DNA damage: a clinical perspective.

Zini A, San Gabriel M, Baazeem A. Source Division of Urology, Department of Surgery, Royal Victoria Hospital, McGill University, Montreal, QC, Canada. ziniarmand@yahoo.com

Los datos sugieren que los suplementos antioxidantes de la dieta pueden tener un efecto beneficioso, reduciendo la Fragmentacin del DNA espermtico, en hombres con elevado nivel de fragmentacin del DNA. El mecanismo ntimo no ha sido bien establecido La mayora de los estudios son MENORES y sin brazo placebo

Algunos estudios planteados han mostrado resultados contradictorios.

Although in vitro studies have demonstrated a beneficial effect of antioxidant supplements in protecting sperm DNA from exogenous oxidants, .

 the effect of these antioxidants in protecting sperm from endogenous ROS, gentle sperm processing and cryopreservation has not been established.

Antioxidants
Showell MG et al. The Cochrane Library 2011, Issue 1

Antioxidantes:
Tratamiento con 1 g de vitamina C y 1 g de vitamina E diario durante 2 meses. En 76% de los casos se llega a una disminucin de DFI. No se ven diferencias en las tasas de fertilizacin o de divisin, pero las tasas de embarazo pasan del 6,9 al 48,2 y las de implantacin de 2,2 al 19,6. El grupo con placebo no mostr diferencias en el DFI.
J Androl. 2005 May-Jun;26(3):349-53. Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment. Greco E, Iacobelli M, Rienzi L, Ubaldi F, Ferrero S, Tesarik J.
Hum Reprod. 2005 Sep;20(9):2590-4. Epub 2005 Jun 2. ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxidant treatment. Greco E, Romano S, Iacobelli M, Ferrero S, Baroni E, Minasi MG, Ubaldi F, Rienzi L, Tesarik J.

Antioxidantes:

Tratamiento con Menevit 1 comprimido al da x 3 meses previos sin seleccin por DFI da tasas del 38,5% en pacientes con tratamiento frente a 16% en pacientes con placebo. No se observan diferencias en la tasa de fertilizacin o calidad embrionaria
Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2007 Jun;47(3):216-21. A randomised control trial examining the effect of an antioxidant (Menevit) on pregnancy outcome during IVF-ICSI treatment. Tremellen K, Miari G, Froiland D, Thompson J.

ACIDO DECOSAHEAENOICO (DHA)

 La composicin de lpidos de membrana se utiliza como indicador de la fluidez de membrana, de modo que, cuanto mayor es el contenido en AGPI-CL (Acidos grasos poli-insaturados de cadena larga) en la membrana espermtica, mayor es su fluidez, mejor su movilidad y se espera una mayor tolerancia a la criopreservacin. (Miller 2004) El cido docosahexaenoico (C22:6, DHA) es un cido graso esencial poliinsaturado (posee 6 dobles enlaces) de la serie omega-3. Estudios previos realizados en animales indican que se puede modificar de forma significativa la concentracin de DHA en la membrana de los espermatozoides modificando la concentracin de este cido graso en la dieta.
(Zaniboni 2006, Cerollini 2006)

Adems, este aumento de DHA se traduce en una mejora en la motilidad del semen criopreservado (Brinsko 2005)

Adaptabilidad de la membrana al dao producido por el proceso de congelacin/descongelacin era marcadamente superior para los espermatozoides con una elevada fluidez de membrana. (Giraud 2000)

Diferentes estudios han relacionado la composicin en AGPI-CL, en especial DHA, en hombres astenozoosprmicos y normozoosprmicos con la motilidad espermtica
(Zalata 1998)

n=23

(Tavilani 2006)

Anlisis composicin AG en espermatozoides de individuos normozoosprmicos, astenozoosprmicos, oligozoosprmicos y asteno-oligozoosprmicos: Espermatozoides de Individuos normozoosprmicos > contenido en DHA Mayor contenido de AGS y AA en individuos astenozoosprmicos, oligozoosprmicos y astenooligozoosprmicos y < niveles de DHA (p<0.01) Relacin significativa entre contenido en DHA y motilidad, concentracin y formas normales

(Aksoy 2006)

En hombres astenozoosprmicos, a travs de la suplementacin diettica con 400-800 mg al da de DHA durante 3 meses se ha demostrado aumentar la concentracin de DHA en el plasma seminal y modificar la composicin lipdica de la membrana espermtica (Conquer 2000).

Utilidad del cido docosahexaenoico en el tratamiento de la infertilidad masculina Juan G. lvarez Vol. 10, N. 1, 2012 , pgs. 138-142 40 pacientes con un aumento en el ndice de fragmentacin del ADN espermtico (DFI), medido mediante el test TUNEL. Se incluy a 20 pacientes en el grupo experimental tratado con 200 mg de DHA derivado de la microalga Schizochytrium sp. (GestaDha) cada 12 horas Disminuye de forma significativa el DFI a partir de la primera semana de tratamiento.

Omega-3 fatty acids help DNA fragmentation in sperm Annual Meeting of the American Society for Reproductive Medicine. Omega-3 fatty acids are beneficial in improving DNA fragmentation in sperm. 46 varones randomizados a 1050 mg of DHA o placebo. DNA fragmentacin (TUNEL) descendi progresivamente de 26% a 9%. Esta dosis de DHA es equivalente 3,000 mg de omega-3. Recomendaron dosis de 500-1,000 mg al da. Creen los autores que si se dobla la dosis puede mejorar an ms la fragmentacin.

POSIBLES CONCLUSIONES

DHA servira como antioxidante endgeno, como proteccin de mebrana.

El resto de los antioxidantes seran como antioxidantes exgenos

Falta por determinar componentes Hay que ser selectivo.

Management of Male Infertility

Lifestyle. Counseling and Education

Empirical
treatments

Risk Factors

Causes

ATR Pitfalls to avoid

Management of DNA Fragmentation

1.- Pitfalls to avoid in the Lab

2.- Selection of Sperm for ICSI 3.- Testicular Biopsy

1.- Period of abstinence for ART

Frequent ejaculation (every 24 hours or less)

vs
Infrequent ejaculations (greater than 24 hours)

Seminal parameters:
Volume Concentration Motility DNA fragmentation index (DFI) (SCD Halosperm kit)

Pre- and post-frequent ejaculation

9 8

120 100

7 6
VOL. ml

80
mill/ml

5 4 3 2 1 0

VOL. ANTES VOL. DESPUES

60 40 20 0

C. ANTES C. DESPUES

seminal volumes

sperm concentration

80 70 60 50
% a+b
DFI

50 40 30

40 30

a+b ANTES a+b DESPUES

DFI ANTES DFI DESPUES

20 10

20 10 0
0

sperm motility

DFI

2-5 Day Period Volume

Daily Ejaculation

DFI
Concentration Motility

= =

= =

CONCLUSION 1.- Period of abstinence for ART

What period of abstinence brings about optimal semen quality? Samples obtained after daily ejaculations (whenever possible) The shortest possible period of abstinence

2.- Time in lab from ejaculation to microinjection

Tras el eyaculado, el ndice de fragmentacin del DNA seminal (DFI) no permanece constante en el tiempo. Factores internos y externos (pH, temperatura, manipulacin en el laboratorio, etc.) lo van aumentando, a veces considerablemente

La velocidad a la que se fragmenta el ADN espermtico es caracterstica y diferente en cada especie y, dentro de ella, en cada individuo; y se conoce como DINAMICA DE LA FRAGMENTACION

2.- Time in lab from ejaculation to microinjection

Sperm DNA fragmentation must be understood as a dynamic process: - This is not the same across patients and time. - Fragmentation speed influences pregnancy rate.

Sperm DFIs were compared after ejaculation at the following times:

30 minutes 90 minutes

4 hours
24 hours

2.- Time in lab from ejaculation to microinjection

Optimal Time elapsed between ejaculation and microinjection:

Up to 90 minutes (approx.) before microinjection
Never greater than 4 hours

3.- Seminal temperature in the lab

If sperm in the laboratory is kept in the incubator, the processes of fragmentation and vacuole formation are accelerated.

Effect of the incubation temperature on the appearance of vacuolated spermatozoa

(Bartoov, congreso Warm 2006)

Pitfalls to avoid in the lab for ART:

1.- Period of abstinence for ART
Samples obtained after daily ejaculations (whenever possible)

2.- Time in lab from ejaculation to microinjection

Up to 90 minutes (approx.) before microinjection

3.- Seminal temperature in the lab

22-25 C

Selection of sperm in the laboratory

Morphology high magnification

Apoptotic markers

Hyaluronic acid binding (PICSI, Sperm Slow)

80

Espermatozoides Testiculares:

Espermatozoides Testiculares:

Nos planteamos comprobar si obtendramos mejores resultados en ICSI cuando utilizbamos espermatozoides testiculares Evaluamos 263 ciclos de ICSI, correspondientes al ao 2010, en los que se realiz a los varones el test de fragmentacin del ADN espermtico

Tcnica de dispersin de la cromatina espermtica (SCD) con el kit Halosperm (Halotech).

Si DFI < 30%

No patolgico

Si DFI 30%

Patolgico

AO 2010

De los 263 Test de Fragmentacin del DNA realizados

TF 2010

170 no patolgicos 93 patolgicos (35%)

NO PATOLGICOS PATOLGICOS

Todos los pacientes con DFI patolgico fueron tratados con antioxidantes orales

AO 2010
De los 93 patolgicos, tras tratamiento
TF TRATAMIENTO

41 se normalizaron 52 indicacin de biopsia testicular (55,9%)

NORMALIZADOS I. BIOPSIA

De los 52 con indicacin de biopsia testicular

TRATAMIENTO

19 biopsia testicular (36,5%)

NO BIOPSIA

33 no biopsia

BIOPSIA

GESTACIONES CON DFI ALTERADO

19 Casos 33 Casos

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 BIOPSIA NO BIOPSIA

GESTACIN NO GESTACIN

TASA DE GESTACIN CON DFI ALTERADO

80 70 60 50 40 30 20 10 0 74% 42% BIOPSIA NO BIOPSIA

p< 0.01

CONCLUSIONES
Los espermatozoides testiculares, en casos severos, de alta tasa de fragmentacin del DNA espermtico, obtienen mejores tasas de gestacin mediante ICSI que los eyaculados.

En los pacientes con alta tasa de fragmentacin del DNA (inaceptables para ICSI) y que no disminuye con tratamiento mdico se debe indicar la extraccin de espermatozoides testiculares: TESE para ICSI.

Bibliografia:

Uso de espermatozoides de testculo

Hum Reprod. 2005 Jan;20(1):226-30. Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa. Greco E, Scarselli F, Iacobelli M, Rienzi L, Ubaldi F, Ferrero S, Franco G, Anniballo N, Mendoza C, Tesarik J. Los niveles de fragmentacin en espermatozoides de testculo son mucho menores que en los eyaculados. No encuentran diferencias en la tasa de fecundacin, de divisin y la morfologa embrionaria. 18 pacientes. MEJORIA EN LA TASA DE GESTACION: De los 9 de TESE 4 embarazos (44,4% embarazo 20,7 implantacin), de los 9 de eyaculado 1 embarazo y aborto

Si es posible en biopsias en fresco

DISCREPANCIAS: Reprod Biomed Online. 2003 Oct-Nov;7(4):449-55. Effects of cryopreservation on testicular sperm nuclear DNA fragmentation and its relationship with assisted conception outcome following ICSI with testicular spermatozoa. Thompson-Cree ME, McClure N, Donnelly ET, Steele KE, Lewis SE. No encuentran diferencias en la tasa de fecundacin, de divisin y la morfologa embrionaria. La tasa de embarazo con frescos es del 30% y con congelados del 26% , no son estadisticamente significativas

REFLEXIONES:

1. La Fragmentacin (ndice Fragmentacin del DNA DFI) no es slo un concepto esttico

2. Las diferentes patologas o causas pueden afectar no slo a la fragmentacin, tambin a su dinmica (DFD), y de forma diferente

3. Puede haber mejoras o empeoramientos diferenciados de los dos parmetros: DFI - DFD?
4. Podra algn tratamiento ser beneficioso para DFI pero no para DFD? 5. Es suficiente con mejorar uno de los parmetros? 6. Cual es el papel de los Antiinflamatorios y Antioxidantes en DFD? 7. Diferentes antioxidantes para cada factor? 8. Queda mucho por conocer

CONCLUSIONES PRACTICAS
1. Diagnosticar causas potencialmente tratables y tratarlas 2. Siempre:

Modificar hbitos txicos. Consejos higinico- dietticos

Eyaculaciones seriadas (diferente del estndar de recogida) Primera fraccin de eyaculado

Minimizar tiempos laboratorio entre recogida y uso

Antiinflamatorios (diclofenaco 50 mg/12 h. en tandas de 15 das)

3. Si no hay causa tratable:

Seleccin de espermatozoides: IMSI, Columnas anexina, etc.

Biopsia testicular ANTIOXIDANTES

Hablar de Manejo de la Fragmentacion, es hablar del: Papel del Urologo o Andrologo en Reproduccion Conceptos: La era de la ICSI y la Fragmentacion del DNA. El cambio de objetivo del Andrlogo:

Andrologo del espermatozoide

Nuevo Paradigma
Mejora del Varn
Disfunciones sexuales y eyaculatorias Alteraciones anatmicas: pene, meato, etc.

Mejora del Semen:

Concentracin: Azoospermia, Oligo., Poli., ... Calidad: Asteno., Necro., Terato, ... Plasma seminal: Volumen, pH,

...

Mejora del Gameto:

Cromosmicas Moleculares Genticas Fragmentacin del DNA

Muchas gracias por su atencin!

Dr. Natalio Cruz

www.andromedi.com ncruz@gmx.es
COORDINADOR NACIONAL ANDROLOGIA